DE2113123A1

DE2113123A1 - Process for the production of virus particles or double-stranded ribonucleic acid

Info

Publication number: DE2113123A1
Application number: DE19712113123
Authority: DE
Inventors: Chain Ernst Boris; Darbyshire Joan Elizabeth; Fred Himmelweit; Giulio Ratti; Banks Geoffrey Talbot; Buck Kenneth William
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1970-03-23
Filing date: 1971-03-18
Publication date: 1971-10-14
Also published as: FR2085729A1; GB1300259A; IL36388A0; ES389437A1; ZA711813B; FR2085729B1; NL7103768A; BE764715A

Description

" Verfahren zur Herstellung von Viruspartike?n oder doppelsträngiger Eibonucleinsäure ""Process for the production of virus particles or double-stranded Eibonucleic acid "

Priorität: 23. März 1970» Grossbritannien, Hr. 13 826/70Priority: March 23, 1970 »Great Britain, Mr. 13 826/70

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Viruspartikeln oder doppelsträngiger Ribonucleinsäure mit die Interferonbildung stimulierender Wirkung.The invention relates to a method for producing virus particles or double-stranded ribonucleic acid with the effect of stimulating the formation of interferons.

Bekanntlich können antivirale Nucleinsäuren aus bestimmten penicillinbildenden Stämmen von Penicillium chrysogenum isoliert werden; vergl. britische Patentschrift Nr. 1 170 929. Viruspartikel mit die Interferonbildung stimulierender Y/irkung wurden auch in einem Stamm von Penicillium stoloniferum und einem Stamm von Penicillium funiculosum gefunden. Ferner wurden ViruGOartikel aus einem Stamm'von Penicillium cyaneofulvum isoliert. In bestimmten Fällen der vorstehenden Art konnte gezeigt werden, dass die in den Viruspartikeln vorliegende Ribonueleinsäure (RNA) der Wirkstoff ist, d»r die Interferonbildung induziert. Es konnte ferner gezeigt werden, dass dieIt is known that antiviral nucleic acids can be isolated from certain penicillin-producing strains of Penicillium chrysogenum; See British Patent No. 1,170,929. Virus particles with an interferon-stimulating action have also been found in a strain of Penicillium stoloniferum and a strain of Penicillium funiculosum. Furthermore, ViruGO articles were isolated from a strain of Penicillium cyaneofulvum. In certain cases of the above type it could be shown that the ribonueleic acid (RNA) present in the virus particles is the active substance which induces the formation of interferon. It could also be shown that the

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aus der Viren isolierte RiJA, die die Interferonbildung induziert, doppelsträngig ist.RiJA isolated from the virus, which induces interferon formation, is double-stranded.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass man Viruspartikel aus dem Myzel von Aspergillus foetidus oder Aspergillus niger oder aus dem Nährmedium gewinnen kann, in welchem diese Pilze gezüchtet wurden.The invention is based on the finding that virus particles from the mycelium of Aspergillus foetidus or Aspergillus niger or from the nutrient medium in which these mushrooms were grown.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Viruspartikeln oder doppelsträngiger Ribonucleinsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass manThe invention thus relates to a process for the production of virus particles or double-stranded ribonucleic acid, which is characterized by the fact that one

(a) Aspergillus foetidus oder Aspergillus niger unter aeroben Bedingungen in üblichen Nährböden unter üblichen Bedingungen züchtet,(a) Aspergillus foetidus or Aspergillus niger under aerobic conditions in customary culture media under customary conditions breeds,

(b) das Myzel vom Nährboden abtrennt und entweder(b) separating the mycelium from the medium and either

den Nährboden mit einer Ribonucleinsäure oder deren Salz behandelt odertreated the culture medium with a ribonucleic acid or its salt or

(ß) die Zellen des Myzels aufbricht, die Zelltrürnmer abtrennt und den Zellinhalt mit einer Ribonucleinsäure oder deren Salz behandelt,(ß) breaks open the cells of the mycelium, separating the cell debris and the cell contents are treated with a ribonucleic acid or its salt,

(c) den ρττ-Wert der nach (tf) oder (ß) erhaltenen Flüssigkeit auf einen Wert von 3 bis 6 einstellt,(c) the ρττ value of the liquid obtained according to (tf) or (ß) set to a value from 3 to 6,

(d) die dabei gebildete Fällung vom Überstand abtrennt,(d) separates the precipitate formed from the supernatant,

(e) die Fällung nach Neutralisation konzentriert und reinigt und ' r (e) the precipitation, after neutralization, is concentrated and purified and ' r

(f) gegebenenfalls die erhaltenen Viruspartikel vom Protein befreit und die erhaltene doppelsträngige Ribonucleinsäure isoliert und gegebenenfalls in ein Salz überführt.(f) if necessary, the virus particles obtained are freed from protein and the double-stranded ribonucleic acid obtained isolated and optionally converted into a salt.

