DE2303846A1

DE2303846A1 - Chromatographic analysis esp of proteins - using laser light beam passing through undyed specimen achieves increased sensitivity

Info

Publication number: DE2303846A1
Application number: DE19732303846
Authority: DE
Inventors: Ernst Dipl Phys Dr Remy
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1973-01-26
Filing date: 1973-01-26
Publication date: 1974-08-08

Abstract

A method of chromatography, esp. electrophoresis, consists of optically detecting local collections of molecules which have become differentiated by their differing speeds of travel from a common starting point. The transporting medium is illuminated, pref. by a laser beam, and the light emanating from the migration fronts is measured. The specimens are pref. left undyed.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Chromatographie, insbesondere zur Elektrophorese Die Erfindung betriiit ein Verfahren zur Chromatographie, insbesondere zur Elektrophorese, bei dem in einer Probe enthaltene Moleküle, Molekülkomplexe od.dgl. einer gerichteten Wanderung in einem Transportmedium von einem gemeinsamen Ausgangspunkt aus unterworfen und die sich durch die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten ergebenden örtlichen Ansammlungen von Molekülen verschiedener Art mit optischen Mittels nachgewiesen werden. Method and device for chromatography, in particular for electrophoresis The invention relates to a method for chromatography, in particular for electrophoresis, in which molecules, molecular complexes or the like contained in a sample. one directed Subjected to migration in a transport medium from a common starting point and those resulting from the different migration speeds local accumulations of molecules of various kinds detected with optical means will.

Von Elektrophorese spricht man bei einem solchen Verfahren dann, wenn die Wanderung der Moleküle - worunter insbesondere auch Makromoleküle und größere Molekülkomplexe bis zu ganzen Zellen verstanden werden können - durch Anlegen einer elektrischen Spannung an das Transportmedium bewirk-t bzw. unterstützt wird. Besondere Bedeutung ha-t die Blektro-Routine phorese in der medizinischen Diagnostik als isendePiverS..h- ren zur Trennung der verschiedenen Eiweißbestandteile von Serurn oder anderen Körperflüssigkeiten.Such a method is called electrophoresis when the migration of the molecules - which can also be understood to include macromolecules and larger molecular complexes up to whole cells - is brought about or supported by applying an electrical voltage to the transport medium. Blektro-routine phoresis is of particular importance in medical diagnostics isendePiverS..h- to separate the various protein components from serum or other body fluids.

Der optische Nachweis der durch die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten getrennten Eiweißfraktionen erfolgt bei den bisher iolichen Verfahren in der Weise, dai, die Eiweißfraktionen nach Beendigung der Wanderung in dem Transportmedium eint;efärbt werden und dann die durch sie bewirkte Lichtextinktion photometrisch nachgewiesen wird Hierdurch wird das ganze Verfahren relativ kompliziert und zeitraubend, nicht nur weil das Einfärben zusätzliche zur beitsgänge erforderlich macht, sondern vor allem deshalb, weil diese Nachweismethode relativ große Mengen der nachzuweisenden Eiweißfraktionen voraussetzt. Die Probe muß deshalb ursprünglich ein bestimmtes Mindestvolumen und damit auch eine rela-tiv große Breite in Wanderungsrichtung haben; damit ist aber auch die Laufstrecke, die bis zum Erreichen einer die anfängliche Linienbreite merklich übersteigenden Trennung der Fraktionen nötig ist, relativ groß und die zum Durchlaufen nötige Meßzeit relativ lang. Auch bei den modern sten Elektrophoreseverfahren, bei denen Acetatmembranfolien als Transportmedium verwen, betragen die Meßzeiten immer noch ca. 1/2 bis 1 Stunde, bei den alteren Verfahren mehr als 12 Stunden. Das für den photometrischen Nachweis der Probe erforderliche Mindestvolumen / setzt auch eine untere Grenze für ae mit dem Verfahren erreichbare Trennschärfe, und die an sich erwünschte Automatisierung des Verfahrens ist wegen der Länge, Kompliziertheit und Dauer der Arbeitsgänge nicht befriedigend möglich. The visual proof of the different migration speeds separate protein fractions takes place in the previous iolichen processes in such a way that dai, which colors the protein fractions in the transport medium after the migration has ended and then the light extinction caused by them is detected photometrically This makes the whole process relatively complicated and time consuming, doesn't it only because the coloring makes additional steps necessary, but before mainly because this detection method involves relatively large amounts of the items to be detected Assumes protein fractions. The sample must therefore originally be a specific one Have a minimum volume and thus a relatively large width in the direction of migration; However, this also means that the running distance, which is the initial one until you reach one, is the initial one Line width noticeably exceeding separation of the fractions is necessary, relative large and the measurement time required to run through it is relatively long. Even with the most modern Electrophoresis processes in which acetate membrane foils are used as the transport medium, are the measuring times still about 1/2 to 1 hour with the older procedures more than 12 hours. That for the photometric detection of Minimum volume required / also sets a lower limit for ae with the sample Process achievable selectivity, and the desired automation of the Procedure is not because of the length, complexity and duration of the operations satisfactory possible.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren der genannten Art so zu verbessern, daß es bei verbesserter Trennleistung und Exaktheit mit weniger Arbeitsvorgängen und vor allem in wesentlich kürzerer Zeit durchgeführt werden kann und sich Desser zur Automatisierung eigne-t als die bisherige Verfahrens durchführung. The object of the invention is to provide a method of the type mentioned to improve that it with improved separation efficiency and accuracy with fewer operations and most importantly, it can be done in a much shorter time and Desser suitable for automation than the previous method implementation.

