DE2203467C - Fermentative process for the manufacture of D mannitol - Google Patents
Fermentative process for the manufacture of D mannitolInfo
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Description
und dem Kohlenwasserstoff hergestellt. Am besten erreicht man diesen Kontakt durch submerse aerobe Fermentation unter raschem Rühren des Gemisches bei gleichzeitigem Hindurchleiten von Luft, z. B. durch Hindurchperlen.and the hydrocarbon. The best way to achieve this contact is by submerged aerobic activity Fermentation with rapid stirring of the mixture while passing air, e.g. B. through pearls.
Während der Fermentation können die üblichen für die Züchtung von Hefen bekannten Zeit- und Temperaturbedingungen, d.h. etwa 20 bis 34°C während etwa 4 bis 9 Tagen angewandt werden. Beim erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren wird die letzte Produktionsstufe unter Rühren etwa 8 bis 9 Tage bei 24 bis 25 0C durchgeführt.During the fermentation, the usual time and temperature conditions known for the cultivation of yeasts, ie about 20 to 34 ° C. for about 4 to 9 days, can be used. In the fermentation process according to the invention, the last production stage is carried out for about 8 to 9 days at 24 to 25 ° C. with stirring.
Die Gewinnung des Inoculums für die eigentliche Fermentation erfolgt in mehreren Stufen. Ein Standardimpfstoff wird aus einer wäßrigen Suspension von Zellen aus einem Schrägnährboden von Candida lipolytica ATCC Nr. 20297 hergestellt, die zur Beimpi ung eines wäßrigen. Glycerin, Riniifleischextrakl, Hefeextrakt und Pepton enthaltenden Nährmediums verwendet wird. Nachdem dieses Nährmedium etwa 20 Stunden bei 280C unter Rühren bebrütet wurde, wird der erhaltene Standartimpfstoff zur Beimpfung von Erlenmeyer-Kolben verwendet, die ein wäßriges Nährmedium und einen assimilierbaren Kohlenwasserstoff enthalten, z. B. n-Hexadecan. Nach etwa 48stündiger Inkubation bei 24 bis 28°C werden Teile der erhaltenen Kultur zur Beimpfung von Fernbach-Kolben verwendet, die ein kohlen wasserstoff haltiges wäßriges Nährmedium enthalten.The inoculum for the actual fermentation is obtained in several stages. A standard vaccine is prepared from an aqueous suspension of cells from an inclined culture medium of Candida lipolytica ATCC No. 20297, the for the imposition of an aqueous. Glycerin, beef extract, yeast extract and peptone-containing nutrient medium is used. After this nutrient medium has been incubated for about 20 hours at 28 ° C. with stirring, the standard vaccine obtained is used for inoculating Erlenmeyer flasks which contain an aqueous nutrient medium and an assimilable hydrocarbon, e.g. B. n-hexadecane. After about 48 hours of incubation at 24 to 28 ° C., parts of the culture obtained are used for inoculating Fernbach flasks which contain an aqueous nutrient medium containing carbon hydrogen.
Nachdem man etwa 72 Stunden bei 24 bis 28°C unter Rühren bebrütet hat, wird ein Teil der Kultur in jeden einer größeren Anzahl von Gärbehältern gegeben, die gerührt werden und ein wäßriges Nährmedium, das mindestens ein normales Peraffin mit etwa 12 bis 18 Kohlenstoffatomen als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, enthalten. Die Gärbehälter, die mit einer Geschwindigkeit von 650 bis 1750 UpM. gerührt werden und durch die je Minute 2 bis 8 1 steriler Luft geleitet werden, werden etwa 8 bis 9 Tage bei 24 bis 25°C bebrütet.After incubating for about 72 hours at 24 to 28 ° C with stirring, part of the culture becomes put into each of a large number of fermenting vessels, which are stirred, and an aqueous nutrient medium, the at least one normal peraffin having about 12 to 18 carbon atoms as the main source for contains assimilable carbon. The fermentation tanks operating at a speed of 650 up to 1750 rpm. be stirred and through which 2 to 8 liters of sterile air are passed per minute incubated for about 8 to 9 days at 24 to 25 ° C.
Die Menge des in den verschiedenen Wachstumsstufen verwendeten Impfstoffs hängt in gewissem Grad von der Dichte des Zellwachstums ab. Im allgemeinen sind etwa 5°/„ Impfstoff mit gutem Zellwachstum für jede Produktionsstufe zufriedenstellend. The amount of vaccine used in the different growth stages depends to a certain extent Degree on the density of cell growth. Generally about 5% is vaccine with good cell growth satisfactory for every stage of production.