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Vorzugsweise wird im Verfahren der Erfindung als Schimmelpilz Aspergillus foetidus IMI I1871 oder Aspergillus niger IMI 146891 verwendet. Alle mit IMI-Nummern bezeichneten Stämme sind in dem Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, hinterlegt. Aspergillus foetidus IMI I1871 or Aspergillus niger IMI 146891 is preferably used as the mold in the process of the invention. All IMI-numbered strains are deposited at the Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England.

Der Ausdruck "Viruspartikel" bezeichnet die polyedrischenThe term "virus particles" denotes the polyhedral

Partikel, die in einem Nährboden gefunden werden, auf dem oder in dem der Schimmelpilz Aspergillus foetidus oder Aspergillus niger gezüchtet wurde, oder die in den Zellen dieser Schimmelpilze selbst gefunden v/erden. Diese Viruspartikel erfüllen sämtliche Kriterien, n.it Ausnahme einer nachweisbaren Infektionseigenschaft, die normalerweise typisch sind für einen Virus, z.B. charakteristische Morphologie und Färbung in Elektronenmikroskopaufnahmen, dem für kleine isometrischeParticles found in a culture medium on which or in which the mold Aspergillus foetidus or Aspergillus is located niger has been grown, or which are found in the cells of these molds themselves. These virus particles meet all criteria, with the exception of a demonstrable infection characteristic, which are normally typical of a virus, e.g. characteristic morphology and coloration in Electron micrographs, the one for small isometric

Viren typischen Sedimentationsbild während der Dichtegradienten-Zentrifugation und analytischen Zentrifugation, speaifi- · sehe serologische Reaktionen und UV-Absorptionsspektren, wie sie für virale Nucleoproteine typisch sind.Virus-typical sedimentation pattern during density gradient centrifugation and analytical centrifugation, speaifi- · see serological responses and UV absorption spectra typical of viral nucleoproteins.

Versuche haben ergeben, dass die aus Aspergillus foetidus und Aspergillus niger isolierten Viruspartikel serologisch nicht verwandt sind, mit den Viren aus Penicillium stoloniferum, Penicillium funiculosum, Penicillium cyaneofulvum und Penicillium chrysogenum.Tests have shown that the virus particles isolated from Aspergillus foetidus and Aspergillus niger do not serologically are related to the viruses from Penicillium stoloniferum, Penicillium funiculosum, Penicillium cyaneofulvum and Penicillium chrysogenum.

Aus den erfindungsgemäss hergestellten Viruspartikeln kann doppeisträngige Ribonucleinsäure isoliert werden, die ebenfalls die Interferonbilduiig in Warmblütern induziert.From the virus particles produced according to the invention can double-stranded ribonucleic acid can also be isolated which induces interferon formation in warm-blooded animals.

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Die doppelcträngigft Ribonucleirisäure kann ein einheitliches Produkt oder ein Gemisch, verschiedener Arten von doppelsträngiger Ribonucleinsäure sein. Bei Verwendung von "Aspergillus foetidus IMI 41871 zur Herstellung der Viruspartikel ist die doppelsträngige RNA ein Gemisch aus mindestens 4 RIiA-Arten. Dies ergibt sich aus der Bildung von mindestens 4 Banden bei der Polyacrylamidgel-Elektrophorese.The double-stranded ribonucleic acid can be a single Product or a mixture of different types of double-stranded Be ribonucleic acid. When using "Aspergillus foetidus IMI 41871 to produce the virus particles, the double-stranded RNA a mixture of at least 4 RIiA species. This results from the formation of at least 4 bands during polyacrylamide gel electrophoresis.

