DE2447700A1 - DIAGNOSTIC AGENTS - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Trockendiagnostiziermittel mit besserer Empfindlichkeit und quantitativer Auswertung, das sich für das Fluoreszenzverfahren zur Entdeckung von Antinuclearfaktor (ANF) für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus (SLE) und anderen autoimmunen Erkrankungen verwenden läßt, und das aus speziell hergestellten, fixierten und stabilisierten Fotuskälberthymocyten besteht.The invention relates to a dry diagnostic agent with better sensitivity and quantitative evaluation, the opted for the fluorescence method for the detection of antinuclear factor (ANF) for the diagnosis of systemic lupus erythematosus (SLE) and other autoimmune diseases, and that from specially manufactured, fixed and stabilized photo calf thymocytes.
Das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel unterscheidet sich durch folgende Merkmalskombination vom Stand der Technik: Es wird ein Fötuskälberthymus als Thymocytenquelle verwendet. Die Isolierung der Einzelzellen erfolgt durch Absieben. Aus den Thymocyten stellt man auf Mikroskopobjektträgern durch Lufttrocknung und chemische Fixierung einen Aufstrich her. Die dabei erhaltenen und fixierten stabilisierten Thymocytenobjektträger sind gebrauchsfertig, und werden in einem .luftdichten Behälter mit einem Trockenmittel verpackt. Das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel ist hierdurch auf den Ob-The diagnostic agent according to the invention differs by the following combination of features from the prior art: A fetal calf thymus is used as the source of thymocytes. The individual cells are isolated by sieving. The thymocytes are put through on microscope slides Air drying and chemical fixation make a spread. The stabilized thymocyte slides obtained and fixed are ready for use and are packed in an airtight container with a desiccant. The inventive Diagnostic agent is thereby on the ob-
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jektträger fixiert (chemisch getrocknet) und kann so zur Entdeckung von Antinuclearfaktor und zur Diagnose von SLE und anderen autpimmunen Erkrankungen verwendet werden. Bei den bekannten Produkten ist ein Zurichten der Objektträger erforderlich.jektträger fixed (chemically dried) and can be used for the detection of antinuclear factor and the diagnosis of SLE and other autoimmune diseases can be used. The known products involve preparing the slide necessary.
Das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel läßt sich in Hospitälern, Kliniklaboratorien und von Ärzten als Diagnostiziermittel beim Fluoreszenzantinuclearfaktortest für die Entdeckung und quantitative Bestimmung von Serumfaktoren verwenden/ die mit autoimmunen Erkrankungen, wie systemischem Lupus erythematosus (SLE), assoziiert sind. Zu anderen sogenannten autoimmunen Erkrankungen, die sich mit dem erfindungsgemäßen Mittel diagnostizieren lassen, gehören Bindegewebeerkrankungen, rheumatische Arthritis, Skeleroderraie und Dermatomyositis. Erfindungsgemäß wird nun ein Reagens für den Lupus erythematosus-Fluoreszenz-ANF-Test geschaffen, der bequem, leicht anwendbar, stabil, äußerst empfindlich und standardisierbar ist.The diagnostic agent according to the invention can be used in hospitals, Clinical laboratories and by doctors as diagnostic tools in fluorescent antinuclear factor test for the detection and quantitative use of serum factors / those with autoimmune diseases, such as systemic Lupus erythematosus (SLE). To other so-called autoimmune diseases that deal with the invention Agents diagnosed include connective tissue disease, rheumatoid arthritis, and sceleroderma Dermatomyositis. According to the invention, a reagent for the lupus erythematosus fluorescence ANF test is now created which is convenient, easy to use, stable, extremely sensitive and can be standardized.
Die Erfindung betrifft demzufolge ein aus speziell hergestellten, fixierten und stabilisierten Fötuskälberthymocyten zusammengesetztes trockenes Diagnostiziermittel, das sich zum Auffinden von Antinuclearfaktor im menschlichen Serum für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus und anderen damit verwandten autoimmunen Erkrankungen verwenden läßt, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein Verfahren zu seiner Anwendung bei Immunofluoreszenztests zur Entdeckung von Antinuclearfaktor en im menschlichen Serum bei der Diagnose von systemischem Lupus erythematosus und anderen autoimmunen Erkrankungen, sowie einen Diagnosesatz oder eine Diagnosepackung, die das Reagens für die genannte Anwendung enthält.The invention accordingly relates to a composition composed of specially manufactured, fixed and stabilized fetal calf thymocytes dry diagnostic agent used to detect antinuclear factor in human serum for the Diagnosis of systemic lupus erythematosus and other related autoimmune diseases Process for its preparation and a process for its use in immunofluorescence tests for the detection of antinuclear factor en in human serum in the diagnosis of systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases, and a diagnostic kit or kit containing the reagent for said application.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines an einen Mikroskopobjektträger fixierten trockenen Diagnostiziermittels zur Entdeckung von humanem Antinuclearfaktor im menschlichen Serum oder Plasma in einem Immunoflureszenztest für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus oder anderen aütoimmuhen Erkrankungen besteht darin, daß man lediglich Fötuskälberthymus siebt, um so hieraus dispergierte Thymocytenzellen zu erhalten, die dispgergierten Thymocytenzellen in isotonischer Puffersalzlösung in einer Zellenmenge von etwa 1,0 bis 1,5 χ 10 Zellen/ml suspendiert, wenigstens einen Teil von etwa 0,05 ml dieser dispergierten Thymocytenzellsuspension auf einen Mikroskopobjektträger bringt, die auf diesen Objektträger befindliche Menge der genannten dispergierten Thymocytensuspension trocknet, die getrocknete Zellsuspension mit modifizierter Carnoylösung fixiert, die fixierte Suspension mit Wasser wäscht und die so erhaltene fixierte und gewaschene Suspension trocknet.The method according to the invention for producing a dry diagnostic agent fixed to a microscope slide for the detection of human antinuclear factor in human serum or plasma in an immunoflurescence test for the diagnosis of systemic lupus erythematosus or other autoimmune diseases is that one merely sifted fetal calf thymus in order to disperse from it To obtain thymocyte cells, the dispersed thymocyte cells in isotonic buffer salt solution in a Suspended amount of cells from about 1.0 to 1.5 10 cells / ml, at least a portion of about 0.05 ml of this dispersed Bring thymocyte cell suspension on a microscope slide, the amount of said on this slide dispersed thymocyte suspension dries, the dried cell suspension is fixed with modified carnoyl solution, the fixed suspension is washed with water and the fixed and washed suspension thus obtained is dried.
Die Erfindung ist ferner auf ein auf einem Mikroskopobjektträger fixiertes trockenes'Diagnostiziermittel gerichtet, mit dem man humanen Antinuclearfaktor im Humanserum oder Plasma bei einem Immunofluoreszenztest für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus oder anderen autoimmunen Erkankungen endecken kann, das das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellte trockene Diagnostiziermittel enthält.The invention also relates to an on a microscope slide Fixed dry'Diagnostiziermittel directed, with which one human antinuclear factor in human serum or plasma in an immunofluorescence test for the diagnosis of systemic Lupus erythematosus or other autoimmune disease can be detected by following the procedure described above contains manufactured dry diagnostic agents.
Ferner bezieht sich die Erfindung auf eine Verbesserung bei der Feststellung von humanem Antinuclearfaktor im Humanserum oder Plasma beim Immunofluoreszenztest für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus und anderen autoimmunen Erkrankungen, wozu man das oben beschriebene trockene Diagnostiziermittel verwendet.The invention also relates to an improvement in the detection of human antinuclear factor in human serum or plasma in the immunofluorescence test for the diagnosis of systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases, using the dry diagnostic agent described above.
