DE2435988C3 - Method for the determination of plasminogen - Google Patents
Method for the determination of plasminogenInfo
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Description
Die Kenntnis des Plasminogengehalts; in menschlichen Blut- und Körperflüssigkeiten ist besonders wichtig bei Patienten, die unter einer fibronolytischen oder antifibronolytischen Therapie stehen, ferner bei thromboembolisch Erkrankten oder bei Patienten mit globaler Gerinnungsstörung.Knowing the plasminogen content; in human Blood and body fluids is especially important in patients who are undergoing a fibronolytic or antifibronolytic therapy, also in thromboembolic patients or in patients with global coagulation disorder.
Zur Bestimmung des Plasminogehalts einer Plasmaoder Serumprobe steht eine Reihe von Methoden zur Verfügung, die auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen, unterschiedlich empfindlich oder störanfällig sind und für die Bestimmung mehr oder weniger Zeitaufwand erfordern. Die biologischen Tests unterscheiden sich prizipiell darin, daß in einem Falle das Plasminogen der Probe in Plasmin umgewandelt und beispielsweise in der Fibrinplatten-Technik nachA number of methods are available for determining the plasminogen content of a plasma or serum sample Available that are based on different principles, differently sensitive or susceptible to failure and require more or less time to determine. The biological tests make a difference principally in the fact that in one case the plasminogen of the sample is converted into plasmin and for example in the fibrin plate technique
ίο Astrup bestimmt wird. Im anderen Falle wird das Plasminogen mit Hilfe eines Katalysators, der Plasminogen in einen Plasminogen-Aktivator umwandelt, z. B. Streptokinase als Aktivator bestimmt, beispielsweise in der Clot-Lysis-Methode nach Christensen, mit der der gebildete Aktivator über die Plasminbildung gemessen werden kann.ίο Astrup is determined. Otherwise it will Plasminogen with the help of a catalyst that converts plasminogen into a plasminogen activator, z. B. streptokinase determined as an activator, for example in the clot lysis method according to Christensen, with which the formed activator can be measured via the plasmin formation.
In einer älteren Patentanmeldung, vgl. deutsche A uslegeschrift 23 38 254, wurde ein Verfahren zur Messung des Plasminogengehalts vorgeschlagen, in dem die Fibrinbildung in einem antiplasminfreien Probenplasma nach Aktivierung des Plasminogens unter Beifügung von Thrombin verzögert und der Plasminogengehalt durch die Bestimmung der Verzögerung der Gerinnungszeit festgelegt wird. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch in der Notwendigkeit, die Antiplasmin-Aktivität des Patientenplasmas mit Isoamylalkohol entfernen zu müssen. Dadurch ist seine Anwendung für die routinemäßige Plasminogenbestimmung in klinischen Laboratorien relativ aufwendig und auch nicht schneller als beispielsweise die Clot-Lysis-Methode.In an earlier patent application, see German A uslegeschrift 23 38 254, a method for measuring the plasminogen content was proposed in which the fibrin formation in an antiplasmin-free sample plasma is delayed after activation of the plasminogen with the addition of thrombin and the plasminogen content by determining the delay in the coagulation time is set. A major disadvantage of this method, however, is the need to remove the antiplasmin activity of the patient's plasma with isoamyl alcohol. As a result, its application for routine plasminogen determination in clinical laboratories is relatively complex and also not faster than, for example, the clot lysis method.
Es bestand daher ein Interesse, das vorgeschlagene Verfahren zu verbessern.
Es wurde nun gefunden, daß die Plasminogenbe-Stimmung wesentlich vereinfacht werden kann, wenn
das Humanplasminogen in einer Probe, z. B. in verdünntem Plasma oder Serum mit Hilfe eines Katalysators
in einen Plasminogen-Aktivator umgewandelt wird und die Menge des Aktivators in einem Test-There was therefore an interest in improving the proposed method.
It has now been found that the plasminogenbe mood can be simplified significantly if the human plasminogen in a sample, e.g. B. in diluted plasma or serum is converted into a plasminogen activator with the help of a catalyst and the amount of activator in a test
system bestimmt wird, das ein Plasminogen im Überschuß enthält, welches durch den Katalysator n-cht aktiviert wird. Die Gerinnungszeit des Testunsatzes mit Thrombin wird dabei zur Meßgröße für den unbekannten Plasminogengehalt.system is determined, which contains a plasminogen in excess, which n-cht by the catalyst is activated. The coagulation time of the test batch with thrombin becomes the measured variable for the unknown Plasminogen content.