In der Verfahrensstufe (b) des erfindungsgemässen Verfahrens dient die zugesetzte Ribonucleinsäure bzw. deren Salz dazu, einen Komplex mit e'en Viruspartikeln zu bilden. Zu diesem Zweck kann jede Ribonucleinsäure verwendet v/erden, vorzugsweise wird jedoch HeferibO2iucleinsäure als solche oder in Form ihres Natriumsalzes verwendet. Nach der Zugabe der Ribonucleinsäure fällt der Komplex aus den Virusteilcheri und der Ribonucleinsäure aus. Diese Ausfällung wird bei einem p^-Wert von 3 bis S, vorzugsweise bei etwa 4,5 durchgeführt. Die Abtrennung der Fällung vom Überstand kann nach üblichen Filtrationsmethoden, z.B. mittels einer Filterpresse erfolgen. Im allgemeinen lässt sich der ausgefällte Komplex durch Suspendieren in einem geeigneten Medium und Einstellen des p^-V/ertes auf etwa 6,5 bis 8,5» vorzugsweise etwa 7,4 wieder zerlegen. Hierbei geht die Heferibonucleinsäure in Lösung und es hinterbleiben die Viruspar tikel in freier Form.In process stage (b) of the process according to the invention, the added ribonucleic acid or its salt serves to form a complex with the virus particles. Any ribonucleic acid can be used for this purpose, but yeast ribonucleic acid is preferably used as such or in the form of its sodium salt. After the addition of the ribonucleic acid, the complex of the virus particles and the ribonucleic acid precipitates. This precipitation is carried out at a p ^ value of 3 to S, preferably at about 4.5. The precipitate can be separated off from the supernatant by conventional filtration methods, for example by means of a filter press. In general, the precipitated complex can be broken down again by suspending it in a suitable medium and adjusting the p ^ -V / ertes to about 6.5 to 8.5, preferably about 7.4. Here, the yeast ribonucleic acid goes into solution and the virus particles remain in free form.

Die Reinigung der Viruspartikel kann z.B. durch Differontialzentrifugieren, Zonalzentrifugieren oder isopyknisches Zentrifugieren erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Reinigung durch Zentrifugieren in der Ultrazentrifuge in einem Caesiumchlorid-The virus particles can be purified, for example, by differential centrifugation, Zonal centrifugation or isopycnic centrifugation take place. The cleaning is preferably carried out by centrifugation in the ultracentrifuge in a cesium chloride

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Dichtegradienten.Density gradient.

Das doppelsträngige Ribonucleinsäurematerial kann aus den erfindungsgemäss gewonnen Viruspartikeln dadurch gewonnen werden, dass man diese deproteinisiert. Vorzugsweise behandelt man zu diesem Zweck die Viruspartikel mit einem Netzmittel und Phenol. Als Netzmittel wird vorzugsweise Natriumdodecylsulfat den Viruspartikeln zugesetzt.. Die erhaltene Suspension wird hierauf mit Phenol extrahiert. Die Phasentrennung wird durch Zentrifugieren erreicht und anschliessend wird das Phenol durch | Zugabe von Äther abgetrennt. Hierauf wird das doppelsträngige RNA-Material durch Zusatz eines Alkohols ausgefällt. Das auf diese Weise erhaltene RNA-Material hat Eigenschaften, wie sie doppelsträngige Ribonucleinsäuren zeigen, z.B. das charakteristische Verhalten beim Erwärmen und bei der Behandlung mit Ribonuclease.The double-stranded ribonucleic acid material can be made from the inventive obtained virus particles are obtained by deproteinizing them. Preferably treated for this purpose the virus particles with a wetting agent and phenol. The preferred wetting agent is sodium dodecyl sulfate added to the virus particles. The suspension obtained is then extracted with phenol. The phase separation is due to Centrifugation is achieved and then the phenol is through | Separated addition of ether. Then the double-stranded RNA material precipitated by adding an alcohol. That on this Well-obtained RNA material has properties such as those shown by double-stranded ribonucleic acids, e.g. the characteristic Behavior when heated and when treated with ribonuclease.

Auf Grund ihrer die Interferonbildung induzierenden Wirkung bei Warmblütern sind die erfindungsgemäss hergestellten Virus partikel und das daraus gewonnene doppelsträngige Ribonucleinsäurematerial wertvolle Arzneistoffe. Die Erfindung betrifft ' somit auch Arzneipräparate, die gekennzeichnet sind durch einen Gehalt an den erfindungsgemäß hergestellten Viruspartikeln oder dem aus diesem Viruspartikeln gewonnenen Ribonucleinsäurematerial oder dessen Salz und gegebenenfalls üblichen pharmakologisch verträglichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln. Die Viruspartikel und bzw. oder das doppelsträngige Ribonucleinsäurematerial kann z.B. intraperitoneal oder parenteral verabfolgt werden. Eine intranasale Verabfolgung ist ebenfalls möglich.Because of their effect on warm-blooded animals which induce interferon formation, the viruses produced according to the invention are particles and the double-stranded ribonucleic acid material obtained from them are valuable medicinal substances. The invention relates to ' thus also medicinal preparations which are characterized by a content of the virus particles produced according to the invention or the ribonucleic acid material obtained from these virus particles or its salt and optionally customary pharmacological compatible carriers and / or diluents. The virus particles and / or the double-stranded ribonucleic acid material can for example be administered intraperitoneally or parenterally. Intranasal administration is also possible.

