DE2111518C3 - Hormone-like substance with hypocalcemic effects and process for their preparation - Google Patents
Hormone-like substance with hypocalcemic effects and process for their preparationInfo
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Description
3535
Die Erfindung betrifft eine hormonähnliche Substanz init hypokalzämischer Wirkung bei Säugetieren und Menschen, die durch Extraktion aus endokrinen Drüsen der Aale von Anguilla-Arten isoliert wird, und ein Verfahren zur Extraktion dieser Substanz.The invention relates to a hormone-like substance with hypocalcemic action in mammals and Human, which is isolated by extraction from endocrine glands of the eels of Anguilla species, and a Method of extraction of this substance.
Es ist bekannt, daß Schilddrüsen und Nebenschilddrüsen bei Säugetieren im Cakiumstoffwechsel eine wichtige Rolle spielen. P. F. H i r s c h et al. berichteten in Endocrinology, Bd. 73 (1963), S. 244, über die Isolierung des Hormons Thyrocalcitonin, ein Hormon mit hypokalzämischer Wirkung bei Säugetieren, aus Rattenschilddrüsen. Es wurde festgestellt, daß Thyrocalcitonin auch in Schilddrüsen anderer Säugetiere, wie Hunde, Affen, Schweine und Rinder, und auch beim Menschen vorkommt.It is known that the thyroid and parathyroid glands in mammals in the calcium metabolism to play an important role. P. F. H i r s c h et al. reported in Endocrinology, 73: 244 (1963) the isolation of the hormone thyrocalcitonin, a hormone with hypocalcemic effects in mammals, from rat thyroid. It has been found that thyrocalcitonin is also present in the thyroid glands of others Mammals such as dogs, monkeys, pigs and cattle, and also occurs in humans.
Vor kurzem wurden dem Thyrocalcitonin analoge Polypeptide auch in anderen Organen gefunden, d. h. in einem Ultimobranchialkörper genannten Gewebe bei Vögeln, Fischen und Amphibien. Diese Substanzen wurden klinisch zur Behandlung von Osteopetrose und Alterskrankheiten verwendet.More recently, polypeptides analogous to thyrocalcitonin have also been found in other organs; H. in a tissue called ultimobranchial body in birds, fish and amphibians. These substances have been used clinically for the treatment of osteopetrosis and diseases of the elderly.
Auf Grund der Tatsache, daß alle sekretierenden Gewebe, in denen diese Substanzen vorhanden sind, •ine positive Toluidinblau-Reaktion zeigen (sie werden fötlich-purpurn gefärbt), wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß in den Blutgefäßwänden der Vena cava, die entlang des Oesophagus des Aals in Richtung zum Herzen verläuft und an der Wand des Oesophagus haftet, ein Gewebe mit positiver Toluidinblau-Reaktion existiert. Bei Ratten, denen ein Extrakt dieses Gewebes verabreicht worden war, trat eine Senkung des Serumcalciumspiegels auf.Due to the fact that all secretory tissues in which these substances are present, • show a positive toluidine blue reaction (they are colored reddish purple), it was determined according to the invention that in the blood vessel walls of the vena cava running along the esophagus of the eel towards the Heart runs and adheres to the wall of the esophagus, a tissue with a positive toluidine blue reaction exists. A depression occurred in rats given an extract from this tissue the serum calcium level.
Außerdem wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß in der Perikardmembran des Aals ein sekretierendes Gewebe vorkommt, das den gleichen, vorstehend erwähnten Wirkstoff enthält. Die Existenz dieser Substanz in diesem sekretierenden Gewebe konnte jedoch nicht durch den Test mit der Toluidinblau-Färbung nachgewiesen werden. Soweit bekannt, war die Existenz von sekretierenden Geweben im Endokard von Vögeln, Fischen oder Amphibien nicht bekannt, die diesen Wirkstoff enthalten.In addition, it was found according to the invention that in the pericardial membrane of the eel a secreting Tissue occurs which contains the same active ingredient mentioned above. The existence of this substance however, in this secreting tissue could not pass the test with the toluidine blue stain be detected. As far as is known, the existence of secreting tissues was in the endocardium of birds, fish or amphibians not known to contain this active ingredient.
Die Serumcalcium-Werte und die Aktivität des hypokalzämisehen Hormons pro Einheit sekretierendes Gewebe von geschlechtsreifen, auf dem Weg zu den Laichplätzen befindlichen und jungen, noch nicht laichfähigen Aalen, die im November im Tone River gefangen worden waren, wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß bei erwachsenen Aalen im Vergleich zu den jungen Tieren sowohl die Calciumwerte als auch die Hormonaktivität gering sind.The serum calcium values and the activity of the hypocalcemic hormone per unit of secretion Tissues from sexually mature, on the way to spawning grounds and young, not yet Spawning eels caught in the Tone River in November were identified. The results are shown in the following table. This shows that in adult eels im Compared to the young animals, both the calcium levels and the hormone activity are low.
Auf Grund dieser Tatsachen wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß der Hormongehalt im genanntenOn the basis of these facts, it was found according to the invention that the hormone content in the above
sekretierenden Gewebe von Aalen in einem gewissen Wachstumsstadium zeitweise ansteigt, wenn die Aale in Seewasser oder in einer Salzlösung ähnlicher Zusammensetzung gezüchtet werden. Pro Einheit sekretierendes Gewebe kann ein Hormon mit hoher hypokalzämischer Wirkung gewonnen werden, wenn als Rohmaterial zur Extraktion das genannte sekretierende Gewebe von Aalen in diesem Wachstumsstadium verwendet wird.eels secreting tissue at a certain stage of growth temporarily increases when the eels cultured in seawater or in a salt solution of similar composition. Secretory per unit Tissues can be obtained when considered a hormone with high hypocalcemic effects Raw material for extraction the said secretory tissue from eels at this stage of growth is used.
F i g. 1 zeigt in einem Diagramm die Beziehung zwischen der Züchtungszeit (Tage) der Aale in mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünntem Meerwasser zum Serumcalciumspiegel und zum osmotischen Druck des Serums;F i g. 1 is a graph showing the relationship between the breeding time (days) of the eels in FIG Water in the ratio of 1: 1 diluted seawater to the serum calcium level and to the osmotic Pressure of serum;
F i g. 2 zeigt die Beziehung zwischen Züchtungszeit (Tage) von Aalen in mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnten Seewasser zur hypokalzämischen Aktivität pro Einheit sekretierendes Gewebe; dieF i g. Fig. 2 shows the relationship between cultivation time (days) of eels diluted with water in a ratio of 1: 1 Sea water for hypocalcemic activity per unit of secreting tissue; the
F i g. 3 und 4 zeigen IR (in KBr)- und UV-Spektren der Substanz (199 μg/ml, λ ^° = 277 πιμ £}?„ = 8,04) mit 70 MRC U/mg;F i g. 3 and 4 show IR (in KBr) and UV spectra of the substance (199 μg / ml, λ ^ ° = 277 πιμ £}? „= 8.04) with 70 MRC U / mg;
F i g. 5 zeigt ein Elutionsdiagramm einer Gelfiltration an vernetztem Dextran (Sephadex ® G-75);
vgl. Beispiel 2.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Substanzen sind Polypeptide, die insofern eng verwandt zum Thyrocalcitonin
sind, als sie in der Lage sind, den Serumcalciumspiegel bei Säugetieren und Menschen
senken.F i g. 5 shows an elution diagram of a gel filtration on crosslinked dextran (Sephadex® G-75); see example 2.
The substances obtained according to the invention are polypeptides which are closely related to thyrocalcitonin in that they are able to control the serum calcium level in mammals and humans
reduce.
Die Substanzen werden als weiße Pulver erhalten und haben folgende Eigenschaften.The substances are obtained as white powders and have the following properties.
L Löslichkeit:L solubility:
Löslich in Wasser, aber unlöslich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln.
2 Dialysierbarkeit, Filtration durch Membranfilter (Nihon Shinku Gijutsu K. K.):Soluble in water but insoluble in various organic solvents.
2 Dialysability, filtration through membrane filter (Nihon Shinku Gijutsu KK):
Die Substanz geht durch ein für Substanzen mit ] einem Molekulargewicht von 10 000 oder darunter durchlässiges Filter, aber nicht durch ein für Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1000 oder darunter durchlässiges Filter.The substance passes through for substances with a molecular weight of 10,000 or less permeable filter, but not through one, for substances with a molecular weight of 1000 or underneath a permeable filter.
