DE2332667B2

DE2332667B2 - Method for the automatic counting and measuring of particles

Info

Publication number: DE2332667B2
Application number: DE19732332667
Authority: DE
Inventors: Der Anmelder Ist
Original assignee: Göhde, Wolfgang, Dr.; Göhde geb. Kühl, Hildegard, Dr.; 4400 Münster
Filing date: 1973-06-23
Publication date: 1976-04-22

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum lelbsttätigen Zählen und Messen von Teilchen, insbelondere von biologischen Zellen, die in einem strö-Inungsfähigen Medium suspendiert sind und von die- |em durch einen definierten Bereich eines physikalischen Feldes hindurchbefördert werden, wobei durch <ien Durchgang der einzelnen Teilchen Signale erzeugt werden, die als zweidimensionale Kurven darstellbar $ind, deren Abszisse von der Zeit bestimmt und deren Ordinate eine Signalgröße ist. Die Signalgröße entspricht bei solchen Verfahren bestimmten physikalischen oder chemischen Eigenschaften der Teilchen, I. B. dem Teilchenvolumen, dem Eiweißgehali usw.The invention relates to a method for the automatic counting and measuring of particles, in particular biological cells, which are suspended in a flowable medium and are conveyed by them through a defined area of a physical field, with a passage of the individual particles, signals are generated that can be represented as two-dimensional curves, the abscissa of which is determined by time and the ordinate of which is a signal variable. In such processes, the signal size corresponds to certain physical or chemical properties of the particles, I. B. the particle volume, the protein content, etc.

Derartige Verfahren und dementsprechend eingerichtete Geräte werden seit mehreren Jahren vor allem für medizinische Diagnosezwecke verwendet, z. B. zum Zählen und Messen von Blutkörperchen oder zur Charakterisierung von Zellen in der Krebsforschung. V'erfahren dieser Art können aber auch für die Untersuchung anderer, mikroskopisch kleiner Teilchen benutzt werden, z. B. zur Untersuchung von staubartigen Materialien. Der Einfachheit halber wird im folgenden jedoch ausschließlich auf die Untersuchung biologischer Teilchen Bezug genommen, ohne daß dadurch der Gegenstand der zu erläuternden Erfindung beschränkt werden soll.Such methods and devices set up accordingly have been in use for several years in particular used for medical diagnostic purposes, e.g. B. for counting and measuring blood cells or for characterization of cells in cancer research. This type of procedure can also be used for the investigation other microscopic particles can be used, e.g. B. for the investigation of dusty materials. For the sake of simplicity, however, the following will focus exclusively on the investigation of biological ones Particles are referred to without thereby limiting the subject matter of the invention to be explained shall be.

Bei allen bekannten Verfahren der eingangs ermahnten Art werden Meßfehler durch Ko.nz.denzereign.sse verursacht. Wird in Abweichung von der eingangs ge-Sderten Verfahrensweise n.it Ausstrichen von Ze. en auf Objektträgern gearbeitet, so treten räumliche Überlappungen auf. Bei Verfahren der eingangs erwähnten Art z.B. bei sogenannten Durchflub-Zythophotometern oder bei dem Coulter-Verfahren können Haßegen zeitliche Überlappungen der Zellen b/u. der von diesen ausgelösten Signale beobachtet werden, abzufälschen Meßsignalen fuhren.In all known procedures the admonished at the beginning Type measurement errors are caused by co.nz.denzereign.sse. Is sent in deviation from the initially stated Procedure after smearing Ze. en worked on microscope slides, spatial ones occur Overlaps on. In the case of the method mentioned at the beginning Type e.g. with so-called flow-through cythophotometers or in the case of the Coulter method, there can be temporal overlaps of cells b / u. the observed by these triggered signals to falsify Drive measurement signals.

Bei den bekannten Verfahren ist die Arbeitsgeschwindigkeit von vornherein beschränkt, da mit sie:- «nden Meßraten die Koinzidenzhäufigkeii zunimnr,. Dadurch wird in automatisch arbeitenden Zahlgeraten _z B Coulier-Verfahren) ein Zählfehler verursacht. Koinzidenten führen zu Zählergebnisse η (Te chen onzentrationen in Suspensionen, z. B. Zahl dei blutkörperchen im Blut), die zu niedrig sind.With the known methods, the working speed is limited from the start, since with them: This causes a counting error in automatically working payment devices ( _{e.g. Coulier method).} Coincidences lead to counting results η (particle concentrations in suspensions, e.g. number of corpuscles in the blood) that are too low.

Es i«t bereits ein im wesentlichen dem eingangs erwähnten Verfahren entsprechendes Verfahren bekannt, bei dem die Impulsdauer in einer bestimmten Te.ihohe. bezogen auf die Maximalhöhe, gemessen und die so gewonnene Größe zur Bewertung des Impulses verwendet wird Dieses bekannte Verfahren hat den Zweck. :n einem nach dem Coulter-Verfahren arbeitenden Apparat solche impulse zu unterdrücken, die von Teilchen stammen, welche außerhalb des axialen Bereiches durch die Öffnung hindurchgewandert sind und deren Meßwert infolge von Unterschieden in der Stromungsgeschwindigkeit einerseits und Randerscheinungen des Feldes andererseits von den Normalwerten abweichen, welche Teilchen liefern, die durch den axialen Bereich der öffnung hindurchgehen.A method essentially corresponding to the method mentioned at the beginning is already known in which the pulse duration is within a certain range. based on the maximum height, measured and the size thus obtained is used to evaluate the impulse. This known method has the purpose. : In an apparatus working according to the Coulter method, to suppress those impulses which originate from particles which have migrated through the opening outside the axial range and whose measured value deviates from the normal values due to differences in the flow velocity on the one hand and edge phenomena of the field on the other, which provide particles that pass through the axial region of the opening.