Die Konzentrationen an D-Mannit, D-Arabit und i-Erythrit werden durch eine Kombination von colorimetrischer und dünnschichtchromatographischer Bestimmungsmethoden ermittelt. Der Gesamtgehalt an Polyol wird unter Anwendung einer Modifizierung des in J. Lab. CHn. Med. Bd. 54, S. 158 (1959), beschriebenen colorimetrischen Verfahrens nach Bailey festgestellt. Die Konzentrationen an i-Erythrit und D-Arabit werden im Anschluß an die Dünnschichtchromatographie mit Cellulose F als Adsorptionsmittel und Aceton—Wasser (85:15) als Lösungsmittel für die Entwicklung und nach Sichtbarmachung mit p-Anisidin und nachfolgendern Besprühung mit Perjodat-Lösung visuell geschätzt.The concentrations of D-mannitol, D-arabitol and i-erythritol are determined by a combination of determined colorimetric and thin-layer chromatographic determination methods. The total salary on polyol using a modification of the method described in J. Lab. CHn. Med. Vol. 54, p. 158 (1959) colorimetric method according to Bailey detected. The concentrations of i-erythritol and D-arabitol are determined following thin-layer chromatography with cellulose F as adsorbent and acetone-water (85:15) as solvent for development and after visualization with p-anisidine and subsequent spraying with periodate solution visually appreciated.
Der D-Mannit wird dadurch aus der gesamten Gärbrühe gewonnen, daß man die Brühe durch eine
Zentrifugalscheibentrennvorrichtung führt und zuerst die Hefezellen und dann den restlichen Kohlenwasserstoff
von der wäßrigen Phase entfernt. Die trübe wäßrige Phase wird durch Filtrieren geklärt und anschließend
entionisiert, indem man sie nacheinander durch ein schwaches Anionenaustauscherhan:, ein
starkes Kationenaustauscherharz und darauf ein schwaches Anionenaustaucherharz führt.· Die geklärte
entionisierte Brühe wird anschließend unter vermindertem Druck zu einer Lösung eingeengt. Dann läßt
man unter Kühlen auskristallisieren. Der kristalline D-Mannit wird abfiltriert oder abzentrifugiert. Zusätzliche
Kristallausbeuten an D-Mannit erhält man durch weiteres Einengen der Mutterlaugen.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfind ungsgemäße Verfahren.The D-mannitol is obtained from the entire fermentation broth by passing the broth through a centrifugal disk separator and first removing the yeast cells and then the remaining hydrocarbon from the aqueous phase. The cloudy aqueous phase is clarified by filtration and then deionized by passing it successively through a weak anion exchanger, a strong cation exchange resin and then a weak anion exchange resin. The clarified deionized broth is then concentrated to a solution under reduced pressure. Then allowed to crystallize with cooling. The crystalline D-mannitol is filtered off or centrifuged off. Additional crystal yields of D-mannitol are obtained by further concentration of the mother liquors.
The following examples explain the inventive method.
Der Stamm Candida lipolytica ATCC Nr. 20297 wird dadurch erhalten, daß man Zellen in einer Mischung aus entrahmter Milch und Rinderblutserum lyophilisiert.The strain Candida lipolytica ATCC No. 20297 is obtained by cultivating cells in a Mixture of skimmed milk and beef blood serum lyophilized.
Arbeits-Kulturen werden dadurch hergestellt, dai3 man periodisch auf Schrägnährboden (25 · 150 mm, enthaltend 17 ml Agar) unter Verwendung eines Näh enthaltend 17 ml Agar) unter Verwendung eines Mediums aus 0,5 °/0 Glucose, 0,3 °/0 Rindfleischextrakt,Work cultures are prepared by dai3 one (25 mm x 150 containing 17 ml agar) periodically slant culture medium comprising using a sewing 17 ml agar) using a medium consisting of 0.5 ° / 0 glucose, 0.3 ° / 0 beef extract,
»ο 0,5% Hefeextrakt. 3.00Z0 Pepton und 2°/0 Agar Subkulturen erzeugt.»Ο 0.5% yeast extract. 3.0 0 0 Z peptone and 2 ° / 0 agar subcultures generated.
