DE2241513B2 - Method for the analytical determination of the sequences of a polynucleotide - Google Patents
Method for the analytical determination of the sequences of a polynucleotideInfo
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Description
5°5 °
Behanntlich sind Polynucleotide oder Polyribonucleotide langkettige Polymere, enthaltend eine Vielzahl von Nucleotid- oder Ribonucleotideinheiten. Jede Nucleotideinheit (Nucleosid) besteht aus einer Ribose, enthaltend einen Purin- oder Pyrimidin-Substituent. Die Riboseteile der benachbarten Nucleoside sind über Phosphatgruppen verbunden. Es isl in der biochemischen und medizinischen Forschung oft von größter Wichtigkeit, die spezielle Anordnung zu kennen, in der die Nucleotideinheiten aneinanderhängen im Aufbau des Polynucleotidmoleküls. Verschiedene Methoden wurden bereits bekannt zum Abbau des Polynucleotidmoleküls in einzelne Nucleoside oder Nucleosideinheiten, die sich dann analysieren lassen, um die einzelnen Purin- oder Pyrimidinbasen zu ermitteln, die daraus gebildet werden können. Durch diese Analyse bezweckt man die Feststellung der Sequenz der einzelnen Basen innerhalb der Poiynucleotidkette. Polynucleotides or polyribonucleotides are known to be long-chain polymers containing a large number of nucleotide or ribonucleotide units. Each nucleotide unit (nucleoside) consists of a ribose containing a purine or pyrimidine substituent. The ribose parts of the neighboring nucleosides are connected via phosphate groups. It is often of the utmost importance in biochemical and medical research to know the particular arrangement in which the nucleotide units are attached to one another in the structure of the polynucleotide molecule. Various methods have been known for breaking down the polynucleotide molecule into individual nucleosides or nucleoside units, which can then be analyzed to determine the individual purine or pyrimidine bases that can be formed from them. The purpose of this analysis is to determine the sequence of the individual bases within the polynucleotide chain.
Nach einem bekannten Verfahren zur Analyse eines Polynucleotids wird ein exonucleolytisches Enzym angewandt, weiches angeblich die endständigen Nucleotideinheiten abzuspalten und damit deren Analyse zu ermöglichen gestattet. Dieses enzymatische Verfahren ist jedoch nicht erfolgreich, da die dafür vorgesehenen Enzyme variierende und nicht reproduzierbare Aktivität besitzen und ungenaue Ergebnisse liefern.According to a known method for analyzing a polynucleotide, an exonucleolytic enzyme is used, which supposedly cleaves off the terminal nucleotide units and thus leads to their analysis allow permitted. However, this enzymatic process is unsuccessful because the ones intended for it Enzymes have variable and non-reproducible activity and give inaccurate results.
Es wurde auch bereits ein stufenweiser chemischer und enzymatischer Abbau bekannt. Dabei erfolgt eine Reaktion mit einer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe des Polynucleotids, Oxydation der unsubstituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleotideinheit zu Dialdehydgruppen, woraufhin die alkalisch katalysierte Abspaltung des endständigen N .leosidfragments erfolgt. Das so erhaltene Fragment vird dann hinsichtlich des Purin- oder Pyrimidinsubstituenten identifiziert. Diese Maßnahme wird für jede Nucleosideinheit des Polynucleotidmoleküls wiederholt. Dieses Verfahren weist verschiedene Nachteile auf. Es gibt keine einfache und wirksame Möglichkeit zur Trennung der freigesetzten Nucleosidfragmente, da alle Reaktionskomponenten und -produkte sich in Lösung befinden. Es muß größte Sorgfalt angewandt .erden, um gleichzeitige Anwesenheit der Phosphatase, von Perjodat und Alkali in der Reaktionsmischung zu verhindern. Andererseits würde die Abspaltung der Nucleosidfragmente in unkontrollierbarer Weise stattfinden und damit zu fehlerhaften Ergebnissen führen.Gradual chemical and enzymatic degradation has also already become known. A Reaction with a phosphatase to split off the terminal 3'-phosphate group of the polynucleotide, Oxidation of the unsubstituted cis-hydroxyl groups of the terminal nucleotide unit to dialdehyde groups, whereupon the alkali-catalyzed cleavage of the terminal N .leosidfragments takes place. The fragment obtained in this way is then or pyrimidine substituents identified. This measure is performed for each nucleoside unit of the polynucleotide molecule repeated. This method has several disadvantages. There is no simple and effective way of separating the released nucleoside fragments, as all reaction components and products are in solution. Great care must be taken to ensure simultaneous presence of phosphatase, periodate and alkali in the reaction mixture. on the other hand the cleavage of the nucleoside fragments would take place in an uncontrollable manner and thus become faulty Results.
