DE2301687A1 - METHOD FOR DETERMINING TOTAL BILIRUBIN IN BODY FLUIDS - Google Patents
METHOD FOR DETERMINING TOTAL BILIRUBIN IN BODY FLUIDSInfo
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Description
Verfahren zur Bestimmung des Gesamtbilirubins in KörperflüssigkeitenMethod for determining total bilirubin in body fluids
Bilirubin ist ein Farbstoff im Blut, der auf den natürlichen Zerfall von Blutkörperchen zurückzuführen ist. Br wird über die Leber und Galle ausgeschieden. Während kleine Mengen Bilirubin im Serum durchaus normal sind, zeigen erhöhte Verte eine Störung in dem Ausscheidungssystem der Leber und Galle an.Bilirubin is a pigment in the blood that is caused by the natural breakdown of blood cells is. Br is excreted in the liver and bile. While small amounts of bilirubin in the serum are quite normal, elevated vertebrae indicate a disturbance in the excretory system of the liver and Bile on.
Ein schon lange bekanntes Verfahren zum Nachweis des Bilirubins im Serum ist die Koppelung dieser Substanz an diazotierte SuIfanilsäure. Man unterscheidet dabei zwischen Bilirubin, das sofort koppeln kann (= direktes Bilirubin) und demjenigen, das erst mit Hilfe eines Accelerators freigesetzt werden muß, um die Koppelungsreaktion eingehen zu können (= indirektes Bilirubin). Für die Hehrzahl der diagnostischen Fragen genügt jedoch die Bestimmung des gesamten Bilirubins. Han bestimmt also direktes und indirektes Bilirubin zusammen, indem man die Bestimmung in Anwesenheit eines Accelerators ausführt. Ein bekannter, häufig verwendeter Accelerator ist eine Lösung von Coffein und Hatriumbenzoat. A method for detecting bilirubin in serum that has long been known is the coupling of this substance to diazotized sulfanilic acid. One differentiates between bilirubin, which can couple immediately (= direct bilirubin) and the one that can only couple with help an accelerator must be released in order to enter into the coupling reaction (= indirect Bilirubin). For most of the diagnostic questions, however, it is sufficient to determine the total bilirubin. So Han determines direct and indirect bilirubin together by making the determination in the presence of a Accelerators running. A well-known, commonly used accelerator is a solution of caffeine and sodium benzoate.
Der Nachteil der bisher üblichen BilirubinbeStimmungen ist, daß fertige Lösungen von diazotierten SuIfanil-Gtlure nur kurze Zeit haltbar sind. Han muß daher die sogenannte Diazolösung vor der Bestimmung jedesmal frisch ansetzen: Entweder dadurch, daß man eine angesäuerte Lösung von Sulfanilsäure mit einer Lösung von ITatriumnitrit versetzt und das so vorbereitete "Diazoreagens" auf die Mischung von Accelerator und Serum einwirken läßt, oder daß man im Untersuchungsröhrchen zuerst eine kleine Menge des Diazoreagens durch Mischen von entsprechend kleinen Mengen Sulfanilsäure undThe disadvantage of the bilirubin determinations that have been customary up to now is that ready-made solutions of diazotized SuIfanil-Gtlure can only be kept for a short time. Han therefore has to use the so-called diazo solution each time before the determination Prepare fresh: Either by mixing an acidified solution of sulfanilic acid with a solution of I added sodium nitrite and the "diazo reagent" prepared in this way to act on the mixture of accelerator and serum, or that one in the test tube first a small amount of the diazo reagent by mixing correspondingly small amounts of sulfanilic acid and
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Natriumnitritlösung herstellt und darauf das Serum und den Accelerator zugibt. In jedem dieser Fälle ist mindestens ein eigener Arbeitsschritt (=Pipettierung) zur Herstellung des Diazoreagens notwendig.Prepares sodium nitrite solution and then adds the serum and accelerator. In each of these cases it is at least one separate work step (= pipetting) is necessary for the preparation of the diazo reagent.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man mindestens eine Pipettierung einsparen kann, wenn man eine Goffeinlösung als Accelerator schon mit Sulfanilsäure vormischt und dieses haltbare Reagens durch Zusatz eines Tropfens llatriumnitritlösung in ein gebrauchsfertiges Farbreagens für eine GesamtbilirubinbeStimmung überführt. Diesem Reagens muß nur noch das zu untersuchende Serum zugesetzt v/erden, um die Koppelung des darin enthaltenen Bilirubins zum entsprechenden Azofarbstoff zu bewirken. Die IParbintensität der Probe stellt ein Maß für den Bilirubinspiegel des Serums dar. Die MöJ-ichkeit der Vormischung ist um so überraschender als die Mischung Accelerator und Natriumnitrat durch Zusatz von Sulfanilsäure nicht zur Bildung eines lcoppelungsfähigen Bilirubinreagens führt.Surprisingly, it has now been found that at least one pipetting can be saved if a gaffeine solution as an accelerator is premixed with sulfanilic acid and this durable reagent by adding a drop of sodium nitrite solution to a ready-to-use color reagent for total bilirubin determination convicted. Only the serum to be examined has to be added to this reagent, to bring about the coupling of the bilirubin contained therein to the corresponding azo dye. the I color intensity of the sample is a measure of the bilirubin level in the serum. The possibility of premixing is all the more surprising than the mixture accelerator and sodium nitrate due to the addition of sulfanilic acid not to the formation a bilirubin reagent capable of coupling.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Reagens und des damit möglichen Verfahren zur Bilirubinbestimmung beruht darauf, daß außer der Pipettierung des Serums nur die Vorlage einer abgemessenen Menge des Reagens notwendig ist, da die ITitritlösung aus einer Tropfflasche zugegeben werden kann. Hierbei mögliche Unterschiede in der Tropfengröße haben nur einen zu vernachlässigenden Einfluß auf das Resultat.The advantage of the reagent according to the invention and the method for bilirubin determination possible therewith is based on the fact that apart from the pipetting of the serum only the presentation of a measured amount of the reagent is necessary because the ITitrite solution from a dropper bottle can be added. Here, possible differences in the droplet size have only one that is negligible Influence on the result.
