DE2446099C3

DE2446099C3 - Method for the quantitative determination of uric acid

Info

Publication number: DE2446099C3
Application number: DE19742446099
Authority: DE
Inventors: Paul Dr. Basel Hunziker (Schweiz)
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1973-10-19
Filing date: 1974-09-26
Publication date: 1977-05-05

Description

Es besteht seit langer Zeit das Bedürfnis für eine spezifische quantitative Methode ?ur Bestimmung von Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Urin, Blut bzw. Serum oder Plasma, die spezifisch ist, nur eine kleine Menge an Untersuchungsmaterial benötigt, billig genug ist, um Massenuntersuchungen zu ermöglichen, keine besondere technische Ausbildung verlangt, und somit für die klinische Verwendung gut geeignet ist. Zusätzlich wird als besonders wünschenswert betrachtet, daß eine derartige Methode sich für ein automatisches System, das mit kontinuierlicher Probenstromung arbeitet, eignet, so daß eine große Anzahl Proben hesteht ein Bedürfnis für ein automatisches ; welches mit kontinuierlicher Probenstromung arbeitet und bei der diagnostischen Untersuchung von ene größen Anzahl Menschen auf die Anwesenheit ,,hnlnmschen Mengen an Harnsaure m ihrem BlutThere has long been a need for a specific quantitative method for determining Uric acid in biological fluids, such as B. urine, blood or serum or plasma, which is specific, only one small amount of test material required, cheap enough to allow mass testing, does not require any special technical training and is therefore well suited for clinical use. In addition, it is considered particularly desirable that such a method should be automatic System that works with continuous sample flow is suitable, so that a large number of samples there is a need for an automatic; which with continuous sample flow works and in the diagnostic examination of a large number of people for the presence ,, Insufficient amounts of uric acid in their blood

SSS⁸SSn^ fietot- ^Di^e "^arnsir ^si¹¹ SSS ⁸ SSn ^ fietot- ^D i ^e " ^arns ir ^s i ¹¹

beim Menschen das Endprodukt des Punnabbaus dar und wird deshalb physiologischerweise im Blut aufgefunden Bei zahlreichen Erkrankungen kommt es zu 2er Erhöhung bzw. Erniedrigung der Harnsaure-Kon-Tentrat on, so daß das Feststellen einer Abweichung vom physiologischen Harnsäuresp.egel im Blut ein _IS äußerst wichtiger diagnostischer Hinweis fur den Arzt ^1StSo werden z.B. bei folgenden Erkrankungen Erhöhungen der Harnsäure-Konzentration gefunden: Gicht, sSere Pneumonien mit ausgedehnten Gewebszersto-in humans is the end product of Punnabbaus and is therefore physiologically found in the blood For many diseases are the uric acid-Kon-Tentrat comes to 2er increase or decrease on so that the detection of a deviation from the physiological Harnsäuresp.egel in the blood an _IS extremely important ^{diagnostic information} for the doctor 1h For example, increases in the uric acid concentration are found in the following diseases: gout, severe pneumonia with extensive tissue destruction

rungen, Leukämie, Perniciosa; eine Erniedrigung wird ζ B bei der toxischen Schädigung der Nierentubuh bei der Wilson-Erkrankung gefunden.lungs, leukemia, pernicious anemia; becomes a humiliation ζ B contributes to the toxic damage to the renal tube of Wilson disease found.

Die bekannten Methoden zur Bestimmung von Harnsäure können im weiteren Sinn in enzymatisch*The known methods for the determination of uric acid can in a broader sense in enzymatic *

,« Methoden, Methoden, worin ein Alkalimetallsalz von Phosphorwolframsäure verwendet wird und verschiedene chemische kolorimetrische Methoden eingeteilt werden. Die enzymatischen Methoden worin das Enzvm Uricase verwendet wird, haben den Nachteil,, «Methods, methods in which an alkali metal salt of Phosphotungstic acid is used and various chemical colorimetric methods can be classified. The enzymatic methods in which the Enzvm Uricase used have the disadvantage

» daß die Messung im U.V.-Gebiet durchgeführt wird, wodurch mit teuren Quarzküvetten und mit einem Spektralphotometer gearbeitet werden muß. In der Methode, worin ein Alkalimetallsalz der Phosphorwolframsäure Verwendung findet wird zwar im sichtbaren»That the measurement is carried out in the U.V. area, which means that with expensive quartz cuvettes and with a Spectrophotometer must be worked. In the Method in which an alkali metal salt of phosphotungstic acid is used is in the visible