1. Molekulargewicht:1. Molecular weight:
3000 bis 4500.
Bestimmungsverfahren:3000 to 4500.
Determination procedure:
Rinderserumalbumin (Molekulargewicht 67 000) und Bacitracin (Molekulargewicht 1423) werden als Vergleichsubstanzen verwendet. Die Molekulargewichte der Substanzen der Erfindung werden durch Gelfiltration an vernetzten Dextranen (Sephadex® G-75, G-50 und G-25) je nach ihrer Elutionsgeschwindigkeit bestimmt.Bovine serum albumin (molecular weight 67,000) and bacitracin (molecular weight 1,423) are used as comparative substances used. The molecular weights of the substances of the invention are determined by gel filtration of cross-linked dextrans (Sephadex® G-75, G-50 and G-25) depending on their elution rate definitely.
4. Farbreaktion:4. Color reaction:
Ninhydrinreaktion, Sakaguchi-Reaktion, Diazoreaktion und Crieg-Liebig-Reaktion positiv.Ninhydrin reaction, Sakaguchi reaction, diazo reaction and Crieg-Liebig reaction positive.
5. Fällungsmittel:5. Precipitants:
Die Substanzen sind durch Zugabe von Fäüungsmitteln für Proteine, wie Trichloressigsäure und Perchlorsäure, ausfällbar.The substances are made by adding feces for proteins, such as trichloroacetic acid and perchloric acid, precipitable.
6. Die Substanzen werden durch proteolytische Enzyme, wie Nagase und Chymotrypsin, inaktiviert. Bedingungen der Inaktivierung:6. The substances are inactivated by proteolytic enzymes such as Nagase and Chymotrypsin. Inactivation conditions:
Die Substanzen der Erfindung werden in 0,01m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 2 Stunden bei 37° C mit dem Enzym in einem Gewichtsverhältnis von 1: umgesetzt.The substances of the invention are in 0.01m Phosphate buffer of pH 6.8 for 2 hours at 37 ° C with the enzyme in a weight ratio of 1: implemented.
7. Aminosäurenzusammensetzutig: Eine Probe von 150 g mit7. Amino acid composition: A sample of 150 g with
von
MRC U/mg wirdfrom
MRC U / mg will
einer Aktivität 24 Stunden bei HO0Can activity for 24 hours at HO 0 C
von mitfrom with
η-Salzsäure hydrolysiert.η-hydrochloric acid hydrolyzed.
3030th
Aminosäure μΜοΙAmino acid μΜοΙ
Lysin 0,063Lysine 0.063
Histidin 0,0041Histidine 0.0041
NH3 0,0816NH 3 0.0816
Arginin 0,0256Arginine 0.0256
Asparaginsäure 0,0638Aspartic acid 0.0638
Threonin 0,0229Threonine 0.0229
Serin 0,0384Serine 0.0384
Glutaminsäure 0,0792Glutamic acid 0.0792
Prolin 0,0207Proline 0.0207
Glycin 0,0846Glycine 0.0846
Alanin 0,0760Alanine 0.0760
Halbcystin (—)Half cystine (-)
Valin 0,0807Valine 0.0807
Methionin —Methionine -
Isoleucin 0,0312Isoleucine 0.0312
Leucin 0,0641Leucine 0.0641
Tyrosin 0,0052Tyrosine 0.0052
Phenylalanin 0,0192Phenylalanine 0.0192
8. Laufstrecken der Produkte der Erfindung (es wurden die nachstehend in Beispiel 7 aufgeführten Produkte verwendet) bei der Disk-Elektrophorese sind in folgender Tabelle wiedergegeben:8. Running routes of the products of the invention (there were the products listed in Example 7 below) are used in disk electrophoresis reproduced in the following table:
Probe Α(100μ8)Sample Α (100μ 8 )
B (5(^g) B (5 (^ g)
Ο(150μ8) E (150 μκ)Ο (150μ 8 ) E (150 μκ)
Elektrophorese
bedingungenElectrophoresis
conditions
3 mA, 60 min 8 mA, 435 min 6 mA, 80 min 6 mA, 40 min 6 mA, 40 min3 mA, 60 min 8 mA, 435 min 6 mA, 80 min 6 mA, 40 min 6 mA, 40 min
Standardgel
(pH 8,9 bis 9,0)Standard gel
(pH 8.9 to 9.0)
Entwick- Tris-Glycinlungslösung PufferDevelop Tris-Glycine Solution Buffer
(pH-Wert 8,6)(pH value 8.6)
Färbemittel Ponceauxrot
Laufstrecke 0 (Aufsetzstelle)
M. G. = Methylgrün.Ponceau red dye
Running distance 0 (touchdown point)
MG = methyl green.
saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)acidic gel with 6-m urea (pH value 4.4)
Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,7)Sodium acetate buffer (pH 4.7)
saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)acidic gel with 6-m urea (pH value 4.4)
/9-Alanin-Essigsäure-Puffer (pH-Wert 5,0)/ 9-alanine-acetic acid buffer (pH value 5.0)
Amidoschwarz Ponceauxrot Rm.g. = 0,4—0,45 Rm.g. = 0,5
saures Gel mit
6-m Harnstoff
(pH-Wert 4,4)Amido black Ponceaux red Rm.g. = 0.4-0.45 rm.g. = 0.5 acidic gel with
6-m urea
(pH value 4.4)
/3-Alanin-Essigsäure-Puffer
(pH-Wert 5,0)/ 3-alanine-acetic acid buffer
(pH value 5.0)
Ponceauxrot
Rm.g. = 0,5Ponceau red
Rm.g. = 0.5
saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)acidic gel with 6-m urea (pH value 4.4)
/3-Alanin-Essigsäuie-Puffer (pH-Wert 5,0)/ 3-alanine acetic acid buffer (pH value 5.0)
Ponceauxrot Rm.g. = 0,5Ponceaux red Rm.g. = 0.5
9. Wurde die Substanz der Erfindung an Testtiere (männliche Ratten) verabreicht, so wurde zusätzlich zur Senkung des Blutcalciumspiegels eine Verminderung des Phosphor- und Magnesiumgehaltes des Bluts beobachtet.9. When the substance of the invention was administered to test animals (male rats), it was additionally to lower the blood calcium level a decrease in the phosphorus and magnesium content of the blood observed.
10. Die in der Verbindung der Erfindung enthaltenen Disulfidbrücken sind nicht oxydationsbeständig und unter stark alkalischen Bedingungen instabil.10. The disulfide bridges contained in the compound of the invention are not resistant to oxidation and unstable under strongly alkaline conditions.
6565
11. Spezifische Drehung:11. Specific rotation:
[a] I3 = -20° (c = 0,4%, H2O) (123 MRC U/mg Probe)[a] I 3 = -20 ° (c = 0.4%, H 2 O) (123 MRC U / mg sample)
12. Dünnschichtchromatographie:12. Thin layer chromatography:
Probe (61 MRC U/mg). Laufmittel: n-Butanol zu Pyridin zu Wasser zu Essigsäure = 15: 10:12: Träger: Abizel® (Asahi Kasei Kogyo KabushikiSample (61 MRC U / mg). Mobile phase: n-butanol to pyridine to water to acetic acid = 15: 10:12: Carrier: Abizel® (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki
Kaisha). Entwicklungsmittel: Daidon-Smith-Reagens. Laufstrecke: Rt = 0,48 bis 0,71.Kaisha). Developing agent: Daidon-Smith reagent. Running distance: R t = 0.48 to 0.71.
Verfahren zur Extraktion der Substanz der Erfindung 1. RohmaterialProcess for extracting the substance of the invention 1. Raw material
(a) Teil des Blutgefäßes der Vena cava des Aals, die entlang dem Oesophagus zum Herzen verläuft und an der Oesophaguswand haftet.(a) Part of the blood vessel of the eel vena cava that runs along the esophagus to the heart and adheres to the esophageal wall.