Weiter ist d.ie Erfindung auf einen Diagnostiziersatz gerichtet, der für die Entdeckung von Humanantinuclearfaktor im Humanserum oder Plasma bei einem Immunofluoreszenztest für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus oder anderenFurthermore, the invention is directed to a diagnostic kit, that for the discovery of human antinuclear factor in human serum or plasma in an immunofluorescence test for the Diagnosis of systemic lupus erythematosus or others
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autoimmunen Erkrankungen verwendet wird, und der im wesentlichen aus 15 Mikroskopobjektträgern, von denen jeder drei stabilisierte Schichten von gemäß obigem Verfahren hergestellten Fötuskälberthymocyten enthält, einer Phiole eines aus SLE-Donatoren hergestellten Vergleichsserums für einen positiven systemischen Lupus erythematosus, einer Phiole mit aus Nicht-SLE-Donatoren hergestelltem Vergleichsserum für einen negativen systemischen Lupus erythematosus, sowie einer Phiole mit lyophilisiertem Hasenantihumanglobulin, des Fluorescein enthält, besteht. Dieses letztgenannte Kanjugat besteht aus Hasenantikörpern, die gegen humanes gamraa-Globulin gerichtet sind. Die Hasenantikörper werden aus Serum von Hasen isoliert, die mit humanem gamma-Globulin hyperimmunisiert wurden. Die gereinigten Hasenantikörper werden mit Fluoresceinisothiocyanat vermischt, erneut gereinigt und lyophilisiert.autoimmune diseases is used, and essentially consists of 15 microscope slides, each of which is three contains stabilized layers of fetal calf thymocytes prepared according to the above procedure, a vial of one made from SLE donors prepared comparison serum for a positive systemic lupus erythematosus, a vial with from Non-SLE donors produced comparison serum for negative systemic lupus erythematosus, as well as a vial with lyophilized rabbit anti-human globulin containing fluorescein. This last-mentioned canjugate consists of rabbit antibodies, directed against human gamraa globulin. The rabbit antibodies are isolated from serum from rabbits which were hyperimmunized with human gamma globulin. The cleaned ones Rabbit antibodies are mixed with fluorescein isothiocyanate, purified again and lyophilized.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Entdeckung von humanem Antinuclearfaktor im Humanserum unter Verwendung eines Immunofluoreszenztests für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus und anderen autoimmunen Erkrankungen, das darin besteht, daß man etwa 0,03 ml verdünntes Humanserum auf etwa 0,05 ml eines getrockneten Fötuskälberthymocytenbelags auf einen Mikroskopobjektträger gibt, der wie oben beschrieben hergestellt wurde, etwa 0,03 ml eines jeden positiven und negativen systemischen Lupus erythematosus Vergleichsserums auf eine zweite und eine dritte Menge von 0,05 ml getrocknetem Fötuskälberthymocytenbelag auf diesem Objektträger anordnet, den so behandelten Objektträger inkubiert, den inkubierten Objektträger spült, den gespülten Objektträger wäscht, jeden Belag mit etwa 0,03 ml verdünntem Hasenantihumanglobulin-Fluorescein-Konjugat versetzt, dieses Konjugat gleichförmig über den gesamten Belag versprüht, die obigen Verfahrensstufen des Inkubierens, Spülens, Waschens, der Zugabe und des Besprühens wiederholt, die erhaltenen Objektträger entsprechend befestigt und diese Objektträger dann unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrößerung (schwaches Objektiv) und bei 440-facher Vergrößerung (starkes Objektiv) untersucht.The invention also relates to a method for the discovery of human antinuclear factor in human serum using an immunofluorescence test for the diagnosis of systemic Lupus erythematosus and other autoimmune diseases, which consists in adding about 0.03 ml of diluted human serum Place about 0.05 ml of dried fetal calf thymocyte plaque on a microscope slide prepared as described above was prepared to contain approximately 0.03 ml of each positive and negative systemic lupus erythematosus control serum placing a second and a third quantity of 0.05 ml of dried fetal calf thymocyte coating on this slide, incubating the thus treated slide, rinsing the incubated slide, washing the rinsed slide, each Add about 0.03 ml of diluted rabbit anti-human globulin fluorescein conjugate to the topping and apply this conjugate uniformly over the all topping sprayed, the above process steps of incubating, rinsing, washing, adding and spraying repeated, the obtained slides attached accordingly and these slides then under a fluorescence microscope examined at 100 times magnification (weak objective) and at 440 times magnification (strong objective).
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Das erfindungsgemäße Diagnostiziermittel besteht nur aus Fötuskälberthymocyten. Keine anderen Thymocyten werden verwendet oder in Betracht gezogen. Thymocyten sind Lymphoblastzellen aus Thymusschrägen, die sehr kleine Kerne enthalten. Mit fortschreitendem Wachsen der Kälber werden die Thymien größer. Die Thymen von Kälberföten liegen daher in ihrem größten Wachstumszustand vor, und sind somit reicher an DNP enthaltenden Thymocyten.The diagnostic agent according to the invention consists only of fetal calf thymocytes. No other thymocytes are used or considered. Thymocytes are lymphoblast cells from thymus slants that contain very small nuclei. With As the calves grow, the thymia become larger. The thymes of calf fetuses are therefore in their greatest state of growth and are thus richer in thymocytes containing DNP.
Erfindungsgemäß werden Fötuskälberthymen von 5 bis 6 Monate alten Kälberföten gesammelt und in physiologischer Salzlösung bis zum Gebrauch bei 4 0C aufgehoben. Die Fötuskälberthymocyten erhält man aus frischem Fötuskälberthymus durch Sieben. Das Sieben ist ein äußerst wichtiger Teil der vorliegenden Erfindung. Hierdurch werden nämlich die einzelnen Thymocytenzellen isoliert und für eine Standardisierung der Zellenraenge des Belages dispergiert. Durch Dispergieren der Thymocytenzellen kommt es zu einer Klumpenbildung, und gleichzeitig läßt sich hierdurch■der Test visuell besser auswerten und interpretieren. Beim Absieben werden die Fötusthymen durch ein Sieb einer Amnionpresse oder dergleichen gesiebt. Auf diese Weise werden die Zellen isoliert und äußerst wirksam und praktisch dispergiert. Die dispergierten Zellen suspendiert man in einer isotonischen gepufferten Salzlösung, und zwar in einer Zellmenge von etwa 1,0 bis 1,5 x 10 Zellen/ml. Dieses Suspendieren hat den Vorteil, daß die Thymocytenzellen nicht verletzt werden. Die Zellzählung ist deshalb erforderlich, damit man eine für eine leichte Auswertung unter einem Mikroskop erforderliche ausreichende Zellenzahl hat, wobei allerdings nicht so viele Zellen vorhanden sind, daß diese zusammenklumpen. Ein Tropfen (etwa 0,05 ml) der ausgezählten Zellsuspension wird dann auf eine oder mehrere Kreisflächen auf einen Mikroskopobjektträger gegeben, wobei sich normalerweise drei Kreis-According to Fötuskälberthymen collected from 5 to 6 months old calf fetuses and canceled in physiological saline until needed at 4 0 C. The fetal calf thymocytes are obtained from fresh fetal calf thymus by sieving. Sieving is an extremely important part of the present invention. This is because the individual thymocyte cells are isolated and dispersed to standardize the number of cells in the coating. By dispersing the thymocyte cells, clumps are formed, and at the same time this makes it easier to visually evaluate and interpret the test. When sieving, the fetal hymen are sieved through a sieve of an amniotic press or the like. In this way the cells are isolated and extremely effectively and conveniently dispersed. The dispersed cells are suspended in an isotonic buffered saline solution in an amount of about 1.0 to 1.5 × 10 cells / ml. This suspension has the advantage that the thymocyte cells are not injured. The cell count is therefore necessary in order to have a sufficient number of cells necessary for easy evaluation under a microscope, although there are not so many cells that they clump together. A drop (about 0.05 ml) of the counted cell suspension is then placed on one or more circular areas on a microscope slide, there are usually three circular
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flächen auf einem Objektträger befinden, und hierauf getrocknet. Die Zellsuspension kann auf dem Objektträger bei Raumtemperatur oder wahlweise auch bei etwa 37 0C bei niedriger Feuchtigkeit getrocknet werden. Der Thymocytenobjektträger wird dann in modifizierter Carnoylösung (75 % absolutes Methanol: 25 % Eisessig) fixiert oder stabilisiert, mit Wasser gewaschen, an der Luft getrocknet und in Gegenwart eines Trockenmittels in einem luftdichten Behälter aufgehoben oder bei -20 0C oder darunter eingefroren, und er ist so gebrauchsfertig für einen Fluoreszenzantinuclearfaktortest.surfaces are on a slide, and then dried. The cell suspension can be dried on the slide at room temperature or optionally also at about 37 ° C. with low humidity. The thymocyte slide is then fixed or stabilized in modified carnoyl solution (75% absolute methanol: 25% glacial acetic acid), washed with water, air-dried and in the presence of a desiccant stored in an airtight container or frozen at -20 0 C or below, and it is so ready to use for a fluorescent antinuclear factor test.