Dies wird gemäß der Erfindung in erster Linie dadurch erreicht, daß man das Transportmedium mit einem Lichtstrahl durchleuchtet und das von den örtlichen Molekülansammlungen aus dem Lichtstrahl herausgestreute Licht mißt. This is achieved according to the invention primarily in that one shines through the transport medium with a beam of light and that from the local Measures light scattered out of the light beam by accumulations of molecules.

Es wurde gefunden, daß der Nachweis von Eiweißmolekülansammlungen mittels Streulicht um mehrere Größenordnungen empfindlicher ist als die klassische Methode des Einfärbens und der photometrischen Auswertung. Das Gesamtvolumen der Probe kann deshalb um mehrere Größenordnungen kleiner sein als bisher, Mußte bisher die Probe anfänglich eine Breite von mindestens 1 mm in Wanderungsrichtung haben, so genügen jetzt Linienbreiten von 1/10 bis 1/100 mm. Bei so scharfen Linien genügt andererseits schon eine kurze Laufstrecke und Laufzeit, um die Eiweißfraktionen um ein zur Auflösung ausreichendes Maß auseinanderzuziehen, d.h. die Laufstrecke kann auf die Größenordnung von Millimetern und die Meßzeit auf die Größenordnung von einer bis wenigen minuten gesenkt werden. Dies ist an sich schon ein entscheidender Vorteil und wirkt sich außerdem vorteilhaft auf die Trennschärfe aus, da innerhalb dieser kurzen Meßzeit die durch Diffusion bedingte Linienverbreiterung noch nicht ins Gewicht fallen kann. Line besonders hohe Lichtintensität bei schmalem Querschnitt des Lichtstrahls und damit eine große Nachweisempfindlichkeit erreicht man, wenn man als Lichtstrahl einen Laserlichtstrahl verwendet. Ein besonders vorteilhaftes lierlsmal des Verfahrens besteht darin, daß man das Licht an den nicht eingefärbten Molekülen bzw. Molekülkomplexen streut. Damit entfällt ein bei den bisherigen Verfahren notwendiger Arbeitsvorgang, der zeitraubend war und ein besonderes Hindernis für die frutomatisierung darstellte. It was found that the detection of protein molecule accumulations by means of scattered light is several orders of magnitude more sensitive than the classic Method of coloring and photometric evaluation. The total volume of the Sample can therefore be several orders of magnitude smaller than before, had to be before the sample initially has a width of at least 1 mm in the direction of migration, so enough now line widths from 1/10 to 1/100 mm. With so sharp Lines, on the other hand, a short running distance and running time are enough to get the protein fractions to pull apart a measure sufficient to resolve the issue, i.e. the running distance can be on the order of millimeters and the measurement time on the order of magnitude can be reduced by one to a few minutes. This in itself is a crucial one Advantage and also has a beneficial effect on the selectivity, because within The line broadening caused by diffusion does not yet affect this short measurement time can be significant. Line particularly high light intensity with a narrow cross-section of the light beam and thus a high detection sensitivity can be achieved if a laser light beam is used as the light beam. A particularly beneficial one First of all, the process consists in applying the light to the uncolored Scatters molecules or molecular complexes. This eliminates the need for the previous procedures necessary work process that was time consuming and a particular obstacle for which represented frutomatization.

Lin Charakteristikum der bisherigen Verfahren bestand darin, daß die Auswertung erst nach Abschluß des eigentlichen Trennvorgangs durchgeführt werden konnte. Die Zeit, nach der man den Trennvorgang abbricht und das Elektropherogramm zur Auswertung präpariert, muß von vorneherein nach Schätzung oder Erfahrung festgelegt werden. Üb sie optimal gewählt war, kann erst nach der Auswertung festgestellt werde 1-i, wenn eine Korrektur nicht mehr möglich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren gibt in besonders vorteilhafter weiterer Ausgestaltung die Möglichkeit, die Auswertung bereits bj laufender Elektrophorese durchzulühren. Insbesondere k;nn man mit dem 1.ichtstrahl einen schmalen Querschnitt des Transportmediums in vorgegebenem Abstand vom Ausgangspunkt durchleuch-ten und die zeitlichen Änderungen des Streulichtes messen, die sich dadurch ergeben, daß die einzelnen Wanderungsfronten von Molekülen od.dgl. nacheinander durch den durchleuchteten Querschnitt wandern. Man hat dadurch ein "on-line"-Verfahren mit Nachweis während der Messung. Häufig. kommt es bei der Untersuchung nur auf relativ wenige, schnell zu trennende Eiweißfraktionen an, während andere, schwierig zu trennende Fraktionen nur in Ausnahmefällen interessieren. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man den Durchgang der Fraktionen durch den Lichtstrahl beobachten und die Messung abbrechen, sobald die jeweils inieressierenden Fraktionen erschienen sind. Hierdurch kann man wertvolle Meßzeit einsparen. Man braun auch den Lichtstrahl längs des Transportmediums verschieben und z.B. die Messung in zwei oder drei verschiedenen Abständen vom Ausgngspuiikt wiederholen, falls sich am ersten Meßpunkt die Trennung der Fraktionen noch als ungenügend erwiesen hat. Die durch den Durchgang der Wanderungsfronten bewirkten Modulationen des Streulichtes kann man als eine die Verteilung der Eiweißfraktionen wiedergebende Kurve z.B. mit einem Schreibgerät registrieren oder auf den Schirm eines Oszilloskops sichtzur machen. Lin characteristic of the previous procedures was that the evaluation can only be carried out after the actual separation process has been completed could. The time after which the separation process is interrupted and the electropherogram Prepared for evaluation, must be determined from the outset according to estimates or experience will. Whether it was optimally selected can only be determined after the evaluation 1-i, if a correction is no longer possible. The inventive method gives in a particularly advantageous further embodiment the possibility of the evaluation to perform electrophoresis already in progress. In particular, you can use the 1st light beam a narrow cross-section of the transport medium at a specified distance from the starting point and the temporal changes in the scattered light measure, which result from the fact that the individual migration fronts of molecules or the like. one after the other through the transilluminated cross-section. One has thereby an "on-line" method with detection during the measurement. Frequently. it comes from the Examination only for relatively few protein fractions that can be separated quickly, while other, difficult to separate fractions are of interest only in exceptional cases. At the The method according to the invention can be the passage of the fractions through the light beam observe and stop the measurement as soon as the respective fractions are of interest have appeared. This can save valuable measuring time. You tan too move the light beam along the transport medium and, for example, measure in two or repeat three different distances from the original, if the first Measuring point, the separation of the fractions has proven to be inadequate. By the passage of the migration fronts caused modulations of the scattered light as a curve showing the distribution of the protein fractions, e.g. with a Register the writing instrument or view it on the screen of an oscilloscope.

