DE2361878A1 - METHOD FOR MANUFACTURING CYCLODEXTRIN-GLYCOSYL TRANSFERASE - Google Patents
METHOD FOR MANUFACTURING CYCLODEXTRIN-GLYCOSYL TRANSFERASEInfo
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Description
transferase.transferase.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms Cyclodextrin-Glycosyltransferase unter Anwendung des Bacillus macerans.The present invention relates to a method of manufacture of the enzyme cyclodextrin glycosyltransferase Application of the Bacillus macerans.
Es ist seit langem bekannt, daß Bacillus macerans ein Enzym erzeugt, das im allgemeinen als Cyclodextrin-Glycosyltransferase (CGT).bezeichnet wird, das aber auch als Bacillus Biacerans-Amylase, Chardinger-Dextrinogenase und Cyclodextrin-Transglycosidase bekannt ist. Dieses Enzym ist in der Lage, Stärke zu einer Reihe von nicht reduzierenden, cyclischen D-Glucosylpolymeren abzubauen, die als Cyclodextrine oder Schardinger-Dextrine bekannt sind. Cyclodextrine sind imstande, Einschlußkomplexe mit einer Vielfalt von anderen Molekülen zu bilden, und diese Eigenschaft ermöglicht die Anwendung bei einer Anzahl von chemisch orientierten Industrien, z.B* bei der Nahrungsmittelindustrie sowie bei der ρetrochemischen und pharmazeutischen Industrie.It has long been known that Bacillus macerans is a Enzyme produced, commonly called cyclodextrin glycosyltransferase (CGT), but also as Bacillus Biacerans amylase, Chardinger dextrinogenase and cyclodextrin transglycosidase is known. This enzyme is able to convert starch to a number of non-reducing, cyclic D-glucosyl polymers that degrade as cyclodextrins or Schardinger dextrins are known. Cyclodextrins are able to Form inclusion complexes with a variety of other molecules, and this property enables that Used in a number of chemically oriented industries, e.g. the food industry as well as the ρetrochemical and pharmaceutical industries.
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Einer der Nachteile für die breite Ausnutzung der Cyclodextrine war in der Vergangenheit die Schwierigkeit, das wichtige Umwandlungsenzym CGT herzustellen. Bekannte Verfahren zur Herstellung von CGT haben die Züchtung des Bacillus macerans in Medien umfaßt, die Kartoffelstücke, Kartoffelextrakt, Hafermehl oder Weizenkleie enthielten. Diese Verfahren zeigen jedoch den Nachteil, daß lange Züchtungszeiten erforderlich waren (z.B. bis zu zwei Wochen), um das CGT zu erzeugen. Im übrigen sind die angewandten Medien chemisch nicht genau definiert. Versuche, CGT in genau definierten Medien zu erzeugen, die frei sind von natürlichen, stärkehaltigen Materialien, haben sich bisher als wenig erfolgreich erwiesen.One of the disadvantages of the wide use of cyclodextrins has been the difficulty in the past to produce the important conversion enzyme CGT. Known procedures for the production of CGT have included the cultivation of Bacillus macerans in media containing potato pieces, potato extract, Contained oatmeal or wheat bran. However, these methods have the disadvantage that long cultivation times (e.g. up to two weeks) were required to achieve the Generate CGT. In addition, the media used are chemically not precisely defined. Attempts at CGT in well-defined Producing media that are free from natural, starchy materials have so far proven to be unsuccessful proven.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren aar Herstellung von Cyclodextrin-Glycosyltransferase (CGT) und ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Bacillus macerans in einem flüssigen Medium züchtet, das am Anfang bis 30 Gew.-%/V, z.B. 5 bis 30 Gew.-%/V, einer löslichen Stärke Kohlenstoffquelle, eine oder mehrere Quellen für Stickstoff und Phosphor, wesentliche Mineralien und die Vitamine Biotin und Thiamin enthält unter Bedingungen, die erlauben, daß die Stärkekonzentration in dem Medium auf ein Maß fällt, bei dem das Wachsen des Bacillus macerans begrenzt wird und danach dem Bacillus die Bildung von CGT gestattet.The present invention relates to a method of manufacture of cyclodextrin glycosyltransferase (CGT) and is characterized in that the Bacillus macerans in a liquid medium which initially contains up to 30% by weight / V, e.g. 5 to 30% by weight / V, of a soluble starch carbon source, one or more sources of nitrogen and phosphorus, essential minerals and the vitamins biotin and Thiamine contains under conditions which allow the starch concentration in the medium to drop to a level which limits the growth of Bacillus macerans and then allows Bacillus to produce CGT.