Vorzugsweise wird der Teil des Oesophagus vor und nach dem Herzen in gleicher Länge herausgeschnitten, z. B. in einer Länge von etwa 2 cm in jeder Richtung. Das so gewonnene Gewebe kann entweder direkt oder in Form eines entfetteten und getrockneten Produktes verwendet werden. Das entfettete und getrocknete Produkt kann nach bekannten Verfahren gewonnen werden. Um Spurenmengen von Metallionen, einschließlich Calciumionen, zu beseitigen, ist es wünschenswert, bei diesem Verfahren Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton zu verwenden. Zum Beispiel wird das genannte Gewebe des Aals durch längeres Eintauchen in Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton entwässert und anschließend mit Chloroform entfettet. Das entstandene Produkt wird wieder längere Zeit in AcetonPreferably, the part of the esophagus before and after the heart is cut out to the same length. z. B. in a length of about 2 cm in each direction. The tissue obtained in this way can either can be used directly or in the form of a defatted and dried product. The defatted and dried Product can be obtained by known methods. To remove trace amounts of metal ions, including calcium ions, it is desirable to use ethylenediaminetetraacetic acid in this process containing acetone to use. For example, the said tissue of the eel is made by prolonged immersion in ethylenediaminetetraacetic acid containing acetone dehydrated and then degreased with chloroform. The resulting Product is again in acetone for a long time
ίο getaucht und dann an der Luft getrocknet.ίο dipped and then allowed to air dry.
(b) Als Rohmaterial zur Extraktion können das Herz oder das Perikardmembran von Aalen direkt ohne weitere Behandlung verwendet werden. Vorzugsweise werden sie jedoch in Form eines getrockneten Produktes verwendet. Diese erhält man auf die gleiche Weise wie unter (a) angegeben.(b) As the raw material for extraction, the heart or the pericardial membrane of eels can be used directly can be used without further treatment. However, they are preferably in the form of a dried one Product used. This is obtained in the same way as indicated under (a).
Verteilung von Geweben im Aal, die den Wirkstoff enthaltenDistribution of tissues in the eel that contain the active substance
Gewebetissue
Gewicht (mg)Weight (mg)
(a) Gewebe mit der am Oesopha- 170,3
gus haftenden Vena cava(a) Tissue with the one on the esophah-170.3
gus adherent vena cava
(b) Perikardmembran 107,7
(a) + (b) 239,6(b) Pericardial membrane 107.7
(a) + (b) 239.6
Die hypokalzämische Aktivität der aus Aalen gewonnenen hormonähnlichen Substanz, d. h. der nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmte Wert der Calcitonin-Aktivität, ausgedrückt pro 1 kg Körpergewicht, wurde mit den Weiten von sekretierenden Geweben anderer Tiere verglichen, die bei D.H. Copp, CO. Parkins: »Pharathyroid Hormone and Thyrocalcitonin (Calcitonin)« Amsterdam Excerpta Media Foundation (1968), S. 78, angegeben sind. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.The hypocalcemic activity of the eel-derived hormone-like substance, i.e. H. the after Calcitonin activity value determined by the method described below, expressed per 1 kg Body weight, was compared with the widths of secreting tissues from other animals exposed to D.H. Copp, CO. Parkins: “Pharathyroid Hormone and Thyrocalcitonin (Calcitonin) "Amsterdam Excerpta Media Foundation (1968), p. 78 are. The results are given in the following table.
Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die aus dem sekretierenden Gewebe eines Aals extrahierte hormonähnliche Substanz mit hypokalzämischer Wirkung eine sehr hohe Aktivität zeigt, wenn man den erhaltenen Wert auf 1 kg Körpergewicht umrechnet. Man kann aus der Tabelle z. B. entnehmen, daß zur Gewinnung eines Wirkstoffes der Erfindung mit einerFrom this table it can be seen that those extracted from the secretory tissue of an eel are hormone-like Substance with hypocalcemic effects shows a very high activity if one uses the obtained Value converted to 1 kg body weight. One can from the table z. B. infer that for extraction an active ingredient of the invention with a
Calcitonin-Aktivität, die dem aus der Schilddrüse eines Schweines gewonnenen Thyrocalcitonin entspricht, etwa 2 bis 4 Aale ausreichen.Calcitonin activity, which corresponds to the thyrocalcitonin obtained from the thyroid of a pig, about 2 to 4 eels are sufficient.
gewichtWeight
dkg)dkg)
suwaniensis)Wild duck (pseudemys concinna
suwaniensis)
mit der am Oesophagus haftenden Vena cavawith the vena cava attached to the esophagus
Die Bestimmung der hypokalzämischen Wirkung der hormonähnlichen Substanz, die aus dem sekretierenden Gewebe von Aalen gewonnen wurde, wurde nach dem nachstehend beschriebenen VerfahrenDetermination of the hypocalcemic effect of the hormone-like substance resulting from the secreting Tissue obtained from eels was prepared according to the procedure described below
DerExtrakt der durch Behandlung eines ein SekKtionS gan enthaltenden Gewebes eines Aals in Γ ho8 monähnliche Substanz mit hy^kalz*The extract of the tissue of an eel in Γ ho 8 m on- like substance containing a section containing a section with hy ^ calc *
SSS wird mit einer 0,1 nSSS is awarded with a 0.1 n
individuelle Unterschiede bestehen. Gewebe mit der am Oesophagus haftenden Vena cava aus der Nähe des Herzens und aus der Perikardmembran von Aalen, die in Seewasser oder Salzlösung weiter gezüchtet worden waren, und von solchen, die nicht weiter gezüchtet worden waren, wurden gewonnen, und dann wurde deren Aktivität pro Einheit sekretierendes Gewebe, Körpergewicht und ProteinstickstofT bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß die Aktivität in jedem Fall auf das 2- bis 3fache angestiegen ist, was darauf zurückzuführen ist, daß die Aale in Meerwasser oder einer Salzlösung ähnlicher Zusammensetzung gehalten wurden.individual differences exist. Tissue close up with the vena cava attached to the esophagus of the heart and from the pericardial membrane of eels that have been further bred in seawater or saline and from those that had not been bred any further were won, and then became whose activity per unit of secretory tissue, body weight and protein nitrogen is determined. the Results are given in the table below. It follows that the activity in in each case has increased 2 to 3 times, which is due to the fact that the eels are in sea water or a saline solution of similar composition.
MRCMRC
mU/Protein (N), μ (Folin-Methode) mU / protein (N), μ (Folin method)
MRC MRCMRC MRC
U/Gewebe mU/mgU / tissue mU / mg
Auf die f u Wcrte The f u Wcrte
entstehen. Männlichen R^fV^tlwdevelop. Male R ^ fV ^ tlw
die^r Lösungen intramuskulär insthe ^ r solutions intramuscularly ins
gleiche Weise, wie oben an gegeben/we same way as given above to / we
des Serumcalciumspiegels »" ^^the serum calcium level »" ^^
Grund der hypol alzam.schen Aktivita^üReason of hypol alzam.schen Aktivita ^ ü
Standard werden die entsprechenden We™ k The corresponding We ™ k
monähnlichen Substanz im genannten Aa1 mon-like substance in said Aa 1
bestimmt. . · Meerwasser oderdefinitely. . · Sea water or
Die ff.^JS'Ä 'Zusammensetzung einer Salzlosung mit ahniicner künst. The ff. ^ JS'Ä 'Composition of a salt solution with ahniicne r artificial .
