DE2410850C3 - Process for the production of peptides - Google Patents
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Description
Peptids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß diePeptide, which is characterized in that the
peptidbildende Reaktion und/oder die Extraktion des Peptids unter Einwirkung von Ultraschallwellen mit ao einer Frequenz von etwa 18 bis 22 kc/s durchgeführtpeptide-forming reaction and / or the extraction of the peptide under the action of ultrasonic waves with ao carried out at a frequency of about 18 to 22 kc / s
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wird.The present invention relates to a will.
Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch Kupp- Es ist nun gefunden worden, daß die Reaktion lung einer Aminosäure oder eines Oligomeren von einheitlich und mit außerordentlich erhöhter Gedieser mit einer Aminosäure oder Oligomeren von schwindigkeit erfolgt, wenn bei den herkömmlichen dieser, welches an ein Harz gebunden ist, wobei ein 35 Verfahren in fester Phase für die synthetische Herstel-Peptid auf dem Harz gebildet wird, Abspalten des lung von Peptid aus Aminosäure oder dessen Oligo-Peptids von dem Harz und anschließende Extraktion meren die Kondensationsreaktion zur Bildung der des Peptids. Peptid-Bindung bei Bestrahlung mit Ultraschallwellen Ein Verfahren in fester Phase ist bereits bekannt durchgeführt wird, wobei ein homogenes Peptid bei und umfaßt die folgenden Stufen: Kupplung einer 30 verkürzter Dauer der Reaktionszeit erhalten werden Aminosäure oder eines Oligomeren von dieser mit kann. Außerdem wurde gefunden, daß bei der Lösungseiner Aminosäure oder Oligomeren von dieser, mittelextraktion des erhaltenen Peptids durch Ultraweiches an ein Harz gebunden ist, wobei ein Peptid schallbestrahlung die Extraktionszeit ebenfalls verauf dem Harz gebildet wird, Abspalten des Peptids ringen werden kann.Process for the preparation of peptides by Kupp- It has now been found that the reaction development of an amino acid or an oligomer of uniform and with extraordinarily increased levels of these with an amino acid or oligomer of speed is done when using the conventional this, which is bound to a resin, being a 35 solid phase process for the synthetic manufacuring peptide is formed on the resin, cleavage of the lung peptide from amino acid or its oligo-peptide of the resin and subsequent extraction, the condensation reaction to form the of the peptide. Peptide binding upon irradiation with ultrasonic waves A method in solid phase is already known to be carried out, whereby a homogeneous peptide is used and comprises the following stages: Coupling of a reduced duration of the reaction time can be obtained Amino acid or an oligomer of this with can. In addition, it has been found that when an amino acid or oligomer is dissolved therefrom, medium extraction of the resulting peptide is bound to a resin by ultra-soft, and a peptide sonicated also increases the extraction time the resin is formed, cleavage of the peptide can be struggled.
von dem Harz und anschließende Extraktion des 35 Es wurde weiterhin gefunden, daß die übliche Vor-Peptids. behandlung und Nachbehandlung der peptidbildenden Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, daß das Umsetzung, welche die Stufen Quellen, Waschen, synthetisch hergestellte Peptid auf dem Harz aus nicht- Entblockieren und Neutralisieren umfassen, innerhalb umgesetzten überschüssigen Reaktionspartnern und einer bemerkenswert kürzeren Zeit abgeschlossen Nebenprodukten sehr leicht durch Auswaschen ge- 40 werden können, wenn die Durchführung unter Ultratrennt werden kann, es hat jedoch den großen Nach- schallbestrahlung erfolgt.from the resin and subsequent extraction of the 35 It was further found that the usual pre-peptide. treatment and post-treatment of the peptide-forming This process has the great advantage that the reaction, which involves the steps of swelling, washing, synthetically made peptide on the resin from non-deblocking and neutralizing include, within converted excess reactants and completed a remarkably shorter time By-products can be very easily washed out if carried out under Ultra Separation can be, it has, however, the great post-sonic irradiation done.
teil, daß die Reaktionsgeschwindigkeit niedrig ist und Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetenpartly that the reaction rate is low and those suitable for the process according to the invention
daß es schwierig ist, die Reaktior. einheitlich durch- Aminosäuren umfassen eine große Vielfalt der üb-that it is difficult to find the Reaktior. uniformly through- Amino acids comprise a large variety of the
zuführen. Insbesondere der letztgenannte Nachteil liehen Aminosäuren mit Aminogruppen und Carboxyl-respectively. In particular, the last-mentioned disadvantage lent amino acids with amino groups and carboxyl
stellt ein ernstes Problem bei der Synthese von Pep- 45 gruppen im Molekül derselben. Beispiele von diesenposes a serious problem in the synthesis of Pep groups in the molecule thereof. Examples of these
tiden aus Aminosäuren und deren Oligomeren dar. sind Glyzin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenyl-tides from amino acids and their oligomers are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenyl
Bei den Verfahren in fester Phase ist es leicht möglich, alantin, Tyrosin, Methionin, Asparagin, Asparagin-In the solid phase procedures, it is easily possible to use alantine, tyrosine, methionine, asparagine, asparagine
daß die Umsetzung der Aminosäuren oder deren säure, Glutamin, Glutaminsäure, Cystein. Arginin,that the implementation of the amino acids or their acid, glutamine, glutamic acid, cysteine. Arginine,
Oligomeren mit den an das Harz gebundenen Amino- Serin, Threonin, Histidin und ähnliche Monoamino-Oligomers with the amino-serine, threonine, histidine and similar monoamino-
säuren oder deren Oligomeren nicht einheitlich ist, 50 karbonsäuren, Hydroxylaminosäuren, Schwefel ent-acids or their oligomers is not uniform, 50 carboxylic acids, hydroxylamino acids, sulfur
so daß es schwierig ist, homogene Produkte zu haltende Aminosäuren usw.so that it is difficult to keep homogeneous products, amino acids, etc.