Eine Verbesserung erreichte man durch Anwendung von lonenaustauscherchromatographie zur Trennung der freigesetzten Nucleosidreste von dem zurückbleibenden Polynucleotidmolckül jeweiU nach einer Abbaustufe. Dies ist zwar günstig, hat jedoch den Nachteil, daß diese Vorgangsweise sehr zeitraubend ist und zu beträchtlichen Materialverlusten führt. Dieses Verfahren läßt sich also nur für relativ wenige Abbaustufen heranziehen und nicht für die Analyse komplexerer Polynucleotidmoleküle.An improvement was achieved by using ion exchange chromatography for separation of the released nucleoside residues from the remaining polynucleotide molecule after each degradation stage. Although this is favorable, it has the disadvantage that this procedure is very time-consuming and leads to considerable material losses. This process can only be used for a relatively small number of degradation stages and not for the analysis of more complex polynucleotide molecules.
Auch Versuche zur Ausfällung der freigesetzten Nucleosidreste, um sie dann zu trennen von dem zurückbleibenden Polynucleotidmolekül, führten zu keinen Erfolgen auf Grund der komplizierten Vorgangsweise und den damit verbundenen Materialverlusten. Also attempts to precipitate the released nucleoside residues in order to then separate them from the remaining polynucleotide molecule did not lead to success due to the complicated procedure and the associated material losses.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein genaues und praktisches Verfahren zum stufenweisen Abbau eines Polynuueotids in bestimmte reproduzierbare Nucleosidfragmente zu erstellen, die dann der Identifizierung hinsichtlich ihrer Purin- oder Pyrimidinbasen zugänglich sind.The object of the invention is to provide an accurate and practical Process for the gradual degradation of a polynucleotide into certain reproducible nucleoside fragments to create, which are then accessible for identification with regard to their purine or pyrimidine bases are.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur analytischen Bestimmung der Sequenzen eines Polynucleotids ist dadurch gekennzeichnet,The method according to the invention for the analytical determination of the sequences of a polynucleotide is characterized,
a) daß das Polynucleotid, dessen endständige 3'-Phosphatgruppe vorher entfernt ist, an einem stark basischen anionenaustauehenden Material adsorbiert wird, a) that the polynucleotide, whose terminal 3'-phosphate group has been removed beforehand, is adsorbed on a strongly basic anion-exchanging material,
b) daß das adsorbierte: Polynucleotid mit einem Perjodat zur Oxydation der unsubstituierten cis-Hydroxylgruppen der endständigen Nucleosideinheiten zu Dialdehydgruppen behandelt wird,b) that the adsorbed: polynucleotide is treated with a periodate to oxidize the unsubstituted cis-hydroxyl groups of the terminal nucleoside units to dialdehyde groups,
c) daß zur Entfernung von überschüssigem Perjodat L-Rhamnose zugesetzt wird,c) that to remove excess periodate L-rhamnose is added,
d) daß das, adsorbierte Polynucleotid mit einem Amin zur Abspaltung der entständigen Nucleotideinheit aus dem Molekül und im wesentlichend) that the adsorbed polynucleotide with a Amine for splitting off the terminal nucleotide unit from the molecule and essentially
gleichzeitig mit einer Phosphatase zur Entfernung der gebildeten endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt wird,treated simultaneously with a phosphatase to remove the terminal 3'-phosphate group formed will,
e) daß die so gewonnenen Nucleosidreste vom adsorbierten Polynucleotid getrennt und identifiziert werden unde) that the nucleoside residues obtained in this way are separated from the adsorbed polynucleotide and identified will and
f) daß die Verfahrensstufen b) bis e) für jede verbleibende Nucleotideinheit des Polynucleotids wiederholt werden.f) that the process steps b) to e) for each remaining nucleotide unit of the polynucleotide be repeated.
Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich Polynucleotide, wie sie als Polyribonucleotide bekannt sind und in biologischen Materialien verfügbar sind oder synthetisiert werden können. Um für das erfindungsgemäße Verfahren herangezogen zu werden, muß von dem Polynucleotid zuerst die endständige 3'-Phosphatgruppe abgespalten werden. Dies geschieht in üblicher Weise unter Anwendung einer alkalischen Phosphatase.Polynucleotides such as those known as polyribonucleotides are suitable for the method according to the invention and are available in biological materials or can be synthesized. In order for the invention Methods to be used must first have the 3'-phosphate terminal group of the polynucleotide be split off. This is done in the usual way using an alkaline one Phosphatase.
Zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete tark basische anionenaustauschende
Materialien befinden sich im Handel. Sie werden beispielsweise hergestellt durch Suspensionspolymerisation
von Styrol mit Divinylbenzol. Die erhaltenen Polymerperlen werden dann umgesetzt mit Chlormethyläther
in Gegenwart von Aluminiumchlond cder Zinkchlorid als Katalysator, um die Chlormethylgruppe
an die Benzolringe des Polymers einzuführen. Dieses Produkt wird dann z. B. mit Trimethylamin
aminiert zu einer hochionisierten quaternären Ammoniumgruppe an d.n. Benzolringen.
• Wie erwähnt, befinden sich die verschiedensten stark basischen Anione;iaustauscherhar?e mit quaternären
Air.moniumgruppen als Reaktionszeiten im Handel.Strongly basic anion-exchange materials suitable for use in the process of the invention are commercially available. They are produced, for example, by suspension polymerization of styrene with divinylbenzene. The polymer beads obtained are then reacted with chloromethyl ether in the presence of aluminum chloride or zinc chloride as a catalyst in order to introduce the chloromethyl group onto the benzene rings of the polymer. This product is then z. B. aminated with trimethylamine to form a highly ionized quaternary ammonium group on dn benzene rings.
• As mentioned, there are a wide variety of strongly basic anions; iaustauscherhar? E with quaternary Air.monium groups as reaction times in the trade.
Als bevorzugtes Anionenaustauschermaterial wendet man ein Austauschermaterial, bestehend aus Polystrol, vernetzt mit 2% Divinylbenzol, an. welches ebenfalls quaternäre Ammoniumgruppen als Reaktioimtellen enthält. Dieses Material besitzt die gewünschte chemische Stabilität und ausreichende Austauscherkapazität über einen pH-Wertbereich für die Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.The preferred anion exchange material used is an exchange material consisting of polystyrene crosslinked with 2% divinylbenzene. which also contains quaternary ammonium groups as reaction sites. This material has the desired chemical stability and sufficient exchange capacity over a pH range for use in the process according to the invention.
Als Perjodat für die Oxydation der cis-Hydroxylgruppen von dem von Phosphatgruppen befreiten Nucleosid des Polynucleotids kann man bekannte Produkte anwenden; die allgemeinen Reaktionsbedingungen sind ebenfalls bekannt.As a periodate for the oxidation of the cis-hydroxyl groups of the nucleoside of the polynucleotide freed from phosphate groups can be known Apply products; the general reaction conditions are also known.