Der Ausdruck "lösliche Stärke", wie er hierbei angewandt wird, bedeutet Stärke, die durch die Einwirkung von oxidierenden Agentien, Säuren, Glycerin oder Enzymen modifiziert worden ist, so daß das Produkt in heißem Wasser löslich oder dispergierbar gemacht wird.The term "soluble starch" as used herein means starch modified by the action of oxidizing agents, acids, glycerin or enzymes so that the product is made soluble or dispersible in hot water.
Die Anfangskonzentration der löslichen Stärke in dem flüssigen Medium beträgt vorzugsweise 10 bis 20 Gew,-%/V.The initial concentration of the soluble starch in the liquid medium is preferably 10 to 20% by weight / volume.
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·- Man soll den Bacillus vorzugsweise so weit wie möglich ' wachsen lassen, bevor die Stärkekonzentration auf ein Maß . reduziert wird, bei dem das Wachstum eingeschränkt'wird oder überhaupt nicht mehr stattfindet. Im allgemeinen hat man gefunden, daß maximale Ausbeuten an trockener Biomasse, die aus dem Verfahren verfügbar sind, im Bereich zwischen 1,5 bis 5,0 Gew.-%/V liegen, und demgemäß sollte man den Bacillus wachsen lassen, bis er eine Konzentration von 1,5 bis 5,0 Gew.-%/V erreicht (bezogen auf die trockene Biomasse), bevor die Stärkekonzentration auf ein Maß fällt, bei dem das Wachstum weitgehend gestoppt wird. Gerade bei dieser Stufe wird die CGT rasch erzeugt, und man sollte die Stärkekonzentration nicht zunehmen lassen, bis die gewünschte Menge an CGT vorhanden ist. Die CGT wird normalerweise innerhalb eines Zeitraumes von 10 bis 50 Stunden erzeugt, und zwar gerechnet von dem Punkt an, bei dem das Wachstum des Bacillus durch das Absinken der Stärkekonzentration stark gebremst wird.- You should preferably bacillus as much as possible ' Let it grow before the starch concentration to a level. is reduced, in which the growth is restricted or no longer takes place at all. In general, it has been found that maximum yields of dry biomass that available from the process range between 1.5 to 5.0 wt% / v and accordingly one should be the Bacillus let it grow until it reaches a concentration of 1.5 to 5.0% by weight / V (based on the dry biomass), before the starch concentration drops to a level where growth is largely stopped. Especially at this stage the CGT is generated rapidly, and one should not allow the starch concentration to increase until the desired amount is reached CGT is present. The CGT is usually within a Period of 10 to 50 hours generated, calculated from the point at which the growth of Bacillus is greatly slowed down by the drop in starch concentration will.
CGT wird von dem Bacillus in beträchtlichen Mengen erzeugt, wenn die Wachstumsgeschwindigkeit durch die Verringerung der Konzentration der Stärkelösung auf einen Wert im Bereich von 0,2 bis 16,0 Gew.-%/V eingeschränkt wird.CGT is produced by the Bacillus in considerable amounts when the growth rate is reduced by the the concentration of the starch solution is restricted to a value in the range from 0.2 to 16.0% by weight / V.
Obgleich man andere Bedingungen anwenden kann, hat es sich gezeigt, daß eine Temperatur von 32 bis 400C, z. B. 39°C, und ein pH-Wert von 6,5 bis 7,5, z.B. 7,1, sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen. Das Wachsen des Bacillus ist ein aerober Vorgang, und daher sollten Luft und Sauerstoff bei dem Verfahren während der Wachstums stuf en des Bacillus zugeführt werden. Vorzugsweise sollte man auch das Medium rühren.Although other conditions can be used, it has been found that a temperature of 32 to 40 0 C, z. B. 39 ° C, and a pH of 6.5 to 7.5, for example 7.1, are suitable for the process according to the invention. The growth of the Bacillus is an aerobic process and therefore air and oxygen should be added to the process during the growth stages of the Bacillus. It is preferable to stir the medium as well.
U 0 9 8 ? 5 / 1 0 B 9 U 0 9 8? 5/1 0 B 9
- 4 - 44 093- 4 - 44 093
Das flüssige Medium enthält vorzugsweise als Quellen für Stickstoff lind Phosphor Diammoniuinhydrogenphosphat und Ammoniumdihydro genpho sphat, wobei die Menge an (NIL)2HPO^ 1 bis 20 g/l und die Menge an NH4H2PO^ 0,5 bis 10 g/l beträgt.The liquid medium preferably contains as sources of nitrogen and phosphorus diammoniuin hydrogen phosphate and ammonium dihydrogen phosphate, the amount of (NIL) 2 HPO ^ 1 to 20 g / l and the amount of NH 4 H 2 PO ^ 0.5 to 10 g / l is.