Herstellung des StandardimpfstoffsManufacture of the standard vaccine
Einer dieser Schrägnährboden von Candida iipoly- »5 tica ATCC Nr. 20297 wird mit 20 ml sterilem destilliertem Wasser gewaschen. 0,2 ml der erhaltenen Zellsuspension werden zum Beimpfen von 10 ml Medium »A« (1% Glycerin, 0,3% Ringfleischextrakt, 0,3% Hefeextrakt und 0,5% Pepton) verwendet. Röhrchen (25· 150 mm), die 10 ml Medium und den Impfstoff enthalten, werden unter Schütteln 20 Stunden bei 280C bebrütet. Die erhaltenen Kulturen stellen den Standardimpfstoff dar.One of these inclined culture media from Candida iipoly- »5 tica ATCC No. 20297 is washed with 20 ml of sterile distilled water. 0.2 ml of the cell suspension obtained is used to inoculate 10 ml of medium "A" (1% glycerol, 0.3% ring meat extract, 0.3% yeast extract and 0.5% peptone). Tubes (25 × 150 mm) containing 10 ml of medium and the vaccine are incubated for 20 hours at 28 ° C. with shaking. The cultures obtained represent the standard vaccine.
Herstellung des Grundmediums »B«Production of the basic medium "B"
Dieses Medium wird so formuliert, daß es je Liter 2,0 g Harnstoff, 1,0 g (NH4)2SO4,1,0 g CaSO4 · 2H2O, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,5 g K2SO4, 0,25 g MgSO4 · 7H2O. 2,5 mg FeSO4 · 7 H20,10 mg MnSO4 · H20,500Mikrogramm Thiaminhydrochlorid und 1,0 ml einer Lösung von Spurenmineralien enthält. Die Hauptmenge des Mediums wird auf pH 3,5 eingestellt und im Autoklav sterilisiert (der Harnstoff wird getrennt sterilisiert und zugefügt). Die Lösung der Spurenelemente (1,0 ml) liefert 1,0 mg CaCl2-2H2O und jeweils 100 Mikrogramm CuSO4 · 5H2O, CoCl2 · 6H2O, ZnSO4 · 7H2O, (NH4^Mo7O24 · 4H2O und Na2B4O7 · 10H2O.This medium is formulated in such a way that it contains 2.0 g urea, 1.0 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.0 g CaSO 4 · 2H 2 O, 0.5 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 g K 2 SO 4 , 0.25 g MgSO 4 • 7H 2 O. 2.5 mg FeSO 4 • 7 H 2, 0.10 mg MnSO 4 • H 2 0.500 micrograms thiamine hydrochloride and 1.0 ml of a solution contains trace minerals. The main amount of the medium is adjusted to pH 3.5 and sterilized in the autoclave (the urea is sterilized and added separately). The trace element solution (1.0 ml) provides 1.0 mg CaCl 2 -2H 2 O and 100 micrograms each of CuSO 4 · 5H 2 O, CoCl 2 · 6H 2 O, ZnSO 4 · 7H 2 O, (NH 4 ^ Mo 7 O 24 · 4H 2 O and Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O.
Die Zellen im Standardimpfstoff werden zweimal mit Wasser gewaschen und wieder in Wasser suspendiert, so daß die endgültige Zellkonzentration etwa 10 mg/ml beträgt. Kolben, die 20 ml Medium »B« und 4 ml n-Hexadecan enthalten, werden mit 1,0 ml der obigen Zellsuspension beimpft. Die Kolben werden dann 9 Tage bei 24 bis 250C auf einer Schüttelvorrichtung bebrütet. Der wäßrige Anteil der Brühe wird durch Zentrifugieren von den Zellen und dem restlichen Kohlenwasserstoff getrennt. Die wäßrige Lösung enthält auf Grund der colorimetrischen Bestimmung und der Dünnschichtchromatographie 34 mg/ml D-Mannit, <1 mg/ml D-Arabit und 3 mg/ml i-Erythrit. The cells in the standard vaccine are washed twice with water and resuspended in water so that the final cell concentration is approximately 10 mg / ml. Flasks containing 20 ml of medium "B" and 4 ml of n-hexadecane are inoculated with 1.0 ml of the above cell suspension. The flasks are then incubated for 9 days at 24 to 25 ° C. on a shaking device. The aqueous portion of the broth is separated from the cells and the remaining hydrocarbon by centrifugation. Based on the colorimetric determination and thin layer chromatography, the aqueous solution contains 34 mg / ml D-mannitol, <1 mg / ml D-arabitol and 3 mg / ml i-erythritol.
