DE2057401C3 - Process for the isolation of native, highly purified plasminogen - Google Patents
Process for the isolation of native, highly purified plasminogenInfo
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Description
Es sind bereits Verfahren bekannt, mit denen man Plasminogen durch Alkoholfäilung des Serums und Extraktion des Niederschlages mit Mineralsäuren isolieren kann. Dabei isi mich schon die Chromatographie an Carboxymethylcellulose als Verfahrensschritt angewandt worden. Diese Verfahren sind jedoch zeitraubend, umständlich und teuer. Wegen der schlechten Ausbeulen sind sie für eine gewerbliche Anwendung ungeeignet.There are already methods known, with which one plasminogen by alcohol precipitation of the serum and Can isolate extraction of the precipitate with mineral acids. Chromatography is also important to me has been applied to carboxymethyl cellulose as a process step. However, these procedures are time consuming, cumbersome and expensive. Because of the bad bulging they are for commercial use Usage unsuitable.
Es ist auch schon bekannt, daß (--Aminocapronsäure, p-Aminoinet hy!benzoesäure und 4-Aminome thy !-cyclohexancarbonsäuren 1) eine antifibrinolytischc Aktivität besitzen, weil sie die Aktivierung des Plasminogens durch Streptokinase oder Urokinase hemmen.It is also already known that (- aminocaproic acid, p-aminoinet hy! Benzoic acid and 4-aminomethy! -Cyclohexanecarboxylic acids 1) have antifibrinolytic activity because they activate plasminogen inhibit by streptokinase or urokinase.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Verfahren zur Isolierung von nativem hochgcreinigtem Plasminogen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Plasminogen aus Plasma oder Serum oder einer Plasminogen enthaltenden Plasma- oder Serumfraktion an einen wasserunlöslichen Träger, der eine Aminocarbonsäure mit einer in ε-Stellung zur Carboxylgruppe befindlichen Aminogruppe kovalent gewunden enthält, absorbiert, unspezifische Begleitproteine durch Wasehen mit einer wäßrigen Pufferlösung vom pH 5,5 bis 6,5 und einer Molarität von 0,05 bis 0,15 entfernt, anschließend das Plasminogen mit einer Pufferlösung vom pH-Wert 2,0 bis 3,5 oder 9,0 bis 10,2 und einer Molarität von 0,05 bis 0,15, welche außerdem eine Aminocarbonsäure der oben beschriebenen Art in einer Molarität von 0,05 bis 0,1 enthält, elutiert und danach gegebenenfalls durch Ausfällen mit Animoniumsulf.u anreichert, anschließend in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Dialysieren entsalzt und lyophil trocknet.The present application relates to a process for the isolation of native, highly purified Plasminogen, which is characterized in that one plasminogen from plasma or serum or a Plasminogen-containing plasma or serum fraction to a water-insoluble carrier, which is an aminocarboxylic acid contains covalently wound with an amino group in ε-position to the carboxyl group, absorbed, unspecific accompanying proteins by washing with an aqueous buffer solution from pH 5.5 to 6.5 and a molarity of 0.05 to 0.15 removed, then the plasminogen with a buffer solution from pH 2.0 to 3.5 or 9.0 to 10.2 and a molarity of 0.05 to 0.15, which also has a Aminocarboxylic acid of the type described above in a molarity of 0.05 to 0.1, eluted and then possibly by precipitation with ammonium sulf.u enriched, then in a manner known per se, for example desalinated by dialysis and lyophil-dried.
Als Ausgangsmaierial für das Plasminogen dient Plasma, Serum oder eine Plasminogen enihaiiende Plasma- oder Serumfraktion menschlichen oder tierischen Ursprungs.Plasma, serum or a plasminogen is used as the starting material for the plasminogen Plasma or serum fraction of human or animal origin.