Die Metalle Magnesium und Calcium und die Spurenelemente Eisen und Mangan werden vorzugsweise in Form ihrer Chloride zugegeben. Die bevorzugte Menge von FeCIo*4H20 beträgt 2 bis 15 mg/1 und die bevorzugte Menge von MhCIo'4H0O 2 bis 20 mg/1, Zusätzlich kann das Medium noch 0,5 bis 5 mg/1 ZnO enthalten.The metals magnesium and calcium and the trace elements iron and manganese are preferably added in the form of their chlorides. The preferred amount of FeClo * 4H 2 0 is 2 to 15 mg / 1 and the preferred amount of MhClo'4H 0 O 2 to 20 mg / 1. In addition, the medium can also contain 0.5 to 5 mg / 1 ZnO.
Das Medium enthält das Vitamin Biotin vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 15 /Ug/1 und das Vitamin Thiamin als Hydrochlorid, vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 2 mg/1.The medium contains the vitamin biotin preferably in an amount of 0.5 to 15 / Ug / 1 and the vitamin thiamine as Hydrochloride, preferably in an amount of 0.1 to 2 mg / l.
Ein besonders geeignetes flüssiges Medium zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein solches, das lösliche" Stärke Thiamin, Biotin, Zinkoxid, Ammonium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Citrat- und Molybdat-Ionen sowie Quellen für Magnesium, Calcium, Kalium, Mangan und Eisen einschließt. Dieses Medium ist neu und liegt als solches im Bereich der vorliegenden Erfindung.A particularly suitable liquid medium for use in the method according to the invention is one which soluble "starch thiamine, biotin, zinc oxide, ammonium, phosphate, sulfate, chloride, citrate and molybdate ions as well Includes sources of magnesium, calcium, potassium, manganese and iron. This medium is new and as such is in the field of the present invention.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann diskontinuierlich oder kontinuierlich durchgeführt werden. Bei diskontinuierlicher Arbeitsweise enthält das flüssige Medium auch eine kleine Menge, z.B. 0,5 g/l, einer zusätzlichen, leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle, z.B. Maltose.The process according to the invention can be discontinuous or be carried out continuously. In the case of discontinuous operation, the liquid medium also contains one small amount, e.g. 0.5 g / l, an additional, easily assimilable one Carbon source, e.g. maltose.
Bei kontinuierlicher Arbeitsweise soll erfindungsgemäß das Verdünnungsverhältnis unter konstanten Bedingungen (steady-state) vorzugsweise unterhalb 0,5 h , und vorzugsweise von 0,02 bis 0,1 h betragen, um große Ausbeuten an CGT zu erzielen.In the case of continuous operation, according to the invention, the dilution ratio should be under constant conditions (steady-state) are preferably below 0.5 h, and preferably from 0.02 to 0.1 h, in order to achieve high yields To achieve CGT.
409825/ 1059 " 5 ~409825/1059 " 5 ~
- 5 - 44 095- 5 - 44 095
Eine besonders "bevorzugte kontinuierliche Arbeitsweise besteht in einer zweistufigen Modifikation, wobei die ■Verdünnungsgeschwindigkeit in der zweiten Stufe geringer ist als in der ersten Stufe, z.B. in der ersten Stufe 0,1 h und in der zweiten Stufe 0,033 π beträgt. Mitunter kann die Ausbeute an CGT durch Zugabe einer Lösung verbessert werden, die eine niedrige Konzentration an Stärke enthält, z.B. 0,08 g/g Trockengewicht xlzu der zweiten Stufe.A particularly "preferred continuous mode of operation consists of a two-stage modification, where the ■ rate of dilution in the second stage is less than in the first stage, e.g. 0.1 h in the first stage and in the second stage is 0.033 π. Sometimes can the yield of CGT can be improved by adding a solution that contains a low concentration of starch, e.g. 0.08 g / g dry weight xl for the second stage.
Die CGT kann aus dem flüssigen Medium durch irgendeine beliebige Maßnahme gewonnen werden. Das Enzym kann z.B. durch Anwendung eines kalten organischen Fällungsmittels wie Aceton ausgefällt werden, oder durch Verdampfen im Vakuum mit anschließender Dialyse und Gefriertrocknung.The CGT can be obtained from the liquid medium by any any measure can be obtained. The enzyme can e.g. by using a cold organic precipitant such as acetone be precipitated, or by evaporation in a vacuum with subsequent dialysis and freeze-drying.
Man kann eine Anzahl von Methoden zur Analyse von CGT anwenden, die auf verschiedenen Eigenschaften des Enzyms beruhen. Diese werden unten zusammengefaßt.One can use a number of methods to analyze CGT based on different properties of the enzyme are based. These are summarized below.