Anstatt an einem oder mehreren Fixpunkten ein zeitlich variierendes Signal zu gewinnen, kann man aber auch in vorteilhafter Weise ständig die gesamte Laufstrecke oder einen Teil davon mit dem Lichtstrahl in rascher periodischer Folge abtasten und die sich durch die Abtastung ergebenden S-treulichtmodulationen auf einem Oszilloskop sichtbar machen. Instead of one or more fixed points, a time-varying one To gain the signal, however, one can also advantageously keep the entire signal Running distance or part of it with the light beam in rapid periodic succession scan and the S-scattered light modulations resulting from the scan visualize it with an oscilloscope.

Dann erhält man ein Momentanbild der örtlichen Verteilung der Wanderungsfronten in dem Transportmedium. Die Beobachtung der langsamen zeitlichen Änderung dieses Momentanbildes kann wertvolle Aufschlüsse über die Zusammensetzung geben. Diese Methode ermöglicht es auch, die Meßzeit auf das absolut nötige Minimum zu beschränken. Außerdem können an sich bekannte optische und elektronische Mittel eingesetzt werden, um z.B. durch Differenzbildung oder Korrelation einer Abtastperiode mit einer oder mehreren vorhergehenden Abtastperioden die Signalgüte zu verbessern, den Untergrund, insbesondere das am Transportmediurn gestreute Licht, zu unterdrücken und das Signal in sonstiger Weise zu manipulieren.Then one receives an instantaneous picture of the local distribution of the migration fronts in the transport medium. Observing the slow change over time of this Instantaneous images can provide valuable information about the composition. These Method also makes it possible to reduce the measurement time to the absolutely necessary minimum. In addition, known optical and electronic means can be used, e.g. by subtracting or correlating a sampling period with an or several previous sampling periods to improve the signal quality, the background, in particular to suppress the light scattered on the transport medium and the signal manipulate in any other way.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gegebene Möglichkeit, mit extrem schmaler Anfangsbreite der probe und mit extrem kurzen Meßzeiten zu arbeiten, macht besondere Maßnahmen zur exakten Auslösung der Molekülwanderung erforderlich. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung lost man die Wanderung der Moleküle in dem Transportmedium dadurch aus, daß man eine Säule des flüssigen oder gelförmigen Transportmediums mit einem folienartigen Proben träger, der die Probe durch Kapillarkräfte od.dgl. trägt, in Berährung bringt. Durch die folienartige Ausbildung des Probenträgers ist eine geringe Breite der Probe in Wanderungsrichtung, d.h. eine kleine Linienbreite, gewährleistet, während andererseits der Querschnitt der Säule des Trans-portmediums und die Flache der probe ausreichend groß sein können, so daß ein genügendes Probenvolumen zur Verfügung steht. In dem Probenträger kann die Probe praktisch unbegrenzte Zeit verbleiben, ehe durch Berührung mit dem Transportmedium die Wanderung ausgelöst wird. Legt man den Probenträger und das Transportmedium vorher auf unterschiedlich elektrische Potentiale, so wird exakt im Augenblick der gegenseitigen Berührung auch die fiir die Elektrophoretische Trennung erforderliche Spannung angelegt. The possibility given by the method according to the invention, with extremely narrow initial width of the sample and to work with extremely short measuring times, makes special measures necessary for the exact triggering of the molecular migration. According to a preferred embodiment of the invention, you solve the migration of the Molecules in the transport medium by having a column of the liquid or gel-shaped Transport medium with a film-like sample carrier, which the sample by capillary forces or the like. carries, brings into contact. Due to the film-like design of the sample carrier is a small width of the sample in the direction of migration, i.e. a small line width, guaranteed, while on the other hand the cross-section of the column of the transport medium and the area of the sample can be sufficiently large so that a sufficient sample volume is available. The sample can remain in the sample carrier for a practically unlimited time remain before the migration is triggered by contact with the transport medium will. If you put the sample carrier and the transport medium on differently beforehand electrical potentials, so will be exactly at the moment of mutual contact the voltage required for electrophoretic separation is also applied.