Die Erfindung bezieht sich demnach auf ein Verfahren zur Bestimmung von Plasminogen in menschlichen Körperflüssigkeiten durch Messung der Gerinnungszeit einer fibrinogenhaltigen Lösung und ist dadurch gekennzeichnet, daß manThe invention accordingly relates to a method for the determination of plasminogen in human Body fluids by measuring the clotting time of a fibrinogen-containing solution and is characterized in that one
a) eine verdünnte, Humanplasminogen enthaltendea) a diluted one containing human plasminogen
Körperflüssigkeit,Body fluid,
b) einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogen-Aktivator umwandelt,b) a catalyst that converts human plasminogen into human plasminogen activator,
c) Fibrinogen,c) fibrinogen,
d) ein durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen und schließlichd) a plasminogen which cannot be activated by the catalyst and finally
e) Thrombine) thrombin
miteinander vermischt und die Gerinnungszeit des Ansatzes mißt.mixed together and the coagulation time of the approach measures.
Das Verfahren eignet sich insbesondere für die Bestimmung von Plasminogen im Plasma, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten von menschlichen Probanden. The method is particularly suitable for the determination of plasminogen in plasma, serum or other body fluids from human subjects.
Dem Verfahren liegt die Überlegung zugrunde, daß Humanplasminogen mit einigen biologischen Katalysatoren, beispielsweise dem Stoffwechsel ß-hämolysie-The process is based on the idea that human plasminogen can be used with some biological catalysts, for example the metabolism ß-hemolysis
render Streptokokken, der Streptokinase, einen Komplex zu bilden vermag, der eine ähnliche enzymatische Wirkung wie die körpereigenen Aktivatoren des Plasminogens hat. Demgegenüber wird tierisches Plasminogen, insbesondere Plasminogen von Wiederkäu;rn, z. 8. Rinderplasminogen durch Streptokinase picht aktiviert. Der Human-Plasminogen-Streptokinase-Komplex katalysiert die Umwandlung von menschlichem und tierischem Plasminogen zu Plasmin.render streptococci, the streptokinase, is able to form a complex that has an enzymatic effect similar to that of the body's own activators of plasminogen. In contrast, animal plasminogen, in particular plasminogen from ruminants, e.g. 8. Bovine plasminogen activated by streptokinase picht. The human plasminogen streptokinase complex catalyzes the conversion of human and animal plasminogen to plasmin.
Beim vorliegenden Verfahren wird nun ein Kataly- *o sator, z. B. die Streptokinase, verwendet, der einerseits Humanplasminogen in Humanplasminogen-Aktivator umzuwandeln vermag, und andererseits ein zugesetztes, phylogeneiisch dem menschlichen nicht verwandtes Plasminogen meist nicht direkt, sondern nur über eine aktivierte Zwischenstufe in Plasmin überführt. Vom Plasmin ist bekannt, daß es eine sehr wirksame Proteinase darstellt, die unter anderem Fibrinogen abzubauen vermag. In einem Geriiinungsansatz erweist sich die Gerinnungszeit um so stärker verzö- « gert, je stärker das Fibrinogen durch vorhandenes Plasmin degradiert wurde.In the present process, a catalyzer * o sator, e.g. B. streptokinase used, the one hand human plasminogen in human plasminogen activator able to transform, and on the other hand an added, phylogeneic unrelated to the human Plasminogen is usually not converted into plasmin directly, but only via an activated intermediate stage. Plasmin is known to be a very effective proteinase which, among other things, produces fibrinogen able to reduce. In a coagulation approach, the coagulation time proves to be all the more delayed. The stronger the fibrinogen was degraded by the plasmin present.
Nach dem Vorhergesagten kann in dem Verfahren statt Streptokinase auch jede andere katalytisch wirksame Substanz Anwendung finden, die in der Lage ist, die gesamte vorhandene Plasminogenmenge in Aktivator zu überführen.According to what has been said above, instead of streptokinase, any other catalytically active substance can also be used in the process Find substance application that is able to use the entire amount of plasminogen present in activator to convict.