Bereich gemessen, jedoch hat diese Methode den Nachteil daß andere reduzierend wirkende Komponenten mite'rfeßt werden, vas zu hohe und damit falsche Meßwerte ergibt.
Vor kurzem wurde von G. F. Domagk undMeasured range, however, this method has the disadvantage that other reducing components are also measured, which results in too high and thus incorrect measured values.
Recently GF Domagk and

H H Schlicke in Analytical Biochemistry 22, 219- 224 (1968), eine besonders interessante Methode zur enzymatischen Bestimmung von Harnsäure beschrieben welche den Vorteil der spezifischen enzymatischen Bestimmung mit dem Vorteil der Meßmöglich-H H Schlicke in Analytical Biochemistry 22, 219-224 (1968), a particularly interesting method for the enzymatic determination of uric acid described which the advantage of the specific enzymatic Determination with the advantage of measuring

4< keil im sichtbaren Bereich kombiniert. Gemäß dieser Methode wird in einem ersten Schritt Harnsäure mit Uricase in Allantoin und Wasserstoffperoxid umgewandelt. 4 <wedge combined in the visible area. According to this In a first step, uric acid is converted into allantoin and hydrogen peroxide using Uricase.

H-NH-N

Uricase _t H₂N + 2H₂O f- O₂ Uricase _t H ₂ N + 2H ₂ O f- O ₂

\=O + CO₂ -f H₂O₂ \ = O + CO ₂ -f H ₂ O ₂

Harnsäureuric acid

Anschließend wird eine Indikatorreaktion angekop- 6o Leucoform vorliegendes Chromogen /um Farbstoff pelt, wobei das entstandene Wasserstoffperoxid unter oxidiert. Als Chromogen wird o-Dianisidin erwähnt, katalytischer Einwirkung von Peroxidase ein in derAn indicator reaction is then coupled to the chromogen / dye present in leuco form, with the resulting hydrogen peroxide being oxidized. As a chromogen, o-dianisidine is mentioned, a catalytic action of peroxidase in the

OCH₁ OCH ₁

OCH, OCH,OCH, OCH,

H, O₂ + H₂NH, O ₂ + H ₂ N

2H,O2H, O

Einer der Nachteile dieser Methode ist jedoch der zeitraubende Enteiweißungsschritt vor der eigentlichen Durchführung der Bestimmung. Diese Methode ist für manuelles Vorgehen beschrieben und eignet sich gemäß den Ausführungen von D. S u s i c und P. Scheibe in Z. Anal. Chem.257, 130-132 (1971), nicht für eine Automatisierung.However, one of the disadvantages of this method is the time-consuming deproteinization step before the actual one Execution of the determination. This method is described for a manual procedure and is suitable according to the remarks by D. S u s i c and P. Scheibe in Z. Anal. Chem. 257, 130-132 (1971), not for automation.

In dieser Publikation von S u s i c et al, in welcher die Verwendung von ABTS [Ammoniumsalz von 2,2'Azino-di-(3-ät(iyl-benzthiazolinsulphonsäure-6)] als Chromogen in einer automatisierten Harnsäurebestimmung beschrieben ist, wird hervorgehoben, daß o-Dianisidin sich für den gleichen Zweck wie ABTS nicht eignet, da dessen Empfindlichkeit zu gering ist.In this publication by S u s i c et al, in which the use of ABTS [ammonium salt of 2,2'Azino-di- (3-ät (iyl-benzthiazolinesulphonic acid-6)] as a chromogen in an automated uric acid determination it is emphasized that o-dianisidine is unsuitable for the same purpose as ABTS, since whose sensitivity is too low.

Es wurde nun gefunden, daß ein unsubstituiertes oder kernsubstituiertes Benzidin oder Diphenylin, wie beispielsweise o-Dianisidin, trotzdem mit Erfolg als Chromogen in einer automatisierten Methode zur Bestimmung der Harnsäure verwendet werden kann und diese Methode mit genügender Empfindlichkeit, sehr hoher Genauigkeit und großem Linearitätsbereich arbeitet.It has now been found that an unsubstituted or ring-substituted benzidine or diphenylin, such as o-Dianisidine, nevertheless with success as a chromogen in an automated method for Determination of uric acid can be used and this method with sufficient sensitivity, very high accuracy and large linearity range.