Die erfindungsgemäß gegebene Möglichkeit, die Wanderungsfronten während der elektrophoretischen Trennung ständig nachzuweisen und zu beobachten, gestattet auch in vorteilhafter Weise die Anwendung zusätzlicher, die Molekülwanderung beeinflussender Maßnahmen, und zwar entsprechend den Notwendigkeiten der jeweils laufenden Messung. Insbesondere kann man während der Messung durch Umpolen oder Pulversieren der eleLtrischen Spannung, durch Beeinflussung des pH-Wertes oder der Ionenstärke des Transportmediums die Wanderungsgeschwindigkeit der Ilole.ille unterschiedlich beeinflussen und dadurch zusätzliche Trenneffekte erzielen. Insbesondere kann man einen Gradienten des pH-Wertes in Richtung der Molekülwanderung oder senkrecht zu dieser Richtung erzeugen und diesen Gradienten zeitlich variieren. Eine ilöglichkeit, dies zu erreichen, besteht z.B. darin, eine den ptI-Wert beeinflussende Substanz, z.B. eine Säure oder Lauge, vom Probeiiende her oder vom entgegengesetzten Ende her oder auch von der Seite her in das Transportmedium eindiffundieren zu lassen. Nan kann auch die Moleküle von dem folienartigen Probenträger aus nach zwei Seiten in Transportmedien mit verschiedenen Eigenschaften wandern lassen. The possibility given according to the invention, the migration fronts during the electrophoretic separation can be continuously detected and observed it is also advantageous to use additional ones that influence molecular migration Measures according to the needs of the current measurement. In particular, during the measurement, polarity reversal or powder coating of the electrical Voltage, by influencing the pH value or the ionic strength of the transport medium affect the migration speed of the Ilole.ille differently and thereby achieve additional separation effects. In particular, you can a gradient the pH value in the direction of molecular migration or perpendicular to this direction generate and vary this gradient over time. One way to achieve this consists, for example, in using a substance that affects the ptI value, e.g. an acid or Lye, from the sample end or from the opposite end or from the Diffuse side into the transport medium. Nan can also do the molecules from the film-like sample carrier to two sides in transport media with different Let properties wander.

Außer der Intensität des Streulichtes kann man unter Umständen noch weitere Eigenschaften des Streulichtes zur Gerinnung zusätzlicher Informationen über die Eiweißfraktionen heranziehen, insbesondere die Richtungsverteilung und die Phase des Streulichtes. Insbesondere bei Verwendung eines kohärenten Lichtes, also eines Lasers-trehls, kann man die sogenannte light-beating-Spek-troskopie anwenden, um durch die Elektrophorese nicht aufgelöste Eiweiß arten voneinander zu unterscheiden. Die light-beating-Spektroskopie beruht darauf, daß das an den einzelnen Molekülen mit Phasenänderung gestreute kohärente Licht sich gegenseitig mit Phasenverschiebung überlagert und daß hierdurch Schwebungen der Licht intensität im Radiofrequenzbereich auftreten, die als Wechselstromsignale am Ausgang eines das Streulicht messenden Empfängers (Photomultiplier) nachgewiesen werden können und deren Frequenz eine Information über die Art der streuenden Eiweißmoleküle liefern kann. In addition to the intensity of the scattered light, it is possible under certain circumstances further properties of the scattered light to coagulate additional information refer to the protein fractions, in particular the directional distribution and the phase of the scattered light. Especially when using a coherent light, so of a laser beam, one can use the so-called light-beating spectroscopy, in order to distinguish protein types that have not been dissolved by electrophoresis. The light-beating spectroscopy is based on the fact that the individual molecules coherent light scattered with phase change mutually phase shifted superimposed and that thereby pulsations of the light intensity in the radio frequency range occur as alternating current signals at the output of a measuring the scattered light Receiver (photomultiplier) can be detected and its frequency a Can provide information about the type of scattering protein molecules.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht im wesentlichen aus einer Säule aus einem Transportmediurn, die mit ihrem einen Ende mit einem Probenträger in Berührung bringbar ist, aus einer Lichtquelle, insbesondere auf einem Laser, zum Erzeugen eines die Säule im Abstand vom Probenträger durchquerenden Lichtstrahls, und einen außerhalb des Lichtstrahles angeordneten Lichtempfänger zum Messen des Streulichtes. A device for carrying out the method according to the invention consists essentially of a column of a transport medium, which with its one end can be brought into contact with a sample carrier from a light source, in particular on a laser, for generating the column at a distance from the sample carrier traversing light beam, and one arranged outside of the light beam Light receiver for measuring the scattered light.

Vorzugsweise ist der Abstand des Lichtstrahls vom Probenträger veränderbar. Auch kann eine Einrichtung zum Erzeugen einer schnellen periodischen Abtastverschiebung des Lich-tstrahls in Längsrichtung der Säule vorgesehen sein, z.B. in Forr.1 einer rotierenden, planparallelen Glasplatte. The distance between the light beam and the sample carrier can preferably be changed. A device for generating a rapid periodic scan shift of the light beam must be provided in the longitudinal direction of the column, e.g. in form 1 a rotating, plane-parallel glass plate.