Als wasserunlöslichen Träger verwendet man ein Knpolymerisat aus Styrol oder Äthylen oder Butylen oder vorzugsweise Propylen und Maleinsäureanhydrid im Verhältnis 1 :1. welches in Gegenwart einer Aminocarbonsäure mit einem aliphaischen oder aromatischen Diamin, beispielsweise Pentamethylendiamin. Hexamethylendiamin oder o-Phenyldiamin, quervernetzt ist. Im Falle des Styrols kann mit Divinylbenzol vernetzt werden. .A polymer made of styrene or ethylene or butylene is used as the water-insoluble carrier or preferably propylene and maleic anhydride in a ratio of 1: 1. which in the presence of a Aminocarboxylic acid with an aliphatic or aromatic Diamine, for example pentamethylenediamine. Hexamethylene diamine or o-phenylene diamine, cross-linked is. In the case of styrene, divinylbenzene can be used be networked. .
Die Umsetzung der Aminocarbonsäure mit dem Träger erfolgt über die Reaktion einer Aminogruppe mit jeweils einem Maleinsäureanhydridrcst, wobei eine peptidartige Bindung entsteht. Unter »Aminocarbonsäuren« sind dabei solche zu verstehen, die eine Aminogruppe in e-Stellung zur Carboxylgruppe enthalten wie dies beispielsweise bei der f-Aminocapronsaure der 4-Aminomeihyl-benzoesäure oder der 4-Aminomethyl-cyclohexancarbonsäure der Fall ist; ebenso kommen natürlich auch andere Aminocarbonsäuren in Frage bei denen der sterische Abstund zwischen de-Aminogruppe und der Carboxylgruppe ein ähnlicher ist wie bei den obengenannten. Am besten geeignet sind jedoch bei den obengenannten. Am besten geeignet sind jedoch Aminocarbonsäuren, die außer der Aminogruppe noch eine weitere reaktionsfähige Gruppe, die fur die Bindung an die als Adsorbens vorgesehene Verbindung geeignet ist beispielsweise eine Ammo- oder Hydroxylgruppe in λ-, p-. γ- oder Λ-Stellung der aliphatischen Kette bzw. in ortho- oder meta-Stellung des Ringes enthalten Dieser Fall liegt beispielsweise beim Lysin vor Ein unter Verwendung einer solchen Aminocarbonsäure hergestellter Träger enthält sowohl freie Carboxyl- als auch freie Amino- bzw. Hydroxylgruppen; die mit seiner Hilfe erzielten Ausbeuten an Plasminogen sind höher und die Spezifität ist größer.The reaction of the aminocarboxylic acid with the carrier takes place via the reaction of an amino group with a maleic anhydride moiety, a peptide-like bond being formed. “Aminocarboxylic acids” are to be understood as meaning those which contain an amino group in the e-position to the carboxyl group, as is the case, for example, with f-aminocaproic acid, 4-aminomethylbenzoic acid or 4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid; Other aminocarboxylic acids in which the steric distance between the de-amino group and the carboxyl group is similar to that of the above-mentioned are also of course also suitable. Most suitable, however, are the above. Most suitable, however, are aminocarboxylic acids which, in addition to the amino group, have a further reactive group which is suitable for binding to the compound intended as an adsorbent, for example an ammo or hydroxyl group in λ-, p-. γ- or Λ-position of the aliphatic chain or in the ortho- or meta-position of the ring. This is the case, for example, with lysine. A carrier produced using such an aminocarboxylic acid contains both free carboxyl and free amino or hydroxyl groups; the yields of plasminogen achieved with its help are higher and the specificity is greater.
Mit Hilfe des beschriebenen wasserunlöslichen Trägers läßt sich Plasminogen aus wäßrigen Lösungen vom pH-Wert 5.0 bis 7.8 in guten Ausbeuten adsorbieren. Die Adsorption wird vorzugsweise im Batch-Verfahren durchgeführt, jedoch kommt auch das Säulenverfahren in Betracht.With the aid of the water-insoluble carrier described, plasminogen can be extracted from aqueous solutions from pH 5.0 to 7.8 adsorb in good yields. The adsorption is preferably in Batch process carried out, but the column process is also possible.