Weiter wurde festgestellt, daß eine automatisierte Methode zur Harnsäurebestimmung, worin o-Dianisidin als Chromogen eingesetzt wird, im Gegensatz zu einer entsprechenden Methode, worin ABTS als Chromogen verwendet wird, eine geringe Störanfälligkeit aufweist und sich für Routineuntersuchungen eignet.It was also found that an automated method for uric acid determination in which o-dianisidine is used as the chromogen, in contrast to a corresponding method in which ABTS is used as the chromogen is used, has a low susceptibility to failure and is suitable for routine examinations.

Demnach betrifft die vorliegende Erfindung eine Me'hode zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure in biologischen Flüssigkeiten, worin man in kontinuierlicher Strömung die folgenden Schritte nacheinander durchführt,Accordingly, the present invention relates to a method for the quantitative determination of uric acid in biological fluids, in which the following steps are carried out in a continuous flow performs,

a) in kontinuierlicher Strömung wird eine bestimmte Menge an Probe mit einer Verdünnungslösung gemischt,a) in continuous flow is a certain amount of sample with a diluting solution mixed,

b) diese Mischung wird durch einen Dialysator geleitet, dabei wird eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung abgetrennt,b) this mixture is passed through a dialyzer, which becomes a clear aqueous solution separated from this mixture,

c) diese klare wäßrige Lösung wird mit einer gepufferten Uricaselösung mit einem pH-Wert zwischen 8,5 und 10 gemischt,c) this clear aqueous solution is mixed with a buffered uricase solution with a pH value between 8.5 and 10 mixed,

d) die gemäß Schritt c) erhaltene wässerige Lösung wird inkubiert,d) the aqueous solution obtained according to step c) is incubated,

e) das Reaktionsgemisch wird bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 mit einem Chromogen und Peroxidase gemischt und dadurch eine gefärbte Lösung erzeugt,e) the reaction mixture is at a pH between 5.5 and 8.5 with a chromogen and Mixed peroxidase to create a colored solution,

f) diese gefärbte Lösung wird durch eine Durchflußküvette geleitet und der in der Probe vorhandene Harnsäuregehalt wird während des Fließens der gefärbten Lösung durch die Durchflußküvette, photometrisch bestimmt.f) this colored solution is passed through a flow cell and the one present in the sample Uric acid content is determined during the flow of the colored solution through the flow cell, determined photometrically.

Erfindungsgemäß verwendet man nun als Chromogen in einer solchen Methode ein unsubstituiertes oder kernsubstituiertes Benzidin oder Diphenylin.According to the invention, an unsubstituted or unsubstituted chromogen is used as the chromogen in such a method ring-substituted benzidine or diphenylin.

In Schritt a) der erfindungsgemäßen Methode kann als Verdünnungsmittel eine wässerige Lösung von Alkali- oder Erdalkalisalzen, wie /.. B. Natriumchlorid, Natriunitetraborat, Kaliumchlorid oder Calciumchlorid verwendet werden. Besonders bevorzugt wird Natriumchlorid. Die Konzentration an Alkali- odor Erdalkalisalzen hangt vom jeweiligen Salz ab. Im Falle von Natriumchlorid wird eine Konzentration /wischen ungefähr !.2 bis 2.0 Prozent bevorzugt, wobei eine Konzentra'ion von ungefähr 1,3 Prozent ganz besonders bevorzugt isi.In step a) of the method according to the invention, an aqueous solution of Alkali or alkaline earth salts, such as / .. B. sodium chloride, sodium tetraborate, potassium chloride or calcium chloride be used. Sodium chloride is particularly preferred. The concentration of alkali or alkaline earth salts depends on the particular salt. In the case of sodium chloride, a concentration / wipe is used about 2 to 2.0 percent preferred, with a concentration of about 1.3 percent being especially preferred preferred isi.

In Schritt b) der erfindungsgemäßen Methode wird die Mischung zum Zweck der Enteiweißung durch einen Dialysator geleitet, wobei eine klare wässerige Lösung von dieser Mischung abgetrennt wird. Die Art des Dialysators ist nicht kritisch. Es wird jedoch bevorzugt, einen Dialysator mit einem Dialysierweg von 30 bis 100 cm zu verwenden.In step b) of the method according to the invention, the mixture is for the purpose of deproteinization by a Dialyzer passed, with a clear aqueous solution being separated from this mixture. The type of Dialyzer is not critical. However, it is preferred to use a dialyzer with a dialysis path of 30 to 100 cm to use.

in Schritt c) wird in den Dialysator die entproteinisierte Lösung mit einer gepufferten Uricaselösungin step c) the deproteinized solution is mixed with a buffered uricase solution in the dialyzer