Vorzugsweise befindet sich das flüssige oder gelförmig Transportmedium in einem lotrechten, oben durch den Probenträger abgedeckten Rohr und kann durch Anheben in dem Rohr mit dem Probenträger in Kontakt gebracht werden. The transport medium is preferably in the form of a liquid or gel in a vertical tube covered at the top by the sample carrier and can through Lifting in the tube to be brought into contact with the sample carrier.

Der Probenträger hat insbesondere die Form einer senkrecht zur Längsrichtung der Säule des Transportmediums verlaufenden Folie, vorzugsweise aus saugfähigem Material, wobei die Foliendicke vorteilhafterweise weniger als 0,1 mm betragen kann. The sample carrier has in particular the shape of a perpendicular to the longitudinal direction the column of the transport medium running film, preferably made of absorbent Material, wherein the film thickness can advantageously be less than 0.1 mm.

Für Reihenuntersuchungen kann der folienartige Probenträger ein Band sein, auf dem eine Folge von Proben nebeneinander angeordnet ist, die durch Verschieben des Bandes quer zur Säule des Transportmediums nacheinander in Meßposition bringbar sind. The foil-like sample carrier a Be a tape on which a sequence of samples is arranged side by side, which through Moving the belt across the column of the transport medium one after the other into the measuring position are bringable.

Vorteilhaft ist eine Kühleinrichtung für das Transportmedium, wodurch es möglich ist, höhere elektrische Spannungen anzulegen. A cooling device for the transport medium is advantageous, as a result of which it is possible to apply higher electrical voltages.

Eine Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung näher erläutert. Diese zeigt eine schematische Prinzipskizze einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Maßverhältnisse der Darstellung entsprechen nicht den wirklichen Veihältnissen. An embodiment of the invention is described below with reference to the drawing explained in more detail. This shows a schematic sketch of a device for Implementation of the method according to the invention. The proportions of the representation do not correspond to the real circumstances.

In einem lotrechten Itohr 1 aus lichidurclUässigem isiaterial befindet sich das Transportmedium 2 in Form einer lotrechten Säule. Die Größe des Röhrchens ist stark übertrieben dargestellt, sein Querschnitt ¾rfte in der Praxis etwa 25 bis 100 mm2 betragen, wobei die optimale Querschnittsgröße aufgrund des für den Nachweis erforderlichen Mindestvolumens einer liolekül-fraktion, ferner aufgrund der Verzerrungen der Molekülwanderungsfronten durch Randeffekte, Konvektionsströmungen usw. festzulegen ist. Der Querschnitt des Röhrchens ist vorzugsweise nicht rund, sondern quadratisch oder jedenfalls mit mindestens zwei ebenen Fensterflächen für den Durchtritt des Lichtstrahls und des gestreuten Lichtes versehen, um Brechungseffekte an gewölbten Flächen auszuschalten. Located in a vertical tube 1 made of light-permeable insulating material the transport medium 2 is in the form of a vertical column. The size of the tube is shown greatly exaggerated, its cross-section should be about 25 in practice up to 100 mm2, with the optimal cross-sectional size due to the Evidence of the required minimum volume of a liolekül fraction, also based on the distortions of the molecular migration fronts due to edge effects, convection currents etc. is to be determined. The cross-section of the tube is preferably not round, but square or at least with at least two flat window surfaces for provide the passage of the light beam and the scattered light, around To switch off refraction effects on curved surfaces.

über den oberen Rand des Rohres 1 ist ein folienartiger Probenträger 3 geführt, der die zu untersuchende Probe 4, Blut z.B. eine Probe von menschlichem Zörperserum, trägt. Die Probe 4 ist der Deutlichkeit halber als Erhöhung an der Oberseite des Probenträgers 3 angedeutet; in der Wirklichkeit jedoch ist die Probe 4 vorzugsweise in dem saugfähigen Probenträger 3 ein:ebettet und hat deshalb die gleiche Dicke wie dieser, ohne auf der einen oder anderen Seite eine Erhöhung zu bilden. Han läßt z.B. einen Tropfen Serum auf den saugfähigen Probenträger auftropfen und vollständig einziehen. Der Probenträger 3 besteht vorzugsweise aus einer saugfähigen Folie wie z.B. Polyacetatfolie.A film-like sample carrier 3 is guided over the upper edge of the tube 1, which carries the sample 4 to be examined, for example a sample of human blood Body serum, wearing. For the sake of clarity, the sample 4 is indicated as an elevation on the upper side of the sample carrier 3; in reality, however, the sample 4 is preferably embedded in the absorbent sample carrier 3: embedded and therefore has the same thickness as this, without forming an elevation on one side or the other. For example, Han lets a drop of serum drip onto the absorbent sample carrier and be completely absorbed. The sample carrier 3 preferably consists of an absorbent film such as polyacetate film.

Der Probenträger 3 kann als Streifen ausgebildet und auf einer Rolle 5 aufgewickelt sein und nebeneinander eine Vielzahl von verschiedenen zu untersuchenden Proben 4,4',4" tragen. Durch Abziehen des Streifens von der Rolle 5 können die Proben nacheinander zur Messung über das Rohr 1 gebracht werden. The sample carrier 3 can be designed as a strip and on a roll 5 be wound up and side by side a variety of different to be examined Carry samples 4,4 ', 4 ". By peeling the strip from the roll 5, the samples one after the other for measurement via the pipe 1.