Die Überprüfung der bei üblichen Messungen aufgenommenen Signalkurven hat gezeigt, daß m vielen Fallen auf Grund der Länge der Meßsignale, d. h. der Lange des Abstandes zwischen dem vordersten ansteigenden und dem letzten abfallenden Ast der Signalkurve sich entscheiden läßt, ob es sich bei den Meßsignalen um solche handelt, die nur von einer Zelle oder von mehreren Zellen ausgelöst worden sind. Dafür, daß mehr als nur eine Zelle, z. B. in dem Meßbereich einer Durchflußkammer sich befindet und Koinzidenzsignale auslöst liegt eine bestimmte Wahrscheinlichkeit vor. Die Häufigkeit, mit der solche Fehler eintreten, ergibt sich aus dem Verhältnis von Signallänge zu mittlerem zeitlichen Abstand der Meßsignale voneinander. Be. einer Länge der Meßsignale von z. B. 30 μζα: und einer Meßrate von 1000/sec beträgt die Koinzidenzhaufigkeit 3% Von diesen 3% Koinzidenzereignissen ν ürde aber nur ein sehr kleiner Teil falsche, d. h. überhöhte Meßsignale ergeben. Ein falsches Meßsignal entsteht nur dann, wenn die zeitliche Überlappung der Signale so eng ist daß die Summe der die Koinzidenz darstellenden Einzelsignale ein Meßsignal ergibt, das höher als das höchste Einzelsignal ist. In der ausführlichen Erläuterung der Erfindung werden dazu noch bildliche D-irsiellungen gegeben. Die ins einzelne gehende Berücksichtigung der Meßsignalentstehung und der Faktoren die die Form der Meßsignale beeinllussen. fuhrt zu Überlegungen darüber, in welcher Weise die Fehlci durch Koinzidenzen bei gleichbleibenden Meßrater vermindert werden können.The examination of the signal curves recorded during normal measurements has shown that in many cases, based on the length of the measurement signals, i.e. the length of the distance between the foremost rising and the last falling branch of the signal curve, it can be decided whether the measurement signals are such acts that have been triggered by only one cell or by several cells. For the fact that more than just one cell, e.g. B. is in the measuring range of a flow chamber and triggers coincidence signals, there is a certain probability. The frequency with which such errors occur results from the ratio of the signal length to the mean time interval between the measurement signals. Be. a length of the measurement signals of z. B. 30 μζα: and a measuring rate of 1000 / sec, the coincidence frequency is 3%. Of these 3% coincidence events ν ν only a very small proportion would result in incorrect, ie excessive measuring signals. An incorrect measurement signal only arises when the time overlap of the signals is so tight that the sum of the individual signals representing the coincidence results in a measurement signal that is higher than the highest individual signal. In the detailed explanation of the invention, pictorial diagrams are also given. The detailed consideration of the generation of the measurement signal and the factors that influence the shape of the measurement signals. leads to considerations about the way in which the errors can be reduced by coincidences with constant measurement ratios.

Im folgenden werden dazu Verfahren und Einrichtungen vorgeschlagen, mit deren Hilfe die Koinzidenz fälle zu einem großen Prozentsatz erkannt werder können, so daß sich aufgrunddessen ihre WeiterleitungProcedures and facilities are described below suggested, with the help of which the coincidence cases can be recognized to a large percentage can, so that because of this their forwarding

jur Registrierung vermeiden IaBt.jur registration avoid IaBt.

Die Erfindung beruht auf dem Grundgedanken, daß |n der überwiegenden Zahl der Koip.zidenziälle die Signale gegenüber Normalsignalen verlängert sind. Nur in sehr seltenen Fällen werden die Zelien unmittelbar nebeneinander den Meßbereich passieren und Signale auslösen, die sich in ihrer Länge von Signalen nicht unterscheiden, die von Einzelzellen aufgelöst werden, Signale, deren Länge aber einen Normalwert überschreitet, können mit Hilfe selbsttätig ablaufender Verfahren i"id elektronischer Mittel erkannt, eliminiert und, falls erwünscht, zum Zwecke der Korrektur des Zählergebnisses auch separat gezählt werden.The invention is based on the basic idea that the signals are the predominant number of the co-occurrences are longer than normal signals. Only in very rare cases do the cells become immediate pass the measuring range side by side and trigger signals that do not differ in length from signals, which are resolved by single cells, signals whose length exceeds a normal value, can be recognized, eliminated and, if necessary, electronic means with the aid of automatically running processes desired, to be counted separately for the purpose of correcting the counter result.