gezüchtet. Bdspicls^« ta^M^r^.^^^ liches Meerwasser oder Sakwaswr ve wasser bred. Bdspicls ^ «ta ^ M ^ r ^. ^^^ liches sea water or Sakwaswr ve water
Im allgemeinen können Aale sowoni ^In general, eels can do so
als auch in Süßwasser leben. Jedoch «e wasser gefangene Aale leicht, ^n«*^ wasser oder in Salzlösungen ™<'™ ^™ gebracht licher Salzkonzentration wie .^^^eerwasser werden. Es ist deshalb .vomghenj«.M ^ der zu verdünnen oder die SalzKonzci wäßrigen Salzlösung so zu waWen^d. ^e also gezüchteten Aale nicht sterben. Die AaW io as well as living in fresh water. However, "e water caught eels easy ^ n" * ^ lacked water or salt solutions ™ '' ™ ^ ™ t Licher salt concentration as shown. ^^^ eerwasser be. It is therefore .vomghenj ".M ^ to dilute the SalzKonzci or aqueous salt solution d ^ wawen. ^ e so farmed eels do not die. The AaW io
in einer wäßrigen Lösung mit einer S^n. die etwa einem Drittel b.s zwei Dr*teln °£htet werden. tration von Meerwasser entspricht. gezucMe ^in an aqueous solution with a S ^ n . which is about one third bs two Dr * stuffs ° £ htet expectant s. tration of sea water. zucMe ^
Auf diese Weise steigt die Calcitonjnλ sekretierenden Gewebe ze.twe.se an wenj. d in Meerwasser oder einer *»°"^, ^SeS- ln ähnlicher Zusammensetzung ^""Xn züchtungszeit F i g. 1 ist die Beziehung ^^e^f Wassef ver-(Tage) von Aalen .n wf *e "iSSum-Wert und dünntem Meerwasser zum f*™™™ wiedergegeben, zum osmotischen Druck des Serums w ^ ^ Sowohl der Serumcalcium-Wert als au der In this way the calcitonjnλ secreting tissue increases ze.twe.se to wenj. d in sea water or a * »°" ^, ^ SeS- ln similar composition ^ "" X n breeding period F i g. 1 is the relation ^^ e ^ f water f ver (days) of eels .n wf * e "iSSum value and thin sea water are shown for the f * ™ Bäumen , for the osmotic pressure of the serum w ^ ^ Both the serum calcium value and au der
tische Druck steigen bis ^ ^T^nachJBgp . Züchtung und beginnen dann zu' »J*™ Substanztable pressures rise to ^ ^ T ^ nachJBg p . Breeding and then begin to '' J * ™ Subs dance
gezeigt ist, steigt die Akt.v.tat ά" ™T™™angssimCr als pro Einheit des sekretierenden Gewebes lang der Serumcalcium-Wert oder der °smoUsen an und erreicht 10 bis 15 Tage^ch Zuchtu g^ ^is shown, the act.v.tat ά "™ T ™ BewegungsimC r increases as the serum calcium value or smoUsen per unit of secreting tissue and reaches 10 to 15 days ^ ch breeding ^ ^
den maximalen wert. fln*,..,c. the maximum value. fln *, .., c.
vität wieder zu fallen. d Zeitpunkt,vity to fall again. d point in time
Demgemäß ist es "^"^'imum erreicht, an dem der Calcitonin-XVert «"JJS Gewebe aus zu bestimmen, und danridas «g£j*«nde dem Aal zu ^-nnen Dje ZucMunß untef ^Accordingly, it is achieved '^' ^ 'imum on which to determine the calcitonin Xvert "" JJS tissue, and danridas "g £ j *' hands the eel ^ -nnen Dje ZucMunß untef ^
7iiir<:wiri<;c etwa 10 DIS W 1 dfc,1-' « 5,2 7iiir <: wiri <; c about 10 DIS W 1 dfc, 1 - '« 5.2
50%Meer- 6^6-9,2 29,7-53,0 7,6-11,5 wasser50% marine 6 ^ 6-9.2 29.7-53.0 7.6-11.5 water
*5 i/3Meer- 5,8-9,0 30,1-51,2 8,1-12,3* 5 i / 3 sea 5.8-9.0 30.1-51.2 8.1-12.3
wasserwater
(Züchtungszeit: 13 Tage)(Growing time: 13 days)
Da jedoch die extrahierte Flüssigkeit verschiedene Fremproteine enthält, wird die Flüssigkeit unter Anwendung
üblicher Verfahren zur Entfernung der Fremdproteine weiter gereinigt. Ein Verfahren zur
Entfernung dieser Fremproteine besteht in ihrer 35 Fällung. Hierbei werden die ausgefällten Fremdproteine
gleichzeitig mit anderen im Extrakt vorhandenen Feststoffen entfernt. Eine andere Möglichkeit
besteht darin, daß dieses Verfahren auf einen flüssigen Extrakt angewendet wird, der nach dem Entfernen der
40 Feststoffe aus dem Extrakt erhalten wird. Außerdem kann das genannte rohe Pulver diesem Reinigungsverfahren
unterzogen werden. Es kann jedes übliche Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Proteinen
herangezogen werden.
45 2. ExtraktionHowever, since the extracted liquid contains various foreign proteins, the liquid is further purified using conventional procedures to remove the foreign proteins. One method of removing these foreign proteins is to precipitate them. The precipitated foreign proteins are removed at the same time as other solids present in the extract. Another possibility is to apply this method to a liquid extract obtained after removing the solids from the extract. In addition, said raw powder can be subjected to this purification process. Any conventional method for separating and purifying proteins can be used.
45 2nd extraction
Die erwähnten Rohprodukte werden zuerst einer Extraktionsbehandlung unterzogen.The crude products mentioned are first subjected to an extraction treatment.
Als Lösungsmittel zur Extraktion können Gemische 50 aus Wasser und hydrophilen organischen Lösungsmitteln verwendet werden, z. B. Alkohole mit 1 bi; 4 C-Atomen, Aceton, Phenol, Dioxan, Pyridin, Tetra hydrofuran, Methoxyäthanol, Dimethylformamid ode Dimethylsulfoxid. Es können auch verdünnte Säuren 55 z. B. Salzsäure, Essigsäure oder Oxalsäure, ode Wasser verwendet werden.Mixtures 50 of water and hydrophilic organic solvents can be used as solvents for the extraction be used, e.g. B. alcohols with 1 bi; 4 carbon atoms, acetone, phenol, dioxane, pyridine, tetra hydrofuran, methoxyethanol, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide. It can also use diluted acids 55 z. B. hydrochloric acid, acetic acid or oxalic acid, or water can be used.
Der Wassergehalt dieser wäßrigen LösiingsmitU muß ausreichend sein, um die vorhandene hormor ähnliche Substanz (Molgewicht 3000 bis 4500) löse 60 zu können. Im allgemeinen genügen 5 bis 15 Volumer prozent Wasser, doch kann die Menge in Abhängij keit vom verwendeten Lösungsmittel variiert werde. Vorzugsweise wird cir.c 4- bis Snola«·- Harnstofflösur als Extraktionslösung verwendet. Vorzugsweise werde diese Lösungen mit Reduktionsmitteln, wie Cyste; oder Vitamin C, versetzt, um eine Oxydation währer des Extraktionsvorganges zu vermeiden. Als ein b vorzugtes, typisches Beispiel sei ein LösungsmitttThe water content of this aqueous solution with U must be sufficient to dissolve the existing hormone-like substance (molecular weight 3000 to 4500) 60 to be able to. In general, 5 to 15 percent by volume of water is sufficient, but the amount can depend on depending on the solvent used. Preferably cir.c 4 to Snola «· urea solution used as extraction solution. Preferably these solutions are made with reducing agents such as cyst; or vitamin C, added to avoid oxidation during the extraction process. As a b a preferred, typical example is a solvent
609614/-609614 / -
1010
gemisch aus 8m Harnstoff, 0,1 n-Cystein und 0,2 η-Salzsäure erwähnt.Mixture of 8m urea, 0.1 n-cysteine and 0.2 η-hydrochloric acid mentioned.
Zur Extraktion genügt es., das Rohmaterial bei normaler Temperatur in das Extraktionslösungsmittel zu geben und zu rühren.For extraction, it is sufficient to put the raw material in the extraction solvent at normal temperature to give and stir.