erhalten. Beispiele von Oligomeren der Aminosäure sindreceive. Examples of oligomers of the amino acid are
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaf- Oligopeptide, d. h. die Kondensationsprodukte vonThe object of the present invention is the sheep oligopeptides, i. H. the condensation products of
fung eines Verfahrens, bei dem die obenerwähnten 2 bis 10 Mol der gleichen oder verschiedenen Amino·operation of a process in which the above-mentioned 2 to 10 moles of the same or different amino
Nachteile der herkömmlichen Verfahren in fester 55 säuren, einschließlich z. B. Dipeptide, Tripeptide,Disadvantages of conventional processes in solid 55 acids, including e.g. B. Dipeptides, Tripeptides,
Phase zur Herstellung von Peptiden von Amino- Tetrapeptide usw.Phase for the production of peptides from amino-tetrapeptides, etc.
säuren oder deren Oligomeren eliminiert wurden. Diese Aminosäuren oder deren Oligomeren werdenacids or their oligomers have been eliminated. These are amino acids or their oligomers
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung als ein verwendetes Ausgangsmaterial in einer an eirAnother object of the present invention as a starting material used in an eir
ist die Schaffung eines Verfahrens in fester Phase zur Harz gebundenen Form verwendet, während als zwei·is the creation of a solid phase process used to form resin bound, while being used as two
Herstellung von homogenen Peptiden von Amino- 60 tes Ausgangsmaterial diese als solche verwendet werProduction of homogeneous peptides from amino 60 th starting material these are used as such
säuren oder deren Oligomeren durch einheitliche den, d. h. in nicht an ein Harz gebundener Formacids or their oligomers by uniform den, d. H. in a form not bound to a resin
Umsetzung und stark beschleunigter Reaktions- Die Arten der zu verwendenden Harze und der VerImplementation and highly accelerated reaction The types of resins to be used and the ver
geschwindigkeit. fahren zur Bindung der Aminosäuren oder der Oligospeed. drive to the binding of the amino acids or the oligo
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung meren derselben an das Harz werden nachfolgencAnother object of the present invention to the resin will be given below
ist die Schaffung eines Verfahrens in fester Phase zur 65 beschrieben.describes the creation of a procedure in a fixed phase for the 65th.
Herstellung von Peptiden von Aminosäuren oder Die gemäß der vorliegenden Erfindung anzuwenPreparation of peptides of amino acids or the to be used according to the present invention
deren Oligomeren, bei dem die Extraktion der erhal- denden Verfahren in fester Phase an sich kann iitheir oligomers, in which the extraction of the sustaining process in the solid phase can per se ii
tenen Peptide in sehr kurzer Zeit durchgeführt wird. herkömmlicher Weise durchgeführt werden. Di<ten peptides is carried out in a very short time. can be carried out in a conventional manner. Tue <
typischen Verfahren dieser Art, die Vor- und Nach- Peptid erhalten. Üblicherwebe wird der Zyklus diesestypical processes of this type that obtain pre- and post-peptide. Usually the cycle becomes this
behandlungsstufen umfassen, sind z. B.: Verfahrens mehrere Maie wiederholt, um die BildungTreatment stages include, are z. B .: Procedure repeated several times in order to achieve the formation
Die Endaminogruppen der Aminosäuren oder der des gewünschten Peptids auf dem Harz durchzuführen. Oligomeren derselben werden zuerst mit Schutz- Nach dem Waschen wird das an das Harz gebundene gruppen »blockiert«, und dann werden die N-blockier- 5 Peptid von dem Harz abgespalten, indem das erhaltene ten Aminosäuren oder Oligomeren derselben an Harze Harz mit einem abspaltenden Mittel, wie z, B. wassergebunden, die sich in festem Zustand unter den für freier Fluorwasserstoff oder mit Bromwasserstoff gedie peptidbildende Reaktion anzuwendenden Bedin- sättigte Trifluoressigsäure, in Kontakt gebracht wird, gungen befinden. Das Blockieren kann durch TJm- Die Behandlung wird üblicherweise bei einer Tempesetzung von. Aminosäuren oder deren Oligomeren mit io ratur von etwa 0 bis 25°C durchgeführt. Nachdem Alkyloxykarbaziden, wie z. B. tert.-Butyloxykarbazid, das abspaltende Mittel unter reduziertem Druck ab-2-(p-Biphenyl)-isopropyloxykarbazid und andere ahn- destilliert wurde, wird das auf diese Weise von dem liehe, in Anwesenheit eines Alkalis bei Zimmer- Harz abgespaltene Peptid mit einem organischen temperatur erfolgen. Unter diesen wird tert.