Beispiel 2
1. WachstumsstufeExample 2
1st stage of growth
300 ml Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 8 ml Medium »A«, 12 ml Medium »B« und 4 ml n-Hexadecan300 ml Erlenmeyer flask, each containing 8 ml medium "A", 12 ml medium "B" and 4 ml n-hexadecane
5 65 6
enthalten, werden mit 1,0 ml des obigen Standard- man dann unter Kühlen auskristallisieren läßt. Die
impfstoffs beimpft und auf einer Schüttelvorrichtung erste Ausbeute an kristallinem D-Mannit beträgt 41 g.
48 Stunden bei 24° C bebrütet. Nach der Umkristalüsation aus Wasser haben diese
„ ,„ . , Kristalle einen Schmelzpunkt von 168cC (korrigiert),
2. Wachstumsstufe 5 der ham Vermischen mit eurer authentischen Probe
Fernbach-Kolben, die 20 ml Medium »A«, 380 ml von D-Mannit nicht verringert wird. Weitere AusMedium »B« und 80 ml gemischte Paraffine (8% beuten an kristallinem D-Mannit erhält man durch
H-C11H30, 72% n-C15h32, 15% n-C^H^) enthalten, Einengen der Mutterlaugen,
werden mit jeweils 20 ml der ersten Wachstumsstufe . .
beimpft und 72 Stunden bei 24° C auf einer Schottel- ίο B e ι s ρ ι e I J
vorrichtung bebrütet. Das Verfahren des Beispiels 2 wird wiederholt, , , . jedoch wird an Stelle der Mischung von n-Paraffinen
rroauktionsstute im lemen Nährmedium ^ gieiche Gewichtsmengeare then allowed to crystallize with 1.0 ml of the above standard with cooling. The vaccine inoculated and on a shaker first yield of crystalline D-mannitol is 41 g. Incubated for 48 hours at 24 ° C. After recrystallization from water, these have ",". , Crystals a melting point of 168 c C (corrected), 2nd growth stage 5 of the ham mixing with your authentic sample Fernbach flask, the 20 ml medium "A", 380 ml of D-mannitol is not reduced. Further from medium "B" and 80 ml of mixed paraffins (8% of crystalline D-mannitol is obtained from HC 11 H 30 , 72% nC 15 h 32 , 15% nC ^ H ^), concentration of the mother liquors,
are each with 20 ml of the first growth stage. .
inoculated and 72 hours at 24 ° C on a Schottel ίο B e ι s ρ ι e IJ
device incubated. The procedure of Example 2 is repeated,,,. However, the mixture of n-paraffins is in place in rroauktionsstute lemen nutrient medium gi ^ e calibrated amount by weight
4-1-Fermentationsbehälter, die mit einem Rührer einer Mischung aus gleichen Teilen n-Dodecan,4-1 fermentation vessel, which with a stirrer a mixture of equal parts n-dodecane,
ausgestattet sind und 2000 ml Medium *B« und 15 n-Tridecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Octa-equipped and 2000 ml of medium * B «and 15 n-tridecane, n-pentadecane, n-hexadecane and n-octa-
400 ml gemischte Paraffine (wie oben) enthalten, decan verwendet, wobei man vergleichbare Ergebnisse400 ml of mixed paraffins (as above) contain decan used, giving comparable results
werden mit jeweils 100 ml der zweiten Wachstums- erhält.are obtained with 100 ml of the second growth.