Es konnte mit dem vorliegenden Verfahren gezeigt werden, daß eine Beziehung zwischen der vorhandenen Plasminogenmenge und der in einem Gerinnungsansatz gemessenen Gerinnungszeit herzustellen ist. Dabei hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die zu testenden Körperflüssigkeiten 1 : 5 bis 1 : 50 mit einem wäßrigen Medium, vorteilhaft mit einer isotonischen Salzlösung, die gegebenenfalls gepuffert sein kann, zu verdünnen. Die Menge an Katalysator soll gegenüber der Plasminogenmenge im Überschuß vorliegen. Im Falle von Streptokinase als Katalysator bedeutet das ein Molverhältnis Streptokinase zu Plasminogen > 1 : 1. In normalerweise vorkommenden Meßbereichen ist es ausreichend, pro ml der verdünnten Körperflüssigkeit 250 bis 5000 Einheiten Streptokinase (nach Christensen) zuzusetzen oder ein entsprechendes Äquivalent einer anderen katalytisch wirksamen Substanz, die in der Lage ist, die gesamte vorhandene Plasminogenmenge in Aktivator zu überführen.It could be shown with the present method that a relationship between the existing Amount of plasminogen and the coagulation time measured in a coagulation batch is to be produced. Has it has proven to be useful to mix the body fluids to be tested 1: 5 to 1:50 with an aqueous Medium, advantageously to be diluted with an isotonic saline solution, which can optionally be buffered. The amount of catalyst should be in excess over the amount of plasminogen. In the case of streptokinase as a catalyst, this means a molar ratio of streptokinase to plasminogen> 1: 1. In normally occurring measuring ranges, it is sufficient to use 250 to 5000 units per ml of the diluted body fluid Add streptokinase (according to Christensen) or a corresponding equivalent of another catalytically active substance that is able to use the entire amount of plasminogen present in activator to convict.
Ferner soll der Ansatz pro ml zweckmäßig I bis 100 mg Fibrinogen, ferner an nicht durch den Katalysator aktivierbarem Plasminogen entsprechend einer Menge von 1 bis 80 Einheiten (eine Einheit Plasminogen entspricht einem Plasminogengehalt von I ml normalen Rinderplasma) und schließlich 0,1 bis 10 Einheiten Thrombin enthalten. Dabei ist es für den Fachmann selbstverständlich, daß eine höhere Fibrinogenmenge eine geringere Thrombinmenge zur Gerinnung in der gleichen Zeiteinheit benötigt bzw. daß die Gerinnungszeit von der Fibrinogenmenge in umgekehrt proportionalem Verhältnis steht. Die Gerinnungszeit, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung mit der Plasminogenmenge in Korrelation steht, kann zweckmäßigerweise mit Hilfe von dafür zur Verfugung stehenden Meßgeräten, sogenannten Koagulometern, bestimmt werden, beispielsweise in einem Kugelkoagulometer.Furthermore, the batch should expediently from 1 to 100 mg of fibrinogen per ml, furthermore not through the catalyst activatable plasminogen corresponding to an amount of 1 to 80 units (one unit of plasminogen corresponds to a plasminogen content of 1 ml normal bovine plasma) and finally 0.1 to Contains 10 units of thrombin. It goes without saying for the person skilled in the art that a higher amount of fibrinogen a smaller amount of thrombin is required or required for coagulation in the same unit of time that the clotting time is inversely proportional to the amount of fibrinogen. The clotting time, which is correlated with the amount of plasminogen in the method according to the invention, can expediently with the help of measuring devices available for this purpose, so-called coagulometers, can be determined, for example in a spherical coagulometer.