Die Anwendung eines hydroxylhaltigen Stoffs wie Äthylenglykol und Butan-2,3 -diol zur Umsetzung mit überschüssigem Perjodat ist bekannt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird dagegen L-Rhamnose angewandt, da diese Substanz als am wirksamsten und am leichtesten reagierend für diesen Zweck befunden werden konnte. Dadurch kann die gesamte Verfahrenszeit verringert v/erden, was ein gewisser Vorteil gegenüber den bekannten Verfahren ist.The use of a hydroxyl-containing substance such as ethylene glycol and butane-2,3-diol to react with excess periodate is known. In the method according to the invention, however, L-rhamnose is used, as this substance was found to be the most effective and most easily reactive for this purpose could be. This can reduce the overall process time, which is a certain advantage over the known method is.
Die Anwendung von alkalischen Produkten wie Amine zum Abbau des Polynucleotids durch Entfernung der endständigen Nucleosidf ragmente ist bekannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Gemisch von Cyclohexylamin und Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethylglycinamid-Hydrochlorid angewandt, da dieses Gemisch eine bessere pH-Werteinstellung auf den gewünschten Wert von 8,5 während des gesamten Verfahrens gestattet. The use of alkaline products such as amines to degrade the polynucleotide by removing the terminal nucleoside fragments is known. In a preferred embodiment of this process according to the invention, a mixture of cyclohexylamine and Ν, Ν, Ν ', Ν'-tetramethylglycine amide hydrochloride is used, since this mixture allows better pH adjustment to the desired value of 8.5 during the entire process.
Während die Arbeitstemperaturen nicht eigentlich kritisch sind, wird vorgezogen, die Reaktion des Polynucleotids mit dem Perjosat, die Behandlung mit L-Rhamnose und die Trennung des abgebauten Nucleosidfragments von dem adsorbierten Polynucleotid bei etwa I0C und die Aminumsetzung mit dem Polynucleotid zum Abbau und Entfernung des endständigen Nicleosidfragments bei etwa 45° C durchzuführen. Der wesentliche Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Adsorption des Polynucleotids an einem unlöslichen Träger, Umsetzung verschiedener Materialien mit dieser damit unlöslich gemachten While the working temperatures are not really critical, it is preferred the reaction of the polynucleotide with the Perjosat, treatment with L-rhamnose, and the separation of the degraded Nucleosidfragments from the adsorbed polynucleotide at about I 0 C and the amine reaction with the polynucleotide for the degradation and removal of the terminal nicoside fragment at about 45 ° C. The essential point of the method according to the invention lies in the adsorption of the polynucleotide on an insoluble support, the reaction of various materials with this insoluble support
ίο Form des Polynucleotids und leichter Abtrennung des abgebauten und damit löslich gewordenen Nucleosidfragments von dem unlöslich verbleibenden Teil des Polynucleotids. Es ist gleichzeitig wesentlich, daß die Reaktionsprodukte von dem Polynucleotid so abge-ίο Form of the polynucleotide and easier separation of the degraded and thus solubilized nucleoside fragment from the insoluble remaining part of the Polynucleotide. At the same time, it is essential that the reaction products are separated from the polynucleotide in this way.
-., spalten werden, daß das restliche Polynucleotid als
Gesamtes an dem Anionenaustauschermaterial adsorbiert bleibt. Dies erreicht man durch Verdünnen der
Flüssigkeit in Berührung mit dem Anionenaustauscherrnaterial bis zu einem solchen Punkt, daß die Konzentrationen
der Anionen mit Ausnahme derer der Polynucleotide auf ein solches Niveau gesenkt werden, daß
sie nicht das Polynucleotid vom Adsorbens verdrängen. Die speziellen Bedingungen, unter denen ein Polynucleotid
von einem Anionenaustauschermaterial freigegeben und wieder adsorbiert werden kann, hängt
ab von der Größe des Polynucleotidmoleküls. Hat man beispielsweise ein Polynucleotid mit 10 Nucleotideinheiten,
so wird dieses vom Anionenaustauschermaterial freigesetzt, wenn die entsprechende Anionenkonzentration
über 1 molar steigt. Ein solches Polynucleotid wird vollständig neuerlich adsorbiert, wenn
die verdrängende Anionenkonzentration durch Verdünnung auf etwa 0,1 m verringert wurde. Ein Polynucleotid,
enthaltend nur 2 Polynucleotideinheiten, wird freigegeben, wenn die verdrängende Anionenkonzentration
über etwa 0,4 m ansteigt und wird wieder vollständig adsorbiert, wenn die verdrängende
Anionenkonzentration unter efva 0,05 m absinkt.