1. Amylase (Dextrinisierungs-)Aktivität 1. Amylase (dextrinization) activity
Diese Methode wurde zum ersten Mal von Manning und Campbell beschrieben (J. bioL. ehem., 1961, 236,- 2952) und beruht auf der sich ändernden Farbintensität des Stärke-Jod-Komplexes in Standard Stärkelösungen, die mit dem Enzym behandelt und mit nicht behandelten Kontrollen verglichen wurden. Diese Methode ist jedoch nicht spezifisch für das CGT.This method was described for the first time by Manning and Campbell (J. bioL. Formerly, 1961, 236, - 2952) and is based on the changing color intensity of the starch-iodine complex in standard starch solutions that are treated with the enzyme and were compared with untreated controls. However, this method is not specific to the CGT.
2. Cyclodextrin-Glycosyltransferase (CT)-Aktivität 2. Cyclodextrin glycosyl transferase (CT) activity
Die Methode von Thoma et.al. (Analyt. Biochem., 1965i 13> 91) zur Messung der Aktivität von Glycolsyltransferase beruht auf der Fähigkeit des Enzyms, ^-Cyclodextrin an ein nicht reduzierendes Co-substrat, oC-Methylglucosid, zu kuppeln,The method of Thoma et al. (Analyt. Biochem., 1965i 13> 91) for measuring the activity of glycolsyltransferase is based on the ability of the enzyme to couple ^ -cyclodextrin to a non-reducing co-substrate, oC-methylglucoside,
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- 6 - 44 093- 6 - 44 093
wobei man lineare oC-Methyl-maltooligosaccharide erhält, die nicht zurückgeführt werden können. Diese Saccharide werden dann mit Pankreas- rf—Amylase hydrolysiert und die erhaltenen Zucker werden mit üblichen Methoden gemessen. Die Methode erfordert die Abwesenheit des Enzyms Cyclo-dextrinase, das das oC -Cyclodextrin zu reduzierenden Zuckern in Abwesenheit des Co-substrates abbauen würde.linear oC-methyl-maltooligosaccharides are obtained, that cannot be returned. These saccharides are then hydrolyzed with pancreatic rf amylase and the obtained Sugars are measured using standard methods. The method requires the absence of the enzyme cyclo-dextrinase, that the oC -cyclodextrin to be reduced sugars in Absence of the co-substrate would degrade.
3. Cyelodextrin-Sytithetase (CS)-Aktivi tät 3. Cyelodextrin sytithetase (CS) activity
Die von Tilden und Hudson beschriebene Methode (J. Bact., 194-2, 43, 527) ist ein verbreitet angewandtes spezifisches Verfahren zur Bestimmung von CGT. Die Fähigkeit des Enzyms, Stärke in Cyclodextrine umzuwandeln, wird angewandt, indem man Proben mit Jodlösung-auf einem Mikroskopierglas in Abständen vermischt und die Ränder des verdampfenden Tropfens unter einem Mikroskop mit geringer Vergrößerung die Anwesenheit des charakteristischen Komplexes von (Χ,-Cyclodextrin-Jod prüft. Weitere praktische Einzelheiten der Methoden 1 bis 3 werden auch von Lane und Pirt (J. Appl. Chem. Biotechnoli, 1971, 21, 330) beschrieben.The method described by Tilden and Hudson (J. Bact., 194-2, 43, 527) is a widely used specific one Method for determining CGT. The enzyme's ability to convert starch into cyclodextrins is applied by one samples with iodine solution- on a microscope glass at intervals mixed and the edges of the evaporating drop under a microscope with low magnification the presence of the characteristic complex of (Χ, -cyclodextrin-iodine checks. Further practical details of Methods 1 to 3 are also provided by Lane and Pirt (J. Appl. Chem. Biotechnoli, 1971, 21, 330).
4. Eine weitere und neue Methode zur Bestimmung der CS-Aktivität von CGT-Zubereitungen wurde entwickelt, um die vorhergenannte Methode 3 zu ersetzen, die mühsam und zeitraubend ist. Diese Methode zur Messung der Fähigkeit von CGT, Stärke in Cyclodextrine umzuwandeln, hängt von der Fähigkeit der Cyclodextrine ab, die Hydrolyse von Estern zu katalysieren. Das Verfahren ist folgendes:4. Another and new method for determining the CS activity of CGT preparations has been developed around the aforementioned Method 3 to replace the tedious and time consuming is. This method of measuring the ability of CGT to convert starch to cyclodextrins depends on the ability of the Cyclodextrins start to catalyze the hydrolysis of esters. The procedure is as follows:
Eine 3,3 %-ige Lösung von standardisierter, löslicher Stärke von hoher Qualität (Van Linge Dextrinfabrieken, Veendam, Holland; Typ W10) wird hergestellt aus 9 Teilen 0,055 m Phosphat-Puffer pH 6,2, und 1 Teil 5 χ 10"^ m CaCl2 wird zu-A 3.3% solution of standardized, soluble starch of high quality (Van Linge Dextrinfabrieken, Veendam, Holland; type W10) is prepared from 9 parts 0.055 m phosphate buffer pH 6.2, and 1 part 5 χ 10 " ^ m CaCl 2 is added
409825/1059 - 7 -409825/1059 - 7 -
gegeben, wenn die Lösung kalt ist. Je 4,5 cnr Stärke lösungen und 0,5 cm^ CGT-ZuTdereitung werden auf 40°C äquilibriert und gemischt. Nach 10 Minuten wurden 1,5 cm^ entfernt und mit 3,0 cnr5 0,3 m C0x~2/HC0^,-Puffer, pH 10,6 vermischt.given when the solution is cold. 4.5 cnr starch solutions and 0.5 cm ^ CGT preparation are equilibrated to 40 ° C and mixed. After 10 minutes, 1.5 cm ^ was removed and mixed with 3.0 cm 3 0.3 m CO x ~ 2 / HCO ^, buffer, pH 10.6.