stufe geimpft und 2i2Stunden bei 24 bis 25°C be- Beispiel 4
brütet. Die FermentationsbehäUer werden mit einerstep vaccinated and 2i2 hours at 24 to 25 ° C. Example 4
broods. The fermentation tanks are equipped with a
Geschwindigkeit von 1750 UpM. gerührt, und je ao Die Herstellung des Standardimpfstoffs, die ersteSpeed of 1750 rpm. stirred, and je ao The manufacture of the standard vaccine, the first
Minute werden durch sie 21 sterile Luft geleitet. Wachstumsstufe und die zweite Wachstumsstufe21 minutes of sterile air are passed through them. Growth stage and the second growth stage
r . , werden wie im Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, r . , are carried out as described in Example 2,
uewinnungsstute jedoch jeweils bei einer Inkubationstemperatur jvonhowever, each mare at an incubation temperature of jvon
Die gesamte Gärbrühe wird zur Entfernung der 28°C. Jeweils 480 ml der zweiten Wachstumsstufe Hefezellen und des restlichen Kohlenwasserstoffs *s werden zum Beimpfen von mehreren 14-1-Newdurch eine Zentrifugalscheibentrennvorrichtung ge- Brunswick-Gärbehältern verwendet, von denen jeder führt. Die trübe wäßrige Phase wird durch Filtrieren 7 1 Medium »B« und 1400 ml gemischte Paraffine geklärt und dann entionisiert, indem man sie nach- (wie im Beispiel 2 beschrieben) enthält. Die Gäreinander durch ein schwaches Ariionenaustauscherharz, behälter werden durch Kühlen von außen auf 25 0C ein starkes Kationenaustauscherharz und ein schwa- 30 gehalten und mit einer Geschwindigkeit von 650 UpM. ches Anionenaustauscherharz führt. 161 der geklärten gerührt. Gleichzeitig werden durch sie je Minute 8 1 entionisierten Brühe, die 12,5 mg/ml D-Mannit ent- Luft geleitet. Nach 212stündiger Inkubation enthält halten, werden unter verringertem Druck zu einer die Brühe 12 mg/ml D-Mannit, der nach dem VerLösung von 25% (Gewicht/Volumen) eingeengt, die fahren des Beispiels 2 gewonnen wird.The entire fermentation broth is used to remove the 28 ° C. Each 480-Brunswick fermenters used, each of which leads ml of the second growth stage yeast cells and the remaining hydrocarbon * s are used to inoculate a plurality of 14-1-Newdurch a Zentrifugalscheibentrennvorrichtung overall. The cloudy aqueous phase is clarified by filtering 7 liters of medium "B" and 1400 ml of mixed paraffins and then deionized by adding them (as described in Example 2). The fermentation through a weak Ariionenauschharz, container is kept by cooling from the outside to 25 0 C a strong cation exchange resin and a black and at a speed of 650 rpm. Ches anion exchange resin leads. 161 of the clarified stirred. At the same time, 8 liters of deionized broth per minute, the 12.5 mg / ml of D-mannitol, are de-aired through them. After 212 hours of incubation, the broth contains 12 mg / ml of D-mannitol, which is concentrated after dissolving 25% (weight / volume), which is obtained in Example 2, under reduced pressure.
Claims (2)
etwa 12 bis 18 Kohlenstoffatomen als Hauptquelle für Im Nährmedium können einzelne n-Alkane vonThe process according to the invention is characterized by the fact that the amount of D-mannitol formed is so low that with this process Candida is so great that the D-mannitol is produced by direct crystalline lipolytics ATCC No. 20297 in an aqueous nutrient sation pure form from the clarified and deionized medium, which at least one normal paraffin can be obtained with sated fermentation broth,
about 12 to 18 carbon atoms as the main source of In the nutrient medium, individual n-alkanes of
nithexanitrat verwendet werden. Zusammen mit Bor- Das Nährmedium enthält außerdem die herkömmsäure wird er auch bei der Herstellung elektrolytischer liehen Quellen für assimilierbaren Stickstoff, Mineral-Trockenkondensatoren zur Anwendung in der Radio- stoffe und andere Wachstumsfaktoren, die sich in der technik verwendet. wäßrigen Phase befinden. Harnstoff wird als QuelleD-mannitol is a non-hygroscopic white and semi-refined "material, however, at least some of these materials should have a pleasantly n-parafsweet taste, the sweetness of which is about 65% of the fin with a chain length of about 12 to 18 carbons. Sucrose is made up of atoms in food, the hydrocarbon content used to give consistency and in 40 chewable tablets such as vitamins or aspirin must be at least about 5 percent by weight for substantial amounts D-mannitol tablets useful as an extender. D-mannitol can be formed. If desired, amounts of finer amounts can be used to make synthetic resins and plasticizers up to 20 percent by weight. To make as well as an intermediate in the production of optimal results is preferred development of the well-known vasodilator D-Man- 45 content, however, about 15 percent by weight,
nitro hexanitrate can be used. Together with boron, the nutrient medium also contains the conventional acid, it is also used in the production of electrolytic borrowed sources for assimilable nitrogen, mineral dry condensers for use in radio emissions and other growth factors that are used in technology. aqueous phase. Urea is used as the source
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---|---|---|---|
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