Eine einfache Messung der Impulslänge ist jedoch zur Erkennung von Koinzidenzen nicht ohne weiteres verwendbar. Wird nämlich die Signallänge bei verschiedenen Verstärkungen in stets der gleichen absoluten Höhe gemessen, so zeigt sich, daß die Impulslängen ni'ü steigender Verstärkung zunehmer.. Entsprechend sind auch unterschiedlich hohe Signale an sich einzeln den Meßbereich passierender Zellen unterschiedlich lang- Ein Koinzidenzsignal, das z. B. von zwei kleinen Meßwerten herrührt, kann mithin durch alleinigen Vergleich der Signallänge an der Basis des Signals nicht sicher von einem großen Meßsignal unterschieden werden, das nur von einer einzelnen Zelle stammt.However, a simple measurement of the pulse length is not straightforward for the detection of coincidences usable. This is because the signal length is always the same absolute for different amplifications Measured height, it can be seen that the pulse lengths increase with increasing amplification .. Correspondingly signals of different levels of individual cells passing through the measuring range are also different long- a coincidence signal, e.g. B. of two small ones Measured values originating from, can therefore not by comparing the signal length at the base of the signal alone can be safely distinguished from a large measurement signal that originates only from a single cell.

Die Erfindung sieht deshalb vor, daß. ausgehend von dem eingangs erwähnten Verfahren, zur Erkennung von Koinzidenzen für jede Signalkurve die maximale Größe und die zwischen Signalkurve und einer parallelen zur Abszisse liegende Fläche bestimmt und diese beiden Größen in Beziehung zueinander gesetzt werden. Eine Ausgestaltung der Erfindung besteht darin. daß die Signalkurven, für die das Verhältnis der Fläche zur maximalen Größe einen bestimmten Wert überschreitet, als Koinzidenzen ausgesondert werden.The invention therefore provides that. based on the method mentioned at the beginning, for detection of coincidences for each signal curve the maximum size and that between the signal curve and a parallel one The area lying on the abscissa is determined and these two quantities are related to one another. One embodiment of the invention consists in this. that the signal curves for which the ratio of the area to the maximum size exceeds a certain value, as coincidences are rejected.

Für verschiedene Anwendungsgebiete, z. B. beim Zählen von Blutkörperchen, kann vorgesehen werden, daß die Koinzidenzsignale gesondert gezählt werden und ihre Summe zur einfachen Summe aller Signale hinzugezählt wird.For different areas of application, e.g. B. when counting blood cells, it can be provided that the coincidence signals are counted separately and their sum to the simple sum of all signals is added.

Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen ausführlich erläutert. Es zeigtThe invention will be based on the following description and the drawings explained in detail. It shows

F i g. 1 eine vereinfachte Darstellung des Meßbereiches einer Impulszytophotometer-Anordnung,F i g. 1 a simplified representation of the measuring range of a pulse cytophotometer arrangement,

F i g. 2 und 3 Photographien von mit der Anordnung nach F i g. 1 gewonnenen Meßsignalen zur Veranschaulichung verschiedener Arten von Koinzidenzsignalen, F i g. 2 and 3 photographs of with the arrangement of FIG. 1 obtained measurement signals for illustration different types of coincidence signals,

Fig.4 bis 6 Photographien von mit der Anordnung nach F i g. 1 gewonnenen Meßsignalen in verschiedenen Verstärkungen,Fig. 4 to 6 photographs of with the arrangement according to FIG. 1 obtained measurement signals in different amplifications,

Fig.7 ein Diagramm der Abhängigkeit der Impulslänge von der Impulshöhe für verschiedenartige MeIisignale, 7 shows a diagram of the dependence of the pulse length on the pulse height for different types of measurement signals,

F i g. 8a und 8b zwei Einrichtungen in vereinfachter Blockschaltbilddarstellung,F i g. 8a and 8b two facilities in simplified form Block diagram representation,

Fig.9 ein Impulsschema eines in der Einrichtung verwendeten Peak-Detektors und9 shows a pulse diagram of an in the facility used peak detector and

Fig. 10 eine vergleichende Gegenüberstellung, die Original-DNS-Histogramme von Leukozyten aus pen pherem menschlichem Blut zeigt, aufgenommen im; einer Meßrate von etwa 4000 Zellen pro Sekunde, wobei die obere Darstellung ohne und die untere Darsie! t>s lung mit Verwendung einer Koinzidenzsperre aufgenommen worden ist.Fig. 10 is a comparative comparison showing the Shows original DNA histograms of leukocytes from pen pherem human blood, recorded in; a measuring rate of about 4000 cells per second, the upper representation without and the lower Darsie! t> s was recorded using a coincidence lock.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend mit Bezug auf die Verwendung einer impuiszwoproiometrischen Anordnung, s. F i g. 1, ausführlich erläuten. Eine solche Anordnung begünstigt die Bildung klar gl·· linierter Beobachtung^.- und Meßverhaltnisse. Es ist jedoch zu beachten, daß die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentliche Verbesserungen auch bfi ar,deren Meßanordnungen ermöglicht, insbesondere auch solchen, die mit Kapazitäts- oder Widerstandsänderungen zur Erzeugung von Meßsignalen arbeiten.The method of the present invention is as follows with reference to the use of an impuiszwoproiometric Arrangement, see Fig. 1, explain in detail. Such an arrangement favors the formation of clearly smooth lined observation and measurement. However, it is note that the use of the method of the invention also makes significant improvements bfi ar, which allows measuring arrangements, in particular including those that work with changes in capacitance or resistance to generate measurement signals.