-Butyl- Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäure, extrahiert, und oxykarbazid, das eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe 15 das Harz wird von dem Extrakt abfiltriert. Wenn (im folgenden als »BOC« bezeichnet) bildet, als Schutz- notwendig, wird der Extrakt durch eine Kolonne eines gruppe am meisten bevorzugt. Ionenaustauscherharzes geleitet, das z. B. »AmberliteCarry out the terminal amino groups of the amino acids or that of the desired peptide on the resin. Oligomers of the same are first coated with protective After washing, that is bound to the resin groups are "blocked", and then the N-blocking 5 peptides are cleaved from the resin by the th amino acids or oligomers of the same on resins resin with a releasing agent, such as, for example, water-bound, which are in the solid state under those for free hydrogen fluoride or with hydrogen bromide peptide-forming reaction to be applied- saturated trifluoroacetic acid, is brought into contact, are located. The blocking can be done by TJm- The treatment is usually given with a temp setting from. Amino acids or their oligomers with io temperature of about 0 to 25 ° C carried out. After Alkyloxy carbazides, e.g. B. tert-Butyloxykarbazid, the releasing agent under reduced pressure from-2- (p-Biphenyl) -isopropyloxykarbazid and other ahn- was distilled in this way from the borrowed peptide, split off in the presence of an alkali in Zimmer resin, with an organic one temperature. Among these, tert-butyl solvents such as. B. acetic acid, extracted, and oxykarbazid, which has a tert-butyloxycarbonyl group, 15 the resin is filtered off from the extract. When (hereinafter referred to as "BOC") forms, as protection is necessary, the extract is passed through a column of a group most preferred. Ion exchange resin passed, the z. B. “Amberlite
Das Verfahren zum Verbinden der Aminosäure IR-45« sein kann, wobei das Peptid durch den Ionenoder des Oligomeren derselben mit dem Harz ist nicht austauscher absorbiert und eluiert wird. Anschließend kritisch, nach einem bevorzugten Verfahren wird 20 wird das Peptid gesammelt und lyophiliert, um reines jedoch das Harz zuerst chlormethyliert oder hydroxyl- Peptid zu erhalten.The method of joining the amino acid IR-45 «can be with the peptide by the ion or of the oligomer of the same with the resin is not absorbed and eluted from the exchanger. Subsequently critically, in a preferred method, the peptide is collected and lyophilized to obtain pure however, the resin will first get chloromethylated or hydroxyl peptide.
methyliert, und dann wird das auf diese Weise modi- Erfindungsgemäß ist es wesentlich, die peptidbildenfizierte
Harz mit N-blockierter Aminosäure oder deren de Kondensationsumsetzung mit herkömmlichen Ver-Oligomerem
in einer organischen Lösung umgesetzt. fahren in fester Phase unter dsr Bestrahlung von
Für diesen Zweck sind verschiedene Harze, die unter 35 Ultraschallwellen durchzuführen,
den für die Peptidbildueg anzuwendenden Reaktions- Durch die Bestrahlung mit Ultraschallwellen ist es
bedingungen fest sind, geeignet; sehr bevorzugt zu möglich, die Umsetzungsgeschwindigkeit der Kondenverwenden
ist ein Styrol-Divinylbenzol-Mischpoly- sationsreaktion zu erhöhen und die Reaktion einheitmerisat.
lieh durchzuführen. Tatsächlich kann erfindungsgemäßAccording to the invention, it is essential to react the peptide-forming resin with N-blocked amino acid or its de condensation reaction with conventional ver oligomers in an organic solution. drive in solid phase under dsr irradiation of For this purpose are different resins, which carry out under 35 ultrasonic waves,
the reaction to be used for the formation of peptides. By irradiation with ultrasonic waves, conditions are fixed, suitable; It is very preferable to use a styrene-divinylbenzene mixed polymerization reaction to increase the rate of conversion of the condensers and to increase the reaction uniformity. borrowed to perform. Indeed, according to the invention
Das mit einer Aminosäure oder deren Oligomcrem 30 die Kondensationsumsetzung innerhalb einer kurzenThat with an amino acid or its Oligomcrem 30 the condensation reaction within a short
gebundene Harz wird anschließend einer Quell- und Zeit von 5 bis 10 Minuten üblicherweise abgeschlossenBound resin is then usually completed with a swelling and time of 5 to 10 minutes
Waschstufe unterzogen und dann einer Stufe zum werden, während bei der herkömmlichen Kondensa-Subjected to a washing stage and then a stage to become, while in the conventional condensation
Entblockieren der N-ständigen Blockgruppe. Die tionsumsetzung, bei welcher keine Bestrahlung durchUnblock the N-standing block group. The implementation in which no irradiation occurs
Quellstufe wird deshalb bevorzugt (obwohl sie nicht Ultraschallwellen erfolgt, etwa 2 bis 4 Stunden erfor-The swelling stage is therefore preferred (although it does not use ultrasound waves, about 2 to 4 hours are
immer notwendig ist), um die anschließende peptid- 35 derlich sind.is always necessary) in order to make the subsequent peptide changes.