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Aspcrgillus foeticlus oder Aspergillus niger wirci in '/erfahren der Erfindung gewöhnlich auf einem festen L'ährboden zur Herstellung eines Inoculums für die Fermentationsstufe gezüchtet. Dieser Nährboden besteht aus einem Gemisch von Kohlenstoff- und Stickst off quellen, Mineralsalzen und Agar, Nach der Be impfung der Agarkultur lässt man die Pilze bei Temperaturen von etv/a 20 bis 35 C, vorzugsweise bei etwa 27 C etwa 1 V/o ehe wachsen. längere Züchtungszeiten sind gewöhnlich unerwünscht, da sich die Kultur mit der Zeit verschlechtert und die Zahl der lebensfähigen Zellen abnimmt. Ein geeigneter Nährboden zur Herstellung von Inoculum hat folgende Zusammensetzung:Aspergillus foeticlus or Aspergillus niger wirci in the invention are usually grown on solid culture medium for the production of an inoculum for the fermentation stage. This nutrient medium consists of a mixture of carbon and nitrogen sources, mineral salts and agar. After the agar culture has been inoculated, the fungi are left at temperatures of around 20 to 35 ° C., preferably at around 27 ° C. about 1 V / o before grow. longer culture times are usually undesirable as the culture deteriorates over time and the number of viable cells decreases. A suitable culture medium for the production of inoculum has the following composition:

Kartoffelextrakt 30 jSPotato extract 30 jS

Glukose 3 ⁰A Glucose 3 ⁰ A

Agar 1,5 ^cß> Agar 1.5 ^c ß>

in destilliertem Wasser bei p^ 7,0.in distilled water at p ^ 7.0.

Das Agarmedium wird in Reagenzgläschen oder lastschalen gegeben, die mit Watte verschlossen, in üblicher V/eise sterilisiert werden. Anschliessend lässt man den Nährboden sich verfestigen. Zur längeren Aufbewahrung lässt man die Kultur auf dem vorgenannten Agarnährboden in Schraubverschlussflaschen etwa 1 V/o ehe wachsen, bevor man die gesamte Schrägagarkultur mit sterilisiertem flüssigen Paraffin überschichtet. Unter diesen Bedingungen lässt sich die Kultur bei Raumtemperatur mehrere Jahre ohne Verlust der Lebensfähigkeit aufbewahren.The agar medium is placed in test tubes or load trays, which are closed with cotton wool and sterilized in the usual manner. The nutrient medium is then allowed to solidify. For longer storage, the culture is left on the aforementioned agar culture medium in screw-cap bottles for about 1 V / o before grow before using sterilized agar slant culture liquid paraffin layered. Under these conditions, the culture can be kept for several years at room temperature Keep loss of viability.

Zur Fermentation wird Aspergillus foetidus oder Aspergillus niger in einem geeigneten Nährboden unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von eLwa 20 bis 35 C, vorzugsweise bei J.7 C gezüchtet.'Ein geeigneter Nährboden enthält eine Kohlenstoff-For fermentation, Aspergillus foetidus or Aspergillus niger is grown in a suitable culture medium under aerobic conditions at temperatures of about 20 to 35 ° C., preferably at 7 ° C. A suitable culture medium contains a carbon

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und Stickstoffquellc und i-iineraisalze. Sin besonuers geeigneter Nährboden hat folgende Zusammensetzung:and nitrogen source and i-iinerai salts. Sin particularly suitable The nutrient medium has the following composition:

Glukose 2,0 ^Glucose 2.0 ^

Pepton 0,1 <fo Peptone 0.1 <fo

Maisquellwasser 5,0 $Corn steeple $ 5.0

Hefeautolysat 0,1 fo Yeast autolysate 0.1 fo

K₂HPO₄ 0,5 Io K ₂ HPO ₄ 0.5 Io

Leitungswassertap water

Pu 6,5; 40 Minuten bei 121°C sterilisiert.Pu 6.5; Sterilized for 40 minutes at 121 ° C.

Die Fermentationsstufe v/ird mit einer Suspension der Pilzzellen beimpft, die durch Abkratzen der Gberflache einer vorstehend beschriebenen Schrägagarkultur in Gegenwart von zugesetzter. vollentsaJ stern V/a&;3or erhalten v/urde. Das Ferraentationsmediurn wird gewöhnlich mit etwa 1 bis 5 ^CA der Inoculumsuspension von Pjlzzellen beimpft.The fermentation stage v / ird is inoculated with a suspension of the fungal cells, which are obtained by scraping the surface of a slant agar culture described above in the presence of added. full decay star V / a &; 3or received v / urde. The fermentation medium is usually ^{inoculated with about 1 to 5 C} A of the inoculum suspension of Pjlz cells.