Die Anordnung nach F i g. 1 weist einen gegenüber anderen optischen Meßanordnungen sehr genau definierten Meßbereich 10 auf. der an der Einmündungsstelle eines kapillaren Kanals 14 in einem kapillaren Querkanal 16 liegt. Die Kanäle 14, 16 sind in einer im wesentlichen aus lichtundurchlässigem Material bestehenden Kammer 12 ausgebildet, wobei der Kanal In und damit auch der Meßbereich 10 durch eine Glasplatte 18 abgedeckt sind. Über dem Deckglas 18 ist unter Zwischenfügung einer Ölimmersionsschichi 22 ei;) Ub jektiv 20 angeordnet. Über einen durchlässigen Spiegc^: 24 wird einerseits der Meßbereich 10 von einer Lichtquelle 26 her beleuchtet, und andererseits werden di·-· vom Meßbereich durch Reflexion oder Fluoreszenz erzeugten Lichtsignale vom Empfänger 28 aufgenommen Die Einrichtungen 26. 28 sind der Einfachheit halber durch Pfeile angedeutet. Vorzugsweise wird mit eineiv verhältnismäßig langen kapillaren Zuflußkanai 14 für die Zellsuspension gearbeitet, wodurch eine Art Emmi schung der Suspension in der Weise erreicht wird, dar· die Zellen nur in dem zentralen Bereich die Meßstelie 10 passieren. In den Kanal 16 wird von dem einen Ende her eine teilchenfreie Suspensionsflüssigkeil eingespeist, um die die Teilchen enthaltende Suspension, dadurch die Kapillare 14 zugeführt wird, von der Meßstelle 10 fortzuspülen.The arrangement according to FIG. 1 has a measuring range 10 which is very precisely defined compared to other optical measuring arrangements. which lies at the junction of a capillary channel 14 in a capillary transverse channel 16. The channels 14, 16 are formed in a chamber 12 consisting essentially of opaque material, the channel In and thus also the measuring area 10 being covered by a glass plate 18. Over the cover glass 18, an oil immersion layer 22 ei;) Ub jective 20 is interposed. A permeable ^Spiegc: 24 of the measurement range is the one part lights 10 from a light source 26 here, on the other hand di · are - · recorded by reflection or fluorescence light signals generated by the receiver 28 of the measuring range, the devices 26 28 are indicated for simplicity by arrows. A relatively long capillary inflow channel 14 is preferably used for the cell suspension, whereby a kind of emmixing of the suspension is achieved in such a way that the cells pass the measuring point 10 only in the central area. A particle-free suspension liquid wedge is fed into the channel 16 from one end in order to flush away from the measuring point 10 the suspension containing the particles, through which the capillary 14 is fed.

Bei einer Geschwindigkeit der Zeilen an der Meß stelle von etwa 2 m/sec und einem Anodenwiderstanti am Photomultiplier von 500 kOhm werden die in der, F i g. 2 bis 6 dargestellten Signale erhalten, die in 50'K. ihrer Höhe etwa 25 usec lang sind.At a speed of the lines at the measuring point of about 2 m / sec and an anode resistor on the 500 kOhm photomultiplier, the FIG. 2 to 6 obtained the signals shown in 50'K. their height are about 25 usec long.

Die F i g. 2 und 3 zeigen Photographien von DNS-Meßsignalen von Ehrlich-Ascites-Tumcrzellen. In beiden Figuren weist jeweils ein Pfeil auf ein Meßsignal, das auf einer Koinzidenz beruht. In F i g. 2 würde bei automatischer Auswertung das Koinzidenzsignal ein zu hohes Meßsignal vortäuschen, das zu einem falschen Meßwert führt. Dagegen beruht dar, Koinzidenzsignal in F i g. 3 auf einer nur teilweise überlappenden Koinzidenz, die keinen falschen zu hohen Meßwert verursacht. In beiden Fällen (F i g, 2 und 3) sind die Koinzidenzsignale in Relation zu ihrer maximalen Hohe zu lang, was gleichzeitig bedeutet, daß die Flächen unter den Signalkurven in Relation zur maximalen Höhe der Signale ebenfalls zu groß sind.The F i g. 2 and 3 show photographs of DNA measurement signals from Ehrlich's ascites tumor cells. In both In the figures, an arrow points to a measurement signal which is based on a coincidence. In Fig. 2 would be at automatic evaluation, the coincidence signal simulates a measurement signal that is too high, which leads to a false one Measured value leads. In contrast, the coincidence signal in FIG. 3 on an only partially overlapping coincidence, which does not cause a false reading that is too high. In both cases (Fig, 2 and 3) the coincidence signals are too long in relation to their maximum height, which also means that the surfaces under the signal curves are also too large in relation to the maximum height of the signals.

In den Fig.4 bis 6 sind Photographien von Meßsignalen mit verschiedenen Verstärkungen wiedergege ben. Die Meßsignale rühren von menschlichen Leuko zyten her. Auf dem Oszillographenschirm entspricht je weils 1 cm einer Zeit von 20 μ5εαIn Figs. 4 to 6 are photographs of measurement signals ben reproduced with different reinforcements. The measurement signals come from human leuco cytes ago. On the oscilloscope screen, 1 cm each corresponds to a time of 20 μ5εα

Als Grundlage für eine Ausführungsform der Erfin dung wird z. B. in den F i g. 4 bis 6 in halber Höhe de Meßsignale der mit »Länge« bezeichnete Abstand ?\v sehen ansteigendem und absteigendem Ast der Signa kurve bestimmt, im Hinblick auf die Abhängigkeit di Fläche unter der Kurve von der Höhe und Länge dt Signals. Dabei ergibt sich, daß man für alle Signale u¹ abhängig von ihrer Höhe etwa demselben Wert von diesem Fall 25 u-see erhält. Es muß angenommen wcAs a basis for one embodiment of the inven tion z. B. in F i g. 4 to 6 at half the height of the measurement signals, the distance marked with "length"? \ V see ascending and descending branches of the signal curve determined, with regard to the dependence of the area under the curve on the height and length of the signal. It follows that for all signals u ^1, depending on their height, approximately the same value is obtained from this case 25 u-see. It must be accepted wc

den, daß alle Signale, deren Länge in halber Höhe diesen Wert um mehr als eine statistische Schwankung überschreitet, von Koinzidenzen herrühren.den that all signals whose length is half the height of this Value by more than one statistical fluctuation, result from coincidences.