Zur Entfernung unspezil'ischer Proteine verwendet man beispielsweise Dinatriumhydrogenphosphat-citronensäurepuffer, Phosphatpuffer oder Citratpuffer.To remove unspecial proteins, for example, disodium hydrogen phosphate-citric acid buffer is used, Phosphate buffer or citrate buffer.
Als saure Eluentien für die Elution des Plasminogens eignen sich beispielsweise die Puffergemische Glycin-Salzsäure und Natriumcitrat-Salzsäure; verwendet man ein alkalisches Elutionsmittel, so kommen beispielsweise Ammoniaklösung, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanlösung oder Dinatriumhydrogenphosphatlösung in Frage. Die Molarität der Elutionsmittel liegt im allgemeinen bei 0.05 bis 0,15 und vorzugsweise bei 0,1; höhere Konzentrationen lassen sich zwar ebenfalls verwenden, doch ist dies nicht sinnvoll, da die Eluentien anschließend wieder entfernt werden müssen. Als Verdrängungsmittel enthalten die Eluentien außerdem eine der obengenannten Aminocarbonsäuren, vorzugsweise Lysin, und zwar in einer Molarität von 0,05 bis 0,1.The buffer mixtures glycine-hydrochloric acid, for example, are suitable as acidic eluents for the elution of the plasminogen and sodium citrate hydrochloric acid; if an alkaline eluent is used, for example Ammonia solution, tris (hydroxymethyl) aminomethane solution or disodium hydrogen phosphate solution in Ask. The molarity of the eluent is generally from 0.05 to 0.15 and preferably 0.1; higher concentrations can also be used, but this does not make sense because the eluents must then be removed again. The eluents also contain eluents as displacement agents one of the abovementioned aminocarboxylic acids, preferably lysine, in a molarity of 0.05 to 0.1.
Das Plasminogen enthaltende Eluat wird vor der Aufarbeitung vorteilhafter Weise einer Vorkonzentration unterzogen. Dazu stellt man es neutral und fallt das Plasminogen mit Ammonsulfat, vorzugsweise durch Dialyse gegen eine gesättigte Ammonsulfatlösung. Durch eine nachfolgende Dialyse gegen eine Salzlösung vom pH-Wert 8-9 und der Molarität 0,1 vorzugsweise Diiiairiumhydrogcnphosphatlösiing, lassen sich dip hei der Elution verwendeten Aminocarbonsäuren entfernen. Abschließend wird die so gereinigte Plasminogen lösung durch Dialyse gegen eine physiologische Lösung, beispielsweise 0,9%ige Natriumchloridlösung, Ringerlösung oder Natriumphosphatlösung, vom pH-Wert 6,5The eluate containing plasminogen is advantageously preconcentrated before work-up subjected. To do this, it is made neutral and the plasminogen with ammonium sulphate preferably falls through Dialysis against a saturated ammonium sulfate solution. Subsequent dialysis against a saline solution with a pH of 8-9 and a molarity of 0.1, preferably diiumium hydrogen phosphate solution, can be heated to dip remove the aminocarboxylic acids used in the elution. Finally, the so purified plasminogen solution by dialysis against a physiological solution, for example 0.9% sodium chloride solution, Ringer's solution or sodium phosphate solution, pH 6.5
bis 7,5 und einer Molarität von etwa 0,05 bis 0,15 auf physiologische Bedingungen eingestellt.to 7.5 and a molarity of about 0.05 to 0.15 physiological conditions set.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglich ae zeitsparende Herstellung von Plasminogen in buien Ausbeuten. Das derart gewonnene Plasminogen ist rein, wie in der Immunelektrophorese nachgewiesen wurde. Die Wirksamkeit wird in Christensen-Einhehen (Chr-E) gemessen (vgl. J. Clin. Invest. 28,1963 (1949).The inventive method allows ae time-saving production of plasminogen in b uien yields. The plasminogen obtained in this way is pure, as demonstrated by immunoelectrophoresis. The effectiveness is measured in Christensen units (Chr-E) (cf. J. Clin. Invest. 28, 1963 (1949).