bildende Umsetzung zu erleichtern. In dieser Stufe Durch einen Zyklus dieses Verfahrens kann ein Molto facilitate educational implementation. At this stage, through one cycle of this process, one mole
wird das Harz mit einer organischen Flüssigkeit, die der Aminosäure oder des Oligomeren von dieserthe resin is mixed with an organic liquid that is the amino acid or the oligomer of this
zum Quellen des Harzes geeignet ist, in Kontakt ge- einheitlich an jede der zuerst an das Harz gebundenenis suitable for swelling the resin, in contact uniformly with each of the first bonded to the resin
bracht. Eine derartige organische Flüssigkeit ist z. B. Aminosäure oder Oligomeren derselben gekuppeltbrings. Such an organic liquid is e.g. B. amino acid or oligomers thereof coupled
Methylenoxyd, Dioxan, Dimethylformamid usw. Die 4° werden.Methylene oxide, dioxane, dimethylformamide, etc. The 4 ° will be.
anschließende Waschstufe wird durchgeführt, um das Die für diesen Zweck anzuwendenden Ultraschall-Quellmittel zu entfernen, wozu ein geeignetes organi- wellen sind solche von etwa 18 kc/s bis vorzugsweise sches Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäure, verwendet etwa 20 kc/s.The subsequent washing step is carried out to remove the ultrasonic swelling agent to be used for this purpose to remove, for which a suitable organic wave are those of about 18 kc / s up to preferably cal solvent, such as. B. acetic acid, uses about 20 kc / s.
wird. Die Entblockierungsstufe wird durchgeführt, Die zur Erzeugung der Ultraschallwellen verwendindem
ein bekanntes chemisches Mittel, wie z. B. eine 45 baren Apparate können verschiedener Art sein. Zur
Mischung aus Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure Anwendung der Ultraschallwellen wird vorzugsweise
oder eine Mischung aus Trifluoressigsäure und Me- ein Ende des Ultraschallvibrator in das Reaktionsthylenchlorid,
verwendet wird. Das bevorzugte Mi- system gebracht und die Ultraschallwellen erzeugt,
schungsverhältnis in diesen Mischungen ist 1:1 Ge- Das vorzugsweise zu verwendende Reaktionsgefäß ist
wichtsprozent. Die Entblockierungsstuie wird in 50 ein solches, das einen Mantel für fließendes Wasser
üblicher Weise durchgeführt, z. B. indem das Harz mit einer konstanten Temperatur aufweist,
mit dem Reaktionsmittel bei Zimmertemperatur in Ernndungsgemäß können Ultraschallwellen nicht
Kontakt gebracht wird. Das von der Schutzgruppe nur bei der Kondensationsumsetzungsstufe, sondern
befreite Harz wird gewaschen, um überschüssiges auch bei der Extraktionsstufe, bei welcher das gebildete
Entblockierungsmittel zu entfernen. Danach wird das 55 Peptid in die Extraktionslörungsschicht, nach AbHarz
mit einer geeigneten Base, wie z. B. tertiäres spaltung des Peptids von dem Harz, übergeführt wird,
Alkylamin, neutralisiert und wieder zur Entfernung angewendet werden, wobei die Extraktionszeit bedieser
Base gewaschen. Danach wird die an das Harz merkenswert reduziert wird, während die Menge des
gebundene erhaltene Aminosäure oder deren Oligo- Extraktes in großem Maße erhöht wird. Tatsächlich
meres einer Kondensationsreaktion mit Aminosäure 60 wird durch die Anwendung von Ultraschallwellen die
oder deren Oligomerem unterzogen, wobei die Amino- Extraktionszeit auf etwa 3 bis 5 Minuten reduziert,
gruppe in derselben Weise wie zuvor blockiert wird, während ohne die Anwendung derselben die Extrakum
das Peptid auf dem Harz zu bilden. Die Konden- tionszeit etwa 0,5 bis 1 Stunde dauert. Überdies kann
sationsumsetzung wird bei Zimmertemperatur unter nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wenigstens
Verwendung eines Kondensationsmittels, wie z. B. 65 eine der Vorbehandlungs- und Nachbehandlungs-Dicyclohexylcarbodiimid,
usw. durchgeführt. Durch stufen für die peptidbildende Umsetzung, wie z. B.