Danach wird der Pilz in der Fermentationsstufe während 2 bis 8 Tagen bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis 55 C, vorzugsweise bei 27 C gezüchtet. Kulturen in kenischen Flaschen werden auf einer Drehsehüttelmaschine geschüttelt oder statisch inkubiert. Kulturen in Fermentern werden durch Einblasen steriler Luft durch das Kulturmedium inkubiert. Die Viruspartikel scheinen in Hysei während der Frühstufe des Wachsturaszyklus vorzuliegen. Es wurde festgestellt, dass die höchste Konzentration an Viruspartikeln im Myzel nach etwa 1 bis 3 Tagen vorliegt. Kach 2 bis 4 Tagen treten dann die Viruspartikel auch im Kulturmedium auf und nach 4 bis 8 Tagen erreichen sie im Kulturmedium die höchste Konzentration. Somit können die Virucpartikel aus dem Kulturmedium nach 4 bis 8 Tagen nach der Inoculation geerntet werden. Andererseits kann man nach etwaThen the mushroom is fermented during 2 to 8 days at temperatures in the range from about 20 to 55 C, preferably grown at 27 C. Cultures in Kenyan flasks are shaken on a rotary shaker or static incubated. Cultures in fermenters are made more sterile by sparging Air incubated through the culture medium. The virus particles appear in Hysei during the early stage of the growth cycle to be present. It was found that the highest concentration of virus particles in the mycelium is present after about 1 to 3 days. After 2 to 4 days, the virus particles also appear in the culture medium and after 4 to 8 days they reach the highest concentration in the culture medium. Thus the Virucpartikel can be harvested from the culture medium after 4 to 8 days after inoculation. On the other hand you can after about

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2 Tagen von der Inoculation das Myzel abtrennen und die lebenden oder abgetöteten Zellen aufbrechen.2 days after inoculation, separate the mycelium and break open the living or dead cells.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

. Beispiel 1. example 1

Aspergillüs foetidus Stamm IMI 4l871 wird 48 Stunden bei 27⁰C in Schüttelflaschen in Submerskultur in einem Medium gezüchtet, das 2 % Glukose, 0,1 % Pepton, 5 % Maisquellwasser, 0,1 % Hefeautolysat und 0,5 % K₂HPO₁₁ enthält. Danach wird das Myzel abgetrennt, Es werden 10 g feuchtes Myzel erhalten, das in einer Pascall Triple Roll Mill Nr. 1 zerstört und in 100 ml eines 0,03 molaren Phosphatpuffers vom p„ 7,0 suspendiert wird. Nach 30minütigem Zentrifugieren bei 15 000 g wird der Überstand 90 Minuten bei 78 480 g zentrifugiert. Das Sediment (Pellets) wird in 0,03 molarem Phosphatpuffer, p„ 7,0 (insgesamt 1,0 ml) aufgenommen, und die Trümmer werden durch 20minütiges Zentrifugieren bei 7000 g abgetrennt. Das erhaltene rohe Viruspräparat wird durch Zonalzentrifugation in einem linearen (10 bis 50 %) Rohrzuckergradienten bei 69 000 g während 2 Stunden weiter gereinigt. Eine wohldefinierte blaugraue, lichtstreuende Bande wird aufgefangen und gegen 0,03 molaren Phosphatpuffer p„ 7,4 erschöpfend dialysiert. Die Untersuchung im Elektronenmikroskop (J.E.M. Modell 7) ergibt, dass dieses Präparat polyedrische Partikel mit einem Durchmesser von etwa ¹JO bis 42, nm enthält, die wie Ikosaeder aussehen.Aspergillüs foetidus strain IMI 4l871 is grown for 48 hours at 27 ⁰ C in shake flasks in submerged culture in a medium containing 2% glucose, 0.1% peptone, 5% corn steep liquor, 0.1% yeast autolysate and 0.5% K ₂ HPO ₁₁ contains. The mycelium is then separated off. 10 g of moist mycelium are obtained, which is destroyed in a Pascall Triple Roll Mill No. 1 and suspended in 100 ml of a 0.03 molar phosphate buffer of pH 7.0. After centrifuging at 15,000 g for 30 minutes, the supernatant is centrifuged at 78,480 g for 90 minutes. The sediment (pellets) is taken up in 0.03 molar phosphate buffer, p "7.0 (total 1.0 ml), and the debris is separated by centrifugation at 7000 g for 20 minutes. The crude virus preparation obtained is further purified by zonal centrifugation in a linear (10 to 50 %) cane sugar gradient at 69,000 g for 2 hours. A well-defined blue-gray, light-scattering band is collected and dialyzed exhaustively against 0.03 molar phosphate buffer p = 7.4. Examination in the electron microscope (JEM model 7) shows that this preparation contains polyhedral particles with a diameter of about ¹ JO to 42 nm, which look like icosahedra.