gewonnen. Das Material wurde 3mal durch jeweils 5stündiges Eintauchen bei 50C in 3 Liter 90 mg Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton entwässert. Das entwässerte Gewebe wurde anschließend durch dreimaliges, jeweils 2stündiges Eintauchen bei 5°C in 2 Liter Chloroform entfettet. Anschließend wurde der genannte Entwässerungsschritt unter Ver-Wendung von je 2 Liter Aceton 3mal wiederholt. Das erhaltene entfettete Material wurde an der Luftwon. The material was dehydrated by 3 times each 5stündiges immersion at 5 0 C in 3 liters of 90 mg ethylenediaminetetraacetic acid-containing acetone. The dehydrated tissue was then defatted by immersing it three times, each for 2 hours, at 5 ° C. in 2 liters of chloroform. The dehydration step mentioned was then repeated 3 times using 2 liters of acetone each time. The obtained defatted material was left in the air
3. Reinigung3. Cleaning
Der nach Abtrennung und Entfernung von aus Gewebsfragmenten des Rohmaterials stammendenThat after separation and removal of originating from tissue fragments of the raw material
Feststoffen erhaltene flüssige Extrakt wird unter ver- io getrocknet. Man erhielt 110 g trockenes Pulver,Liquid extract obtained from solids is dried under ver io. 110 g of dry powder were obtained,
mindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. HOg des so erhaltenen trockenen Pulvers wurdenevaporated under reduced pressure and freeze-dried. HOg of the dry powder thus obtained
Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt. der Extraktion unterworfen, wobei das Produkt beiA powdery crude product is obtained. subjected to extraction, with the product at
Man kann den bei der Extraktion (2) erhaltenen normaler Temperatur in 1 Liter 480 g Harnstoff undYou can get the normal temperature obtained in the extraction (2) in 1 liter of 480 g of urea and
Extrakt auch wie folgt reinigen: 17,5 g Cystein enthaltende 0,2 η-Salzsäure gegebenAlso clean the extract as follows: Add 17.5 g of cysteine containing 0.2 η-hydrochloric acid
a) Die verschiedenen Fremdproteine werden durch 15 und 2 Stunden gerührt wurde. Der entstandene flüssigea) The various foreign proteins are stirred for 15 and 2 hours. The resulting liquid
il Ek d i i i Gih Atonil Ek d i i i Gih Aton
Extrakt wurde mit 2 Liter eines Gemisches aus Aceton und Essigsäure (1 : 1) und außerdem mit einem Gemisch aus 28 ml 1 molarer Kochsalzlösung und 3 Liter Aceton versetzt und zur Ausfällung der Fremdproteine gründlich gerührt. Sodann wurden die Fremdproteine 15 Minuten bei 9000 U/Min, abzentrifugiert. Die überstehende, klare Flüssigkeit wurde mit 5 Liter peroxydfreiem Äther versetzt und gründlich gerührt, wobei ein Niederschlag aus Proteinen niedrigerenExtract was made with 2 liters of a mixture of acetone and acetic acid (1: 1) and also with a mixture of 28 ml of 1 molar saline solution and 3 liters of acetone are added and the foreign proteins are precipitated thoroughly stirred. The foreign proteins were then centrifuged off at 9000 rpm for 15 minutes. The supernatant, clear liquid was mixed with 5 liters of peroxide-free ether and stirred thoroughly, being a precipitate of proteins lower
) p) p
Zusatz von hydrophilen organischen Lösungsmitteln, z. B. Alkoholen mit 1 bis 4 C-Atomen, Aceton, Phenol, Dioxan, Pyridin, Tetrahydrofuran, Methoxyäthanol. Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, aus dem Extrakt ausgefällt.Addition of hydrophilic organic solvents, e.g. B. alcohols with 1 to 4 carbon atoms, acetone, phenol, Dioxane, pyridine, tetrahydrofuran, methoxyethanol. Dimethylformamide or dimethyl sulfoxide, from which Precipitated extract.
b) Lösliche anorganische Salze, z. B. Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, können dem flüssigen Extrakt zugesetzt werden.b) Soluble inorganic salts, e.g. B. sodium chloride or ammonium sulfate, the liquid Extract can be added.
c) Durch Zugabe von Trichloressigsäure oder Per- gc) By adding trichloroacetic acid or Per- g
chlorsäure zum flüssigen Extrakt wird ein Nieder- 25 Molekulargewichts auftrat, der hauptsächlich aus der schlag erhalten, der hauptsächlich aus der gewünschten gewünschten wirksamen Substanz bestand. Der Niederwirksamen Substanz besteht. Wird der Niederschlag schlag wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei in Wasser dispergiert, so löst sich der wirksame Be- 9000 U/Min, gewonnen. Er wurde 2mal mit 400 ml standteil in Wasser. Durch Entfernen des unlöslichen eines Gemisches aus Äther und Aceton (1:1) geRückstandes kann die Reinheit des wirksamen Be- 3° waschen und dann in 1 Liter 1,75 g Cystein enthaltenstandteils auf das 2- bis 5fache des vorhergehenden der 20prozentiger Essigsäure gelöst. Diese Lösung Reinheitsgrades verbessert werden. Ist der pH-Wert wurde mit 50 g Kochsalz versetzt. Die Endkonzendes Wassers zu niedrig, so werden verschiedene Fremd- tration betrug somit 5 %. Die Lösung wurde zur Ausproteine in unerwünschter Weise in Lösung gebracht. fällung von Verunreinigungen gründlich gerührt und Bei zu hohem pH-Wert werden die im wirksamen 35 der Niederschlag durch 15minütiges Zentrifugierenchloric acid to the liquid extract will have a low molecular weight, mainly from the hit which consisted primarily of the desired desired active substance. The low-impact substance consists. If the precipitate was hit by centrifugation for 15 minutes When dispersed in water, the effective speed dissolves. 9000 rpm, gained. He was twice with 400 ml component in water. By removing the insoluble residue of a mixture of ether and acetone (1: 1) can wash the purity of the effective 3 ° and then contain 1.75 g of cysteine constituent in 1 liter dissolved to 2 to 5 times the previous 20 percent acetic acid. This solution Degree of purity can be improved. If the pH value was added 50 g of common salt. The final concentration Water too low, so different foreign tration was thus 5%. The solution became Ausproteins brought into solution in an undesirable manner. Precipitation of impurities thoroughly stirred and If the pH value is too high, the precipitates in the effective 35 are removed by centrifuging for 15 minutes
fi bifi bi
Bestandteil vorhandenen Disulfidbrücken aufgespalten. Der pH-Wert des Wassers wird deshalb am besten auf 5,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,0, eingestellt, um eine Entfernung der verschiedenen Fremdproteine zu erreichen. Part of the existing disulfide bridges split. The pH of the water is therefore best adjusted to 5.0 to 7.0, preferably 6.0, to a To achieve removal of the various foreign proteins.
Die Entfernung der Fremdproteine aus der rohen. wirksamen Substanz kann durch Gelfiltration unter Verwendung von Polyacrylamidgelen oder durch Tonenaustauschchromatographie unter VerwendungThe removal of the foreign proteins from the raw. active substance can be taken by gel filtration Using polyacrylamide gels or by using ion exchange chromatography
g
bei 9000 U/Min, entfernt.G
at 9000 rpm.
Die überstehende, klare Flüssigkeit wurde mit 170 ml 45%iger Trichloressigsäure versetzt. Die Endkonzentration betrug somit 7,5%. Dabei begann die gewünschte wirksame Substanz auszufallen. Dei Niederschlag wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei 9000 U/Min, gewonnen, mit 200 ml Äther gewaschen und in 500 ml 0,02 η-Salzsäure gelöst. Die den gewünschten Wirkstoff enthaltende salz-170 ml of 45% strength trichloroacetic acid were added to the supernatant, clear liquid. The final concentration was thus 7.5%. The desired active substance began to precipitate. Dei Precipitate was collected by centrifugation at 9,000 rpm for 15 minutes, washed with 200 ml of ether and dissolved in 500 ml of 0.02 η hydrochloric acid. The salt containing the desired active ingredient
h lh l
g g ghten Wirkstoff enapproved active ingredients
von Ionenaustauschern auf Basis von vernetzten Dex- 45 saure Lösung wurde auf eine mit Austauscherharz aul tränen mit funktionalen ionischen Gruppen erreicht Basis eines vernetzten Polystyrolgerüsts mit Trialkyl· werden. Als Ionenaustauscher können auch Carboxy- ammoniumendgruppen beschickte Säule (2 χ 30 cm' methyl-Cellulose oder Diäthylaminoäthyl-Cellulose gegeben. Die Säule hatte eine Durchflußgeschwindig verwendet werden. keit von 150 ml/Stunde. An diesem Ionenaustauscherof ion exchangers based on crosslinked Dex-45 acidic solution was based on an exchange resin aul tears with functional ionic groups achieved the basis of a cross-linked polystyrene framework with trialkyl will. Columns loaded with carboxyammonium end groups (2 χ 30 cm ' methyl cellulose or diethylaminoethyl cellulose. The column had a flow rate be used. speed of 150 ml / hour. On this ion exchanger
Die nach dem Entfernen der verschiedenen Fremd- 50 harz wurden die verschiedenen, in der Lösung enthal proteine erhaltene Flüssigkeit enthält Salze. Sie wird tenen Salze absorbiert. Schließlich wurde die Säul< daher üblicherweise unter Verwendung von Ionen- iAfter removing the various foreign resins, the various substances contained in the solution were found protein obtained liquid contains salts. It is absorbed by ten salts. Finally the column became therefore usually using ionic i
austauscherharzen oder nach anderen üblichen Verfahren entsalzt. Die so behandelte Flüssigkeit wird eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält ein Pulver, das hauptsächlich aus der gewünschten aktiven Substanz besteht. Die nach diesem Verfahren erhaltene Substanz kann weiter gereinigt werden, z. B. durch Gelfiltration, Elektrophorese, Gegenstromverteilung oder Dünnschichtchromatographie.exchange resins or other customary methods desalinated. The liquid treated in this way is evaporated and freeze-dried. One receives a Powder composed mainly of the desired active substance. The after this procedure obtained substance can be further purified, e.g. B. by gel filtration, electrophoresis, countercurrent distribution or thin layer chromatography.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Stufe AThe examples illustrate the invention. example 1 Level a
Aus 2000 Aalen der Art Anguilla japonica wurden aus dem Stück der am Oesophagus haftenden Vena cava, das in der Nähe des Herzens liegt, 505 g Gewebe2000 eels of the species Anguilla japonica became the vena attached to the esophagus cava, which is near the heart, 505 g of tissue
mit 50 ml destilliertem Wasser eluiert. Es wurde eii salzfreies, den gewünschten Wirkstoff enthaltende: Eluat erhalten. Das Eluat wurde eingedampft und ge friergetrocknet. Es wurden 800 mg einer pulver förmigen Substanz mit hypokalzämischer Wirkuni erhalten.eluted with 50 ml of distilled water. It became eii salt-free, containing the desired active ingredient: eluate obtained. The eluate was evaporated and ge freeze-dried. There were 800 mg of a powdery substance with hypocalcemic activity receive.