Waschen des erhaltenen Produkts aus der Konden- Quellstufe, Waschstufen, Entblockierungsstufe und
sationsumsetzung wird das an das Harz gebundene Neutralisierungsstufe, unter Bestrahlung mit Ultra-will. The deblocking step is carried out using a known chemical agent such as a chemical agent to generate the ultrasonic waves. B. a 45 bar apparatus can be of various types. For the mixture of hydrochloric acid and acetic acid application of the ultrasonic waves is preferably used or a mixture of trifluoroacetic acid and Me- one end of the ultrasonic vibrator in the reaction ethylene chloride is used. The preferred mi- system brought and the ultrasonic waves generated, the ratio in these mixtures is 1: 1 Ge The preferred reaction vessel to be used is weight percent. The Entblockierungsstuie is carried out in such a way that a coat for running water is carried out in the usual way, e.g. B. by having the resin at a constant temperature,
ultrasonic waves cannot be brought into contact with the reactant at room temperature. The resin freed from the protective group only in the condensation reaction stage but is washed in order to remove excess also in the extraction stage, in which the deblocking agent formed. Then the 55 peptide is in the extraction solution layer, after AbHarz with a suitable base, such as. B. tertiary cleavage of the peptide from the resin, is converted, alkylamine, neutralized and reapplied for removal, the extraction time of this base being washed. Thereafter, that of the resin is remarkably reduced while the amount of the bound amino acid or its oligo-extract obtained is largely increased. In fact, more of a condensation reaction with amino acid 60 is subjected to the oligomer or its oligomers by the application of ultrasonic waves, reducing the amino extraction time to about 3 to 5 minutes, group being blocked in the same way as before, while without the application of the extracum the peptide to form on the resin. The condensation time takes about 0.5 to 1 hour. In addition, sationsumetzung is carried out at room temperature under the inventive method at least using a condensing agent, such as. B. 65 one of the pre-treatment and post-treatment dicyclohexylcarbodiimide, etc. performed. By stages for the peptide-forming implementation, such as. B. washing of the product obtained from the condensate swelling stage, washing stages, deblocking stage and sationsumetzung, the neutralization stage bound to the resin, under irradiation with ultra-
schallwellen durchgeführt werden. Die Bestrahlung mit Ultraschallwellen dient zur schnellen Erzielung der gewünschten Ergebnisse. Wenn z. B. bei der Quellstufe Ultraschallwellen angewendet werden, wird ein wirksamer Quellvorgang innerhalb einer kurzen Zeit erreicht. Außerdem wird durch Bestrahlung mit Ultraschallwellen die Waschstufe und Entblockierungsstufe innerhalb einer kürzeren Zeit abgeschlossen.sound waves are carried out. The irradiation with ultrasonic waves is used for quick achievement the desired results. If z. B. be applied at the source stage ultrasonic waves, a effective swelling process achieved within a short time. In addition, by irradiation with ultrasonic waves the washing step and deblocking step completed in a shorter time.
Deshalb erfolgt vorzugsweise die Durchführung der erwähnten Vorbehandlungs- und Nachbehandlungsstufen unter Einwirkung von Ultraschallwellen in dem Reaktionsgefäß für die peptidbildende Umsetzung, in welchem die Ultraschallbehandlung durchgeführt werden kann. In diesen Fällen sind Ultraschallwellen verschiedener Frequenzen ebenso anwendbar, aber solche mit einer Frequenz von 18 bis 22 kc/s sind — ebenso wie für die peptidbildende Umsetzung — vorzuziehen.Therefore, the aforementioned pre-treatment and post-treatment stages are preferably carried out under the action of ultrasonic waves in the Reaction vessel for the peptide-forming reaction in which the ultrasound treatment is carried out can. In these cases, ultrasonic waves of different frequencies are applicable as well, however those with a frequency of 18 to 22 kc / s are - as well as for the peptide-forming conversion - preferable.
110 g ω-Nitro-L-Arginin wurden in 500 ml einer ln-NaOH-Lösung gelöst, und zu dieser Lösung wurde eine Mischung von 85,9 g tert-Butyloxykarbazid und 500 ml Dioxan gegeben. Zu der erhaltenen Mischung wurden 85 ml Triäthylamin gegeben und das ganze für 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach dem Abdestillieren von niedrigsiedenden Substanzen aus der erhaltenen Reaktionsmischung unter reduziertem Druck wurde der Rückstand über Kaliumsulfat getrocknet und 140 g t.-BOC-eu-Nitro-L-Arginin erzeugt Es wurden 10 g des chlormethylierten Mischpolymerisats aus Styrol und Divinylbenzol (Mischpolymerisationsverhältnis 98: 2 Gewichtsprozent), in welchem 0,84 Milliäquivalente des Chlors pro Gramm des Mischpolymerisats enthalten sind, in einer Mischung aus 100 ml Äthylalkohol und 50 ml Chloroform suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10,4 g L-BOC-eu-Nitro-L-Arginin und 4,7 ml Triäthylamin gegeben und die Mischung unter Rückflußbedingungen 48 Stunden lang erhitzt, um das L-BOC-co-Nitro-L-Arginin an das Mischpolyme-110 g of ω-nitro-L-arginine were in 500 ml of a Dissolved in NaOH solution, and a mixture of 85.9 g of tert-butyloxy carbazide and 500 ml of dioxane given. To the mixture obtained, 85 ml of triethylamine were added and the whole left for 48 hours at room temperature. After distilling off low-boiling substances from the obtained reaction mixture under reduced pressure, the residue was poured over potassium sulfate dried and 140 g of t-BOC-eu-nitro-L-arginine 10 g of the chloromethylated copolymer of styrene and divinylbenzene were produced (Copolymerization ratio 98: 2 percent by weight), in which 0.84 milliequivalents des Chlorine per gram of the copolymer are contained in a mixture of 100 ml of ethyl alcohol and 50 ml of chloroform suspended. 10.4 g of L-BOC-eu-nitro-L-arginine and Added 4.7 ml of triethylamine and the mixture heated under reflux conditions for 48 hours to the L-BOC-co-nitro-L-arginine to the mixed polymer
risat zu binden. Das erhaltene Harz wurde dann mit Essigsäure gewaschen und getrocknet, worauf 10,6 g des t.-BOC-w-Nitro-L-Arginylharzes erhalten wurden, in welchem 0,21 Millimol Arginin pro Gramm des Harzes enthalten waren.to bind risat. The resulting resin was then washed with acetic acid and dried, yielding 10.6 g of the t-BOC-w-nitro-L-arginyl resin were obtained, which contained 0.21 millimoles of arginine per gram of resin.