Viruspartikel aus Aspergillüs niger, Stamm IMI 146891, die auf die gleiche Weise hergestellt wurden, sind morphologisch denVirus particles from Aspergillus niger, strain IMI 146891, which are based on produced the same way are morphologically the most

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aus Aspergillus foetidus erhaltenen Viruspartikeln ähnlich.virus particles obtained from Aspergillus foetidus are similar.

Das rohe Viruspräparat wird durch isopyknisches Zentrifugieren in einem vorher hergestellten Caesiumchloridgradienten mit dem Beckman SW 27 Rotor während 18 Stunden bei 25 000 U/Min, weiter gereinigt. Im Dichtebereich 1,3^ bis 1,^0 v/erden vier Banden erhalten, die sämtliche intakte Viruspartikel enthalten. Dies ergab sich bei der Prüfung im Elektronenmikroskop. Diese vier Banden werden vereinigt und gegen 0,03 molaren Natriumphosphatpuffer Pu 7»^,der 0,1 molar an Natriumchlorid ist, erschöpfend dialysiert. Diese Präparate zeigten eine einzige Grenzlinie (S = 156s),wenn sie in einer analytischen Ultrazentrifuge (Beckman Modell E) bei 40 000 g zentrifugiert und mit dem UV-Scanner oder mit Schlierenoptik untersucht wurden. Das UV-Absorptionsspektrum ist typisch für Nucleoprotein (A_mQV ²⁶° ^nm » >. <« ²²*5 nm, Verhältnis 260/280 = 1,50 : 1).The crude virus preparation is further purified by isopycnic centrifugation in a previously prepared cesium chloride gradient with the Beckman SW 27 rotor for 18 hours at 25,000 rpm. Four bands containing all intact virus particles are obtained in the density range 1.3 to 1.0. This was found when examining in an electron microscope. These four bands are combined and dialyzed exhaustively against 0.03 molar sodium phosphate buffer Pu 7 »^, which is 0.1 molar in sodium chloride. These preparations showed a single borderline (S = 156s) when they were centrifuged in an analytical ultracentrifuge (Beckman model E) at 40,000 g and examined with the UV scanner or with Schlieren optics. The UV absorption spectrum is typical for nucleoprotein (A _mQV ²⁶ ° ^nm »>. <« ²² * 5 nm, ratio 260/280 = 1.50: 1).

in ei χ * minin a χ * min

Aus den gereinigten Viruspräparaten beider Pilzstämme wird die Ribonucleinsäure nach der Phenol-Natriumdodecylsulfatmethode von Franklin, Proc. U.S. Nat. Acad. Sei., 5_5 (1966), Seite 1504, extrahiert. Das UV-Absorptionsspektrum des Produktes ist typisch für Ribonucleinsäure;/* 258 ^nm;.^:;_min ²35 nm; Verhältnis 26O/28O = 2,26 : 1. Die Ribonucleinsäure wurde mit 0,3 η Natronlauge 18 Stunden bei 37°C hydrolysiert. Die in hoher Ausbeute gebildeten Nucleotide wurden durch ihre elektrophoreti" sehe Beweglichkeit in 0,05 molarem Ammoniumformiatpuffer p„ 3»5 und ihre UV-Absorptlonsspektren als Uridylsäure, Guanylsäure, Cytidylsäure und Adenrylsäure identifiziert.Ribonucleic acid is obtained from the purified virus preparations of both fungal strains using the phenol-sodium dodecyl sulfate method by Franklin, Proc. US Nat. Acad. Sci., 5_5 (1966), page 1504, extracted. The UV absorption spectrum of the product is typical of ribonucleic acid; / * 258 ^nm;. ^: ; _min ² 35 nm; Ratio 26O / 28O = 2.26: 1. The ribonucleic acid was hydrolyzed with 0.3 η sodium hydroxide solution at 37 ° C. for 18 hours. The nucleotides formed in high yield were identified by their electrophoretic mobility in 0.05 molar ammonium formate buffer p "3" 5 and their UV absorption spectra as uridylic acid, guanylic acid, cytidylic acid and adenrylic acid.