1st das Nucleosidfragment abgetrennt von dem Polynucleotid, kann es hinsichtlich seiner Purin- oder
Pyrimidinbase nach bekannten Methoden analysiert werden. Zum Beispiel kann der Ablauf aus der Abbaustufe,
enthaltend die endständige Nucleotideinheit, Amin und Phosphatase zum Trocknen eingedampft
werden. Es wird Ameisensäure zugesetzt und die Reaktionsmischung im Autoklav erwärmt. Diese
Säurebehandlung wandelt die endständigen Nucleosidreste in freie Purin- oder Pynmidinbasen um, die dann
durch Anionenaustauscherchromatographie identifiziert werden können.-., Cleave that the remaining polynucleotide remains adsorbed as a whole on the anion exchange material. This is accomplished by diluting the liquid in contact with the anion exchange material to such a point that the concentrations of the anions other than those of the polynucleotides are lowered to such a level that they do not displace the polynucleotide from the adsorbent. The particular conditions under which a polynucleotide can be released from an anion exchange material and re-adsorbed depends on the size of the polynucleotide molecule. For example, if you have a polynucleotide with 10 nucleotide units, it will be released from the anion exchange material when the corresponding anion concentration rises above 1 molar. Such a polynucleotide is completely re-adsorbed when the displacing anion concentration is reduced to about 0.1 m by dilution. A polynucleotide containing only 2 polynucleotide units is released when the displacing anion concentration rises above about 0.4 m and is completely adsorbed again when the displacing anion concentration falls below efva 0.05 m.
If the nucleoside fragment is separated from the polynucleotide, it can be analyzed with regard to its purine or pyrimidine base by known methods. For example, the effluent from the degradation stage containing the terminal nucleotide unit, amine and phosphatase can be evaporated to dryness. Formic acid is added and the reaction mixture is heated in the autoclave. This acid treatment converts the terminal nucleoside residues into free purine or pynmidine bases, which can then be identified by anion exchange chromatography.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird am folgenden Beispiel weiter erläutert.The method according to the invention is further illustrated by the following example.
0,1 ecm Anionenaustauscherharz in der Chloridform mit einer Korngröße von unter 37 μΐη wurde in ein Glasrohr gegeben und zwischen Glaswollstopfen fixiert. Das Harzbett wurde mit einer Puffermischung von 0,5 m Natriumchlorid und 0,01 m tris(Hydroxy methyl)aminomethan mit einem pH-Wert von 7,5 ge waschen und dann mit kaltem destilliertem Wasser zur Entfernung von überschüssiger Pufferlösung gespült. Das Austauscherbett wurde auf einer Temperatur von etwa 1° C gehalten, indem man es in einem Wasser- 0.1 ecm of anion exchange resin in the chloride form with a grain size of less than 37 μm was placed in a glass tube and fixed between glass wool stoppers. The resin bed was washed with a buffer mixture of 0.5 M sodium chloride and 0.01 M tris ( hydroxymethyl) aminomethane with a pH of 7.5 and then rinsed with cold distilled water to remove excess buffer solution. The exchange bed was kept at a temperature of about 1 ° C by placing it in a water
6S bad anordnete. 6 S bad arranged.