1,00 g des auf diese Weise erhaltenen, gut getrockneten t.-BOC-co-Nitro-L-Arginylharzes wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben und 10 ml Methylenchlorid zugeführt, um das Harz voll aufzuquellen. Das Methylenchlorid wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert, und spezielle Mengen von Reagenzpartnern wurden in das das Harz enthaltende Reaktionsgefäß in der Reihenfolge, wie sie in Tabelle 1 angegeben ist, gegeben, wobei nach jeder der angegebenen Stufen eine Ultraschallweüenbestrahlung mit einer Frequenz von 20 kc/s für eine bestimmte Zeit erfolgte. Die erhaltene Flüssigkeit wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert. Durch einen Zyklus der Stufen, wie er in Tabelle 1 angegeben ist, wurde das Peptid erhalten,1.00 g of the well-dried t.-BOC-co-nitro-L-arginyl resin obtained in this way was poured into a Given the reaction vessel and added 10 ml of methylene chloride to fully swell the resin. The methylene chloride was filtered off with a suction pump, and special amounts of reagent partners were made into the reaction vessel containing the resin in the order given in Table 1, given, after each of the specified stages an ultrasound radiation with a frequency of 20 kc / s for a certain time. The obtained liquid was drawn with a suction pump filtered off. By cycling the steps as given in Table 1, the peptide was obtained
ao wobei 1 Mol der verwendeten Aminosäure mit 1 Mol der an das Harz gebundenen Aminosäure kondensiert wurde. Es wurden verschiedene t.-BOC-Aminosäuren für die peptidbildende Reaktion in der folgenden Reihenfolge verwendet: t.-BOC-L-Phenylalanin,ao where 1 mol of the amino acid used condenses with 1 mol of the amino acid bound to the resin would. Various t-BOC amino acids have been used for the peptide-forming reaction in the following Order used: t.-BOC-L-phenylalanine,
as t.-BOC-L-Prolin, t.-BOC-0-Benzyl-L-Serin, t.-BOC-L-Phenylalanin, t.-BOC-Glyzjn, t.-BOC-L-Prolin und t.-BOC-w-Nitro-L-Arginin. Bei jedem Zyklus wurden in der peptidbildenden Reaktion nach der Zugabe der t.-BOC-Aminosäure Ultraschallwellen für die Dauer von 0,5 Minuten einwirken gelassen, und dann wurde Dicyciohexylkarbodiimid als das Kondensationsmitte] dem System zugeführt, worauf eine 2,5 Minuten dauernde Einwirkung mit Ultraschallwellen erfolgte. Jede der t.-BOC-Aminosäuren wurde in der Form einer in Methylenchlorid gelösten Lösung verwendet, und das verwendete Dicyclohexykarbodiimid wurde ebenfall: in der Form der Methylenchlorid-Lösung zugegeben Es wurden 1,15 g t.-BOC-cu-Nitro-L-Arginyl-L-Prolyl L - Prolyl - Glycyl - L - Phenylalanyl - O - Benzyl - L - Seryl L-Prolyl-L-Phenylalanyl-co-Nitro-L-Arginyl-Harz ge wonnen.as t.-BOC-L-proline, t.-BOC-0-benzyl-L-serine, t.-BOC-L-phenylalanine, t.-BOC-Glyzjn, t.-BOC-L-proline and t.-BOC-w-nitro-L-arginine. In each cycle were in the peptide-forming reaction after the addition of the t.-BOC-amino acid was allowed to act on ultrasonic waves for a period of 0.5 minutes, and then was Dicyciohexylkarbodiimide as the condensation agent] is added to the system, followed by a 2.5 minute run Exposure to ultrasonic waves took place. Each of the t-BOC amino acids was in the form of an in Methylene chloride dissolved solution was used, and the dicyclohexykarbodiimide used was also: added in the form of the methylene chloride solution. 1.15 g of t-BOC-cu-nitro-L-arginyl-L-prolyl were added L - Prolyl - Glycyl - L - Phenylalanyl - O - Benzyl - L - Seryl L-prolyl-L-phenylalanyl-co-nitro-L-arginyl resin ge won.