In F i g. 7 sind diese gemessenen Signallangen gegen die Höhe der Meßsignale aufgetragen. Das Diagramm wurde so zusammengestellt, daß aus Photographien. wie in den F i g. 4 bis 6 wiedergegeben, bei verschiedenen Verstärkungen, d. h. verschiedenen Impulshöhen, die Längen der Meßsignale ermittelt wurden. Die in F i g. 7 eingetragenen Werte stellen die Mittelwerte für jeweils 20 Signale dar. Die Kreise geben die Impulslängen in stets derselben absoluten Höhe an. Dagegen geben die Quadrate die Impulslängen bei unterschiedliehen Verstärkungen oder Impulshöhen in stets 50% der Maximalhöhe des jeweiligen Meßsignals an. Das Diagramm belegt, daß die Impulslängen, gemessen jeweils in einer auf die Maximalhöhe des Signals bezogenen Höhe von 50%, konstant sind. Nur solche Koinzidcnzcrcignissc, wie in F i g. 2 dargestellt, lösen längere Signale aus. Eine Verlängerung eines Signals im Falle einer Koinzidenz entspricht einer größeren Fläche unter dem Signal. Auf Grund dieser Maßverhältnisse ist es daher möglich, solche Koinzidenzsignale in einem selbsttätig ablaufenden Verfahren zu erkennen und zu eliminieren.In Fig. 7 these measured signal lengths are plotted against the height of the measurement signals. The diagram was compiled in such a way that from photographs. as in Figs. 4 to 6 reproduced, at different Reinforcements, d. H. different pulse heights, the lengths of the measuring signals were determined. In the F i g. The values entered in 7 represent the mean values for 20 signals each. The circles indicate the pulse lengths always at the same absolute level. On the other hand, the squares give the pulse lengths for different Gains or pulse heights are always 50% of the maximum height of the respective measurement signal. The The diagram shows that the pulse lengths, each measured in a relative to the maximum height of the signal Amount of 50%, are constant. Only such coincidences as shown in FIG. 2, solve longer ones Signals off. An extension of a signal in the case of a coincidence corresponds to a larger area below the signal. Due to these dimensional relationships, it is therefore possible to have such coincidence signals in one Recognize and eliminate automatically running procedures.

F i g. 8a und 8b zeigen in vereinfachter Darstellung Blockschaltbilder von beispielhaften Einrichtungen zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. F i g. 9 zeigt schematisch Impulse, die in solchen Einrichtungen auftreten.F i g. 8a and 8b show, in a simplified representation, block diagrams of exemplary devices for Execution of the method according to the invention. F i g. 9 shows schematically pulses generated in such devices appear.