Das Transportmedium ist vorzugsweise flüssig oder gelförmig. Geeignete Transportmedien für die Elektrophorese sind dem Fachmann bekannt. Es kann in dem Rohr 1 angehoben und abgesenkt werden, z.B. mittels eines Kolbens 6 oder (nicht dargestellt) dadurch, daß das Rohr 1 mit einem heb-und senkbaren, mit Transportmedium gefüllten Staugefäß kommuniziert. Zu beginn der Messung ist das Transportmedium so weit abgesenkt, daß sein oberes niveau tiefer liept ls der Probenträger 3, dieser also mit dem Transportmedium keinen Kontakt hat. Durch Anheben der Säule des Transportmediums 2 wird dieses mit dem probenträger 3 in Bei-Qihrung gebracht. In diesem Augenblick beginnen die Moleküle der Probe 4 in das Transportmedium 2 hineinzudiffundieren. The transport medium is preferably liquid or gel-like. Suitable Transport media for electrophoresis are known to the person skilled in the art. It can be in that Tube 1 can be raised and lowered, e.g. by means of a piston 6 or (not shown) in that the tube 1 with a lifting and lowerable, communicates storage vessel filled with transport medium. At the beginning of the measurement is the transport medium is lowered so far that its upper level lies lower Sample carrier 3, so this has no contact with the transport medium. By lifting the column of the transport medium 2 is this with the sample carrier 3 in-Qihrung brought. At this moment, the molecules of sample 4 begin to enter the transport medium 2 diffuse into it.

Die Probe 4 auf dem Probenträger3 einerseits und das untere Ende des Transportmediums 2 andererseits sind durch geeignete anschlüsse 7,8 mit den beiden Polen einer elektrischen Gleichspannungsquelle verbunden. In dem Augenblick, in welchem das Transportmedium 2 den Probenträger 3 berührt, wird der elektrische Kontakt geschlossen, und im Transportmedium bildet sich eine elektrische Spannung aus, die die Wanderung der elektrische Ladungen tragenden Eiweißmoleküle durch das Transportmedium bewirkt. Aufgrund der verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten bilden sich verschiedene Wandungsfronten 9,9' usw. aus, die jeweils eine oder mehrere Eiweißfraktionen enthalten. The sample 4 on the sample carrier 3 on the one hand and the lower end of the transport medium 2, on the other hand, are connected to the connected to both poles of an electrical DC voltage source. At this moment, in which the transport medium 2 touches the sample carrier 3, the electrical The contact is closed and an electrical voltage is generated in the transport medium from which the migration of the electrical charges carrying protein molecules through the Transport medium causes. Because of the different migration speeds different wall fronts 9, 9 'etc. are formed, each one or more Contain protein fractions.

Ein von einer Lichtquelle 10 (schematisch angedeutet) erzeugter Lichtstrahl 11 durchleuchtet das Rohr 1 mit dem Transportmedium 2 in einem bestimmten Abstand a vom Probenträger 3. Der Abstand a kann in der Praxis wenige Millimeter betragen. Der Lichtstrahl 11 sollte möglichst scharf gebündelt sein, d.h. seine Erstreckung in Wanderungsrichtung der Moleküle sollte die Dicke des Probenträgers 3 nicht übersteigen. Vorzugsweise ist die Lichtquelle 10 ein Laser. Hierdurch ergibt sich einerseits die Möglichkeit einer sehr scharfen bündelung des Lichtstrahles und außerdem ist die Verwendung kohärenten Lichtes für weitere Meßzwecke vorteilhaft. In Höhe des Lichtstrahles 11 ist ein Lichtempfänger 12, z.B. ein Photemultiplier, so angeordnet, daß er vom direkten Lichtstrahl 11 nicht getroffen wird, sondern nur das Streulicht 13 empfängt, welches im Transportmedium 2 gestreut wird. Der Licht empfänger 12 liegt also außerhalb der Zeichenebene, falls der Lichtstrahl 11 iil dieser Zeichenebene verläuft. Das Transportmedium 2 selbs-t streu das Licht nich-t oder nur wenig; jedoch tritt Streulicht auf, wenn die Wanderungsfron-ten 9,9' usw. A light beam generated by a light source 10 (indicated schematically) 11 shines through the tube 1 with the transport medium 2 at a certain distance a from the sample carrier 3. The distance a can in practice be a few millimeters. The light beam 11 should be focused as sharply as possible be, i.e. its extension in the direction of migration of the molecules should correspond to the thickness of the sample carrier Do not exceed 3. The light source 10 is preferably a laser. This results in On the one hand, there is the possibility of a very sharp focus of the light beam and the use of coherent light is also advantageous for further measurement purposes. At the level of the light beam 11 is a light receiver 12, e.g. a photo multiplier, arranged so that it is not hit by the direct light beam 11, but receives only the scattered light 13 which is scattered in the transport medium 2. Of the Light receiver 12 is therefore outside the plane of the drawing if the light beam 11 runs iil this plane of the drawing. The transport medium 2 itself scatters the light little or no; however, stray light occurs when the migration fronts 9.9 'etc.