Der Mikroskopobjektträger wird deshalb mit modifizierter Carnoylösung fixiert, um eine Zersetzung der Thymocytenzellen zu vermeiden. Die modifizierte Carnoylösung wirkt als Konservierungsmittel und Stabilisator, wodurch ein Zusammenbrechen der Zellen und Abwaschen vom Objektträger vermieden wird. Ohne Carnoylösung hat man kein genügend stabiles Produkt. Andere Fixierlösungen verursachen entweder eine nichtspezifische Fluoreszenz, einen Verlust an Zellintegrität oder einen Verlust an spezifischer Fluoreszenz. Der Objektträger wird in destilliertem Wasser gewaschen und an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet, um so überschüssige Carnoylösung zu entfernen. Nach dem Trocknen werden die Objektträger zusammen mit einem Trockenmittel in luftdichte Behältnisse gegeben, wodurch ein Abbau der Thymocyten vermieden wird. Zur Durchführung des Fluoreszentantinuclearfaktortests unter Verwendung des erfindungsgemäßen Diagnostlzierraittels inkubiert man Patientenserum mit den Thymocytenbelägen auf den Objektträgern derart, daß eventuell vorhandene Antikörper für DNP mit dem DNP in den Thymuskernen reagieren können und gebunden werden. Nichgebundene Serumkomponenten werden dann durch mehrmaliges Spülen abgewaschen. Die Umsetzung wird hierauf durch Zugabe von tierischem Antikörper zu humanem gamma-Globulin sichtbar gemacht, das man vorher mit einem Fluoreszenz emittierenden Molekül, wie Fluresceinisothiocyanat, konjugierte. Nach weiterem Waschen zum Entfernen nichtspezifischer FluoreszenzThe microscope slide is therefore fixed with modified carnoyl solution to prevent decomposition of the thymocyte cells to avoid. The modified carnoyl solution acts as a preservative and stabilizer, causing breakdown of cells and washing off the slide is avoided. Without carnoyl solution one does not have a sufficiently stable product. Other Fixing solutions cause either non-specific fluorescence, loss of cell integrity, or loss specific fluorescence. The slide is washed in distilled water and left in the air at room temperature dried to remove excess carnoyl solution. After drying, the slides are put together placed in airtight containers with a desiccant, which prevents the thymocytes from breaking down. To carry out the fluorescent tin nuclear factor test using of the diagnostic aid according to the invention, patient serum is incubated with the thymocyte coatings on the slides in such a way that any antibodies for DNP present with the DNP in the thymus nuclei can react and be bound. Unbound serum components are then removed by repeated Rinse washed off. The conversion is then made visible by adding animal antibodies to human gamma globulin, previously conjugated with a fluorescence emitting molecule such as fluorescein isothiocyanate. To further washing to remove non-specific fluorescence
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wird der Objektträger unter einem mit einer Lichtquelle und mit Filtern versehenen Mikroskop untersucht, um ihn zur
Fluoreszenz anzuregen. Falls das Serum positiv ist, dann läßt sich in den Thymuskernen ein Komplex aus DNP-Antikörper:DNP
und Antihumanglobulin sehen.the slide is examined under a microscope equipped with a light source and filters in order to use it
To stimulate fluorescence. If the serum is positive, then a complex of DNP antibodies: DNP and anti-human globulin can be seen in the thymus nuclei.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. The invention is illustrated in more detail by means of the following examples.
A. Materialien A. Materials
Modifizierte CarnoylösungModified carnoyl solution
Absolutes Methanol 75 % Eisessig 25 %Absolute methanol 75% glacial acetic acid 25%
Mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PPS), 0,05 m, pH 7,1 i 0,Phosphate buffered saline (PPS), 0.05 m, pH 7.1 i 0,
NaH3PO4.H2O 1,9 3 gNaH 3 PO 4 .H 2 O 1.9 3 g
Na2HPO4 5,11 gNa 2 HPO 4 5.11 g
NaCl 5,70 gNaCl 5.70 g
mit H3O auf 1 Liter aufgefüllt.made up to 1 liter with H 3 O.
Reich-Objektträger (Bellco-Glas) Gestelle und Gläser zum Tauchen Amnionsieb bzw. -presserReich microscope slide (Bellco glass) Racks and glasses for diving amniotic sieve or squeezer
Gesammelter und bei 4 0C in physiologischer Salzlösung aufbewahrter Fötusthymus (von einem 5 bis 6 Monate alten Fötus).Collected and of stored at 4 0 C in physiological saline Fötusthymus (from a 5 to 6 months old fetus).
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B. Herstellung der Fötuskälberthymocyten-Suspension B. Preparation of Fetal Calf Thymocyte Suspension
1. Es wird eine 10g Menge vom Fötusthymus entnommen und in PPS gespült.1. A 10g amount is taken from the fetal thymus and rinsed in PPS.
2. Diese 10 g werden durch eine Amnionpresse in einen 500 ml Kolben gepreßt, der 250 ml PPS enthält. Die Presse wird mit 250 ml PPS gespült, wodurch man ein Endvolumen von 500 ml erhält.2. These 10 g are forced through an amniotic press into a 500 ml flask containing 250 ml of PPS. the The press is rinsed with 250 ml of PPS, resulting in a final volume of 500 ml.
3. Die dabei erhaltene 500 ml Suspension leitet man durch 6 Schichten von Gaze, worauf man sie in vier 250 ml Zentrifugenröhrchen 7 bis 8 Minuten bei 170 g (IEC-PR6, Kopf Nr. 259, 800 Umdrehungen pro Minute) zentrifugiert. 3. The 500 ml suspension thus obtained is passed through 6 layers of gauze, whereupon it is divided into four 250 ml Centrifuge tubes centrifuged for 7 to 8 minutes at 170 g (IEC-PR6, head # 259, 800 revolutions per minute).
4. Die überstehende Flüssigkeit wird sorgfältig entfernt und durch einen Sinterglasfilter der Porennummer c filtriert.4. The supernatant liquid is carefully removed and pore numbered through a sintered glass filter c filtered.
5. Es erfolgt eine Zellenzählung mit Trypanblau und Einstellung der Suspension auf einen Zellgehalt von 1 χ 10 Zellen/ml.5. The cells are counted with trypan blue and the suspension is adjusted to a cell content from 1 10 cells / ml.
C. Herstellung von Fötuskälberthymocyten-Objektträgern C. Preparation of fetal calf thymocyte slides
1. Man gibt einen Tropfen (etwa 0,05 ml) der verdünnten Zellsuspension in das Zentrum eines jeden Keramikrings auf den Reich-Objektträgern.1. Place one drop (approximately 0.05 ml) of the diluted cell suspension in the center of each ceramic ring on the Reich microscope slides.
2. Die Suspension wird mittels Warmluft auf dem Objektträger getrocknet.2. The suspension is dried on the slide using warm air.
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3. ' Sobald der Belag trocken ist, werden die Objektträger mit ihrer Kante in das Tauchgestell gebracht, wobei die Objektträger nicht Rückseite an Rückseite angeordnet werden dürfen.3. 'As soon as the topping is dry, slide the slides placed with their edge in the immersion rack, whereby the slides are not back to back may be ordered.
4. Das Gestell taucht man 10 Minuten in frische modifizierte Carnoylösung.4. The frame is immersed in fresh modified carnoyl solution for 10 minutes.
5. Die Objektträger werden in PPS gespült und durch 10 Minuten langes Tauchen in PPS gewaschen. Zum Spülen und Waschen verwendet man getrennte Bäder. 5. The slides are rinsed in PPS and washed by immersing them in PPS for 10 minutes. To the Separate baths are used for rinsing and washing.
6. Die Objektträger werden von Salz freigespült, indem man sie in drei aufeinanderfolgende Bäder mit destilliertem Wasser taucht.6. The slides are rinsed free of salt by placing them in three successive baths of distilled salt Water dives.
7. Die Objektträger läßt man abtropfen und trocknet sie dann.7. The slides are drained and then dried.
8. Die dabei erhaltenen Objektträger werden sofort verpackt, wobei man eine Trockenpackung und 15 Objektträger pro Behältnis verwendet.8. The slides obtained in this way are packed immediately, using a dry pack and 15 slides used per container.