In der Schemadarstellung F i g. 8a bezeichnet der Kasten 30 ein Gerät zur Signalerzeugung. Dieses Gerät kann die mit den Bezugszeichen 10 bis 26 bezeichneten Teile aus F i g. 1 umfassen. Statt dessen kann dieser Teil auch von denjenigen Bestandteilen eines Coulter Counters gebildet werden, die zur unmittelbaren Signalerzeugung dienen. Für verschiedene Messungen, die mit einer Einrichtung nach F i g. 1 ausgeführt werden, z. B. für Untersuchungen an menschlichen Leukozyten, hat es sich bewährt, als Maß für den Desoxyribonukleinsäure-Gehalt pro Zelle die Höhe des Meßsignals zu verwenden. Zu diesem Zweck ist, s. Fig.8a, an das Signalerzeugungsgerät 30 eine Au"verteeinrichtung angeschlossen, die einen Detektor für die Impulshöhe 32 (peak-detector) enthält. Parallel zu dem Impulshöhendetektor 32 ist mit dem Gerät 30 ein Detektor 34 zur Bestimmung der Signalfläche verbunden. Hierfür kann der Detektor 34 als Integrator ausgebildet sein. Die Ausgangssignale der Detektoren 32, 34 werden über die Leitungen 38, 40 einer Schaltung 4',l zur Bildung eines Quotienten aus den in den Vorrichtungen 32, 34 ermittelten Meßwerten zugeführt. Die Schaltung 42 kann entweder analog oder digital arbeilen; im letzteren Fall enthalten die Kanäle 38, 40 entsprechende Analog/Digital-Wandler. An die Vorrichtung 42 schließt ein Diskriminator 44 an. Der Diskriminator 44 unterdrückt in diesem Gerät diejenigen aus Impulshöhe und Signalfläche gebildeten Quotienten, die unter einem bestimmten Schwellenwert liegen. Diese Quotienten, bei denen im Vergleich zur Signalhöhe die Signalfläche verhältnismäßig groß ist, beruhen auf Koinzidenzen und werden aus diesem Grunde ausgesondert. Die übrigen Signale, für die die Quotienten aus Signalhöhe und Signalfläche über einem bestimmten Grenzwert liegen, werden einem Vielkanalanalysator 46 zugeführt, in welchem die Signale, gesteuert durch ihre maximale Höhe, klassifiziert werden. Hierzu kann eine nicht dargestellte Steuerverbindung vom Impulshöhendetektor 32 zum Analysator 46 vorgesehen sein, oder die Einrichtung 42 kann die Impulshöhe in einen entsprechenden Code umsetzen, der in der Vorrichtung 46 die Ansteuerung des Kanals ermöglicht, der der maximalen Höhe des zugeführten Signals entspricht. An den Vielkanalanalysator 46 ist eine Ausgabeeinheit 48 angeschlossen, die z. B. ein x-y-Schreiber sein kann, der die Größenverteilungen der Signale aufzeichnet, die die Diskriminatorschwelle 44 passieren.In the schematic representation F i g. 8a, the box 30 denotes a device for signal generation. this device the parts identified by the reference numerals 10 to 26 from FIG. 1 include. Instead, this part can can also be formed from those components of a Coulter counter that are used for direct signal generation serve. For various measurements that are carried out with a device according to FIG. 1 are executed, e.g. B. For examinations on human leukocytes, it has proven itself as a measure of the deoxyribonucleic acid content to use the level of the measurement signal per cell. For this purpose, see Fig. 8a, to the signal generating device 30 is connected to an output device which has a detector for the pulse height 32 (peak detector) contains. In parallel with the pulse height detector 32, a detector 34 is used with the device 30 Determination of the signal area connected. For this purpose, the detector 34 can be designed as an integrator. the Output signals from the detectors 32, 34 are used via the lines 38, 40 of a circuit 4 ', 1 to form of a quotient from the measured values determined in the devices 32, 34 are supplied. The circuit 42 can work either analog or digital; in the latter case the channels 38, 40 contain corresponding ones Analog / digital converter. A discriminator 44 connects to the device 42. The discriminator 44 In this device, suppresses those quotients formed from the pulse height and signal area that are below a certain threshold. These quotients at which the signal area is in comparison to the signal height is relatively large, are based on coincidences and are therefore rejected. The other signals, for which the quotients of signal height and signal area are above a certain limit value are fed to a multichannel analyzer 46, in which the signals, controlled by their maximum height to be classified. A control connection (not shown) from the pulse height detector can be used for this purpose 32 to the analyzer 46, or the device 42 can convert the pulse height into a corresponding Implement code that enables the control of the channel in the device 46, which is the maximum Corresponds to the level of the supplied signal. An output unit 48 is connected to the multichannel analyzer 46, the z. B. can be an x-y writer who Plots size distributions of the signals that pass the discriminator threshold 44.

ίο In dem Blockschaltbild nach F i g. 8a entsprechen die mit 32 bis 48 bezeichneten Teile dem Geräteteil 28 in Fig. 1.ίο In the block diagram according to FIG. 8a correspond to the with parts designated 32 to 48 the device part 28 in FIG. 1.

Während das Blockschaltbild nach F i g. 8a eine allgemeine Meßanordnung darstellt, ist in Fig.8b eine Anordnung für ein Teilchenzählgerät dargestellt. Der Kasten 30 hat die gleiche Bedeutung wie in F i g. 8a und kann z. B. ein Coulter-Counter oder ein Impulszytophotometer sein. Die im Gerät 30 erzeugten Signale werden einem Detektor 50 zur Bestimmung der Impulshöhe zugeführt, der in diesem Fall mit einem Impulsformer kombiniert ist. An den Detektor 50 ist ein Zähler 52 angeschlossen, der alle im Gerät 30 erzeugten Signale zählt.While the block diagram according to FIG. 8a a general Measuring arrangement represents, is in Fig.8b a Arrangement for a particle counter shown. The box 30 has the same meaning as in FIG. 8a and can e.g. B. be a Coulter counter or a pulse cytophotometer. The signals generated in the device 30 are fed to a detector 50 for determining the pulse height, in this case with a pulse shaper is combined. A counter 52 is connected to the detector 50 and records all of the signals generated in the device 30 counts.

Parallel zum Detektor 50 ist an das Gerät 30 ein Detektor 54 zur Bestimmung der Signalfläche angeschlossen. Zur Bestimmung der Signalfläche kann der Detektor 54 als üblicher Integrator arbeiten. Die Vorrichtung 50 ist über einen Kanal 58 und die Vorrichtung 54 über einen Kanal 60 mit einer Schaltung 62 verbunden, die aus Impulshöhe und Signalfläche einen Quotienten bildet. Die Teile 58, 60, 62 entsprechen in ihrem Bau und ihrer Arbeitsweise im wesentlichen den Teilen 38. 40. 42 der Einrichtung nach F i g. 8a.A detector is attached to the device 30 parallel to the detector 50 54 connected to determine the signal area. The detector can be used to determine the signal area 54 work as a usual integrator. The device 50 is over a channel 58 and the device 54 over a channel 60 is connected to a circuit 62 which forms a quotient from the pulse height and signal area. The parts 58, 60, 62 essentially correspond to parts 38, 40 in terms of their construction and mode of operation. 42 of the device according to FIG. 8a.