6060
6565
Stufe BLevel B.
Insgesamt 1.0 g pulverförmiger Substanz (6,5 MRC U/mg) aus mehreren Ansätzen der Stufe A wurden 11 100 ml eines Gemisches aus Butanoi, essigsäure uns Wasser (60:15: 25) dispergiert und durch einstündige Rühren bei 4°C extrahiert. Anschließend wurde de Extrakt mit 30 ml Butanoi, 110 ml Wasser um 3,75 ml Pyridin versetzt. Das entstandene Gemiscl wurde gerührt und anschließend stehengelassen, wöbe sich die Lösung in zwei Phasen trennte. Die oberA total of 1.0 g of powdery substance (6.5 MRC U / mg) from several batches of stage A were 11 100 ml of a mixture of butanoi, acetic acid and us Water (60:15: 25) dispersed and through one hour Stirring extracted at 4 ° C. Then the extract with 30 ml of butanoi, 110 ml of water was around 3.75 ml of pyridine are added. The resulting Gemiscl was stirred and then left to stand, wöbe the solution separated into two phases. The upper
11 1211 12
Butanolphase, in der der Hauptteil des gewünschten chrom C (Molekulargewicht 12 750) werden alsButanol phase, in which the main part of the desired chromium C (molecular weight 12,750) are called
Wirkstoffes enthalten war, wurde von der unteren Vergleichssubstanzcn verwendet. Die Molekular-Active ingredient was contained, was used by the comparison substance below. The molecular
Phase abgetrennt. Die untere Phase wurde mit 100 ml gewichte der Substanzen der Erfindung werdenPhase separated. The lower phase was weighted with 100 ml of the substances of the invention
der oberen Schicht eines Gemisches aus Butanol, durch Gelfiltration an vernetzten Dextranenthe top layer of a mixture of butanol, by gel filtration on crosslinked dextrans
Essigsäure, Wasser und Pyridin (6:1:9:0,25) ver- 5 (Sephadex® G-50) und je nach ihrer Elutionsge-Acetic acid, water and pyridine (6: 1: 9: 0.25) in 5 (Sephadex® G-50) and depending on their elution
setzt. Das Gemisch wurde umgerührt und stehen- schwindigkeit bestimmt.puts. The mixture was stirred and the standing speed was determined.
gelassen. Das Gemisch trennte sich in zwei Phasen. Diecalmly. The mixture separated into two phases. the
obere Butanolphase wurde abgetrennt. Die untere 4- farbreaktion:the upper butanol phase was separated off. The lower 4- color reaction:
Phase wurde weitere dreimal nach dem vorgenannten Ninhydrinreaktion, Sakaguchi-Reaktion, Diazo-Phase was further three times after the aforementioned ninhydrin reaction, Sakaguchi reaction, diazo
Verfahren behandelt. Die so abgetrennten oberen 10 reaktion und Rydon-Smith-Reaktion positiv.Procedures dealt with. The upper 10 reaction separated in this way and Rydon-Smith reaction positive.
Phasen wurden vereinigt und unter vermindertem 5 Die Substanzen werden durch proteolytischePhases were combined and reduced 5 The substances are proteolytic by
Druck eingedampft. Das eingedampfte Produkt wurde Enzyme, wie Subtilopeptidase A und Chymo-Pressure evaporated. The evaporated product became enzymes such as subtilopeptidase A and chymo-
mit Äther gewaschen und dann in 25 ml Wasser gelöst. trypsin, inaktiviert.washed with ether and then dissolved in 25 ml of water. trypsin, inactivated.
Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Man erhielt _. .. . . . . .The solution was freeze dried. One received _. ... . . . .
105 mg eines Pulvers. 15 Bedingungen der Inaktivierung:105 mg of a powder. 15 conditions of inactivation:
Anschließend wurden 105 mg des so erhaltenen Die Substanzen der Erfindung werden in 0,01-mThen 105 mg of the thus obtained substances of the invention are in 0.01-m
Pulvers in 5 ml 0,2-m Ammoniumacetatlösung vom Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 2 Stunden bei 37° CPowder in 5 ml of 0.2 M ammonium acetate solution of phosphate buffer with pH 6.8 for 2 hours at 37 ° C
pH-Wert 4,7 gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit mit dem Enzym in einem Gewichtsverhältnis von 1: 50Dissolved pH 4.7. The solution was made one with the enzyme in a weight ratio of 1:50
einem Ionenaustauscher auf Basis vernetztes Dextrane umgesetzt,implemented by an ion exchanger based on cross-linked dextrans,
beschickte Säule (2,0 χ 80 cm), die mit 0,2-m Ammo- 20 , . .loaded column (2.0 χ 80 cm), which with 0.2-m Ammo-20,. .
niumacetatlösung vom pH-Wert 4,7 äquilibriert wor- 6· Aminosaurenzusammensetzung:nium acetate solution with a pH of 4.7 equilibrated. 6 · Amino acid composition:
den war, aufgesetzt und mit einer Geschwindigkeit Eine Probe von 150 μg wird 24 Stunden bei 1100Cthat was, put on and at a speed. A sample of 150 μg is stored at 110 ° C. for 24 hours
von 12 ml/Stunde mit dem genannten Puffer eluiert. mit 6 η-Salzsäure hydrolysiert.of 12 ml / hour eluted with the said buffer. hydrolyzed with 6η-hydrochloric acid.
Das entstandene Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml . . ...The resulting eluate was in fractions of 4 ml. . ...