Dieses Verfahren bedeutet eine wesentliche Zeitersparnis und eine außerordentliche Erhöhung derThis method means a significant time saving and an extraordinary increase in
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Genauigkeit. Die Präzision kann auf diese Weise dreimal so genau erhalten v/erden. Dies drückt sich in der relativen Standardabweichung (=Variationskoeffizient) von + 0,60 $ für das erfindungsgemäße Verfahren aus, v/ährend sie für die üblichen Verfahren bei + 2,0 $5 bis + 3,0 ?° beträgt.Accuracy. The precision can be obtained three times as accurate in this way. This is expressed in the relative standard deviation (= coefficient of variation) of + 0.60 $ for the method according to the invention, while it amounts to + 2.0 $ 5 to + 3.0 ° for the usual methods.
Außerdem ist es möglich, das Reagens schon in abgemessener Menge in Pläschchen oder Küvetten zur Verfügung zu stellen, so daß der Benutzer nur einen Tropfen Nitritlösung zugeben und das zu untersuchende Serum einpipettieren muß. Die Verwendung dieses Reagens in Analysenautomaten bedeutet ebenfalls eine wesentliche Vereinfachung der zu errichtenden Vorrichtung zur Bestimmung des Bilirubins.It is also possible to have the reagent available in measured quantities in small bottles or cuvettes to provide so that the user only add a drop of nitrite solution and that to be examined Must pipette in serum. The use of this reagent in automatic analyzers also means a significant simplification the device to be set up to determine bilirubin.
Die Eichkurve verläuft bis über 20 mg Bilirubin/i00ml Serum geradlinig.The calibration curve runs up to over 20 mg bilirubin / 100 ml Serum straight forward.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Bilirubinreagens werdenFor the preparation of the bilirubin reagent according to the invention will
1,3 - 2,2 vornehmlich 2,0 . 10""1MoI Coffein, 1,0 - 1,2 vornehmlich 1,4 . 10" Mol Sulfanilsäure 3,8 - 4,6 vornehmlich 4,2 . 10~ Mol Natriumbenzoat 2,5 . 10"1MoI Salzsäure und 1,5 - 2,0 vonöimlich 1,75 Mol Triaethanolamin in Wasser auf 1 Liter gelöst. 1.3 - 2.2 mainly 2.0. 10 "" 1 MoI caffeine, 1.0 - 1.2 primarily 1.4. 10 "moles of sulfanilic acid 3.8-4.6, mainly 4.2. 10 ~ moles of sodium benzoate 2.5. 10" 1 mole of hydrochloric acid and 1.5-2.0 of 1.75 moles of triethanolamine dissolved in water per 1 liter.
Dazu bereitet man eine ITatriumnitritlösung von 1-8,7 Mol, Die Durchführung der Analyse verläuft wie folgt: Bilirubinreagens 2,0 ml werden mit 1 Tropfen (0,05 ml) ITatriumnitritlösung gemischt und mit genau 0,2 ml Serum versetzt.To do this, one prepares a sodium nitrite solution of 1-8.7 mol, The analysis is carried out as follows: Bilirubin reagent 2.0 ml is added with 1 drop (0.05 ml) Mix the sodium nitrite solution and add exactly 0.2 ml of serum.
Der Serumleerwat zur Eliminierung der Eigenfarbe und einer eventuellen Trübung des Serums setzt sich aus 2,0 ml Bilirubinreagens und 0,2 ml Serum ohne der llatriumnitritlösung zusammen. Die Probe wird gegenThe serum empty water to eliminate its own color and a possible turbidity of the serum consists of 2.0 ml of bilirubin reagent and 0.2 ml of serum without the ll sodium nitrite solution together. The sample is against
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den Serumleerwert im Photometer bei Hg 546 innerhalb 3 Minuten nach Zugabe des Serums gemessen.the serum blank value in the photometer at Hg 546 within Measured 3 minutes after adding the serum.
Zur Berechnung des Bilirubingehalts wird die gemessene Extinktion mit dem experimentell gefundenen Paktor 13,2 multipliziert. Das Resultat ergibt den Bilirubinspiegel in mg/100 ml Serum.To calculate the bilirubin content, the measured absorbance is compared with that found experimentally Pactor 13.2 multiplied. The result is that Bilirubin levels in mg / 100 ml serum.
Berechnungsbeispiel: Extinktion = 0,128 0,128 . 13,2 = 1,69 mg/Bilirubin/100 ml SerumCalculation example: absorbance = 0.128 0.128. 13.2 = 1.69 mg / bilirubin / 100 ml serum
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