ίο vereinigt. Als Uricase werden aus tierischen Organen isolierte Präparate verwendet, wie z. B. Schweinsleberuricase. Diese Uricase wird vor der Reaktion in einen wäßrigen Puffer von pH-Wert 8,5 bis 10 aufgelöst. In der Regel kann jede übliche Puffermischung, welche sich zur Aufrechterhaltung eines derartigen pH-Bereiches eignet, verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch ein Borat-Puffer, insbesondere ein Natriumtetraborat-Puffer, verwendet. Die Konzentration des Puffers in der Puffer-Uricase-Lösung hängt von dem jeweiligen Puffer ab. Im Falle von Natriumtetraborat liegt diese Konzentration zweckmäßig zwischen 5 und 15mMol/ Liter. Besonders bevorzugt wird eine Konzentration von lOmMol/Liter. Die erforderliche Aktivität an Uricase hängt von dem jeweiligen Puffer ab. Im Falleίο united. As a uricase are made from animal organs isolated preparations used, such as. B. Pig liver uricase. This uricase is before the reaction in a dissolved aqueous buffer of pH 8.5 to 10. As a rule, any common buffer mixture, which is used for Maintaining such a pH range is suitable. Preferably, however, a Borate buffer, especially a sodium tetraborate buffer, is used. The concentration of the buffer in the Buffer uricase solution depends on the buffer used. In the case of sodium tetraborate, this is the case Concentration expediently between 5 and 15 mmol / liter. A concentration is particularly preferred of 10mmoles / liter. The required activity Uricase depends on the buffer used. In the event of

*5 von Natriumtetraborat liegt diese Aktivität vorzugsweise bei mindestens 2 Einheiten, wobei 10 Einheiten pro Liter besonders bevorzugt sind.* 5 of sodium tetraborate this activity is preferred at least 2 units, with 10 units per liter being particularly preferred.

Zur Vervollständigung der in Schritt c) erfolgten Umwandlung von Harnsäure in Allantoin und Wasserstoffperoxid wird in Schritt d) das Reaktionsgemisch inkubiert. Die Temperatur der Inkubation ist nicht kritisch, liegt jedoch mit Vorteil bei ungefähr 37⁰C. Die Dauer der Inkubation hängt von mehreren Parametern ab, wie z. B. von der Temperatur, dem Dialysierweg, und der Uricaseaktivität. Als Inkubationszeit wird bevorzugt 4 Minuten gewählt.To complete the conversion of uric acid into allantoin and hydrogen peroxide carried out in step c), the reaction mixture is incubated in step d). The temperature of the incubation is not critical, but is advantageously around 37 ^° C. The duration of the incubation depends on several parameters, such as, for. B. on the temperature, the dialysis route, and the uricase activity. The preferred incubation time is 4 minutes.

Nach der Inkubation wird in Schritt e) das entstandene Wasserstoffperoxid unter katalytischer Einwirkung von Peroxidase mit einem kernsubstituierten oder unsubstituierten Benzidin (4,4'-Diaminobiphenyl) oder Diphenylin (2,4'-Diaminobiphenyl) zur Reaktion gebracht. Als substituiertes Benzidin eignen sich z. B. o-Dianisidin und o-Tolidin. Diese Leucofarbstoffe werden in wässeriger Lösung zugegeben. Die Konzentration dieser Leucofarbstoffe ist nicht kritisch und beträgt im Falle von o-Dianisidin mit Vorteil 1,3 mg/ml.After the incubation, the hydrogen peroxide formed is subjected to catalytic in step e) Exposure to peroxidase with a nucleus-substituted or unsubstituted benzidine (4,4'-diaminobiphenyl) or diphenylin (2,4'-diaminobiphenyl) reacted. As substituted benzidine are suitable z. B. o-dianisidine and o-tolidine. These leuco dyes are added in aqueous solution. The concentration this leuco dye is not critical and, in the case of o-dianisidine, is advantageously 1.3 mg / ml.

Die Peroxidase wird in Form einer wässerigen, . vorzugsweise gepufferten Lösung zugegeben. Als Peroxidase wird eine solche, welche aus Merrettich isoliert wurde, bevorzugt.The peroxidase is in the form of an aqueous,. preferably buffered solution added. When Peroxidase is preferred that one isolated from horseradish.