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die praktische Durchführung in der Weise vorzunehmen, daß man zu einer verdünnten, menschliches Plasminogen enthaltenden Körperflüssigkeit einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogen-Aktivator umwandelt, zusetzt, das Gemisch zu einer Lösung, die Fibrinogen und ein durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen enthält, zufügt, den Ansatz schließlich mit Thrombin zur Gerinnung bringt und die Gerinnungszeit bestimmt. Dies wird dann mit der Plasminogenmenge in Beziehung gesetzt. Man kann aber auch zweckmäßig so verfahren, daß man eine verdünnte, menschliches Plasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einem Gemisch ausIt has proven to be useful to carry out the practical implementation in such a way that one to a dilute body fluid containing human plasminogen a catalyst, the human plasminogen converts into human plasminogen activator, adds the mixture to a solution that Contains fibrinogen and a plasminogen which cannot be activated by the catalyst, adds to the batch finally coagulates with thrombin and determines the coagulation time. This is then done with the Plasminogen amount related. But one can also expediently proceed in such a way that one diluted body fluid containing human plasminogen into a mixture
a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogenaktivator umwandelt,a) a catalyst that converts human plasminogen into human plasminogen activator,
b) Fibrinogen undb) fibrinogen and
c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen zufügt, den Ansatz schließlich mit Thrombin zur Gerinnung bringt, die Gerinnungszeit bestimmt. c) a plasminogen which cannot be activated by the catalyst is added, finally also to the batch Causes thrombin to coagulate, determines the coagulation time.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Ausführungsbeispiel nun näher erläutert:The method according to the invention is now explained in more detail by the following exemplary embodiment:
Erstellung der EichkurveCreation of the calibration curve
In 10 Teströhrchen aus Polystyrol mit den Abmessungen 14,5 · 84 mm wird je eine Glaskugel (Durchmesser 2 mm) gegeben. In 5 der Röhrchen soll die Gerinnungszeit des Standardplasmas ohne Aktivierung durch Streptokinase durchgeführt werden. In den restlichen 5 Röhrchen wird die Gerinnungszeit nach Aktivierung mit Streptokinase bestimmt. Die Gerinnungszeiten werden jeweils in 5 verschiedenen Verdünnungen gemessen, wobei jeweils eine Kontrolle ohne Plasmaverdünnung vorgenommen wird. Das Plasma wird 1 : 20 mit 0,06 M Diäthylbarbiturat-Na-Acetat-HCI vorverdünnt und die weitere Verdünnung mit der gleichen Lösung in der Weise vorgenommen, daß in den zu testenden Röhrchen 100%, 50%, 25",,. 12,5% und 0% der Plasmaverdünnung vorliegt. In den Proben, die mit Streptokinase aktiviert werden, werden pro 2 ml Plasma-Vorverdünnung 0,1 ml einer Streptokinaselösung von 20 000 I. E. pro ml zugegeben und 30 see bei Raumtemperatur belassen.In 10 test tubes made of polystyrene with the dimensions A glass ball (diameter 2 mm) is placed at each 14.5 x 84 mm. In 5 of the tubes the The coagulation time of the standard plasma can be carried out without activation by streptokinase. In the The remaining 5 tubes are used to determine the coagulation time after activation with streptokinase. The clotting times are each measured in 5 different dilutions, with a control in each case is done without plasma dilution. The plasma is 1:20 with 0.06 M diethyl barbiturate-Na-acetate-HCl prediluted and the further dilution made with the same solution in the way, that 100%, 50%, 25 ",. 12.5% and 0% of the plasma dilution are present in the tubes to be tested. In the Samples that are activated with streptokinase are 0.1 ml of a streptokinase solution per 2 ml of plasma pre-dilution of 20,000 I.U. per ml are added and leave for 30 seconds at room temperature.
Für die nachstehend beschriebenen Gerinnungsansätze werden folgende Lösungen benötigt: The following solutions are required for the coagulation approaches described below:
1. Rinderfibrinogenlösung mit 4 mg/ml Rinderfibrinogen, 1. Bovine fibrinogen solution containing 4 mg / ml bovine fibrinogen,
2. Thrombinlösung mit 2 NIH Einheiten/ml Thrombin. 2. Thrombin solution with 2 NIH units / ml thrombin.
Im folgenden Testansatz ergeber, sich die angeführten Gerinnungszeiten. Die in einer Doppelbestimmung erhaltenen Mittelwerte der Gerinnungszeiten werden auf einem Doppel-Logarithmenpapier aufgetragen, die als Eichkurve für die weiteren Bestimmungen verwendet werden kann.In the following test approach, the listed Clotting times. The mean values of the coagulation times obtained in a double determination are plotted on a double logarithmic paper as the calibration curve for the further determinations can be used.