nacheinander durch den Lichtstrahl 11 laufen. Itit einem an den lichtempfänger 12 (über geeignete, nicht dargestellte Verstärker usw.) angeschlossenen Registriergerät 14 kann die Kurve der zeitlichen Anderungen der Streulichtintensität aufgezeichnet werden, die dem zeitlichen Verlauf des Durchgangs der Wanderungsfronten 9, 9' durch den Lichtstrahl 11 sowie die relativen Stärken bzw. Konzentrationen in den. Wanderungsfron-ten 9,9' wiedergibt. Diese Kurve entspricht der bei den bisherigen Verfahren gewonnenen photometrischen Extinktionskurve, hat jedoch eine wesentlich höhere Auflösung und wird in wesentlich kürzerer Zeit (entsprechend der geringen Laufstrecke a) gewonnen.run through the light beam 11 one after the other. Itit one to the light receiver 12 (via suitable, not shown amplifier, etc.) connected recording device 14 the curve of the time changes in the scattered light intensity can be plotted that the temporal course of the passage of the migration fronts 9, 9 'through the light beam 11 and the relative strengths or concentrations in the. Migration fronts 9.9 'reproduces. This curve corresponds to that obtained with the previous methods photometric absorbance curve, however, has a much higher resolution and is obtained in a much shorter time (corresponding to the short running distance a).

Der Lichtstrahl 11 ist in Längsrichtung des Transportmediurns 2 parallel zu sich selbst verschiebbar, was durch den Pfeil 15 angedeutet ist und durch Verschiebung der Lichtquelle oder init anderen geeigneten optischen Mitteln bewirkt werden kann. Hierdurch knnn der Abstand a von der Probe 4 willkürlich gewählt werden. Insbesondere kann man sich zuerst durch eine Messung bei sehr kleinem Abstand a, also in sehr kurzer Zeit, einen allgemeinen überblick über die Verteilung der Wanderungsfronten 9 verschaffen und dann -erforderlichenfalls - durch Wiederholung der Messung in einem größeren Abstand a bestimmte Interessierende Teile der Kurve mit besserer Auflösung nochmals messen. The light beam 11 is parallel in the longitudinal direction of the transport medium 2 displaceable to itself, which is indicated by the arrow 15 and by displacement the light source or other suitable optical means. As a result, the distance a from the sample 4 can be chosen arbitrarily. In particular you can first make a measurement at a very small distance a, i.e. in very shortly, a general overview of the distribution of the migration fronts 9 and then - if necessary - by repeating the measurement in a greater distance a certain parts of the curve with better interest Measure the resolution again.

Man kann aber auch den Lichtstrahl 11 schnell periodisch hin- und herbewegen und dadurch die Laufstrecke in dem Transportmedium 2 oder einen Teil davon ständig abtasten. ßine schnelle periodische Parallelverschiebung des Lichtstrahles zu sich selbst kann z.-. durch eine den Lichtstrahl n':ch 1-1' brechende Glasplatte 16 bewirkt werden, die in rotation versetzt wird (Pfeil 17). In diesem Fall kann an den Lichtemp fänger 12 ein Oszilloskop u angeschlossen sein, welches synchron zur periodischen Verschiebung des Lichtstrahls 11 arbeitet. Dann gibt das Oszilloskop die bei jeder "Abtastzeile" sich ergebende Intensitätsverteilung des Streulichtes und damit die momentanef Verteilung der Wanderungsfronten 9 längs der vom Lichtstrahl abgetasteten Strecke des Transportmediums wieder. But you can also quickly and periodically back and forth the light beam 11 move forward and thereby the route in the transport medium 2 or a part constantly scan it. A rapid periodic parallel shift of the light beam to oneself can e.g. through a glass plate refracting the light beam n ': ch 1-1' 16, which is set in rotation (arrow 17). In this case it can to be connected to the Lichtemp receiver 12, an oscilloscope u, which synchronously for the periodic shift of the light beam 11 works. Then there is the oscilloscope the intensity distribution of the scattered light resulting from each "scanning line" and thus the momentary distribution of the migration fronts 9 along that of the light beam scanned path of the transport medium again.

An den Lichtempfänger 12 kann ferner ein Gerät 19 angeschiossen sein, welches mittels Bandfilter, Verstärker und Anzeigegerät eine Auswertung dei in dem Streulicht enthaltenen hochfrequenten Wechsellichtanteile ermöglicht. Hierdurch kann man bei Streuung von köhärentem Laserlicht an den dann derungsfronten light-beating-Spektroskopie betreiben. A device 19 can also be connected to the light receiver 12, which by means of a band filter, amplifier and display device an evaluation dei in the Scattered light contained high-frequency alternating light components allows. Through this one can use light-beating spectroscopy when coherent laser light is scattered on the derungsfronten operate.

Abweichungen von der darstellten Ausführungsform sind im Rahmen der Erfindung möglich. Soist es z.B. denkbar, die Moleküle von der Probe 4 aus in zwei oder mehr verschiedenen Transportmedien - au d derselben oder auf verschiedenen Seiten des Probenträgers 3 - wandern zu lassen, wobei durch Anlegen unterschedlicher elektrischer Spannungen, durch Wahl unterschiedlicher Transportmedien, durch Einstellen unterschiedlicher pH-Werte im Transportmedium usw. die einzelnen Molekülarten, z.B. Eiweißfraktionen, in verschiedener Weise getrennt werden können. Während bei der Elektrophorese in einem einzigen Transportmedium die 91 Eiweißarten von menschlichem Blutserum normalerweise in 7 Fraktionen getrennt werden können, ist durch Anwendung der vorstehend genannten Methoden eine weitere Auftrennung in insgesamt etwa 30 Fraktionen möglich, wobei das erfindungsgemäße Verfahren mit seiner sehr kurzen, die Auswirkung störender Diffusionserscheinungen ausschließender Meßzeit eine wesentliche Voraussetzung für die Anwendung derartiger Methoden ist. Deviations from the illustrated embodiment are within the scope of Invention possible. For example, it is conceivable to split the molecules from sample 4 into two or more different transport media - on the same or on different ones Sides of the sample carrier 3 - to let wander, whereby by applying different electrical voltages, by choosing different transport media, by setting different pH values in the transport medium etc. the individual types of molecules, e.g. Protein fractions can be separated in various ways. While at the Electrophoresis in a single transport medium the 91 types of protein of human Blood serum can normally be separated into 7 fractions by application of the above methods a further separation into a total of about 30 Fractions possible, the process according to the invention with its very short, the effect of disruptive diffusion phenomena excluding the measuring time an essential A prerequisite for the application of such methods is.