Die Aktivität der Peroxidase in der Lösung hängt von dem jeweiligen Puffer ab, beträgt jedoch mit Vorteil mindestens 0,04 Einheiten/ml, wobei 0,4 Einheiten/ml besonders bevorzugt werden. Die Peroxidase-Lösung wird zweckmäßigerweise auf einen pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 gepuffert. Hs kann jede übliche Puffermischung, welche sich zur Aufrechterhaltung eines derartigen pH-Bereiches eignet, verwendet werden. Vorzugsweise wird ein Phosphaipuft'er vom pH-Wert 7,5 eingesetzt. Die Reihenfolge der Zusetzung des i.eucofarbstoffes, des Puffers und der Peroxidase spielt keine Rolle, es wird jedoch vorzugsweise· zuerst die l.eucofarbstofflösung and anschließend die: gepufferte Peroxidase-Lösung zugesetzt.The activity of the peroxidase in the solution depends on the particular buffer, but is advantageous at least 0.04 units / ml, with 0.4 units / ml being particularly preferred. The peroxidase solution is expediently buffered to a pH between 5.5 and 8.5. Hs can be any common buffer mixture, which is suitable for maintaining such a pH range can be used. A phosphate buffer with a pH value is preferred 7.5 used. The order of addition of the i.euco dye, the buffer and the peroxidase plays a role It does not matter, but it is preferred to first use the l.euco dye solution and then the: buffered one Peroxidase solution added.

Schließlich wird in Schritt f) die Extinktion der erhaltenen gefärbten Lösung in einem Photometer gemesser.. Im Falle von o-Dianisidin erfolgt diese Messung /wischen 420 und 4bO nni. Die Ergebnisse derFinally, in step f), the extinction of the colored solution obtained is measured in a photometer knife .. In the case of o-dianisidine, this measurement is carried out / between 420 and 4bO nni. The results of the

2020th

photometrischen Messung werden mit einem geeigneten Registriergerät festgehalten.photometric measurements are recorded with a suitable recording device.

Ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßenAn embodiment of the invention

automatisierten Methode wird anhand der Figur näher erläutert.automated method is explained in more detail with reference to the figure.

Die Figur illustriert ein automatisches System mitThe figure illustrates an automatic system with

kontinuierlicher Strömung, worin die zu analysierenden Proben der Reihe nach aus getrennten Probebehältern vom Probenschlauch 2 gesaugt wird (Durchfluß 0,42cc/min). Der Probeteller 1 dreht mit einer konstanten Geschwindigkeit und Hefen dem System 60 Proben pro Stunde mit einem Waschverhältnis voncontinuous flow, in which the samples to be analyzed sequentially from separate sample containers is sucked from the sample tube 2 (flow rate 0.42cc / min). The sample plate 1 rotates with a constant speed and yeasts the system 60 samples per hour with a wash ratio of

5:1. Eine auf diese Weise angesaugte Probe wird in Strömung mit einer l,3°/oigen Kochsalzlösung (Durchfluß 2,00cc/Min.) gemischt und durch eine übliche5: 1. A sample sucked in this way is mixed with a 1.3% saline solution (flow-through 2.00cc / min.) And mixed through a usual

Mischspule 3 mit 5 Windungen aus Glas geleitet.Mixing coil 3 headed with 5 turns of glass.

Nachdem die Mischung die Mischspule durchflossen hat, wird sie durch einen Dialysator 4 (Dialysierweg 60 cm), welcher mit einer Cellophanmembran od. dgl. versehen ist, gepumpt, wobei die Harnsäure durch Dialyse in dieAfter the mixture has flowed through the mixing coil, it is passed through a dialyzer 4 (dialysis path 60 cm), which od with a cellophane membrane. The like. Is pumped, the uric acid by dialysis in the

in den unteren Teil des Dialysators zugeführte (Durchfluß 2,00cc/Min.) gepufferte Uricase-LösungBuffered uricase solution fed into the lower part of the dialyzer (flow rate 2.00 cc / min.)

(pH = 9,5), übergeht. Nach Durchgang des Dialysators(pH = 9.5). After going through the dialyzer

wird das Reaktionsgemisch bei einer Temperatur von 37⁰C während 4 Minuten in einem Heizbad 5 inkubiert, wobei die Harnsäure quantitativ zu Allantoin und Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. Dem erhaltenenthe reaction mixture is incubated at a temperature of 37 ^° C. for 4 minutes in a heating bath 5, the uric acid being converted quantitatively to allantoin and hydrogen peroxide. The received

Reaktionsgemisch wird dann in kontinuierlicher WeiseThe reaction mixture is then used in a continuous manner

eine wäßrige Lösung von o-Dianisidin zugesetzt (Durchfluß 0,10cc/Min.). Anschließend wird diesean aqueous solution of o-dianisidine was added (flow rate 0.10 cc / min.). Then this