, , · 1 ■ 1 »1 -j Aminosäure μΜοι,, · 1 · 1 »1 -j amino acid μΜοι
gesammelt. Die biologische Aktivität einer jeden 45 . JI - , collected. The biological activity of every 45 JI - ,
Fraktion wurde an Ratten bestimmt. Es stellte sich u-^a- λ nniiFraction was determined on rats. It turned out u- ^ a- λ nnii
heraus, daß der gewünschte Wirkstoff mit den Frak- Histidin u.uwifound out that the desired active ingredient with the frak-histidine u.uwi
tionen Nr. 65 bis 85 eluiert wurde. Deshalb wurden Arginin U,Ui3öNo. 65 to 85 was eluted. Therefore arginine U, Ui3ö
diese Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Asparaginsäure U.UöJSthese fractions combined and reduced under reduced aspartic acid U.UöJS
Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhielt 30 inreonm η n,alPressure evaporated and freeze-dried. One received 30 inreonm η n, al
24 mg (98 MRC U/mg) pulverförmigen Wirkstoff. cTuLunsäure''.'.".'.".'.'. \'.'.'.'. \'.'.'.'.'. 0,07«24 mg (98 MRC U / mg) powdered active ingredient. cTuLunic acid ''. '. ".'.". '.'. \ '.'. '.'. \ '. '. '.'. '. 0.07 «
Stufe C Prolin 0,0207Grade C proline 0.0207
Anschließend wurden 24 mg des Pulvers in 1 ml GIyc!n Then 24 mg of the powder in 1 ml of GIyc ! n
0,01-m Ammoniumformiatlösung vom pH-Wert 4,37 35 ™a^"n \ 0.01 m ammonium formate solution, pH 4.37 35 ™ a ^ " n \
gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit Carboxymethyl- MaiDcystin solved. The solution was diluted with carboxymethyl-MaiDcystin
cellulose (CMC) beschickte Säule (l,0x 5,0 cm) ge- 7™?.· ·: ;cellulose (CMC) loaded column (1.0 x 5.0 cm) ge 7 ™?. · ·: ;
geben und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von Metnionin η rmogive and with a flow rate of metnionine η rmo
4,5 ml/Stunde schrittweise mit 70 ml 0,01 m Ammo- Isoleucin U1UJIi4.5 ml / hour gradually with 70 ml of 0.01 M Ammo-Isoleucine U 1 UJIi
niumformiatlösung vom pH-Wert 4,37, 60 ml 0,01- 40 i:eucnl sodium formate solution of pH 4.37, 60 ml 0.01-40 i: eucnl
bis 0,2-m Ammoniumformiatlösung, 30 ml 0,2-m Am- i,^?!'' "■ to 0.2 M ammonium formate solution, 30 ml 0.2 M Am- i, ^ ?! '' "■
moniumformiatlösung und 40 ml 2,0-m Ammonium- !Phenylalanin monium formate solution and 40 ml of 2.0 M ammonium! phenylalanine
foirniatlösung eluiert. Das erhaltene Eluat wurde in ' ryptopnan ) (bpuren)foirniat solution eluted. The eluate obtained was in 'ryptopnan) (bpuren)
Fraktionen von je 2 ml gesammelt. Die Fraktionen *) Hydrolyse mit einer 4-m Ba(OH)j-Lösung 50 Stunden beiFractions of 2 ml each collected. The fractions *) hydrolysis with a 4-m Ba (OH) j solution for 50 hours
Nr. 50 bis 65, in denen die Substanz mit Calcitonin- 45 110°C in eincm geschlossenen Röhrchen. Wirkung eluiert wurde, wie durch Bestimmung derNo. 50 to 65, in which the substance with calcitonin- 45 110 ° C in a closed tube. Effect was eluted as determined by the
biologischen Aktivität der einzelnen Fraktionen fest- '■ =>pezinscne urehung:biological activity of the individual fractions fixed- '■ => pezinscne urehung:
gestellt wurde, wurden vereinigt. Die vereinigten [«] ? = — 20° (c = 0,4% H1O). Fraktionen wurden unter vermindertem Druck einge-were put together. The United ["] ? = - 20 ° (c = 0.4% H 1 O). Fractions were concentrated under reduced pressure.
dampft und dann gefriergetrocknet. Es wurden 12 mg 50 8· Uisk-blektrophorese:steamed and then freeze-dried. There were 12 mg 50 8 Uisk blectrophoresis:
(220 MRC U/mg) eines hormonähnlichen Wirkstoffes Probe: 150 μ-g; Bedingungen: 6 mA 40 und 80 MiinPulverform erhalten, nuten; Gel: saures Gel mit 6-m Harnstoff: _. ._. , , ,. „ , . . Laufpuffer: ß-Alanin-Essigsäurepuffer; Anfärbe Die Eigenschaften dieser Substanz sind: mittel:Ponceauxrot;Laufstrecke: Rw.^gron = 0,f(220 MRC U / mg) of a hormone-like active ingredient Sample: 150 μ-g; Conditions: 6 mA 40 and 80 ml powder form obtained, groove; Gel: acidic gel with 6-m urea: _. ._. ,,,. ",. . Running buffer: .beta.-alanine-acetic acid buffer; Coloring The properties of this substance are: medium: Ponceau red; running distance: Rw. ^ Gron = 0, f
1. Weißes Pulver. 55 Λ -.- , - , ι u·1. White powder. 55 Λ -.-, -, ι u
9. Dunnschichtchromatographie:9. Thin layer chromatography:
2. Löslichkeit: Laufmittel: n-Butanol zu Pyridin zu Wasser z\ Löslich in Wasser, aber unlöslich in verschiedenen Essigsäure = 15:10:12: 3; Träger: Abize organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Hexan (Asahi Kassi Kogyo Kabushiki Kaisha); Ent und Tetrachlorhohlenstoff. 60 wicklungsmittel: Rydon-Smith-Reagens; Lauf2. Solubility: Mobile phase: n-butanol to pyridine to water z \ Soluble in water, but insoluble in various acetic acids = 15:10:12: 3; Carrier: Abize organic solvents such as benzene, hexane (Asahi Kassi Kogyo Kabushiki Kaisha); Ent and carbon tetrachloride. 60 winding agents: Rydon-Smith reagent; Run
. , strecke: Rt = 0,46 bis 0,71.. , stretch: Rt = 0.46 to 0.71.
■>. MoieKuiargcwiCiii: ■>. MoieKuiargcwiCiii:
4000 bis 4500. B e i s ρ i e 1 24000 to 4500. B e i s ρ i e 1 2
_ . ,. 1000 Aale der Art Anguillajaponica wurden 12 Tag_. ,. 1000 eels of the species Anguillajaponica became 12 days
Bestimmungsverfahren: 65 bei ^o c in künstlich hergestelltem Meerwasser miDetermination method: 65 at ^ o c in artificially produced sea water mi
Cobalamin (Molekulargewicht 1355), Glucagon einer Meerwasserkonzentration von 50% (Vant HoffCobalamin (molecular weight 1355), glucagon with a seawater concentration of 50% (Vant Hoff
(Molekulargewicht 3485), Thyrocalcitomin vom künstliches Meerwasser) gehalten. Anschließend wurd(Molecular weight 3485), thyrocalcitomin from artificial sea water). Then became
Schwein (Molekulargewicht 3600) und Cyto- das Vena-cava-Gewebe am Oesophagus in der NähPig (molecular weight 3600) and cyto- the vena cava tissue on the esophagus in the vicinity
des Herzens und die Perikardmembran entfernt. Das so gewonnene Rohmaterial wurde zweimal entwässert. Dabei wurde es 5 Stunden bei 5°C in 1500 ml. 30 mg Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton getaucht. Anschließend wurde das entwässerte Produkt zweimal entfettet, wobei es 2 Stunden bei 5°C in 1200 ml Chloroform getaucht wurde. Dann wurde weitere zweimal unter den gleichen Bedingungen, aber unter Verwendung von 1200 ml Aceton entwässert. Das entwässerte Produkt wurde an der Luft getrocknet. Es entstanden 75 g (Aktivität: 235 MRC U/mg) getrocknetes Produkt. 75 g getrocknetes Produkt wurden durch Dispergieren in einem Gemisch aus 225 ml Butanol, 150 ml Pyridin, 45 ml Essigsäure und 180 ml Wasser unter Rühren 24 Stunden bei 500C extrahiert.of the heart and the pericardial membrane removed. The raw material thus obtained was dehydrated twice. It was immersed for 5 hours at 5 ° C. in 1500 ml. Acetone containing 30 mg of ethylenediaminetetraacetic acid. The dehydrated product was then defatted twice by immersing it in 1200 ml of chloroform at 5 ° C. for 2 hours. Dehydration was then carried out twice more under the same conditions but using 1200 ml of acetone. The dehydrated product was air dried. 75 g (activity: 235 MRC U / mg) of dried product were obtained. 75 g of dried product were extracted by dispersing in a mixture of 225 ml of butanol, 150 ml of pyridine, 45 ml of acetic acid and 180 ml of water with stirring at 50 ° C. for 24 hours.
Das erhaltene Gemisch wurde durch Gaze und Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 500C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in 200 ml Wasser aufgenommen und zur Entfernung der unlöslichen Bestandteile 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Der klare Überstand wurde gefriergetrocknet. Es wurden 400 mg pulverförmiger Wirkstoff (9 MRC U/mg) erhalten.The resulting mixture was filtered through cheesecloth and filter paper. The filtrate was concentrated at 50 ° C. under reduced pressure. The residue obtained was taken up in 200 ml of water and centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to remove the insoluble constituents. The clear supernatant was freeze-dried. 400 mg of powdered active ingredient (9 MRC U / mg) were obtained.