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es, ausgehend von einem nicht vorgereinigten Plasminogen oder sogar von einer Plasminogen enthaltenden Plasmaoder Serumfraktion ein reines natives (d. h. unverändertes) Plasminogen zu erhallen. Die Verwendung eines vorgereinigtcn Ausgangsmaterials ist nicht erforderlich.The inventive method makes it possible, starting from a non-prepurified plasminogen or even from a plasma or serum fraction containing plasminogen a pure native (i.e. unchanged) To obtain plasminogen. The use of a pre-cleaned starting material is not necessary.
100 mg Copolymcrisat aus Propylen und Maleinsäureanhydrid werden in 0,15-m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 angeteigt und mit 0,15-m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 in einem Gesamtvolumen vom 5 ml fein suspendiert. Dann setzt man unter Rühren 10 mg Hexamethylendiamin zu, die in 1 ml des oben angegebenen Phosphatpuffers gelöst werden. Anschließend werden 5 ml einer 2,5%igen Kaliumphosphatgepufferten Lysinlösung vom pH 7,5 dazu pipettiert und der Ansatz 24 Stunden lang bei +4X gerührt. Dann wird das unlösöiche Vernetzungsproduki durch Zentrifugation gewonnen, mit physiologischer Kochsalzlösung Lysin-frei gewaschen, mit destilliertem Wasser gespült und lyophil getrocknet.100 mg copolymer of propylene and maleic anhydride are made into a paste in 0.15 m potassium phosphate buffer with a pH of 7.5 and with 0.15 m potassium phosphate buffer of pH 7.5 finely suspended in a total volume of 5 ml. Then one sets with stirring 10 mg of hexamethylenediamine, which are dissolved in 1 ml of the above-mentioned phosphate buffer. Subsequently 5 ml of a 2.5% potassium phosphate-buffered lysine solution with a pH of 7.5 are added by pipette and the batch was stirred for 24 hours at + 4X. Then the insoluble crosslinking product is removed by centrifugation obtained, washed lysine-free with physiological saline solution, with distilled water rinsed and lyophilized.
100 mg des lyophilisierten Vernetzungsproduktes werden nach Anteigen mit einigen ml Humanplasma in 70 ml Humanplasma suspendiert, der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 7,0 eingestellt und der Ansatz 30 Minuten bei 37"C gerührt. Das Adsorbens wird dann in der Zentrifuge abgeschleudert und mit 0,15 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 so lange gewaschen, bis die Waschwasser proteinfrei sind. Die Elution des Plasminogen erfolgt mit 25 ml einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanlösung vom100 mg of the lyophilized crosslinking product are mixed with a few ml of human plasma in Suspended 70 ml of human plasma, adjusted the pH to 7.0 with dilute hydrochloric acid and the batch Stirred for 30 minutes at 37 ° C. The adsorbent is then spun off in the centrifuge and with 0.15 m Sodium phosphate buffer with a pH of 6.4 washed until the wash water is free of protein. the The plasminogen is eluted with 25 ml of a 0.1-m Tris (hydroxymethyl) aminomethane solution from
pH-Wert 10,0, die 0,05 m Lysin enthält. Das Eluat wird mit normaler Salzsäure neutralisiert und unter Rühren gegen das gleiche Volumen gesättigter Amtnonsulfailösung dia'.ysiert. Die Fällung wird abzentrifugiert, in 2 —3 ml 0,1-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung aufgenommen, zweimal 12 Stunden gegen jeweils das lOOfache Volumen der gleichen Lösung und anschließend gegen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 dialysiert.pH 10.0, which contains 0.05M lysine. The eluate will Neutralized with normal hydrochloric acid and, with stirring, against the same volume of saturated Amtnonsulfail solution dia'.ysed. The precipitate is centrifuged off in 2-3 ml of 0.1 M disodium hydrogen phosphate solution added, twice for 12 hours against 100 times the volume of the same solution and then dialyzed against 0.1 M sodium phosphate buffer of pH 7.5.