Mischung durch eine Mischspule 6 mit 20 Windungen aus Glas geleitet. Nach Durchfließen dieser MischspuleMixture passed through a mixing coil 6 with 20 turns of glass. After flowing through this mixing coil

6 wird eine gepufferte wässerige Peroxidase-Lösung Tabelle I6 is a buffered aqueous peroxidase solution Table I

von pH-Wert 7,0 zugesetzt (Durchfluß 0,42 cc/Min.), wodurch die entstandene Mischung einen pH-Wert von 7,5 aufweist. Diese Mischung wird dann durch eine zweite Mischspule 7 mit 20 Windungen geleitet. Bei Durchströmung dieser Mischspule 7 reagiert das Wasserstoffperoxid unter katalytischem Einfluß der Peroxidase mit dem o-Dianisidin unter Bildung einer gelborangen Färbung. Anschließend werden in einemof pH 7.0 added (flow rate 0.42 cc / min.), whereby the resulting mixture has a pH of 7.5. This mixture is then passed through a second mixing coil 7 with 20 turns. at When flowing through this mixing coil 7, the hydrogen peroxide reacts under the catalytic influence of the Peroxidase with the o-dianisidine giving a yellow-orange color. Then in a

Photometer 8 in einer 15-mm-Durchflußküvette bei 460 nm photometrische Messungen durchgeführt, d. h.Photometer 8 in a 15 mm flow cell 460 nm photometric measurements carried out, d. H.

die Extinktion der zu prüfenden Lösung wird bei 460 nm in einem Photometer mit einer Durchflußküvette gemessen. Die Ergebnisse der photometrischen Messung werden mit einem geeigneten Registriergerät 9 festgehalten.the extinction of the solution to be tested is measured at 460 nm in a photometer with a flow cell measured. The results of the photometric measurement are recorded using a suitable recording device 9 held.

Das System mit kontinuierlicher Strömung, welches durch die Figur illustriert ist, saugt 60 Proben/Stunde an. Die Materialien, welche in das System einströmen, werden mittels einem geeigneten Pumporgan 10, welches eingestellt wurde, um die gewünschte Strömungsgeschwindigkeiten aufrechtzuerhalten, in dieses System gepumpt. Zur Vermeidung von Kontaminationseinflössen werden die Verdünnungslösung und die gepufferte Uricase-Lösung durch Luftblasen segmentiert (Durchfluß 0,23CcZMIn.). Zur Erzielung eines regelmäßigen Blasenmusters wird diesen beiden Lösungen sowie der gepufferten Peroxidase-Lösung ein Detergenz zugesetzt Als Detergenz eignet sich z. B. Polyoxyäthylcnsorbitanmonolaurylat. Die Konzentration des zugefügten Detergenz beträgt für die Verdünnungslösung vorzugsweise 0,25 Prozent, für die beiden anderen Lösungen vorzugsweise 1 Prozent.The continuous flow system illustrated by the figure draws 60 samples / hour. The materials that flow into the system are removed by means of a suitable pump element 10, which was adjusted to maintain the desired flow rates into this System pumped. To avoid the effects of contamination, the dilution solution and the buffered uricase solution segmented by air bubbles (flow rate 0.23CcZMIn.). To achieve a These two solutions as well as the buffered peroxidase solution will produce a regular bubble pattern Detergent added. B. Polyoxyäthylcnsorbitanmonolaurylat. The concentration of the detergent added is preferably 0.25 percent for the diluting solution, for the both other solutions preferably 1 percent.

Die Menge an Reagenzien, welche in einem bestimmten Reagenzsystem gebraucht wird, kann ohne Mühe, in Relation zu der zu untersuchenden Probe, mit Bestimmungen.The amount of reagents that is used in a particular reagent system can be without Difficulty in relation to the sample to be examined, with determinations.

Hilfe der vorstehend angegebenen molaren Mengen respektive Enzymaktivität berechnet werden. Diese Berechnungen sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise kann ein Reagenzsystem die folgenden spezifischen Verbindungen enthalten:
Reagenz AWith the aid of the molar amounts given above, or the enzyme activity, can be calculated. Those skilled in the art are familiar with these calculations. For example, a reagent system can contain the following specific compounds:
Reagent A.