A. Materialien A. Materials
Mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PPS), pH 7,2 - 0,1.With phosphate buffered saline (PPS), pH 7.2 to 0.1.
Formulierung pro Liter:Formulation per liter:
NaCl 7,65 gNaCl 7.65 g
Na3HPO4 0,724 gNa 3 HPO 4 0.724 g
KH3PO4 0,21 gKH 3 PO 4 0.21 g
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Es lassen sich mehrere Liter herstellen und bei Raumtemperatur aufheben und der pH-Wert eines jeden PPS-Ansatzes wird bestimmt. Falls der pH-Wert über oder unter dem Wert 7,2 - 0,1 liegt, erfolgt eine Einstellung mit normalem Natriumhydroxid oder normaler Salzsäure.Several liters can be produced and stored at room temperature, as can the pH of each PPS batch is determined. If the pH value is above or below the value 7.2 - 0.1, a setting is made with normal Sodium hydroxide or normal hydrochloric acid.
Ein Teil PPS, pH 7,2, plus 9 Teile Glycerin (chemisch rein).One part PPS, pH 7.2, plus 9 parts glycerine (chemically pure).
Für eine Fluoreszenzmikroskopie geeignete Mikroskope. Eine Ultraviolettquelle, wie eine HBO 200W Hochdruckquecksilberlampe in Kombination mit einem BG12 Erregerfilter und einem 0G1 Grenzfilter reicht für einen Routinegebrauch aus.Microscopes suitable for fluorescence microscopy. An ultraviolet source, such as an HBO 200W high pressure mercury lamp in combination with a BG12 excitation filter and a 0G1 limit filter is sufficient for routine use.
B. Verfahren B. Procedure
1. Man sammelt Blutproben aseptisch, und zwar unter Vermeidung von Hämolyse, und läßt sie dann zusammenklumpen. Das Serum sollte entfernt und im Kühlschrank aufgehoben oder eingefroren werden, falls man es nicht sofort zur Untersuchung braucht. Inaktive Seren oder Vergleiche dürfen nicht erwärmt werden.1. Aseptically collect blood samples, avoiding hemolysis, and then allow them to clump together. The serum should be removed and stored in the refrigerator or frozen if you can't needs to be examined immediately. Inactive sera or comparisons must not be heated.
2. Mit 1 ml destilliertem Wasser wird wieder lyophilisiertes Antihumanglobulin hergestellt.2. Lyophilized anti-human globulin is reconstituted with 1 ml of distilled water.
3. Das wiederhergestellte Antihumanglobulin verdünnt man mit mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PPS) . Die optimale Konzentration für jede Konjugatraenge wird vorher bestimmt. Da Bedingungen und Ausrüstung von Labor zu3. The reconstituted anti-human globulin is diluted with phosphate buffered saline (PPS). The optimal one Concentration for each conjugate level is determined beforehand certainly. Because conditions and equipment from laboratory to
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Labor variieren, empfiehlt sich eine Bestimmung des Verdünnungsfaktors für jeden Ansatz Antihumanglobulin durch Untersuchung mit Standardvergleichsseren. Die ausgewählte Lösung ist optimal, wenn man mit dem positiven Vergleichsserum eine maximale Fluoreszenz und mit dem negativen Vergleichsserura eine minimale Fluoreszenz erhält.Laboratory vary, a determination of the dilution factor for each antihuman globulin approach is recommended by examination with standard reference sera. The chosen solution is optimal if one maximum fluorescence with the positive comparison serum and one with the negative comparison serum receives minimal fluorescence.
4. Vom Serum des Patienten stellt man eine 1:1O-Verdünnung in PPS her. Hierbei ist zu beachten, daß positive und negative Vergleiche gleichzeitig mit jedem Test gefahren werden sollten. Die Vergleichsseren sind unter keinen Umständen zu verdünnen. 4. Make a 1: 10 dilution of the patient's serum in PPS. It should be noted that positive and negative comparisons are made at the same time should be driven for every test. The comparison sera should not be diluted under any circumstances.
5. Der erste Kreis an Thymocyten auf dem Mikroskopobjektträger wird mit etwa 0,03 ml verdünntem Patientenserum versetzt. Die zweiten und dritten Kreise versetzt man in ähnlicher Weise mit 0,03 ml positiven und negativen Wolfs-AN-F-Vergleichsseren. Es ist darauf zu achten, daß die Seren nicht überfüllt werden oder sich vermischen können;5. The first circle of thymocytes on the microscope slide is diluted with approximately 0.03 ml of patient serum offset. Add 0.03 ml positive to the second and third circles in a similar manner and Wolfs AN-F negative control sera. Care must be taken that the sera are not overfilled or can mix;
6. Die Objektträger werden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei man zur Vermeidung einer Verdampfung in feuchter Atmosphäre arbeitet.6. The slides are kept at room temperature for 30 minutes incubated, working in a humid atmosphere to avoid evaporation.
7. Die Objektträger werden in PPS gespült, indem man die Objektträger 5 Minuten lang in PPS-haltige Beizgläser gibt. Die Objektträger werden bewegt, indem man sie in das PPS eintaucht und herausnimmt.7. The slides are rinsed in PPS by placing the slides in PPS-containing pickling glasses for 5 minutes gives. The slides are moved by immersing them in and removing them from the PPS.
8. Unter Verwendung von frischem PPS wird der Waschvorgang wiederholt.8. Using fresh PPS is the washing process repeated.
9.^ Die Objektträger werden aus dem Wasser entnommen, worauf man überschüssige Flüssigkeit abschüttelt und den Rand mit Saugpapier trocknet. 509817/07659. ^ The slides are removed from the water, whereupon excess liquid is shaken off and the edge is dried with absorbent paper. 509817/0765
10. Zu jedem kreisförmigen Belag werden etwa 0,03 ml verdünntes Konjugat gegeben und damit gleichförmig mit einem Applicator über die gesammten Beläge verteilt. 10. Add approximately 0.03 ml to each circular topping given diluted conjugate and thus uniform Spread over the entire topping with an applicator.
11. Die Arbeitsstufen 6, 7, 8, 9 und 10 werden wiederholt. 11. Steps 6, 7, 8, 9 and 10 are repeated.
12. Die Objektträger werden unmittelbar darauf fertiggestellt/ indem man auf jeden Belag einen kleinen Tropfen eines Fixiermediums gibt und dann ein12. The slides are finished immediately afterwards / by putting a small drop of a fixing medium on each topping and then pouring it in
24 χ 50 mm Deckglas auflegt.24 χ 50 mm cover slip is placed.
13. Die Objektträger werden möglichst bald untersucht. Falls eine Verzögerung bei der Auswertung erforderlich ist, hebt man die Objektträger bei 4 0C im Dunklen auf und wertet sie innerhalb von 4 Stunden aus.13. The slides are examined as soon as possible. If a delay in the evaluation is necessary, the slide is kept at 4 ° C. in the dark and evaluated within 4 hours.
14. Die Beläge werden mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Anwendung einer 100-fachen Vergrößerung (schwaches Objektiv) und einer 450-fachen Vergrößerung (starkes Objektiv) untersucht.14. The plaques are examined with a fluorescence microscope using a 100X magnification (weak lens) and a 450-fold magnification (strong lens).
Testverfahren für die hergestellten diagnostiziermittelhaltigen Objektträger unter Verwendung eines DiagnosesatzesTest method for the manufactured diagnostic agent-containing Slides using a diagnostic kit
Wie bereits gesagt, bezieht sich die Erfindung auch auf einen Diagnostiziersatz zur Entdeckung von Humanantinuclearfaktor, der die erfindungsgemäß hergestellten Fötuskälberthymocyten-Objektträger enthält. Ein solcher Diagnostiziersatz bestehtAs already said, the invention also relates to a diagnostic kit for the detection of human anti-nuclear factor, which contains the fetal calf thymocyte slides produced according to the invention. Such a diagnostic kit exists
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kurz aus fötuskälberthymocytenhaltigen Objektträgern, einer Phiole, die Antihumanglobulin enthält, das mit Fluorescein konjungiert ist (lyophilisiertes Hasenantihumanglobulin, konjungiert mit Fluoresceinisothiocyanat), einer phiole, die positives Wolfs-AN-F-Humanbezugsserum enthält, und einer Phiole mit negativem Wolfs-AN-F-Humanbezugsserum. Dieser erfindungsgemäße Testsatz läßt sich wie folgt erläutern:briefly from fetal calf thymocyte-containing slides, one Vial containing anti-human globulin conjugated with fluorescein (lyophilized rabbit anti-human globulin, conjugated with fluorescein isothiocyanate), a vial containing Wolfs AN-F positive human reference serum, and a vial with negative Wolfs AN F human reference serum. This test set according to the invention can be explained as follows:
Der Testsatz aus Fluoreszenzsatzantinuclearfaktor (AN-F) wird für den Immunofluoreszen'ztest zur Entdeckung von Hümanantinuclearfaktoren verwendet, die mit systemischem Lupus erythematosus assoziiert sind. Das Ganze ist in Form eines multiplen Testsatzes verpackt, wobei jeder Satz für 45 Bestimmungen ausreicht.The test kit of fluorescence kit antinuclear factor (AN-F) is used for the immunofluorescence test for the detection of human antinuclear factors associated with systemic lupus erythematosus. The whole thing is in the form of a multiple test set packaged, each set being sufficient for 45 determinations.