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Auf Grund ihrer charakteristischen Schmelzkurven und des Verhaltens bei der Behandlung mit Ribonuclease ergab sich, dass die isolierte Ribonucleinsäure doppeis tr ängig v/ar.Because of their characteristic melting curves and behavior on treatment with ribonuclease it was found that the isolated ribonucleic acid doubly v / ar.

Sowohl die Yirusteilchen als auch die doppelsträngige Ribonucleinsäure verursachen eine kräftige induktion der Interferonbildung bei Mäusen. 18 bis 22 g schwere Mäuse (Stamm CDI) v/erden intraperitoneal 10 j' ΗΙΛ aus Aspergillus fcetidus IMI 41871 in freier Form oder in Form der Yiruspartikel in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung verabfolgt. 24 Stunden später werden die Mäuse mit unterschiedlichen Verdünnungen von Encephalon^ocarditisvirus (EMV), Semliki Eorestvirus (SPV) oder Coxsackie Bi-Virus (CBlV) durch intraperitoneale Verabfolgung infiziert. Das Mortalitätsverhältnis und die mittlere Überlebenszeit der behandelten Mäuse v/ird mit unbehandelten Mäusen verglichen. Die mittlere tjberlebenazeit wird nach folgender Gleichung berechnet:Both the virus particles and the double-stranded ribonucleic acid cause a strong induction of interferon production in mice. Mice weighing 18 to 22 g (strain CDI) v / ground intraperitoneally 10 j 'ΗΙΛ from Aspergillus fcetidus IMI 41871 administered in free form or in the form of yirus particles in 0.1 ml of physiological saline solution. 24 hours later the mice are given different dilutions of Encephalon ^ ocarditisvirus (EMV), Semliki Eorestvirus (SPV) or Coxsackie Bi Virus (CBIV) by intraperitoneal Administration infected. The mortality ratio and the mean survival time of the treated mice are compared to untreated mice Compared to mice. The mean survival time will be calculated according to the following equation:

Überlebenszeit = —= Survival time = - =

η
χ η
χ

JJ = Zahl der Tiere in der Gruppe.YY = number of animals in the group.

η = Zahl der Tiere, die am x-ten Tage sterben.η = number of animals that die on the nth day.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I bis III zusammengestellt:The results are compiled in Tables I to III:

10-9842/162010-9842 / 1620

Table I.

Encephalomyocarditiε-Virus Encephalomyocarditi ε virus

Verdünnung
des infi
zierenden
EMVdilution
of the infi
ornamental
EMC doppelsträngige
RNA der Erfin
dungdouble-stranded
RNA of the inventor
manure überle-
benszeitsurvive
good time Virus partikel
der ErfindungVirus particles
the invention Überle-
benszeitSurvive
good time KontrolControl !versuch!attempt Mortali
tätMortali
activity 7,17.1 Mortali
tätMortali
activity 6,86.8 Morta
litätMorta
lity Ü-bc-rle-
benszeitÜ-bc-rle-
good time ίο² ίο ² 9/109/10 12,012.0 9/109/10 10,710.7 -- —- ΙΟ⁵ ΙΟ ⁵ 5/105/10 17,817.8 5/105/10 COCO 10/1010/10 3,93.9 ΙΟ⁴ ΙΟ ⁴ 3/103/10 OOOO 0/100/10 COCO 10/1010/10 4,34.3 1Ο>1Ο> 0/100/10 0/100/10 6/106/10 7,17.1 ¹^₅O
(Reed & ₊
Huench) ¹ ^ ₅ O
(Reed & ₊
Huench) _lo-3,2O _lo -3.2O ΙΟ"²'⁹ ΙΟ " ² ' ⁹ ΙΟ"⁵>⁴ ΙΟ " ⁵ > ⁴

Semliki ForestvlrusSemliki Forestvlrus Table II

Verdünnung
des infi
zierenden
Sl¹Vdilution
of the infi
ornamental
Sl ¹ V doppele trängige
RNA der Srfin-
dungdouble stranded
RNA of the Srfin
manure Über." ?»-
benszeitAbove."?"-
good time Vi r u ο par t ik el
der ErfindungVi ru ο par t ik el
the invention Überle
bens ze.itSurvive
bens ze.it KontrollversuchControl attempt "überle-
benszeit"survive-
good time 10² 10 ² Morta
litätMorta
lity '9,49.4 Morta
litätMorta
lity 7,97.9 Morta
litätMorta
lity -4,6-4.6 10³ 10 ³ 7/107/10 6,66.6 7/107/10 8,48.4 10/1010/10 4,74.7 10⁴ 10 ⁴ 10/1010/10 22,522.5 9/109/10 12,512.5 10/1010/10 6,16.1 10*10 * 4/104/10 80,080.0 7/107/10 22,922.9 10/1010/10 6,06.0 ^LÜ50
(Reed &
Muench) ^LÜ 50
(Reed &
Muench) 1/101/10 3/103/10 9/109/10 ΙΟ"'·⁷ ΙΟ "' ⁷ ΙΟ"⁴'² ΙΟ " ⁴ ' ² ίο"⁶·⁷ ίο " ⁶ · ⁷