An die Schaltung 62 ist ein Diskriminator 64 angeschlössen, der in diesem Fail Signale durchläßt, deren Quotienten Koinzidenzen anzeigen, d. h., bei denen die Signalfläche gegenüber der Signalhöhe verhältnismäßig groß ist. Signale, deren Quotienten normale Meßereignisse anzeigen, werden in dem Diskriminator 64 unterdrückt. An den Diskriminator 64 ist ein Zähler 66 für die Koinzidenzsignale angeschlossen. Die Ergebnisse der Zähler 52 und 66 werden in einem Korrekturglied 68 zusammengefaßt. Die Gesamtzahl der Koinzidenzsignale, die durch den gleichzeitigen Durchgang von zwei Teilchen durch den Meßbereich verursacht worden sind, wird zur Gesamtzahl aller Signale, d. h. dei einfachen und der Koinzidenzsignale, in dem Korrekturglied 68 hinzugezählt. Diese Zusammenfassung er gibt die Gesamtzahl der durch den Meßbereich hin durchgegangenen Teilchen. An das Korrekturglied 6« ist eine Anzeigevorrichtung 70 für dieses korrigiert! Zählergebnis angeschlossen.A discriminator 64 is connected to the circuit 62, which in this case lets through signals, the quotients of which indicate coincidences, d. i.e. where the Signal area is relatively large compared to the signal height. Signals whose quotients are normal measurement events are suppressed in the discriminator 64. To the discriminator 64 is a counter 66 for the coincidence signals connected. The results of the counters 52 and 66 are in a correction element 68 summarized. The total number of coincidence signals caused by the simultaneous passage of two particles through the measurement area becomes the total number of signals, i.e. H. the simple and the coincidence signals in the correction term 68 added. This summary gives the total number of times through the measuring range passed particles. A display device 70 has been corrected for the correction element 6 ″! Counting result connected.

Zur weiteren Erläuterung der Teilchen-Meßanord nung nach F i g. 8a ist in F i g. 9 ein Impulsschema dar gestellt, das in einer einfachsten Anordnung bei de Auswertung eines Meßsignals auftritt, das von dem Ge rät 30 an den Peak-Detektor 32 abgegeben wird, wöbeTo further explain the particle measuring arrangement according to FIG. 8a is in FIG. 9 shows a pulse scheme placed, which occurs in a simplest arrangement in de evaluation of a measurement signal that is generated by the Ge advises 30 is delivered to the peak detector 32, wöbe

dieser mit dem Vielkanalanalysator 46 zusammenwirkt Die Meßanordnung ist in diesem Beispiel als »Samthis interacts with the multichannel analyzer 46. The measuring arrangement is in this example as "Sam

ple-Hold-Schaltung« ausgeführt, in der die Maximalhö he des Meßsignals (F i g. 9A) für eine bestimmte Zei gehalten wird (F i g. 9B). Beim Überschreiten einer vor wählbaren Ansprechschweüe (F i g. 9A) wird im Peak Detektor ein internes Signal (F i g. 9C) ausgelöst. Vople-hold circuit «, in which the maximum height The measurement signal (FIG. 9A) is held for a certain time (FIG. 9B). When crossing a front selectable response threshold (Fig. 9A), an internal signal (Fig. 9C) is triggered in the peak detector. Vo

diesem Zeitpunkt an läuft eine vorwählbzre Zeit ab, a deren Ende ein Signal (F i g. 9D) zum Vielkanalanalysa tor geleitet wird. Dieses Signal löst das Abgreifen de Höhe des gehaltenen Meßsignals aus F i g. 9B aus. DieAt this point in time, a preselectable time runs out, a the end of which sends a signal (FIG. 9D) to the multi-channel analyzer gate is directed. This signal triggers the tapping of the level of the held measurement signal from F i g. 9B off. the

ses kurze Signal (K i g. 9E). dessen I lohe der maximalen Höhe des Meßsignals (Fig. 9Λ) enispridii. wird den Vorrichtungen 42 zugclciiet und zur Steuerung ties Vielkaiialanalysators 46 benutzt. Kurze Zeil danach wird das gehaltene Signal im Peak-Detektor (Γ ι g.^L)li) wiedei gelöscht, so daß die Anordnung zur Verarbeitung eines weiteren Meßsignals wieder bereit isi. Das die absolute Höhe des jeweiligen Meßsignals darsullcnde Signal (F i g. 9E) wird zusammen mit der Signalfläclie zur Bildung des Verhältnisses benutzt, das. sofern es in der Form »Signalflache zu maximaler Signalgröße« einen bestimmten Wert überschreitet, kennzeichnend für das Auftreten von Koinzidenzen ist.This short signal (K i g. 9E). whose I lohe the maximum level of the measurement signal (Fig. 9Λ) enispridii. is used to access the devices 42 and to control the multi-purpose analyzer 46. Shortly thereafter, the held signal in the peak detector (Γ ι g. ^L ) li) is deleted again, so that the arrangement is ready again for processing a further measurement signal. The signal representing the absolute level of the respective measurement signal (FIG. 9E) is used together with the signal area to form the ratio which, if it exceeds a certain value in the form of "signal area to maximum signal size", indicative of the occurrence of Is coincidences.