Der AN-F-Test beruht auf. dem Prinzip der oben beschriebenen Fluoreszenzantikörpertechnik. Die dabei involierte spezielle Antikörperantigenreaktion besteht in einer Bindung der Serumantinuclearfaktoren an Nuclearkomponenten von Fötuskälberthymocyten. Die Verwendung von Kälberthymocyten als Träger zur Entdeckung von Antinuclearfaktoren ist bereits bekannt.The AN-F test is based on. the principle of the above Fluorescent antibody technology. The special antibody antigen reaction involved consists in binding the serum antinuclear factors on nuclear components of fetal calf thymocytes. The use of calf thymocytes as a carrier for The discovery of antinuclear factors is already known.
Die Aufstriche für die Fötuskälberthymocyten, die der Träger für den fluoreszierenden AN-F-Test sind, werden speziell hergestellt. Unter Verwendung der vorgesehenen Reagentien und Materialien läßt sich der Fluoreszent-AN-F-Test ohne weiteres durchführen, und zwar insbesondere verglichen mit dem Standard-LE-Zellentest. Man kann mit einer verhältnismäßig wohlfeilen Ausrüstung erfolgreich mit den weitverbreiteten Standardmikroskopen arbeiten.The spreads for the fetal calf thymocytes, which are the carrier for the fluorescent AN-F test, are specially made. Using the reagents and materials provided, the fluorescent AN-F test can be easily performed, in particular compared to the standard LE cell test. You can do it with relatively cheap equipment work successfully with the widely used standard microscopes.
15 Mikroskopobjektträger mit jeweils 3 Ringen, die stabilisierte Beläge von Fötuskälberthymocyten enthalten.15 microscope slides with 3 rings each containing stabilized coatings of fetal calf thymocytes.
Eine Quetschphiole - 1 ml AN-F-positives Vergleichsserum (human).A squeeze vial - 1 ml AN-F positive reference serum (human).
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Eine Quetschphiole - 1 ml AN-F-negatives Vergleichsserum (human). A squeeze vial - 1 ml AN-F negative reference serum (human).
Eine Phiole - 1 ml Hasenantihumanglobulin, mit Fluorescein konjugiert und lyophilisiert.One vial - 1 ml rabbit anti-human globulin conjugated with fluorescein and lyophilized.
Erforderliche Ausrüstung und Materialien, die nicht im Diagnostiziersatz vorhanden sindEquipment and Materials Required Not Included in the Diagnostic Kit
1. Fluoreszenzmikroskop1. Fluorescence microscope
2. Deckgläser (24 χ 50 mm).2. Cover glasses (24 50 mm).
3. Beizgläser und Gestelle3. Pickling glasses and racks
4. Saugpapier4. Absorbent paper
5. Pasteurpipette (etwa 0,03 ml fassend)5. Pasteur pipette (about 0.03 ml)
6. Serologische Teströhrchen6. Serological test tubes
7. Mit Phosphat gepufferte Salzlösung (PPS) , siehe Formulierung 7. Phosphate Buffered Saline (PPS), see formulation
8. Glycerin (chemisch rein), siehe Formulierung des Fixiermediums.8. Glycerine (chemically pure), see formulation of the fixing medium.
Die meisten Mikroskope lassen sich für eine Fluoreszenzmikroskopie anpassen. Für den AN-F-Test empfehlen sich folgende Lampen-, Filter- oder Kondensorkombinationen.Most microscopes can be used for fluorescence microscopy adjust. The following lamp, filter or condenser combinations are recommended for the AN-F test.
Lampen- und Filterkombination für den Fluoreszenz-AN-F-Test.Lamp and filter combination for the fluorescence AN-F test.
1. HBO 200 Lampe BG-22 Hitzefilter BG-12 (702) Erregerfilter (3-4 mm Stärke) OG-1 (724) Grenzfilter (orange) Dunkelfeldkondensor1. HBO 200 lamp BG-22 heat filter BG-12 (702) exciter filter (3-4 mm thick) OG-1 (724) border filter (orange) dark field condenser
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2. HBO 200 Lampe *."+·+//«« BG-22 Hitzefilter2. HBO 200 lamp *. "+ · + //« « BG-22 heat filter
BG-38 Erregerfilter BG-12 (702) Erregerfilter (3 - 4 mm Stärke) OG-1 (724) Grenzfilter (orange) HellfeldkondensorBG-38 exciter filter BG-12 (702) exciter filter (3 - 4 mm thick) OG-1 (724) border filter (orange) bright field condenser
3. HBO 200 Lampe BG-22 Hitzefilter UG-1 Erregerfilter (2 oder 4 mm Stärke) OG-1 (724) Grenzfilter (orange) Dunkelfeldkondensor3. HBO 200 lamp BG-22 heat filter UG-1 exciter filter (2 or 4 mm thick) OG-1 (724) border filter (orange) dark field condenser
4. HBO 200 Lampe BG-22 Hitzefilter BG-38 Erregerfilter OG-1 (724) Grenzfilter (orange) UG-1 Erregerfilter (2 oder 4 mm Stärke) Helifeldkondensor4. HBO 200 lamp BG-22 heat filter BG-38 exciter filter OG-1 (724) border filter (orange) UG-1 exciter filter (2 or 4 mm thick) helifield condenser
5. HBO 200 Lampe BG-22 Hitzefilter BG-12 (702) Erregerfilter (3-4 mm Stärke) Corning 5840 (693) Erregerfilter (2 mm Stärke) GG-9 (723) Grenzfilter Dunkelfeld- oder Hellfeldkondensor5. HBO 200 lamp BG-22 heat filter BG-12 (702) exciter filter (3-4 mm thick) Corning 5840 (693) exciter filter (2 mm thick) GG-9 (723) limit filter darkfield or brightfield condenser
6. Quartzjodidlampe6. Quartz iodide lamp
BG-12 (702) Erregerfilter Corning 5113 (695) Erregerfilter Grenzfilter HellfeldkondensorBG-12 (702) exciter filter Corning 5113 (695) exciter filter Boundary filter bright field condenser
7. Wolframfadenlampe 6 oder 12V bei Maximalspannung7. Tungsten filament lamp 6 or 12V at maximum voltage
(Rheostat)(Rheostat)
BG-12 (702) Erregerfilter (4 mm Stärke) OG-1 (724) Grenzfilter oder Kodakfilter No.BG-12 (702) Excitation filter (4 mm thick) OG-1 (724) Boundary filter or Kodak filter No.
oder 16, Gelatinefolie vor dem Augenstück angeordnet Hellfeldkondensoror 16, gelatin sheet placed in front of the eye piece Bright field condenser
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24A770024A7700
Gebrauchsanweisung für den Diagnostiziersatz ProbeInstructions for use for the diagnostic kit sample
1. Man sammelt die Blutproben aseptisch, wobei man eine Hämolyse vermeidet, und läßt sie zusammenklumpen. Das Serum sollte entfernt und im Kühlschrank aufgehoben oder eingefroren werden, falls man den Test nicht sofort durchführt.1. Aseptically collect the blood samples using a Avoids hemolysis and makes them clump together. The serum should be removed and stored in the refrigerator or frozen if the test is not performed immediately.
2. Die Seren oder Vergleiche dürfen nicht durch Erwärmen inaktiviert werden.2. The sera or comparisons must not be inactivated by heating.