Als Endprodukt erhält man 3 ml einer O,31°/oigen Plasminogenlösung mit 37 300 Christensen-Einheiten (Chr-E)/ml und 12 000 Chr-E/mg Protein. Das Ausgangsmaterial besitzt eir.sn Plasminogentiter von 4000 Chr-E/ml und 53 Chr-E/mg Protein.The end product obtained is 3 ml of a 0.31% plasminogen solution with 37,300 Christensen units (Chr-E) / ml and 12,000 Chr-E / mg protein. The starting material has a plasminogen titre of 4000 Chr-U / ml and 53 Chr-U / mg protein.
Insgesamt wird von 280 000 Chr-E/ml ausgegangen und es werden 112 000 Chr-E/ml zurückgewonnen, was einer Ausbeute von 40% entspricht.A total of 280,000 Chr-U / ml is assumed and 112,000 Chr-U / ml are recovered, what corresponds to a yield of 40%.
Aus den angegebenen Zahlen ergibt sich eine Anreicherung um den Faktor 1 :200 durch das erfindungsgemäße Verfahren. Nach der Adsorption sind im Ausgangsplasma noch 99 Chr-E/ml enthalten, das sind 2,2% des Ansgangswertes.The figures given result in an enrichment by a factor of 1: 200 through the method according to the invention. After the adsorption, the starting plasma still contains 99 Chr-U / ml, the are 2.2% of the initial value.
4 Liter Humanplasma werden mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und mit 5,7 g eines lyophilisierten, nach Beispiel I hergestellten Copolymerisates aus Propylen und Maleinsäureanhydrid, das kovalent gebundenes Lysin enthält und mit Hexamethylendiamin vernetzt wurde, 30 Minuten lang unter Rühren bei 37°C inkubiert. Das plasminogenhaltige Adsorbens wird durch Zentrifugation. abgetrennt, mit 0,15-m Natriumphosphatpuffer pH 6,4 proteinfrei gewaschen und anschließend mit 1100 ml einer 0,1-m Ammoniaklösung, die 0,05-m Lyson enthält, eluiert. Durch Neutralisation mit verdünnter Salzsäure, Konzentrieren des Eluates über eine 50% Ammonsulfatsättigung. Auflösung des Ammonsulfatrückstandes in 90 ml einer 0,1-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung, Dialysieren gegen die gleiche Lösung und anschließend gegtn 0,15-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 erhält man 100 ml einer 0,4%igen Plasminogenlösung mit 47 000 Chr-E/ml. Die Ausbeute beträgt 29%, bezogen auf 4 Liter Plasma mit einer Aktivität von 4000 E/ml. Die spezifische Aktivität des so isolierten Plasminogen beträgt 11 800 Chr-E/mg. Die Plasminogen-Aktivität des adsorbierten Plasmas beträgt 704 liters of human plasma are adjusted to a pH of 7.0 with dilute hydrochloric acid and with 5.7 g of a lyophilized copolymer prepared according to Example I from propylene and maleic anhydride, containing covalently bound lysine and crosslinked with hexamethylenediamine for 30 minutes incubated with stirring at 37 ° C. The plasminogen-containing adsorbent is made by centrifugation. separated, with 0.15 m sodium phosphate buffer pH 6.4 washed free of protein and then washed with 1100 ml of a 0.1 m Ammonia solution containing 0.05 m lysone elutes. By neutralization with dilute hydrochloric acid, concentration of the eluate over 50% ammonium sulfate saturation. Dissolve the ammonium sulphate residue in 90 ml a 0.1 M disodium hydrogen phosphate solution, dialyzing against the same solution and then against 0.15 m sodium phosphate buffer of pH 7.5 100 ml of a 0.4% plasminogen solution with 47,000 Chr-U / ml are obtained. The yield is 29%, based on 4 liters of plasma with an activity of 4000 U / ml. The specific activity of the so isolated Plasminogen is 11,800 Chr-U / mg. The plasminogen activity of adsorbed plasma is 70
ίο 70 Chi-E/ml.ίο 70 Chi U / ml.