Das zu untersuchende Polynucleotid wurde mit alkalischer Phosphatase zur Abspaltung der endständigen 3'-Phosphatgruppe behandelt. Eine wäßrige Lö-The polynucleotide to be examined was treated with alkaline phosphatase to split off the terminal 3'-phosphate group. An aqueous solution
sung, enthaltend etwa 100 η Mol des erhaltenen PoIynucleotids wurde einige Male mit Hilfe einer Rücklaufpumpe durch das Austauscherbett geführt, wobei sich der Hauptanteil des Polynucleotid am Harz adsorbierte. Nicht adsorbiertes Polynucleotid wurde durch weiteres Waschen mit destilliertem Wasser aus dem Bett entfernt. 0,5 ecm einer 0,2 m Natronperjodatlösung wurde bei 1°C etwa 15 Minuten immer wieder durch das Bett gepumpt. Die Perjodatlösung führte zu einer Oxydation der cis-Hydroxylgruppen an den endständigen Nucleosiden unter Bildung von Dialdehydgruppen; wegen seines ionischen Charakters desorbierte es das Polynucleotid vom Harz. Diese Polynucleotidhaltige Lösung wurde mehrere Male durch das Harz geleitet, dann wurden 0,5 ecm einer 1-m-L-Rhamnose-Lösung der im Kreislauf geführten Lösung zugesetzt und das Ganze immer wieder durch das Bett geleitet, während 5 Minuten. Die L-Rhamnose hatte während dieser Zeit die Möglichkeit, nicht umgesetztes Perjodat zu zerstören. 4,6 ecm kaltes destilliertes Wasser wurden dann eingebracht, um die Jodationenkonzentration auf etwa 0,01 m herabTudrücken. Das Umpumpen der gesamten Flüssigkeit wurde noch 10 Minuten fortgesetzt, so daß das Polynucleotid wieder adsorbiert werden konnte. Dann wurde die Flüssigkeil aus dem Bett abgelassen und das Harz mit 1 ecm kaltem destilliertem Wasser gewaschen. 0,1 ecm bakterieller alkalischer Phosphatase wurden dann in das Bett eingebracht und anschließend 0,1 ecm einer 1-m-Cyclohexylamin- und 2-m-N,N,N',N'-tetramethylglycinamid-Hydrochlorid-Lösung in das Bett geleitet. Weiter wurden 0,1 ecm der Aminlösung zugefügt und diese Flüssigkeit nun 2 Stunden bei 45° C wiederholte Male durch das Bett geleitet. Dieses Gemisch der Amine und Phosphatase spaltete die endständigen Nucleoside aus dem Polynucleotidmolekül ab und ebenso die so gebildete endständige 3'-Phosphatgruppe. Auch diese Lösung wegen ihres ionischen Charakters verdrängte das Fclynucleotid vom Harz. Nun wurden 5 ecm destilliertes Wasser der Reaktionsmischung zugesetzt, wodurch die Aminkonzentration auf etwa 0,04 m absank. Die Temperatur des Bettes wurde auf etwa Γ C gesenkt und obiges Flüssigkeitsgemisch 15 Minuten bei 1°C wiederholte Male durch das Harz geleitet. Das Polynucieotid, dem sein ursprünglich endständiges Nucleosid fehlte, wurde wieder adsorbiert. Die verdünnte Lösung, enthaltend Amin-Phosphatase und das Fragment des endständigen Nucleosids, wurde aus dem Bett abgeleitet und in einem mit einei Schraubkappe versehenen Prooeröhrchen aufgefangen. Das Reaktionsgefäß mit dem Austauscherharz wurde dann mit 1 ecm kaltem destilliertem Wasser gewaschen, welches dann auch in das Proberöhrchen lief. Die Gesamtzeit für die obige Perjodat-Oxydation, Abspaltung des endständigen Nucleosids und der Phosphorsäuregruppe betrug etwa 200 Minuten. Das Austauscherharz mit adsorbiertem Polynucleotid wurde dann wieder nach obigem Reaktionszyklus behandelt, um die nächste endständige Nucleotideinheit zu entfernen. Dieser Kreislauf wurde wiederholt bis die gesamten Nudeotideirvheiten des Polynucleotide abgespalter varen.solution containing about 100 η mol of the resulting polynucleotide was passed through the exchanger bed a few times with the aid of a return pump, whereby Most of the polynucleotide adsorbed onto the resin. Polynucleotide was not adsorbed removed from bed by further washing with distilled water. 