TestansatzTest approach
0,4 ml Rinderfibrinogenlösung
+ 0,2 ml Plasmaverdünnungen, nicht aktiviert0.4 ml bovine fibrinogen solution
+ 0.2 ml plasma dilutions, not activated
oder aktiviert
2 min inkubieren (37°C)or activated
Incubate for 2 min (37 ° C)
+ 0,1 ml Thrombin+ 0.1 ml thrombin
Je nach der verwendeten Piasminverdünnung liefert ein solcher Ansatz folgende Gerinnungszeiten in see:Depending on the piasmin dilution used, such an approach provides the following coagulation times in see:
Plasma unaktiviertPlasma inactive
100% bis 26,3/26,3 = 26,3" 50% bis 24,6/25,1 =24,9" 25% bis 24,3/24,0 = 24,2"100% to 26.3 / 26.3 = 26.3 "50% to 24.6 / 25.1 = 24.9" 25% to 24.3 / 24.0 = 24.2 "
12,5% bis 23,4/23,2 = 23,3" 0% bis 23,2/23,1 -23,2"12.5% to 23.4 / 23.2 = 23.3 "0% to 23.2 / 23.1 -23.2"
Plasma aktiviertPlasma activated
100% bis 40,5/39,0 = 39,8" 50% bis 34,8/34,0 = 34,4" 25% bis 29,5/29,3 = 29,4"100% to 40.5 / 39.0 = 39.8 "50% to 34.8 / 34.0 = 34.4" 25% to 29.5 / 29.3 = 29.4 "
12,5% bis 26,6/26,5 = 26,6" 0% bis 23,1/23,2 = 23,2"12.5% to 26.6 / 26.5 = 26.6 "0% to 23.1 / 23.2 = 23.2"
Testung unbekannter Seren oder PlasmenTesting of unknown sera or plasmas
Die zu testenden Seren- oder Plasmenproben werden wie das Standard-Humanplasma 1 :20 vorverdünnt. 2 ml dieser Serum- oder Plasmaverdünnung werden mit 0,1 ml Streptokinase (20 000 E/ml) versetzt und 30 see bei Raumtemperatur belassen. Danach wird die inkubierte Probe 1 +1 verdünnt in den Testansatz zur Bestimmung der Gerinnungszeit eingesetzt. Aus der resultierenden Gerinnungszeit von 37 see kann mit Hilfe der Eichkurve (vgl. Abbildung) und einer primär getroffenen Annahme, daß Standard-Humanplasma 5000 E/ml Plasminogen enthält, die Menge des Plasminogens in der getesteten Probe z. B. mit 70% dieses Werts entsprechend 3500 Einheiten Plasminogen/ml entnommen werden. Unter Berücksichtigung der eingangs vorgenommenen Verdünnung von 1: 2 beträgt der Plasminogen-Gehalt der Probe 7000 E/ml. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man dieThe sera or plasma samples to be tested are prediluted 1:20 like standard human plasma. 2 ml of this serum or plasma dilution are mixed with 0.1 ml streptokinase (20,000 U / ml) and Leave at room temperature for 30 seconds. The incubated sample is then diluted 1 +1 in the test mixture Determination of the clotting time used. From the resulting coagulation time of 37 see can with With the help of the calibration curve (see figure) and a primary assumption made that standard human plasma Contains 5000 U / ml plasminogen, the amount of plasminogen in the tested sample z. B. with 70% this Value corresponding to 3500 units of plasminogen / ml can be removed. Taking into account the dilution of 1: 2 carried out at the beginning the plasminogen content of the sample 7000 U / ml. The same results are obtained using the
ίο vorverdünnte Humanplasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einer Mischung aus plasminogenhaltigem Rinderfibrinogen mit 500 E/ml Streptokinase zusetzt, den Ansatz 2 min bei 37°C inkubiert und anschließend mit der angegebenen Thrombinlösung zur Gerinnung bringt.ίο prediluted body fluid containing human plasminogen added to a mixture of plasminogen-containing bovine fibrinogen with 500 U / ml streptokinase, incubated the batch for 2 min at 37 ° C. and then with the specified thrombin solution coagulates.
Zeigt es sich beispielsweise, daß eine zu prüfende Körperflüssigkeit in dem Testsystem einen nicht bestimmbar hohen Plasminogenwert erbringen würde wird sinnvollerweise die Probe entsprechend vorver dünnt und diese Verdünnung in der Bestimmung ir Rechnung gesetzt.If it turns out, for example, that a body fluid to be tested cannot be determined in the test system would produce a high plasminogen value, the sample is appropriately pre-treated thins and this dilution is taken into account in the determination ir.
Entsprechendes gilt bei zu niedrigem Plasminogen· gehalt.The same applies if the plasminogen content is too low.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings
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