400 mg des oben hergestellten Wirkstoffes wurden in 50 ml 0,2 n-Ammoniumazetatlösung (pH 4,7) gelöst. Diese Lösung wurde auf eine mit der genannten Ammoniumazetatlösung gepufferte Säule (7,5 X 90 cm) mit vernetztem Dextran (Sephadex G-75) gegeben. Die Elution wird mit der genannten Ammoniumazetatlösung bsi einer Geschwindigkeit von 127,5 ml/Stunde durchgeführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 ml gesammelt.400 mg of the active ingredient prepared above were dissolved in 50 ml of 0.2 N ammonium acetate solution (pH 4.7). This solution was applied to a column (7.5 x 90 cm) buffered with the ammonium acetate solution mentioned. given with crosslinked dextran (Sephadex G-75). The elution is carried out with the aforementioned ammonium acetate solution carried out at a rate of 127.5 ml / hour. The eluate was in fractions of each 15 ml collected.
Die biologische Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde an Ratten bestimmt. Die Fraktionen Nr. 205 bis 225 wiesen eine hohe Aktivität bezüglich der Senkung des Serumkalziumspiegels auf. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Es wurden 12 mg (160 MRC U/mg) des Wirkstoffes erhalten. 'The biological activity of the individual fractions was determined on rats. The parliamentary groups No. 205 to 225 showed high activity in lowering serum calcium levels. These factions were combined and freeze-dried. 12 mg (160 MRC U / mg) of the active ingredient were obtained. '
Die Eigenschaften der erhaltenen Substanz sind die gleichen wie im Beispiel 1 unter den Punkten 1 bis 5 und 7 bis 9, jedoch wurden unter Punkt 6 die folgenden Mengen an Aminosäuren gefunden:The properties of the substance obtained are the same as in Example 1 under items 1 to 5 and 7 to 9, but the following amounts of amino acids were found under point 6:
45 Aminosäure μΜοΙΙ/mg45 amino acid μΜοΙΙ / mg
Lysin 6,97Lysine 6.97
Histidin 1,62Histidine 1.62
Arginin 5,35Arginine 5.35
Asparaginsäure 6,74Aspartic acid 6.74
Threonin 3,96Threonine 3.96
Serin 5,58Serine 5.58
Glutaminsäure 8,60Glutamic acid 8.60
Prolin 17,20Proline 17.20
Glycin 23,20Glycine 23.20
Alanin 11,10Alanine 11.10
Halbcystin 0,46Half cystine 0.46
Valin 4,42Valine 4.42
Methionin (Spuren)Methionine (trace)
Isoleucin 4,20Isoleucine 4.20
■ Leucin 6,32■ Leucine 6.32
Tyrosin 0,69Tyrosine 0.69
Phenylalanin 2,32Phenylalanine 2.32
Tryptophan*) (Spuren)Tryptophan *) (traces)
*) Hydrolyse mit einer 4-m Ba(OH),-Lösung 50 Stunden bei 6s 110°C in einem geschlossenen Röhrchen.*) Hydrolysis with a 4-m Ba (OH), solution for 50 hours at 6s 110 ° C in a closed tube.
Aus etwa 1000 Aalen (Anguilla anguilla) wurden aus dem Stück der am Oesophagus haftenden Vena cava, das in der Nähe des Herzens und des Endocardiums liegt, Gewebestücke herausgeschnitten. Das derart erhaltene Rohmaterial wurde den gleichen Emfettungs- und Entwässerungsstufen wie im Beispiel 1 angegeben unterworfen. Man erhielt 75 g trockenes Pulver.About 1000 eels (Anguilla anguilla) became the vena attached to the esophagus cava, which is near the heart and endocardium, cut out pieces of tissue. The The raw material thus obtained was subjected to the same degreasing and dehydration steps as in Example 1 specified subject. 75 g of dry powder were obtained.
Das derart erhaltene trockene Pulver wurde in 750 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Butanol-Essigsäure-Wasser im Verhältnis 5:1:2 dispergiert. Durch 24stündiges Rühren bei 50° C wurde der Wirkstoff extrahiert. Das erhaltene Gemisch wurde durch Gaze und Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 50"C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde zweimal mit je 50 ml Aceton und dreimal mit je 50 ml Chloroform gewaschen und dann in 75 ml 2 η-Salzsäure gelöst. Zur Abtrennung von Feststoffen wurde die Lösung 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 36 g Harnstoff versetzt und dann auf eine Säule (7,5 χ 90 cm) mit vernetztem Dextran (Sephadex G-75) gegeben und mit einer 0,1-m wäßrigen Ameisensäurelösung behandelt. Die Elution wurde mit der genannten Ameisensäurelösung bei einer Geschwindigkeit von 127,5 ml/Stunde durchgeführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 ml gesammelt.The dry powder thus obtained was dissolved in 750 ml of a mixed solvent of butanol-acetic acid-water dispersed in a ratio of 5: 1: 2. By stirring for 24 hours at 50 ° C, the active ingredient extracted. The resulting mixture was filtered through cheesecloth and filter paper. The filtrate was concentrated under reduced pressure at 50 ° C. The residue obtained was twice with 50 ml Acetone and washed three times with 50 ml of chloroform each time and then dissolved in 75 ml of 2η hydrochloric acid. To the To separate solids, the solution was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes. The supernatant 36 g of urea were added and then a column (7.5 × 90 cm) with crosslinked dextran (Sephadex G-75) and treated with a 0.1 M aqueous formic acid solution. The elution was carried out with the said formic acid solution is carried out at a rate of 127.5 ml / hour. The eluate was collected in fractions of 15 ml each.
Die biologische Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde an Ratten bestimmt. Die Fraktionen Nr. 205 bis 223 wiesen eine hohe Aktivität bezüglich der Senkung des Serumkalziumspiegels auf. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Es wurden 75 mg (60 MRC U/mg) des Wirkstoffes erhalten.The biological activity of the individual fractions was determined on rats. The parliamentary groups No. 205 through 223 showed high activity in lowering serum calcium levels. These factions were combined and freeze-dried. 75 mg (60 MRC U / mg) of the active ingredient were obtained.
Die Eigenschaften der erhaltenen Substanzen sind die gleichen wie im Beispiel 1 unter den Punkten 1 bis 5 und 7 bis 9, jedoch wurden unter Punkt 6 die folgenden Mengen an Aminosäuren gefunden:The properties of the substances obtained are the same as in Example 1 under items 1 to 5 and 7 to 9, but the following amounts of amino acids were found under point 6:
Aminosäureamino acid
μΜοΙ/mgμΜοΙ / mg
Lysin 5,18Lysine 5.18
Histidin 1,05Histidine 1.05
Arginin 6,60Arginine 6.60
Asparaginsäure 4,77Aspartic acid 4.77
Threonin 4,10Threonine 4.10
Serin 4,67Serine 4.67
Glutaminsäure 6,70Glutamic acid 6.70
Prolin 14,50Proline 14.50
Glycin 26,30Glycine 26.30
Alanin 12.60Alanine 12.60
Halbcystin 0^45Half-cystine 0 ^ 45
Valin 3,84Valine 3.84
Methionin (Spuren)Methionine (trace)
Isoleucin 2,15Isoleucine 2.15
Leucin 5,20Leucine 5.20
Tyrosin 0,50Tyrosine 0.50
Phenylalanin 1,66Phenylalanine 1.66
Tryptophan*) (Spuren)Tryptophan *) (traces)
*) Hydrolyse mit einer Ba(OH)2-Lösung 50 Stunden bei 1100C in einem geschlossenen Röhrchen.*) Hydrolysis with a Ba (OH) 2 solution for 50 hours at 110 ° C. in a closed tube.
Hierzu 3 Blatt ZeichnungenFor this purpose 3 sheets of drawings
Claims (3)
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1976270 | 1970-03-10 | ||
| JP1976270 | 1970-03-10 | ||
| JP8167770 | 1970-09-19 | ||
| JP8167770 | 1970-09-19 | ||
| JP12444470 | 1970-12-28 | ||
| JP12444470 | 1970-12-28 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2111518A1 DE2111518A1 (en) | 1971-10-14 |
| DE2111518B2 DE2111518B2 (en) | 1975-08-21 |
| DE2111518C3 true DE2111518C3 (en) | 1976-04-01 |
Family
ID=
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