0.5 ecm of a 0.2 M sodium periodate solution was repeatedly pumped through the bed at 1 ° C for about 15 minutes. The periodate solution led to an oxidation of the cis-hydroxyl groups on the terminal nucleosides with the formation of dialdehyde groups; because of its ionic character, it desorbed the polynucleotide from the resin. This polynucleotide-containing Solution was passed through the resin several times, then 0.5 ecm of a 1m L-rhamnose solution added to the circulating solution and the whole thing over and over again through the bed conducted for 5 minutes. During this time, L-rhamnose had the option of unreacted Destroy periodate. 4.6 ecm cold distilled water was then added to reduce the iodate ion concentration press down to about 0.01 m. The pumping over of all the liquid was still going on Continued for 10 minutes so that the polynucleotide could be adsorbed again. Then the liquid wedge became Drained from the bed and washed the resin with 1 ecm of cold distilled water. 0.1 ecm bacterial alkaline phosphatase were then placed in the bed followed by 0.1 ecm of a 1-m-Cyclohexylamine and 2-m-N, N, N ', N'-tetramethylglycine amide hydrochloride solution headed into bed. Further 0.1 ecm of the amine solution were added and this liquid then passed through the bed repeatedly for 2 hours at 45 ° C. This mixture of Amines and phosphatase cleaved the terminal nucleosides from the polynucleotide molecule and likewise the terminal 3'-phosphate group thus formed. Also this solution because of its ionic Character displaced the glycleotide from the resin. Now 5 ecm of distilled water were added to the reaction mixture, thereby increasing the amine concentration dropped to about 0.04 m. The temperature of the bed was lowered to about Γ C and the above liquid mixture was repeated for 15 minutes at 1 ° C passed the resin. The polynucleotide that its original terminal nucleoside was absent, was adsorbed again. The dilute solution containing amine phosphatase and the fragment of the terminal nucleoside, was derived from the bed and placed in a test tube with a screw cap caught. The reaction vessel with the exchange resin was then distilled with 1 ecm cold Washed water, which then ran into the sample tube. The total time for the above Periodate oxidation, cleavage of the terminal nucleoside and the phosphoric acid group was approximately 200 minutes. The exchange resin with adsorbed polynucleotide was then again according to the above reaction cycle treated to remove the nearest terminal nucleotide unit. This cycle became repeated until the total nucleic acidity of the polynucleotide was split off.
Die kombinierten Abläufe der einzelnen Verfahrenszyklen hatten ein mittleres Volumen von etwa 8 ecm. Die einzelnen Abläufe wurden getrennt auf 100 C 2 Stunden in einem verschlossenen Rohr erwärmt; uie gebildete freie Purin- oder Pyrimidinbase in jedem Prüfröhrchen wurde nun durch Anionenaustauschchromatographie analysiert.The combined processes of the individual process cycles had an average volume of about 8 ecm. The individual processes were heated separately to 100 ° C. for 2 hours in a sealed tube; The purine or pyrimidine free base formed in each test tube was then determined by anion exchange chromatography analyzed.
Das ganze Verfahren diente dazu, die Sequenz derThe whole procedure served to determine the sequence of the
Nucleosideinheiten eines Polynucleotid in an sich bekannter Weise durch stufenweisen Abbau zu ermitteln. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt auch die Bestimmung der Sequenz der Nucleotideinheiten in Polynucleotide^ deren Sequenzen bisher noch nicht bekannt waren.To determine nucleoside units of a polynucleotide in a manner known per se by gradual degradation. The method according to the invention also enables the sequence of the nucleotide units to be determined in polynucleotides ^ the sequences of which were not yet known.