7. 0 07. 0 0
3 cnr dieser Mischung wurden in eine Küvette (1 cm Lichtweg) gegeben und auf 25 gebracht. 10 /ul einer Lösung von 3»5-Dimethylphenylacetat oder 1-Naphthylacetat (3 x 10 m) in Acetonitril werden in den Innenteil der Küvette gegeben. Die Küvette wird dann drei Mal so schnell wie möglich umgekehrt und in ein registrierendes Spectrophotometer gebracht, das bei 25° gehalten wird. Darauf wird die Hydrolyse des Esters bei 240 oder330 mn verfolgt. Die beobachtete Geschwindigkeit skonstante für die Reaktion erster Ordnung Ck ) wird aus dem Ausdruck errechnet:3 cnr of this mixture were placed in a cuvette (1 cm light path) given and brought to 25. 10 / µl of a solution of 3 »5-dimethylphenyl acetate or 1-naphthyl acetate (3 x 10 m) in Acetonitrile are added to the inside of the cuvette. The cuvette is then inverted three times as quickly as possible and placed in a registering spectrophotometer held at 25 °. The hydrolysis of the Esters at 240 or 330 mn. The observed speed s constant for the first order reaction Ck) calculated from the expression:
S-S
QQ ο SS
QQ ο
k _ k _
worin S , S. und S Absorbentien unmittelbar nach Zugabe des Esters nach t Minuten, bzw. am Ende der Reaktion sind.wherein S, S. and S absorbents immediately after addition of the ester after t minutes or at the end of the reaction.
Die Berechnung wird für fünf Werte von S. und t wiederholt, worauf .man den Durchschnittswert für kQ erhält. Die Konstante erster Ordnung für die Grundgeschwindigkeit der Hydrolyse des Esters in Abwesenheit von Cyclodextrin (k ) wird gemessen, indem man CGT durch destilliertes Wasser in der Mischung ersetzt. Der Wert für *-—^— wurde dann errechnet. Die Konzentration von ο u Cyclodextrinen in der Küvette erhält man dann aus einer EichkurveThe calculation is repeated for five values of S and t, whereupon the average value for k Q is obtained. The first order constant for the base rate of hydrolysis of the ester in the absence of cyclodextrin (k) is measured by replacing CGT with distilled water in the mixture. The value for * -— ^ - was then calculated. The concentration of ο u cyclodextrins in the cuvette is then obtained from a calibration curve
11"11 "
— gegen Tvtjjt ·> die gebildet wird, indem man Lösungen- against Tvtjjt ·> which is formed by creating solutions
von1 ugetrocknetem, chromatographisch reinem cC-Cyclodextrinof 1 u of dried, chromatographically pure cC-cyclodextrin
—2 —4-2-4
von 10 m bis 5 x 10 m in 3 % Van Linge Stärke anwendet. Die Einheit der CS-Aktivität wird definiert als diejenige, die eine Gesamtheit von 1 m von θ(.-Cyclodextrin unter den Prüfbedingungen erzeugt.from 10 m to 5 x 10 m in 3% Van Linge thickness. The unit of CS activity is defined as that having a total of 1 m of θ (.- cyclodextrin among the Test conditions generated.
409825/10S9 " 8 "409825 / 10S9 " 8 "
- 8 - 44 095- 8 - 44 095
Das erfindungsgemäße Verfahren wird weiterhin in den folgenden Beispielen erläutert. The process according to the invention is further illustrated in the following examples.
v Bacillus macerans NCJB 9638 wurde auf Nährglucose-Agar gegeben und bei 37°C 2 Tage lang inkubiert. Etwa fünf Kolonien wurden auf ein Medium gebracht, das aus 1,5 g zerquetschtem Weizen und 0,6 g Calciumcarbonat in 45 cnr Wasser bestand, 5 Tage lang bei 37°C inkubiert und dann bei Zimmertemperatur zur Verwendung als Stammkultur aufbewahrt. v Bacillus macerans NCJB 9638 was placed on nutrient glucose agar and incubated at 37 ° C for 2 days. About five colonies were placed on a medium consisting of 1.5 g of crushed wheat and 0.6 g of calcium carbonate in 45 cubic meters of water, incubated at 37 ° C for 5 days, and then stored at room temperature for use as a stock culture.