Verfahrenprocedure
1. Lyophilisiertes Antihumanglobulin wird mit 1 ml destilliertem Wasser wieder hergestellt.1. Lyophilized anti-human globulin is reconstituted with 1 ml of distilled water.
2. Das wieder hergestellte Antihumanglobulin verdünnt man mit mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PPS) .2. The reconstituted anti-human globulin is diluted with phosphate-buffered saline (PPS).
Die phosphatgepufferte Salzlösung (PPS) hat einen pH-Wert von 7,1 - 0,1 und folgende Zusammensetzung:The phosphate-buffered saline solution (PPS) has a pH value of 7.1 - 0.1 and the following composition:
NaCl 5,7 gNaCl 5.7 g
Na2HPO4 5,11 gNa 2 HPO 4 5.11 g
NaH3PO4.H2O 1,93 gNaH 3 PO 4 .H 2 O 1.93 g
destilliertes Wasser 1000 mldistilled water 1000 ml
Mehrere Liter hiervon lassen sich herstellen und bei 4 C aufbewahren. Der pH-Wert eines jeden Ansatzes von PPS wird bestimmt. Liegt der pH-Wert über oder unter dem Wert von 7,1 - 0,1, dann erfolgt Einstellung mit normalem Natriumhydroxid oder mit normaler Salzsäure. Die optimale Konzentration eines jeden Ansatzes an Konjugat wird vorher bestimmt und auf dem Etikett ver-Several liters of this can be produced and stored at 4 ° C. The pH of each batch of PPS is determined. If the pH value is above or below the value 7.1 - 0.1, then the setting is made with normal sodium hydroxide or with normal hydrochloric acid. The optimal concentration of each approach Conjugate is determined beforehand and written on the label
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2U77Q02U77Q0
merkt. Das verdünnte Konjugat wird in kleinen Mengen freigesetzt und zum Lagern gefroren. Nachdem die Bedingungenn von einem Labor zum anderen schwanken, erscheint eine Bestimmung der optimalen Arbeitsverdünnung für jeden Ansatz an Antihumanglobulin wünschenswert. Dies wird erreicht, indem man Reihenverdünnungen des Antihumanglobulins in PPS gegen die AN-F-positiven und negativen Vergleichsseren testet. Die optimale Arbeitslösung ist diejenige Verdünnung, die mit dem positiven Vergleichsserum maximale Fluoreszenz und mit dem negativen Vergleichsserum minimale Fluoreszenz ergibt. Das wiederhergestellte und verdünnte Konjugat sollte bei Raumtemperatur nicht längere Zeit stehengelassen oder Licht ausgesetzt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden.notices. The diluted conjugate is used in small amounts released and frozen for storage. After the conditions fluctuate from one laboratory to another, appears a determination of the optimal working dilution for each batch of antihuman globulin is desirable. This is achieved by making serial dilutions of the anti-human globulin in PPS against the AN-F positive and negative comparison sera tests. The optimal working solution is the dilution that with the positive reference serum maximum fluorescence and with the negative reference serum minimal fluorescence results. The reconstituted and diluted conjugate should not be kept at room temperature for long periods of time left standing or exposed to light. Repeated freezing and thawing should be avoided.
Vom Serum des Patienten in PPS stellt man eine 1:10 Verdünnung her. Man muß darauf achten, daß bei jedem Versuch gleichzeitig positive und negative Vergleiche durchgeführt werden. Die Vergleichsseren dürfen nicht verdünnt werden.A 1:10 dilution is made from the patient's serum in PPS. One must take care that with each Attempt to carry out positive and negative comparisons at the same time. The comparison sera must not be diluted.
Ein Tropfen (etwa 0,03 ml) verdünntes Patientenserum wird zum ersten Kreis des AN-F-Mikroskopobjektträgers gegeben. In ähnlicher Weise setzt man einen Tropfen an positiven und negativen AN-F-Vergleichsseren zu den zweiten und dritten Kreisen zu. Es ist darauf zu achten, daß die Seren nicht überfüllt oder vermischt werden. Erforderlichenfalls kann ein tieferer Graben gebildet werden, indem man die Peripherie eines jeden Kreises mit einer Weichwachskreide markiert.One drop (approximately 0.03 ml) of diluted patient serum becomes the first circle on the AN-F microscope slide given. Similarly, add a drop of positive and negative AN-F comparison sera to the second and third circles too. Care should be taken not to overfill or mix the sera. If necessary, a deeper trench can be formed by cutting the periphery of each circle marked with a soft wax chalk.
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5. Die Objektträger werden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und zwar zur Verhinderung einer Verdampfung in feuchter Atmosphäre.5. Incubate slides for 30 minutes at room temperature to prevent evaporation in a humid atmosphere.
6. Die Objektträger werden in PPS gespült, indem man sie 5 Minuten in eine PPS-haltige Ständerschale gibt. Die Objektträger werden bewegt, indem man sie in das PPS eintaucht und wieder herausnimmt.6. The slides are rinsed in PPS by placing them in a stand dish containing PPS for 5 minutes. the Slides are moved by immersing them in the PPS and removing them again.
7. . Unter Verwendung von frischem PPS wird der Spülvorgang zweimal wiederholt (Gesamtspülzeit =15 Minuten).7.. Using fresh PPS, the rinsing process is repeated twice (total rinsing time = 15 minutes).
8. Die Objektträger werden aus dem Puffer entnommen, von überschüssiger Flüssigkeit freigeschüttelt und an ihrem Rand mit Saugpapier getrocknet.8. The slides are removed from the buffer, shaken free of excess liquid and put on their edge dried with absorbent paper.
9. Jeder Kreis des Objektträgers wird dann mit einem Tropfen (etwa 0,03 ml) verdünntem Konjugat versetzt, worauf man das Ganze verschmiert und gleichförmig mit einem Applicator besprüht, wodurch der ganze Belag bedeckt wird.9. One drop (approximately 0.03 ml) of diluted conjugate is then added to each circle of the slide, whereupon the whole thing is smeared and sprayed evenly with an applicator, making the whole thing Covering is covered.
10. Die Arbeitsstufen 5,6,7 und 8 werden wiederholt.10. Steps 5,6,7 and 8 are repeated.
11. Die Objektträger werden sofort fixiert, indem man auf jeden Belag einen kleinen Tropfen Fixiermedium gibt und dann ein 24 χ 50 mm großes Deckglas auflegt.11. The slides are fixed immediately by placing a small drop of fixing medium on each surface and then a 24 χ 50 mm cover slip is placed on top.
Ein Teil PPS, pH 7,1, puls 9 Teile Glycerin (chemisch rein)One part PPS, pH 7.1, puls 9 parts glycerine (chemically pure)
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12. Die Objektträger werden möglichst bald untersucht. Falls eine Verzögerung der Auswertung nötig ist, dann werden die Objektträger bei 4 0C im Dunkeln aufbewahrt und innerhalb von 4 Stunden ausgewertet.12. The slides are examined as soon as possible. If the evaluation needs to be delayed, the slides are stored in the dark at 4 ° C. and evaluated within 4 hours.
13. Die Beläge auf den Objektträgern werden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrößerung (schwaches Objektiv) und bei 440-facher Vergrößerung (starkes Objektiv) geprüft.13. The coverings on the slides are covered with a Fluorescence microscope at 100-fold magnification (weak objective) and 440-fold magnification (strong lens) checked.
1. Positive LE-Seren können verschiedene Fluoreszenzmuster zeigen. Eine homogene oder diffuse Nuclarfärbung sowie eine peripherische oder zottelhaarige Nuclearfärbung sind am häufigsten. Die letztere läßt sich im allgemeinen nur bei stark reaktionsfähigen Seren feststellen.1. Positive LE sera can show different fluorescence patterns demonstrate. A homogeneous or diffuse nucleus color as well as a peripheral or shaggy hair Nuclear stains are most common. The latter can generally only be used with highly reactive Identify serums.