Stufestep
ReagenzReagent
Menge an Einwirkung Anzahl der Reagenz von Ultra- Behandschallwellen lungen in Min.Amount of action number of Reagent of ultrasound treatment waves lungs in min.
919,4 g des auf diese Weise erhaltenen Peptidharzes 65 wobei das Peptid von dem Harz abgespalten wind wurde getrocknet und danach in 15 ml wasserfreiem Daraufhin wurde unter reduziertem Druck der Fluo Fluorwasserstoff bei 00C für die Dauer von 60 Mi- wasserstoff- and die flüchtigen Substanzen entferr nuten in Anwesenheit von 1,5 ml Anisol behandelt. Der Rückstand wurde in 20 ml ln-Essigsäure suspe919.4 g of the peptide resin thus obtained 65 was dried wherein the peptide wind cleaved from the resin, and thereafter ml in 15 anhydrous Thereupon under reduced pressure, the Fluo hydrogen fluoride at 0 0 C for the duration of hydrogen of 60 micro and the Volatile substances are treated in the presence of 1.5 ml of anisole. The residue was suspended in 20 ml of ln acetic acid
diert und mit Ultraschallwellen mit einer Frequenz von 20 kc/s für die Dauer von 3 Minuten zur Extraktion behandelt. Die das freie Peptid enthaltende Flüssigkeitsphase wurde mit einer Saugpumpe abfiltriert, und das Filtrat wurde durch eine Säule von »Amberlite IR-45« geleitet. Die Säule wurde mit ln-Essigsäure gewaschen. Das das Peptid enthaltende Eluat wurde aufgefangen und lyophiliert. Das erhaltene Pulver wurde über Phosphorpentoxyd in einem Exsikkator getrocknet und 177 mg des gewünschten Produktes, i. e. Bradykinin, erhalten. Die Ausbeute betrug 83,5%. Das Produkt hatte das gleiche Verhalten wie eine authentische Probe bei der Papierelektrophorese unter Verwendung einer Pufferlösung bei 4,8 pH und eine optische Drehung (D-Linie, 190C) von —77,4° (C 1,28, 1 η-Essigsäure). Die optische Drehung von reinem Bradykinin betrug —76,5° (C 1,27, ln-Essigsäure). (Literaturhinweis: J. Amer. Chem. Soc, Bd. 86, S. 304, 1964.) Die Aminosäureanalyse des Produktes (in 6n-Chlorwasserstoffsäure ao bei 1050C für die Dauer von 24 Stunden hydrolysiert) ergab die Werte von 1,94 (2) für Arginin, 0,95 (1) für Serin, 1,00 (1) für Glyzin, 3,02(3) für Prolin und 2,04 (2) für Phenylalanin (die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben). Die biologische Prü- as fung des Produkts an einem Hemmuskel von Meerschweinchen zeigte die gleiche spezifische Aktivität wie bei Aer authentischen Probe von Bradykinin, wie aus A b b. 1 ersichtlich ist, in welcher die Linie A die Aktivität des Produkts zeigt und die Linie B die Aktivität der authentischen Probe von Bradykinin zeigt.dated and treated with ultrasonic waves at a frequency of 20 kc / s for a period of 3 minutes for extraction. The liquid phase containing the free peptide was filtered off with a suction pump and the filtrate was passed through a column of "Amberlite IR-45". The column was washed with 1N acetic acid. The eluate containing the peptide was collected and lyophilized. The powder obtained was dried over phosphorus pentoxide in a desiccator and 177 mg of the desired product, ie bradykinin, were obtained. The yield was 83.5%. The product had the same behavior as an authentic sample on paper electrophoresis using a buffer solution at 4.8 pH and an optical rotation (D-line, 19 0 C) of -77.4 ° (C 1.28, 1 η- Acetic acid). The optical rotation of pure bradykinin was -76.5 ° (C 1.27, in-acetic acid). (Reference: J. Amer. Chem. Soc, Vol. 86, p. 304, 1964.) The amino acid analysis of the product (hydrolyzed in 6N hydrochloric acid ao at 105 ° C. for a period of 24 hours) gave the values of 1, 94 (2) for arginine, 0.95 (1) for serine, 1.00 (1) for glycine, 3.02 (3) for proline and 2.04 (2) for phenylalanine (theoretical values are given in brackets ). The biological Prü- as evaporation of the product to a Hemmuskel of guinea pigs showed the same specific activity as authentic at Aer sample of bradykinin, as shown in A b b. 1, in which line A shows the activity of the product and line B shows the activity of the authentic sample of bradykinin.