Man züchtete Inocula aus der Stammkultur entweder in einem konischen 250 oder 2000 cm' Kolben, der 10 cm' bzw. 100 cm^ des Mediums enthielt. Die Stammkultur (5 VoI-%/V) wurde in den Kolben gegeben, der bei 37°C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung mit 200 UpM inkubiert wurde. Die Kultur wurde dann als Impfstoff (5 Vol-%/V) für die Züchtungen des Bacillus angewandt.Inocula were grown from the stock culture in either a 250 or 2000 cm 'conical flask that was 10 cm' or 100 cm ^ of the medium contained. The stock culture (5 VoI -% / V) was added to the flask, which was incubated at 37 ° C on a rotary shaker at 200 rpm. the Culture was then used as a vaccine (5 vol% / v) for the cultures of Bacillus.
Das Wachstumsmedium, das bei den folgenden Züchtungen von B. macerans angewandt wurde, wird als DM bezeichnet und hat die in Tabelle I angegebene Zusammensetzung.The growth medium used in the following cultivations of B. macerans is referred to as DM and has the composition given in Table I.
a) Diskontinuierliche Züchtungen a) Discontinuous breeding
Eine "CeCa" Fermentorapparatur (A.Gallenkamp und Co. , London) mit einem Betriebsvoliunen von 2 Litern wurde mitA "CeCa" fermenter apparatus (A.Gallenkamp and Co., London) with an operating volume of 2 liters was used with
40982 5/105940982 5/1059
9· - 44 09$9 - 44 09 $
deffi fiediiM gefüllt, das mit eine* Eäiltto? iföö 1* ffiäceraiis impft wtf£de. Die fempeliättiir wätarend der Ziiefttüng wurde "bei 390G md das pH "bei ?,1 dürcn Zugäbe xrön 1 übe HgSO^ ödei? 5 odes? 5 ώ ifstOS geitalteit*deffi fiediiM filled with a * Eäiltto? iföö 1 * ffiäceraiis vaccinates wtf £ de. The fempeliättiir during the training was "at 39 0 G and the pH" at?, 1 by adding xrön 1 over HgSO ^ ödei 5 odes? 5 ώ ifstOS geitalteit *
Uie Eültür würde durclt luJteeS tu± 12Ö0 Üpit tmd von Luft iü den öt>ereii Satiffi des ifeBäerttöirs iröa 600 belüftet* eeHatimea wttrde dtfcrck Zugabe vö& 2000, Öheii)Uie Eältür would be ventilated by luJteeS tu ± 12Ö0 Üpit tmd von Luft iü den öt> ereii Satiffi des ifeBäerttöirs iröa 600 * eeHatimea wttrde dtfcrck addition vö & 2000, Öheii)
ΐ>) Kontigtiieriiclte ΐ>) contingent obligations
Biese wurden tmter ätoliclien Bedinguiigea wie die kontimiieriiciieDL Ziicüttiägen dürcMgefiiiift Stit deif me, daß das Betriebsveiximeii deä Fermeatörs 1*25 Mt er1 trag -und die Liift mit eiffier ÖescMriEtdigkeit iroii i l/ffiiä ' eingeleitet würde« Das angewandte iTerdüaÄüngs-veriiältiiis wax 0,05 oder; 0,03 Ii*1.These were tmter ätoliclien conditions such as the contimiieriiciieDL objectives duly established that the operational veiximeii of the Fermeatörs 1 * 25 Mt er 1 - and the lift with eiffier ÖescMriEdigkeit applied irois il / ffiiä 'was initiated or ; 0.03 Ii * 1 .