2. Das Ausmaß der Fluoreszenz bestimmt man mit dem Auge, und die Helligkeit im Vergleich zu den negativen und positiven Vergleichen wird nach folgender einfacher Skala beurteilt:2. The extent of fluorescence is determined by eye, and the brightness compared to the negative and positive comparisons are assessed on the following simple scale:
negativ (unter Einschluß von - und Spuren) + gerade sichtbare Fluoreszenz ++ eindeutige Fluoreszenz +++ leuchtende Fluoreszenznegative (including - and traces) + just visible fluorescence ++ clear fluorescence +++ luminous fluorescence
3. Patienten mit rheumatischer Arthritis, Sklerodermie, Dermatomyositis und einer Reihe Gewebeerkrankungszuständen können AN-F-positiv sein, und zwar normalerweise bei niederen Titern und niedriger Frequenz.3. Patients with rheumatoid arthritis, scleroderma, Dermatomyositis and a variety of tissue disease conditions can be AN-F positive, usually at low titers and low frequency.
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Ein Anfangstest bei einer 1:10-Verdünnung vermeidet eine große Anzahl nicht spezifischer Reaktionen und ergibt einen aussagekräftigen Wert über die Empfindlichkeit und Spezifizität des Tests.Avoid an initial test at a 1:10 dilution a large number of non-specific reactions and gives a meaningful value about the sensitivity and specificity of the test.
Es empfiehlt sich die Patienten mit positivem AN-F-Test bei der Verdünnung von 1:10 erneut zu testen und auszuwerten. Stark positive Reaktionen mit AN-F-Titern von über 1:80 bis 1:1:160 beobachtet man oft bei Patienten mit klinisch identifizierbarem SLE. Hohe AN-F-Titer deuten daher stark auf SLE hin und können mit der Aktivität der Erkrankung korrelieren. Zu beachten ist jedoch, daß ein starker positiver AN-F-Test die Diagnose von SLE nicht bestätigt. Für die Prognose und Behandlung von SLE-Patienten sind daher weitere Klinik- und Laborergebnisse erforderlich.It is advisable to retest the patients with a positive AN-F test at the dilution of 1:10 and to evaluate. Strongly positive reactions with AN-F titers of over 1:80 to 1: 1: 160 are often observed in Patients with clinically identifiable SLE. High AN-F titers therefore strongly suggest SLE and can correlate with the activity of the disease. Note, however, that a strong positive AN-F test the diagnosis of SLE not confirmed. For the prognosis and treatment of SLE patients are therefore further clinical and laboratory results required.
5. Ein negativer AN-F-Test bei der Serumkonzentration von 1:10 schließt dagegen wirklich eine Diagnose von SLE aus, da der Fluoreszenz-AN-F-Test bei über 99 % der Patienten mit SLE positiv ist. Einen Wiederholungstest mit einer frischen Probe ist 7 bis 10 Tage später jedoch günstig, und zwar insbesondere bei Patienten, die sich in einem frühen Krankheitszustand, in Remission oder auf Steroidtherapie befinden.5. A negative AN-F test at a serum concentration of 1:10, on the other hand, really does conclude a diagnosis of SLE because the fluorescence AN-F test is positive in over 99% of patients with SLE. A repeat test however, using a fresh sample 7-10 days later is beneficial, especially in patients who himself in an early stage of the disease, in remission or are on steroid therapy.
Klinische und labormäßige Beurteilung des Fluoreszenzantinuclearfaktorreagens zur Diagnose von systemischem Lupus erythematosusClinical and laboratory evaluation of the fluorescent antinuclear factor reagent for the diagnosis of systemic lupus erythematosus
Das erfindungsgemäße Fluoreszenzantinuclearfaktorreagens wurde bereits chemisch und labormäßig beurteilt.The fluorescent antinuclear factor reagent according to the invention has already been assessed chemically and in a laboratory.
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PatientenPatient
Die Beurteilung erfolgt anhand der Seren von 145 Patienten, von denen 22 klinisch aktiven systemischen Lupus erythematosus haben, 21 klinisch inaktiven systemischen Lupus erythematosus besitzen, 6 über Bindegewebeerkrankungen verfügen und 96 zum Vergleich dienen (unter Einschluß normaler Vergleiche sowie Krankenhausvergleiche und anderer Krankheitszustände, wie sie in Tabelle II angegeben sind).The assessment is based on the sera of 145 patients, of which 22 clinically active systemic lupus erythematosus have, 21 have clinically inactive systemic lupus erythematosus, 6 have connective tissue diseases and 96 for Serve comparison (including normal comparisons as well as Hospital comparisons and other disease states as indicated in Table II).
Mit diesen 145 Patienten werden Vergleiche mit folgenden Zubereitungen durchgeführt: (1) LE-Zellenpräparationsstandard-Test (Test A), (2) der DNP-Latex-Reagens-Test (Test B), (3) Test mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzantinuclearfaktor (100 Patienten) und (4) Test mit einem weiteren Fluoreszenzantinuclearfaktor (Test C) .With these 145 patients, comparisons are made with the following preparations performed: (1) LE cell preparation standard test (Test A), (2) the DNP latex reagent test (Test B), (3) test with the fluorescent antinuclear factor according to the invention (100 patients) and (4) test with another fluorescent antinuclear factor (Test C).
Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt. Die Titrationswerte für den erfindungsgemäßen Test mit dem Fluoreszenzantinuclearfaktor und den Test mit dem DNP-Latex-Reagens (Test B) sind darüberhinaus in Tabelle III angegeben.The results obtained are summarized in Tables I and II. The titration values for the inventive The fluorescent antinuclear factor test and the DNP latex reagent test (test B) are also shown in Table III specified.
Man erhält durchwegs übereinstimmende Ergebnisse zwischen dem Test mit dem DNP-Latex-Reagens (Test B) und dem Test A, nämlich 82 % gegenüber 86 % positiven Ergebnissen für klinisch aktive. Fälle, 19 % gegenüber 19 % positiven Ergebnissen für klinisch inaktive Fälle, 100 % gegenüber 83 % negativen Ergebnissen für Fälle mit Bindegewebserkrankungen (was für eine etwas höhereConsistent results are obtained between the Test with the DNP latex reagent (test B) and test A, namely 82% versus 86% positive results for clinically active. Cases, 19% versus 19% positive results for clinically inactive cases, 100% versus 83% negative results for Cases of connective tissue disease (what a slightly higher
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Spezifizität des Tests rait dem DNP-Latex-Reagens spricht) und 99% gegenüber 99 % negativen Ergebnissen für die Vergleichspatienten. Der empfindlichere Test C und der erfindungsgemäße Test mit dem Fluoreszenzantinuclearfaktor zeigen eine größere Spezifizität für die erfindungsgemäße Zubereitung als für die Testszubereitung C,'nämlich 89 % gegenüber 82 % positiven Ergebnissen für klinisch aktive Fälle, 58 % gegenüber 71 % . positiven Ergebnissen für klinisch inaktive Fälle, 67 % gegenüber 50 % negativen Ergebnissen für Fälle mit Bindegewebserkrankungen und 100 % gegenüber 94 % negativen Ergebnissen für Vergleichspatienten. Sowohl der Test C als auch der erfindungsgemäße Test sind reaktiver und weniger spezifisch als das DNP-Latex-Reagens (Test B) und der Test A.Specificity of the test rait the DNP latex reagent speaks) and 99% versus 99% negative results for the comparator patients. The more sensitive test C and the test according to the invention with the fluorescence antinuclear factor show a greater specificity for the preparation according to the invention than for test preparation C, namely 89% versus 82% positive results for clinically active cases, 58% versus 71%. positive results for clinically inactive cases, 67 % versus 50% negative results for cases with connective tissue disease, and 100% versus 94% negative results for comparator patients. Both test C and the test of the invention are more reactive and less specific than the DNP latex reagent (test B) and test A.
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Summe der Auswertung der Fluoreszenzantinuclearfaktortests und des DNP-Latextests bei der '- Labordiagnose von systemischem Lupus erythematosus Total evaluation of fluorescence Antinuclear factor test and the DNP-latex tests at '- laboratory diagnosis of systemic lupus erythematosus
Krankheitszustand Disease state
Test mit einer LE-Zellenpräpa-Test with an LE cell preparation
rationration
Test ATest A
Positive ReaktorenPositive reactors
Test B Test CTest B Test C
Test mit dem erfindungsgemäßen Pluoreszenzantinuclearfaktor Test with the fluorescent antinuclear factor according to the invention
cn
ο
cocn
ο
co
klinsch aktiver Lupusclinically active lupus
klinisch inaktiver Lupusclinically inactive lupus
zusammenhängende Bindegewebeer- krankungrelated connective tissue disease
Vergleichcomparison
19/22 (86%)19/22 (86%)
4/21 (19%)4/21 (19%)
1/61/6
(17%)(17%)
18/22 (82%)18/22 (82%)
4/21 (19%)4/21 (19%)
0/6 ( 0%) 18/22 (82%) 15/21 (71%)0/6 (0%) 18/22 (82%) 15/21 (71%)
3/6 (50%)3/6 (50%)
17/1917/19
11/1911/19
2/62/6
TotalTotal
h++/96h ++ / 96
25/145 (17%)25/145 (17%)
23/145 (16%) 6/96 ( 6%) 23/145 (16%) 6/96 (6%)
42/145 (29%)42/145 (29%)
0/560/56
30/10030/100
Normale sowie Krankenhausvergleichsseren und andere Krankheitszustände gemäß Aufstellung in Tabelle III.Normal as well as hospital reference sera and other disease states according to the list in table III.