Tert.-BOC-L-Alanylharz, in welchem 0,287MiUimol des L-Alanins pro 1 Gramm Harz enthalten sind, wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß L-AIa-Tert.-BOC-L-alanyl resin in which 0.287MiUimol of L-alanine are contained per 1 gram of resin, was in the same manner as described in Example 1, produced, with the exception that L-AIa-
35 nin an Stelle von Arginin verwendet wurde. In ein Reaktionsgefäß wurde t.-BOC-L-Alanylharz (in welchem 0,287 Millimol von L-Alanin pro Gramm Harz enthalten sind) gegeben und Methylenchlorid dazu gegeben, um das Harz voll aufzuquellen. Nach dem Abfiltrieren des Methylenchlorids wurden die Reaktionsstufen, wie aus Tabelle 2 ersichtlich, in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt, wobei jede Stufe in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurde, indem t.-BOC-Aminosäuren in der folgenden Reihenfolge zugegeben wurden: t.-BOC-ε-Benzyloxycarbonyl-L-Lysin, t.-BOC-L-Prolin, t.-BOC-cü-Benzyl-L-Threonin, t.-BOC-O-Benzyl-L-Tyrosin, t.-BOC-L-Phenylalanin, t.-BOC-L-Phenylalanin, t.-BOC-Glyzin und t.-BOC-0-Nitro-L-Arginin. Dies ergab t. - BOC -ω - Nitro - L Arginyl - Glycyl - L - Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-O-Benzyl-L-Tyrosyl-O-Benzyl-L-Threonyl-L-Prolyl-e-Benzyloxykarbonyl-L-Lysyl-L-Alanylharz. Das auf diese Weise erhaltene Peptidharz wurde mit wasserfreiem Wasserstofffluorid, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei das Peptid von dem Harz abgespalten wurde. Das von dem Harz befreite Peptid wurde dann in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt und ergab das gewünschte Produkt in der Form von Pulver, i. e. L - Arginyl - Glyzyl - L - Phenylalanyl - L - Phenylalanyl-L-Tyros >l-L-Threonyl-L-Prolyl-L-Alanin. Das Produkt wurde einer Papierelektrophorese unter Verwendung einer Pufferlösung bei 4,8 pH und einer Farbreaktion mit Ninhydrin nach dem Verfahren von Pauli und Sakaguchi unterworfen. Es wurde dabei nur ein einzelner Fleck gefunden. Die Aminosäureanalyse des Produkts (in on-Chlorwasserstoffsäure bei 1050C für die Dauer von 24 Stunden hydrolysiert) ergab die folgenden Werte: 0,84 (1) für Lysin, 0,83 (i) für Arginin, 0,85 (1) für Threonin, 0,77 (1) füi Prolin, 1,07 (1) für Glyzin, 1,00 (1) für Alanin, 0,66 (1) für Tyrosin und 1,92 (2) für Phenylalanin (die theoretischen Werte sind in Klammern angegeben). 35 nin was used in place of arginine. T-BOC-L-alanyl resin (which contains 0.287 millimoles of L-alanine per gram of resin) was placed in a reaction vessel, and methylene chloride was added to fully swell the resin. After the methylene chloride had been filtered off, the reaction steps, as shown in Table 2, were carried out in the order given, each step being carried out in the same manner as described in Example 1 by adding t.-BOC-amino acids in the following order: t.-BOC-ε-benzyloxycarbonyl-L-lysine, t.-BOC-L-proline, t.-BOC-cü-benzyl-L-threonine, t.-BOC-O-benzyl-L-tyrosine, t. -BOC-L-phenylalanine, t.-BOC-L-phenylalanine, t.-BOC-glycine and t.-BOC-0-nitro-L-arginine. This resulted in t. - BOC -ω - Nitro - L Arginyl - Glycyl - L - Phenylalanyl-L-Phenylalanyl-O-Benzyl-L-Tyrosyl-O-Benzyl-L-Threonyl-L-Prolyl-e-Benzyloxycarbonyl-L-Lysyl-L- Alanyl resin. The peptide resin obtained in this way was treated with anhydrous hydrogen fluoride as described in Example 1, the peptide being cleaved from the resin. The de-resinated peptide was then treated in the same manner as described in Example 1 to give the desired product in the form of powder, ie L - Arginyl - Glyzyl - L - Phenylalanyl - L - Phenylalanyl-L-Tyros> IL- Threonyl-L-prolyl-L-alanine. The product was subjected to paper electrophoresis using a buffer solution at pH 4.8 and color reaction with ninhydrin by the method of Pauli and Sakaguchi. Only a single spot was found. The amino acid analysis of the product (hydrolyzed in on-hydrochloric acid at 105 ° C. for a period of 24 hours) gave the following values: 0.84 (1) for lysine, 0.83 (i) for arginine, 0.85 (1) for threonine, 0.77 (1) for proline, 1.07 (1) for glycine, 1.00 (1) for alanine, 0.66 (1) for tyrosine and 1.92 (2) for phenylalanine (the theoretical Values are given in brackets).
im wesenlin the essential
:hrieben hergestellt, wöbe jedoch kerne Einwirkung durch UltraschailweHei erfolgte. Die Reihenfolge der Behandlung ist wie folgt:: Written produced, however, there would be no effect from ultrasonic waves took place. The order of treatment is as follows:
609 «84/32609 «84/32
Claims (1)
Applications Claiming Priority (2)
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Publications (3)
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