70 ml Rinderplasma werden unter Rühren bei 37°C mit 100 mg des nach Beispiel 1 hergestellten Lysin-vernetzten Copolymeren 30 Minuten lang inkubiert. Das durch Zentrifugation zurückgewonnene Adsorbens wird mit 0,15-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 proteinfrei gewaschen und dann mit 25 ml einer 0,15-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung, die 0,05-m ε-Aminocapronsäure enthält, eluiert. Das Eluat wird gegen 0,1-molare Tris-Lösung und nach Entfernen der ε-Aminocapronsäure gegen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 dialysiert. Dabei werden 22 ml einer 0,l%igen Lösung gewonnen, die pro ml die dreifache Aktivität vom Rinderplasma hat, somit 94% der Aktivität des eingesetzten Rinderpiasmus enthält. Die vergleichende Aktivitälsbestimmung wurde nach optimaler Aktivierung des Plasminogen durch Urokinase, eines Plasminogenaktivators aus menschlichem Harn, an plasminogenfreiem Rinderfibrinogen durchgeführt. 70 ml of bovine plasma are crosslinked with 100 mg of the lysine prepared according to Example 1 at 37 ° C. while stirring Copolymers incubated for 30 minutes. The adsorbent recovered by centrifugation is washed protein-free with 0.15 M sodium phosphate buffer of pH 6.4 and then with 25 ml of a 0.15 M disodium hydrogen phosphate solution containing 0.05 m ε-aminocaproic acid, eluted. The eluate will against 0.1 molar Tris solution and after removal of the ε-aminocaproic acid against 0.1 M sodium phosphate buffer dialyzed from pH 7.5. This 22 ml of a 0, l% solution are obtained, which per ml of the has three times the activity of bovine plasma, thus contains 94% of the activity of the bovine plasma used. The comparative determination of activity was carried out after optimal activation of the plasminogen by urokinase, a plasminogen activator from human urine, carried out on plasminogen-free bovine fibrinogen.
100 mg eines Copolymeren, aus Propylen und Maleinsäureanhydrid im Verhältnis 1 : 1 werden in 5 ml 0,15-m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 fein suspendiert. Im Abstand von 2 Minuten werden 10 mg Hexamethylendiamin in 1 ml und 94 mg ε-Aminocapronsäure in 5 ml Kaliumphosphatpuffer dazupipettiert.100 mg of a copolymer of propylene and maleic anhydride in a ratio of 1: 1 are in 5 ml 0.15 M potassium phosphate buffer of pH 7.5 finely suspended. At an interval of 2 minutes, 10 mg Hexamethylenediamine in 1 ml and 94 mg ε-aminocaproic acid in 5 ml potassium phosphate buffer are added by pipette.
Nachdem der Ansatz 12 Stunden bei +40C gerührt wurde, wird das unlösliche Gel abzentrifugiert, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, bis es keine ungebundene ε-Aminocaptonsäure mehr enthält, anschließend mit Wasser gewaschen und lyophilisiert.After the mixture was stirred for 12 hours at +4 0 C, the insoluble gel is removed by centrifugation, washed with physiological saline solution until it no longer contains unbound ε-Aminocaptonsäure, then washed with water and lyophilized.