! A B E L ι Ε! A B E L ι Ε
Züsaiomensetztmg von- DM Menge prcr InAddition of the amount per in
(eingestellt Ätlf pH 7 fflit ifäOH)(adjusted to pH 7 fflit ifäOH)
(öür für diskönti-(ö for discreet-
Enlturen) 0,5 gQuantities) 0.5 g
409025/1-059 "409025 / 1-059 "
- 10 - 44 093- 10 - 44 093
Thiamin-HCl 2 mgThiamine HCl 2 mg
Biotin 15 mg Biotin 15 mg
ZnO - 4 mgZnO - 4 mg
ffaCl2*4H20 15 mgffaCl 2 * 4H 2 0 15 mg
FeGl2 *4H20 10 mgFeGl 2 * 4H 2 0 10 mg
(KH^)2Mo04-2H20 2 mg(KH ^) 2 Mo0 4 -2H 2 0 2 mg
c) Zweistufige(Chemostat) Züchtungen c) Two-stage (chemostat) breeding
Zwei Fermentoren vom "Forton-Typ" mit ArbeitsvolUBiina von 1 Liter bzw. 3 Liter wurden für die erste bzw. zweite Stufe angewandt* Der Permeator der ersten Stufe wurde bei 1200 UpM gerührt und mit einer Geschwindigkeit von 2 l/min belüftet. Die Luft diente auch zum Transport der Kultur aus der ersten in die zweite Stufe. Das DM Medium wurde zu der ersten Stufe in zwei getrennten Strömen gegeben, wobei die eine Losung die Phosphate und K2SOL enthielt und die andere die Stärke, Vitamine und anorganische Salze. Der zweite Fermentor wurde gerührt mit 900 üpK, und das Verdünnungsverhältnis in der zweiten Stufe wurde durch Überwachung des Flusses des Mediums in die erste Stufe und des.Flusses der Kultur von der ersten Stufe zu einem Abfallbehälter geregelt. Die Differenz zwischen diesen beiden ergab die Menge, die in die zweite Stufe durch den Luftstrom gebracht wird. Die Bedingungen von pH-Wert, Temperatur und Schaumkontrolle wurden bereits oben in (a) beschrieben.Two "Forton-type" fermentors with working volumes of 1 liter and 3 liters respectively were used for the first and second stage, respectively. * The permeator of the first stage was stirred at 1200 rpm and aerated at a rate of 2 l / min. The air was also used to transport the culture from the first to the second stage. The DM medium was added to the first stage in two separate streams, one solution containing the phosphates and K 2 SOL and the other containing the starch, vitamins and inorganic salts. The second fermentor was stirred at 900 gpK and the dilution ratio in the second stage was controlled by monitoring the flow of the medium into the first stage and the flow of the culture from the first stage to a waste container. The difference between these two gave the amount that is brought into the second stage by the air flow. The conditions of pH, temperature and foam control have already been described in (a) above.
Für Jede der obigen Züchtungsarten wurde die Kultur auf die GGT-Äktivität durch eine oder mehrere der oben beschriebenen Methoden geprüft. Zusätzlich wurde die Konzentration der trockenen Biomasse 12nd die Reststärkekonzentration bestimmt .For each of the above cultivars, the culture was tested for GGT activity by one or more of the methods described above. In addition, the concentration of the dry biomass and the residual starch concentration was determined.
- 11 409825/1059 - 11 409825/1059
- 11 - 44 093- 11 - 44 093
a) Die Ergebnisse, die in typischen diskontinuierlichen Züchtungen erhalten wurden, sind in den Figuren 1 "bis 3 angegeben. Diese zeigen die Veränderungen mit der Zeit, der Ausbeute an trockener Biomasse, Reststärkekonzentration und CGT (Amylase) Aktivität bei einer Reihe von Züchtungen unter Verwendung von Ausgangskonzentrationen von Stärke von 6, 10, 20 bzw. 30 g/l.a) The results obtained in typical discontinuous cultivations are given in FIGS. These show the changes over time, the yield of dry biomass, residual starch concentration and CGT (amylase) activity in a number of cultivars using starting concentrations of strength 6, 10, 20 or 30 g / l.
Die nachstehenden Punkte gehen aus diesen Ergebnissen hervor.The following points emerge from these results.
1) Biomasse-Ausbeuten unter Anwendung dieses = Mediums über- · schreiten nicht rund 5 g/1»1) Biomass yields using this = medium over- · do not go around 5 g / 1 »
2) eine wesentliche CGT-Aktivität tritt nicht auf, bis die Stärkekonzentration des Mediums auf ein niedriges Maß reduziert worden ist,2) substantial CGT activity does not occur until the Starch concentration of the medium has been reduced to a low level,
3) die größte CGT-Aktivität wird bei Anwendung einer anfänglichen Stärkekonzentration von 20 g/l beobachtet.3) the greatest CGT activity is observed using an initial starch concentration of 20 g / l.
b) Die Ergebnisse der Chemostat-Züchtungen bei verschiedenen Verdünnungsverhältnissen unter Anwendung einer Ausgangskonzentration von 10 g/l sind in Figur 4- zusammengestellt. Man erkennt dabei deutlich, daß die CGT-Aktivitätb) The results of the chemostat cultivations at different dilution ratios using a starting concentration of 10 g / l are shown in Figure 4-. It can be clearly seen that the CGT activity
—1 rasch ansteigt, wenn das Verdünnungsverhältnis unter 0,5 & reduziert wird. Die Figuren in Tabelle II zeigen die Wirkung von verschiedenen anfänglichen Stärkekonzentrationen auf die CGT-Aktivität in Chemostat-Eulturen und beweisen die grössere CGT-Aktivität, die mit der größeren anfänglichen Stärkekonzentration verbunden ist.—1 increases rapidly when the dilution ratio is below 0.5 & is reduced. The figures in Table II show the effect of various initial starch concentrations on the CGT activity in chemostat cultures and prove the greater CGT activity, those with the larger initial starch concentration connected is.