Die Analyse nach der Erfindung bringt exakte Werte in wesentlich kürzerer Zeit und von viel komplexeren Pooynucleotiden, als dies b^i den bekannten Analysenverfahren der Fall war. Durch die einfachenThe analysis according to the invention produces exact values in a much shorter time and of much more complex ones Pooynucleotides, as this b ^ i the known Analytical method was the case. Through the simple
Verfahrensmaßnahmen ist eine Automation für den Ablauf des gesamten Bestimmungsprozesses möglich.Process measures, automation is possible for the entire determination process.
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Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2514275A1 (en) * | 1975-03-27 | 1976-10-14 | Schering Ag | PROCESSES FOR THE PREPARATION OF N-(POLYSACCHARIDYL)-NITROGEN HETEROCYCLES, ESPECIALLY PYRIMIDINE OR PURINE BASES |
| JPS55149546U (en) * | 1979-04-16 | 1980-10-28 | ||
| US4302204A (en) * | 1979-07-02 | 1981-11-24 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Transfer and detection of nucleic acids |
| GB2059421A (en) * | 1979-10-03 | 1981-04-23 | Self C H | Assay method and reagents therefor |
| US4446231A (en) * | 1979-10-03 | 1984-05-01 | Self Colin H | Immunoassay using an amplified cyclic detection system |
| US4704256A (en) * | 1980-09-23 | 1987-11-03 | California Institute Of Technology | Apparatus for the sequential performance of chemical processes |
| DE3274017D1 (en) * | 1981-03-07 | 1986-12-04 | Colin Henry Self | Assay and use |
| JPS5913644U (en) * | 1982-04-24 | 1984-01-27 | 三國工業株式会社 | Throttle valve air volume adjustment device |
| DE3312929A1 (en) * | 1982-06-02 | 1983-12-08 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | METHOD FOR SEQUENCE ANALYZING AN OPTIONALLY MODIFIED OLIGORIBONUCLEOTIDS OR OLIGODESOXYRIBONUKLETIDS |
| JPS60187347U (en) * | 1984-05-22 | 1985-12-12 | 小松ゼノア株式会社 | vaporizer |
| US4962037A (en) * | 1987-10-07 | 1990-10-09 | United States Of America | Method for rapid base sequencing in DNA and RNA |
| US6551784B2 (en) | 1989-06-07 | 2003-04-22 | Affymetrix Inc | Method of comparing nucleic acid sequences |
| US5744101A (en) * | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US6040138A (en) | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US6379895B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-04-30 | Affymetrix, Inc. | Photolithographic and other means for manufacturing arrays |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US6919211B1 (en) * | 1989-06-07 | 2005-07-19 | Affymetrix, Inc. | Polypeptide arrays |
| US20060194258A1 (en) * | 1989-06-07 | 2006-08-31 | Affymetrix, Inc. | Polypeptide array synthesis |
| US6955915B2 (en) * | 1989-06-07 | 2005-10-18 | Affymetrix, Inc. | Apparatus comprising polymers |
| US5925525A (en) * | 1989-06-07 | 1999-07-20 | Affymetrix, Inc. | Method of identifying nucleotide differences |
| DE69132843T2 (en) * | 1990-12-06 | 2002-09-12 | Affymetrix Inc N D Ges D Staat | Identification of nucleic acids in samples |
| US6943034B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-09-13 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US6864101B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-03-08 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US7323298B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-01-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences |
| US5807522A (en) * | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US7378236B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-05-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for analyzing gene expression patterns |
| US8236493B2 (en) * | 1994-10-21 | 2012-08-07 | Affymetrix, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
| EP0880598A4 (en) * | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | Nucleic acid analysis techniques |
| CN104316621B (en) * | 2014-11-17 | 2017-01-11 | 上海征泰饲料有限公司 | Method for measuring total nucleotide in protein products |
-
1971
- 1971-08-27 US US00175756A patent/US3730844A/en not_active Expired - Lifetime
-
1972
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