Mit geeigneten Modifikationen ist das Verfahren auch dann anwendbar, wenn es sich nicht um eine durch elektrische Spannung bewirkte Molekülwanderung also Elektrophorese handelt, sondern allgemein um chromatograohische Trennvorgänge. With appropriate modifications, the procedure is too then applicable if it is not a molecular migration caused by electrical voltage So it is about electrophoresis, but generally about chromatographic separation processes.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Process for chromatography, in particular for electrophoresis, in which molecules, molecular complexes or the like contained in a sample are directed Migration into a transport medium from a common starting point is subdued and those resulting from the different migration speeds local accumulations of molecules of different Ait detected by optical means be indicated by the fact that one is the transport medium. with a Light beam shines through and that from the local molecule accumulations or migration fronts measures light scattered out of the light beam.

Method according to Claim 1, characterized in that that a laser beam is used as the light beam.

3. The method according to claim 1, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that the light is scattered on the uncolored molecules or molecular complexes.

4. The method according to any one of claims i to 3, characterized g e k e n It is clear that a light beam creates a narrow cross-section of the transport medium x-rayed at a given distance from the starting point and the temporal changes of the scattered light, which result from the fact that the individual migration fronts of molecules or the like. different types one after the other through the transilluminated cross-section hike.

5. The method according to claim 4, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e -t, that measurements are taken one after the other at different distances from the starting point.

6. The method according to claim 4, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t, that by constant periodic scanning of the entire migration route or of a section of the transport medium depending on the current local distribution the accumulation of molecules corresponding scattered light image is generated.

7. Verafhren according to claim 6, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t, that by subtracting or in particular by correlating a sampling period with one or more preceding sampling periods the background, in particular the light scattered on the transport medium,, suppresses.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized g e k e n n z e i c h n e t that the migration of the molecules or the like. in the transport medium triggered by the transport medium with a foil-like sample carrier Who, the sample by capillary action or the like. carries, brings in contact.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized g e k e n n z e i c h n e -t that there are temporal and / or spatial changes during the measurement the properties of the transport medium influencing the migration speed, especially its pH.

10. Device for performing the method according to one of the claims 1 to 9, not shown by a column made of a transport medium (2), one end of which can be brought into contact with a sample carrier (3), a Light source (10), in particular a laser, for generating a column of the transport medium (z) at a distance from the sample carrier traversing light beam (11), and one outside of the light beam arranged light receiver (12) for measuring the scattered light (13).

11. The device according to claim 10, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that the distance between the light beam (11) and the sample carrier (3) can be changed is.

12. The apparatus of claim 10, g e k e n n z e i c h -n e t through means (16) for generating a fast scan periodic shift of the light beam (11) in the longitudinal direction of the column of the transport medium (2).

13. The device according to claim 12, characterized in that g e k e n n -z e i c h n e t that the device (16) consists of a rotating, the light beam by refraction exists parallel to the self-displacing glass plate.

14. Device according to one of claims 10 to 1 2 ,, thereby to g it is not indicated that the liquid or gel-like transport medium (2) arranged in a vertical tube (1) covered at the top by the sample carrier (3) and can be brought into contact with the sample carrier by lifting it in the ear.

15. Vorrich-device according to one of claims 10 to 14, thereby g e k It is noted that the sample carrier (13) has the shape of a perpendicular to the longitudinal direction the column of the transport medium has running film.

16. The device according to claim 15, characterized in that g e L e n n -z e 1 c h n e t that the sample carrier (3) is a film made of absorbent material.

17. Apparatus according to claim 15 or 16, characterized in that it is -k e n n z e i c h n e t that the film thickness is less than 0.1 mm.

18. The device according to claim 15 to 17, characterized in that g e -k e n n z e i c h n e t that the follen-like sample carrier (n) is a band, on which a sequence of samples (4,4 ', 4 ") is arranged, which by moving the Belt transversely to the column of the transport medium (2) successively brought into the measuring position are.

19. Device according to one of claims 10 to 18, characterized g e k It is noted that the column of the transport medium (2) is attached to one pole and the sample carrier (3) is connected to the other pole of an electrical voltage source is.

20. Device according to one of claims 10 to 19, g e -k e n n z e i c h n e t by a cooling device for the transport medium.

1. Device according to one of claims 10 to 20, characterized g e k e It is noted that the light receiver is connected to an oscilloscope (18) is.

22. Device according to one of claims 10 to 21, characterized g e k e n n z e i c h n e t that to the light receiver (12) a device (19) for Detection of high-frequency amplitude oscillations of the scattered light connected is (light beating spectroscopy).

L e r s e i t e