10 Einheiten Uricase (Suspension) (oder Lyophilisat)
Reagenz B10 units of uricase (suspension) (or lyophilisate)
Reagent B

60 mmol Phosphat-Puffer (Granulat) 100 Einheiten Peroxidase (Lyophilisat) Reagenz C60 mmol phosphate buffer (granules) 100 units peroxidase (lyophilisate) Reagent C

66 mg o-Dianisidin (Lyophilisat) Reagenz D66 mg o-dianisidine (lyophilisate) reagent D

18 ml Tween 20 (viskose Flüssigkeit) Reagenz E18 ml Tween 20 (viscous liquid) reagent E

10 mmol Natriumtetraborat (kristallines Pulver)10 mmol sodium tetraborate (crystalline powder)

Die Haltbarkeit dieser Reagenzien beträgt mindestens 1 Jahr bei 2-8° C.The shelf life of these reagents is at least 1 year at 2-8 ° C.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele noch weiter erläutert. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.The invention is further illustrated by the following examples. All temperatures are in degrees Celsius indicated.

B e i s ρ i e 1 1B e i s ρ i e 1 1

Es wurde eine Verdünnungsreihe wäßriger Harnsäurestandards hergestellt mit den Konzentrationen 2 mg/100 ml, 5 mg/100 ml, 10 mg/100 ml, 20 mg/100 ml, 30 mg/100 ml und 40 mg/100 ml. Diese Standards werden wie Proben eingesetzt und wie in dem durch die Figur veranschaulichten Ausführungsbeispiel bestimmt.A dilution series of aqueous uric acid standards was prepared with the concentrations 2 mg / 100 ml, 5 mg / 100 ml, 10 mg / 100 ml, 20 mg / 100 ml, 30 mg / 100 ml and 40 mg / 100 ml. These standards are used like samples and determined as in the embodiment illustrated by the figure.

HarnsäurekonzentrationUric acid concentration Ergebnis inResult in mg/mlmg / ml SkalenteilenDivisions 22 4,44.4 55 11,111.1 1010 22,322.3 2020th 44,444.4 3030th 65,065.0 4040 87,387.3

Die Tabelle 1 beweist, daß mit der erfindungsgemäßen Methode ein gesicherter Linearitätsbereich bis 40 mg/ml gewährleistet ist.Table 1 shows that with the method according to the invention, a guaranteed linearity range of up to 40 mg / ml is guaranteed.

Example 2

Es wurde der Harnsäuregehalt von 5 verschiedener KontroHseren gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur bestimmt. Das Ergebnis wird in dei nachstehenden Tabelle II wiedergegeben.The uric acid content of 5 different control sera according to the exemplary embodiment was determined the figure determined. The result is given in Table II below.

Tabelletable HH XX SS. VKVK NN Serumserum 4,504.50 0,0540.054 1,201.20 1515th aa 4,174.17 0,0490.049 1,181.18 1515th bb 9,119.11 0,0120.012 0,130.13 1010 CC. 439439 0,0320.032 0,730.73 1010 dd 4,884.88 0,070.07 1,431.43 1010 ee Mittelwert mgMean mg Harnsäure/100 ml.Uric acid / 100 ml. X = X = Standardabweichung.Standard deviation. s =s = Variationskocffizient (%).
Anzahl der in der Serie dnr<Coefficient of variation (%).
Number of in the series dnr < VK =
N = VK =
N = ■■hprfiihricn■■ hprfiihricn

Die Tabelle II zeigt einen durchschnittlichen Variationskoeffizienten von weniger als 1 Prozent und beweist somit die Präzision der Methode.Table II shows an average coefficient of variation of less than 1 percent and thus proves the precision of the method.

Example 3

Es wurden respektiv 0,93 mg/100 ml, 1,86 mg/100 ml und 2,79 mg/100 ml an Harnsäure 2 verschiedenenThere were 2 different uric acid levels, 0.93 mg / 100 ml, 1.86 mg / 100 ml and 2.79 mg / 100 ml, respectively

Kontrollsera zugesetzt und der Harnsäuregehalt gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur bestimmt.Control sera added and the uric acid content according to the embodiment according to the figure determined.

Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabelle 111 wiedergegeben.The result is shown in Table III below.

Tabelle Hl veranschaulicht die Rückgewinnung (»Rccovery-Mcihode«) von Harnsäure.Table HI illustrates the recovery ("Rccovery-Mcihode") of uric acid.