Durch Procainamid induziertes SLE Syndrom· (89%)Procainamide induced SLE syndrome (89%)
(58%)(58%)
(33%)(33%)
(30%)(30%)
IIII
Summe der Auswertung der Fluoreszenzantinuclearfaktortests und des DNP-Latextests bei derSum of the evaluation of the fluorescence antinuclear factor tests and the DNP latex test in the
Labordiagnose von systemischem Lupus erythematosus Laboratory diagnosis of systemic lupus erythematosus
CTl CJ CD OOCTl CJ CD OO
O -j CDO -j CD
untersuch
ten Serennumber of
investigation
ten serums
LE-Zellenprä-
paration
Test ATest with a
LE cell pre-
paration
Test A
zenz-AN-F
Test CTest with fluorescent
zenz-AN-F
Test C.
gemäßer
Testinvention
more appropriate
test
aktiv)SLE (clinical
active)
inaktiv)a SLE (clinical
inactive) a
erkrankung :Connective tissue
illness :
rheumatische
Arthritis
SklerodermiePolyarthritis
rheumatic
arthritis
Scleroderma
21
2
2
22
2
2
heitszustände:other sick
state of health:
21
2
2
1 11 1
2
1 1
Candida
SeptikämiaAnemia
Candida
Septicemia
16th
1
16th
1
16 ·
1
16th
1
16th
1
(Plasmazellen)Dyscrasia
(Plasma cells)
MononucleosisInfectious
Mononucleosis
K)1
K)
Tabelle II (Forts.) Table II (cont.)
cn ο co cocn ο co co
Summe der Auswertung der Fluoreszenzantinuclearfaktortests und des DNP-Latextests bei derSum of the evaluation of the fluorescence antinuclear factor tests and the DNP latex test in the
Labordiagnose von systemischem, Lupus erythematosusLaboratory diagnosis of systemic, lupus erythematosus
untersuch
ten Serennumber of
investigation
ten serums
LE-Zellenprä-
paration
Test ATest with a
LE cell pre-
paration
Test A
zenz -AN-F
Test GTest with fluores
zenz -AN-F
Test G
gemäßer
Testinvention
more appropriate
test
Herzleidenrheumatic
Heart condition
phlebitisThrombo
phlebitis
Krankenhaus-
vergleiehenormal and
Hospital-
compare
Kriterien für einen positiven Fluoreszenzantinuclearfaktortest sind positive Seren bei Verdünnungen von 1:10 oder darüber.Criteria for a positive fluorescent antinuclear factor test are positive Sera at dilutions of 1:10 or above.
aKlinisch aktiver systemischer Lupus erythematosus/ der den Kriterien von Siegel et al entspricht (kein Fieber, keine aktive Arthfiitis und keine Anzeichen sonstiger akuter Entzündungen) a Clinically active systemic lupus erythematosus / which meets the criteria of Siegel et al (no fever, no active arthritis and no signs of other acute inflammation)
Durch Procainamid induziertes SLE-Syndrom. 'Drei Seren wurden nicht untersucht. Zwei Seren wurden nicht untersucht.Procainamide induced SLE syndrome. 'Three sera were not examined. Two sera were not examined.
K3K3
-J-J
CD CDCD CD
cn ο co oocn ο co oo
Zusammenfassung der SLE-Serumantikörpertiter/ die man nach dem Test mit dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzantinuclearfaktor und dem Test mit DNP-Latex-Reagens erhältSummary of the SLE serum antibody titers / which one after the test with the inventive Fluorescent antinuclear factor and the DNP latex reagent test
untersuch
ten Serennumber of
investigation
ten serums
Latex-Test
1:1-1:10 20-80 1Serum titre at
Latex test
1: 1-1: 10 20-80 1
60-320 320SLE-DNP-
60-320 320
untersuch
ten Serennumber of
investigation
ten serums
AN-F-Test
1:1-1:10 20-80 160-320 320Serum titre at fluorescence
AN-F test
1: 1-1: 10 20-80 160-320 320
aktivSLE clinical
active
inaktivSLE clinical
inactive
vergleichconnective tissue
comparison
Krankenhausver
gleichsseren unc
andere in TabelJ
II zusammenge
faßte Krankheits
zuständenormal and
Hospital
the same unc
others in TabelJ
II together
grasped illness
conditions
Le
j-I.
Le
j-
Durch Procainamid induziertes SLE-SyndromProcainamide induced SLE syndrome
Aufgrund obiger klinischer und labormäßiger Beurteilung läßt sich folgendes schließen:Based on the above clinical and laboratory assessment, the following can be concluded:
1. Bei 22 Patienten mit klinisch aktivem systemischem Lupus erythematosus erhält man positive Ergebnisse in 82 bis 89 % bei allen Tests, nämlich 82 beim Test mit DNP-Latex-Reagens (Test B), 89 % beim erfindungsgemäßen Test mit dem Fluoreszenzantinüclearfaktor, 82 % beim Test C und 86 beim Test A.1. In 22 patients with clinically active systemic lupus erythematosus positive results are obtained in 82 to 89% of all tests, namely 82 in the test with DNP latex reagent (Test B), 89% in the test according to the invention with the fluorescence antinuclear factor, 82% in test C and 86 in test A.
2. 21 Patienten mit klinisch inaktivem systemischem Lupuserythematosus ergeben sowohl beim Test A als auch beim Test mit DNP-Latex-Reagens (Test B) zu 81 % negative Ergebnisse. Der erfindungsgemäße Test und der Test C, die stärker reaktionsfähig sind, ergeben für die erfindungsgemäße Testzubereitung bzw. für die Testzubereitung C negative Werte bei 42 % bzw. 29 %. Der erfindungsgemäße Test ist daher spezifischer.2. 21 patients with clinically inactive systemic lupus erythematosus give 81% negative for both test A and the DNP latex reagent test (test B) Results. The test according to the invention and test C, which are more reactive result for the test preparation according to the invention or for the test preparation C negative values at 42% and 29%, respectively. The inventive Test is therefore more specific.
3. 6 Patienten mit Bindegewebserkrankungen ergeben beim Test A bzw. beim Test mit DNP-Latex-Reagens (Test B) 83 % bzw. 1OO % negative Ergebnisse. Der letztgenannte Test ist daher spezifischer. Der reaktivere erfindungsgemäße Test und der Test C ergeben für den erfindungsgemäßen Test und für den Test C negative Werte zu 67 % und 50 %. Der erfindungsgemäße Test ist daher spezifischer.3. 6 patients with connective tissue diseases give test A or test with DNP latex reagent (test B) 83% and 100% negative results, respectively. The latter test is therefore more specific. The more reactive according to the invention Test and test C give negative values for the test according to the invention and for test C. 67% and 50%. The test of the invention is therefore more specific.
4. 96 normale Patienten und Krankenhausvergleichspatienten sind beim Test A und beim Test mit dem DNP-Latex-Reagens zu 99 % negativ. Der reaktivere erfindungsgemäße Test und der Test C ergeben für die erfindungsgemäße Testzubereitung (56 Fälle) und die Testzubereitung Test C (96 Fälle) Werte von 100 % bzw. 94 %. Der erfindungsgemäße Test ist daher spezifischer.4. 96 normal patients and hospital comparator patients are in test A and in the test with the DNP latex reagent 99% negative. The more reactive test according to the invention and test C result for the test preparation according to the invention (56 cases) and the test preparation Test C (96 cases) values of 100% and 94%, respectively. The inventive Test is therefore more specific.
50981 7/076550981 7/0765
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