+American Journal of hygiene, Bd. 27, (1938)» ^s + American Journal of Hygiene, Vol. 27, (1938) » ^p

10 9 8 4 2/162010 9 8 4 2/1620

Coxsackie Bl-VirusCoxsackie Bl virus

- 12 Tabelle III- 12 Table III

Verdünnung
des infi
zierendendilution
of the infi
ornamental doppelsträngige
RNA der Erfin
dungdouble-stranded
RNA of the inventor
manure Überle-
bonszeitSurvive
bonus time Virus partikel
dor ErfindungVirus particles
dor invention Überle-
benszeitSurvive
good time KontrOliversνchKontrOlivers ν ch Überle
bens ze it ■Survive
ben e time ■ CBlVCBlV Morta
lität !Morta
lity! 12,212.2 Morta
litätMorta
lity 9,09.0 Morta
litätMorta
lity . ⁴'² . ⁴ ' ² ΙΟ¹ ΙΟ ¹ 4/104/10 15,615.6 6/106/10 16,216.2 9/109/10 10,010.0 10^Ζ "10 ^Ζ " 4/104/10 Ö3Ö3 5/105/10 COCO 4/104/10 54,054.0 ΙΟ³ ΙΟ ³ 0/100/10 0/100/10 2/102/10 ™5Ο
(Reed &
>luench) ™ 5Ο
(Reed &
> luench) ΙΟ"¹'² ΙΟ " ¹ ' ² ίο-¹'*ίο- ¹ '* ΙΟ"¹'⁹ ΙΟ " ¹ ' ⁹

Example2

Beispiel 1 wird wiederholt, als Schimmelpilze werden jedoch Aspergillus foetidus IMI 150408 . sowie AspergillusExample 1 is repeated, however, as molds Aspergillus foetidus IMI 150408. as well as Aspergillus

niger IMI 50566 verwendet. Auch in diesem Pail können Viruspartikel mit die Interferonbildung stimulierender Wirkung isoliert werden.niger IMI 50566 used. Virus particles can also be found in this pail with interferon-stimulating effects.

109842/162109842/162

Claims

•1. Process for the production of virus particles or double-stranded Ribonucleic acid, characterized by the fact that one

(a) Aapergillus foetidus or Aspergillus niger under aerobic conditions in customary culture media under customary conditions breeds, -

(b) separating the mycelium from the medium and either

(pf) den Nänrboden with a ribonucleic acid or its Salt treats or

(ß) breaks the cells of the mycelium, separates the cell debris and the cell contents with a ribonucleic acid or their salt treated,

(c) adjusts the power of the liquid obtained after (<K) or (ß) to a value of 3 to 6,

(d) separates the precipitate formed from the supernatant,

(e) the precipitation suspended in a suitable medium after Neutralization concentrates and cleanses

and
(f) if appropriate, the virus particles obtained are freed from protein and the double-stranded ribonucleic acid obtained is isolated and optionally converted into a salt.

2. The method according to claim '!, characterized in that Aspergillus foetidus IMl 41871 or Aspergillus niger IMI 146891 breeds in stage (a).

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3. The method according to claim 1, characterized in that Aspergillus foetidus IMI 130408 or Aspergillus niger IMI 50566 is grown in step (a).

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that that the concentration and purification of the neutralized suspension in step (e) by differential centrifugation and or or performs ultrafiltration.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that that in step (b) yeast ribonuclaic acid in the form of its sodium salt used.

6. The method according to claim 1, characterized in that an aqueous suspension of the virus particles with a wetting agent and treated with phenol, the aqueous phase obtained is separated off and the double-stranded ribonucleic acid is precipitated.

7. The method according to claim ⁷ 6, characterized in that the wetting agent used is sodium dodecyl sulfate.

8. The method according to claim 6, characterized in that the double-stranded ribonucleic acid by adding an alcohol fails.

9. Medicinal preparations, characterized by a content of the virus particles produced according to claims 1 to 8 or the Ribonucleic acid or its salt and optionally customary

pharmacologically acceptable carriers and / or diluents.

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