Tabelle IIITable III Zugefügte HarnsäureAdded uric acid Gesamtmenge anTotal amount ZurückgewonneneRecovered Durchschnittaverage RückBack Harnsäure in derUric acid in the Harnsäureuric acid Harnsäureuric acid gewinnungextraction Probesample mg/100 mlmg / 100 ml mg/100 mlmg / 100 ml mg/100 mlmg / 100 ml %% mg/100 mlmg / 100 ml 0,930.93 5,435.43 5,395.39 99,399.3 4,504.50 1,861.86 6,366.36 6,356.35 99,899.8 4,504.50 2,792.79 7,297.29 7,307.30 100,2100.2 4,504.50 0,930.93 9,899.89 10,0810.08 102102 8,968.96 1,861.86 10,8210.82 10,9910.99 101,5101.5 8,968.96 2,792.79 11,7511.75 11,6811.68 99,499.4 8,968.96 100.36100.36

Example 4

Es wurden respektive 10 mg/100 ml Glutathion, 10 mg/100 n.l Allantoin und 5 mg/100 ml Kreatinin einem Kontrollserum mit einem ursprünglichen HarnsLure-Gehalt von 4,6 mg/100 ml zugegeben und danach der Harnsäuregehalt erneut gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur bestimmt. There were 10 mg / 100 ml glutathione, 10 mg / 100 n.l allantoin and 5 mg / 100 ml creatinine, respectively a control serum with an original uric acid content of 4.6 mg / 100 ml was added and thereafter the uric acid content is determined again according to the embodiment according to the figure.

Das Ergebnis wird in der nachstehenden Tabelle IV wiedergegeben.The result is given in Table IV below.

Tabelletable IVIV SollwertSetpoint GefundenerFound Probesample Zugefügte FremdAdded foreign Wertworth substanzsubstance mg/100 mlmg / 100 ml mg/100 mimg / 100 mi 4,64.6 4,64.6 11 4,64.6 4,64.6 22 Glutathion,Glutathione, 10 mg/100 ml10 mg / 100 ml 4,64.6 4,74.7 33 Allantoin,Allantoin, 10 mg/100 ml10 mg / 100 ml 4,64.6 4,74.7 44th Kreatinin,Creatinine, 5 mg/100 ml5 mg / 100 ml

Tabelle IV veranschaulicht die geringe Störanfälligkeit der erfindungsgemäßen Methode in bezug auf Glutathion, Allantoin und Kreatinin.Table IV illustrates the low susceptibility of the method according to the invention in relation to Glutathione, allantoin and creatinine.

B e i s ρ i e 1 5B e i s ρ i e 1 5

Es wurde ein Standard hergestellt mit der Konzentration 30 mg Harnsäure pro 100 ml. Ein aliquoter Teil dieses Standards wurde mit Ascorbinsäure so versetzt, daß die Gesamtkonzentration an Ascorbinsäure 5 mg/ 100 ml betrug. Anschließend wurden die beiden Standards wie Proben in das System eingesetzt und der Gehalt der Harnsäure gemäß dem Ausführungsbeispiel nach der Figur gemessen.A standard was prepared with a concentration of 30 mg uric acid per 100 ml. An aliquot ascorbic acid was added to this standard so that the total concentration of ascorbic acid was 5 mg / Was 100 ml. The two standards were then inserted into the system like samples and the Uric acid content measured according to the embodiment according to the figure.

Ergebnis:Result:

Probe ohne Ascorbinsäure: 30,0 mg Harnsäure/100 mlSample without ascorbic acid: 30.0 mg uric acid / 100 ml

Probe mit Ascorbinsäure: 30,2 mg Harnsäure/100 mlSample with ascorbic acid: 30.2 mg uric acid / 100 ml

Das vorstehende Ergebnis zeigt die geringe Störanfälligkeit der erfindungsgemäßen Methode in bezug aul Ascorbinsäure.The above result shows the low susceptibility of the method according to the invention with regard to aul Ascorbic acid.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

709 618/33709 618/33

Claims

Patent claims are analyzed quickly and with great accuracy:

1. Method for the quantitative determination of uric acid in biological fluids, in which one carry out the following steps one after the other in continuous flow,

a) in continuous flow is a certain amount of sample with a diluting solution mixed,

b) this mixture is passed through a dialyzer, which becomes a clear aqueous solution separated from this mixture,

c) this clear aqueous solution is mixed with a buffered uricase solution with a pH value mixed between 8.5 and 10

d) the aqueous solution obtained according to steps) is incubated,

e) the reaction mixture is at a pH between 5.5 and 8.5 with a chromogen and Mixed peroxidase, creating a colored solution

f) this colored solution is passed through a flow cell and the one in the sample existing uric acid content is determined during the flow of the colored solution through the Flow cell determined photometrically, characterized in that the chromogen used is an unsubstituted or nuclear-substituted one Benzidine or Diphenylin used.

2. Method according to claim 1, characterized in that the nucleus-substituted benzidine o-dianisidine used.

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