c) Die Ergebnisse der typischen Zweistufen Chemostat-Züchtungen werden in Tabelle III angegeben. D^. und D2 bedeutenc) The results of the typical two step chemostat cultivations are given in Table III. D ^. and D mean 2
- 12 409825/10 5 9 ■ ? i-■- 12 409825/10 5 9 ■? i- ■
die Verdünnungsverhältnisse in den ersten und zweiten Fermentoren, und F zeigt eine zusätzliche Zuführung von Stärke bei einer Geschwindigkeit von 0,08 g/g trockene Biomasse xh zu der zweiten Stufe. Folgende Schlüsse können unter Bezugnahme auf die Ergebnisse in den Tabellen II und III gezogen werden.the dilution ratios in the first and second fermentors, and F shows an additional feed of starch at a rate of 0.08 g / g dry biomass xh to the second stage. The following conclusions can be drawn with reference to the results in Tables II and III will.
i)t Wenn man in der ersten Stufe bei einem Verdünnungsverhältnis arbeitet, das die maximale Biomasse-Produktivität ergibt (g Biomasse/lxh), werden in der zweiten Stufe zu vernachlässigende CGT-Aktivitäten erzeugt,i) t If one works in the first stage at a dilution ratio that results in the maximum biomass productivity (g biomass / lxh), negligible CGT activities are generated in the second stage,
2) die CGT-Aktivität wird um 57 % für D1 = 0,1 h~1 und Dp = 0,035 h~ erhöht, wenn eine zusätzliche Stärke-Zugabe in der zweiten Stufe erfolgt.2) the CGT activity is increased by 57% for D 1 = 0.1 h ~ 1 and Dp = 0.035 h ~ if additional starch is added in the second stage.
se
(g/l)Biomas
se
(g / l)
Aktivi
tätCS
Activi
activity
Aktivi
tätAmylase
Activi
activity
Aktivi
tatCS
Activi
did
Aktivi
tätAmylase
Activi
activity
se
(g/l)Biomas
se
(g / l)
416660
416
4,3.3.6
4.3.
0,050.03
0.05
409825/1059409825/1059
0? A B E L L E III0? A B E L L E III
1ν
1
Kultur.Culture.
50 cm^ einer Lösung mit 10 g Na2HPO^ und 4 g KH2PO^, die auf ein pH von 75O eingestellt ist, wurden zu einem Liter der überstehenden Lösung von der Kultur bei 2° gegeben. Die Lösung wurde auf -3°ύ gekühlt und heftig gerührt, während 1,5 Volumina kalten Acetons (2°C) enthaltend Essigsäure langsam zugegeben wurden. Die Menge Essigsäure, die in einer Versuchsfällung bestimmt wurde, reichte aus, um den pH-Wert am Ende auf 6,5 bis 6,6 zu drücken. Man ließ den Niederschlag 10 Minuten lang absitzen. Die klare Flüssigkeit wurde abgedrückt und der. ausgefällte Anteil durch kurzes Zentrifugieren bei 2° gesammelt. Der Niederschlag wurde drei Mal mit 10 cm^ 0,01 m-Phosphat-Puffer von pH 6,2 extrahiert, der 5 x 10 m CaCl2 enthielt, und der Extrakt wurde bei 2° gegen50 cm ^ of a solution with 10 g Na 2 HPO ^ and 4 g KH 2 PO ^, which is adjusted to a pH of 7 5 O, were added to one liter of the supernatant solution from the culture at 2 °. The solution was cooled to -3 ° ύ and stirred vigorously while 1.5 volumes of cold acetone (2 ° C) containing acetic acid were slowly added. The amount of acetic acid, which was determined in an experimental precipitation, was sufficient to push the pH down to 6.5 to 6.6 at the end. The precipitate was allowed to settle for 10 minutes. The clear liquid was squeezed off and the. precipitated fraction collected by brief centrifugation at 2 °. The precipitate was extracted three times with 10 cm ^ 0.01 M phosphate buffer of pH 6.2 containing 5 × 10 M CaCl 2 , and the extract was counteracted at 2 °
- 14 409825/1059 - 14 409825/1059
44- 09344-093
den gleichen Puffer dialysxert. Dabei wurden Ausbeuten bis zu 91 % erhalten.dialysxert the same buffer. Yields of up to 91 % were obtained.
40 9 8 25/105940 9 8 25/1059
Claims (12)
in der zweiten Stufe beträgt,10. The method according to claim 9, characterized in that the rate of dilution is 0.1 h in the first
in the second stage is
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