In F i g. 10 sind Original-Häufigkeitsverteilungen des DNS-Gehahcs von Leukozyten von peripherem menschlichem Blut gegenübergestellt, von denen die oDcren ohne und die unteren mit Koinzidenzsperre aufgenommen worden sind, und zwar mit einer Meßrate von etwa 4000 Zellen pro Sekunde. Die Kurven sind so gezeichnet, daß auf der Abszisse als Maß der Gehalt an DNS pro Zelle und in der Ordinate die Anzahl der Zellen pro Kanal abgetragen sind. Der hohe Flächenanieil unier der Kurve an der Stelle 2c stammt von Cj ι-Phase-Zellen. Oben rechts ist dann weiter zu erkennen, daß viele Meßwerte registriert worden sind, die zum überwiegenden Teil durch Koinzidenzercignisse zustande gekommen sind. Der hohe Anteil dieser »falschen« Meßwerte wird nach 4- und Ibfachcr Streckung des Histogramms in V-Richtung deutlich, siehe oben rechts die verschiedenen, aus Einzelpunkten zusammengesetzten Kurven. Oben links in Fig. 10 ist zur Verdeutlichung das oben rechts w iedergegebcne Histogramm ohne die in V-Richiung gestreckten Kurvenanieile ein /weites Mal wiedergegeben worden. Fine eingehende iictrachtung tier dieser Darstellung zugrundeliegenden ^ Meßergehni^se halte gezeigt, daß die hei 4c 'cgislrierlen Meßsignale mit den kleinsten Vergleichsflächen in IΟ"··,, liner I lohe eine Lange von etwa 40 usec halten. I nt" die Aufnahme des unteren Histogramms isi die Konzidenzsperre so eingestellt worden, daß nur MeIisignale aufgezeichnet wurden, die in 10% ihrer Höhe nicht langer als 45 usec waren. Das so e¹ haltenc Histogramm zeigt wesentlich weniger Meßwerte im Bereich von 4c' und darübei. bei denen es sich im Fall des oberen Histogramms um registrierte Koinzidenzen gehandell hat. Auch im Bereich des Histogramms zwischen 2t'und 4t'sind unter Verwendung der Koinzidenzsperre wesentlich weniger Zellen registriert Das so erhaltene Histogramm entspricht trotz der hohen Meßrate einer DNS-Mengenverteilung normaler Leukozyten des peripheren Blutes. Neben einem großen Anteil von Gi-Phasc-Zellen 2c und einigen G:-Phase-Ze!len 4t sind in diesem Fall weniger als I¹VO Zellen zwischen 2t und 4r registriert worden (.S'-I'hase-Zellen). Die Strek kung des Histogramms unten rechts in V-Richtung macht deutlich, daß rechts von 4c keine von Koinziden zen stammenden Meßsignale mehr registriert wordei sind. Unten links ist entsprechend der Darstellung obei links das in ) -Richtung nicht gestreckte llistogramn aus dem rechten Original-Histogramm herausgezeichIn Fig. 10 are compared with the original frequency distributions of the DNA content of leukocytes of peripheral human blood, of which the lower ones were recorded without and the lower ones with a coincidence lock, namely at a measuring rate of about 4000 cells per second. The curves are drawn in such a way that the amount of DNA per cell is plotted on the abscissa and the number of cells per channel is plotted on the ordinate. The high surface area unier of the curve at point 2c comes from Cj ι-phase cells. At the top right it can also be seen that many measured values have been recorded, the majority of which were due to coincidence events. The high proportion of these "false" measured values becomes clear after stretching the histogram 4 and 1 times in the V direction, see above right the various curves composed of individual points. At the top left in FIG. 10, for the sake of clarity, the histogram shown at the top right has been reproduced one time without the curve lines stretched in the V direction. A detailed consideration of the measuring results on which this illustration is based, it has been shown that the hot 4c 'cgislrierl measuring signals with the smallest comparison areas in liner I keep a length of about 40 microseconds. Inside the recording of the lower In the histogram, the concession lock was set in such a way that only small signals were recorded that were no longer than 45 usec in 10% of their height. The thus e ¹ haltenc histogram shows much less values in the range of 4c 'and darübei. which in the case of the upper histogram were registered coincidences. Even in the area of the histogram between 2t 'and 4t', significantly fewer cells are registered using the coincidence lock. Despite the high measuring rate, the histogram thus obtained corresponds to a DNA quantity distribution of normal leukocytes of the peripheral blood. In addition to a large proportion of Gi-Phasc cells 2c and a few G: phase cells 4t, fewer than I ¹ VO cells between 2t and 4r were registered in this case (.S'-phase cells). The stretching of the histogram at the bottom right in the V direction makes it clear that to the right of 4c no measurement signals originating from coincidences have been registered any more. At the bottom left, the llistogram, which is not stretched in the) direction, is drawn out of the original histogram on the right, as shown in the illustration above

τ,ο net tiargestellt. τ, ο net tiarosed.

Hierzu 8 Blatt ZeichnungenIn addition 8 sheets of drawings

Claims

Patent claims:

1. Method for the automatic counting and measuring of particles, especially biological ones Cells that are suspended in a fluid medium and defined by this by a th area of a physical field can be conveyed through, whereby through the passage of the individual particle signals are generated which can be represented as ic two-dimensional curves, whose The abscissa is determined by time and the ordinate is a signal variable, characterized in that that 'for the detection of coincidences for each signal curve the maximum size and the two Signal curve and a parallel to the abscissa reading area is determined and these two quantities be related to each other.

2. The method according to claim J, characterized in that that the signal curves for which the ratio of the area to the maximum size determines Exceeds the value as coincidences are rejected.

3. The method according to claim 1 or 2 for counting in particular blood cells, characterized in that that the coincidence signals are counted separately and their sum to the simple sum of all signals is added.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the signals with light signals generated by a pulse cytophotometer can be used.

5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that capacitance change signals are used as signals be used.

6. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the signals resistance change signals be used.