100 mg des lyophilisierten ε-Amtnocapronsäure-halügen Copolymeren werden mit 70 ml Humanplasma bei einem pH-Wert von 7,0 und 37°C unter Rühren 30 Minuten lang inkubiert. Das plasminogenhaltige Copolymere wird durch Zentrifugation zurückgewonnen, mit 0,15-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 proteinfrei gewaschen und das Plasminogen mit 25 ml einer 0,05-m Ammoniaklösung, die 0,05 m ε-Aminocapronsäure einhält, elüicrt. Das neutralisierte Eluat wurde durch 50% Ammonsulfat-Sättigung konzentriert und gegen 0,1-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung dialysiert. Nach Entfernung der für die Elution verwendeten (!-Aminocapronsäure wird eine weitere Dialyse gegen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom100 mg of the lyophilized ε-amnocaproic acid halide Copolymers are mixed with 70 ml of human plasma at a pH of 7.0 and 37 ° C. while stirring 30 Incubated for minutes. The plasminogen-containing copolymer is recovered by centrifugation, with 0.15 M sodium phosphate buffer pH 6.4 and the plasminogen with 25 ml a 0.05 m ammonia solution that complies with 0.05 m ε-aminocaproic acid, elüicrt. The neutralized eluate was concentrated through 50% ammonium sulfate saturation and against 0.1 M disodium hydrogen phosphate solution dialyzed. After removing the (! -Aminocaproic acid used for the elution, another Dialysis against 0.1 m sodium phosphate buffer from
pH-Wert 7,5 angeschlossen. Auf diese Weise erhält man 3,5 ml einer 0,2%igen Plasmincgcnlösung mit 12 000 Chr-E/ml bzw. 6100 Chr-E/mg Substanz. Die Ausbeute beträgt 16%, bezogen auf das Ausgangsmaterial von 70 ml mit 3800 Chr-E/ml.pH 7.5 connected. In this way, 3.5 ml of a 0.2% plasmin cgcn solution containing 12,000 are obtained Chr-E / ml or 6100 Chr-E / mg substance. The yield is 16% based on the starting material of 70 ml with 3800 Chr-U / ml.
100 mg Copolymeres aus Propylen und Maleinsäureanhydrid werden in 5 ml 0,15-m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, fein suspendiert. Anschließend werden 1 ml einer l%igen Hexamethylendiaminlösung und 2 bis 3 Minuten später 5 ml einer 2°/oigen Lösung 4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure-(l) in die Suspension eingerührt. Der Ansatz wird 12 Stunden bei +40C gerührt und das entstandene Gel durch Zemnfugation isoliert, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, bis es keine freie 4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure-(1) mehr enthält, darauf mit Wasser salzfrei gespült und lyophilisieri.100 mg of copolymer of propylene and maleic anhydride are finely suspended in 5 ml of 0.15 M potassium phosphate buffer, pH 7.5. Then 1 ml of a 1% strength hexamethylenediamine solution and 2 to 3 minutes later 5 ml of a 2% strength solution of 4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid (l) are stirred into the suspension. The batch is stirred for 12 hours at +4 0 C and the resulting gel is isolated by Zemnfugation, washed with physiological saline solution until it contains no more free 4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid (1), then rinsed salt-free with water and lyophilized.
70 m! Humanplasma werden mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,5 titriert und mit 100 mg des nach obiger Vorschrift hergestellten Adsorbens 30 Minuten lang bei 37°C unter Rühren inkubicrt. Das Adsorbens wird anschließend abzentrifugiert und mit 0,15-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6.4 gewaschen, bis im Waschwasser kein Protein mehr nachgewiesen werden kann. Dann wird das Plasminogen mit 25 ml einer 0.1-m Tris-(hydroxymeihyl)-aminomethanlösung, die 0.05-m Lysin enthält, eluiert. Das Lysin wird durch Dialyse gegen eine 0,1-m Tris-Lösung entfernt und danach die erhaltene Lösung gegen einen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5. dialssiert. Als Endprodukt erhält man 20 ml einer 0.25%igen Lösung mit 6700 Chr-E/ml. Bezogen auf das Ausgangsplasma mit 4800 Chr-E/ml beträgt die Ausbeute 134 000 Chr-E = 39%.70 m! Human plasma are diluted with hydrochloric acid titrated to a pH of 5.5 and treated with 100 mg des The adsorbent prepared according to the above instructions was incubated for 30 minutes at 37 ° C. with stirring. The Adsorbent is then centrifuged off and mixed with 0.15 M sodium phosphate buffer with a pH of 6.4 washed until no more protein can be detected in the wash water. Then the plasminogen becomes with 25 ml of a 0.1 m tris (hydroxymethyl) aminomethane solution, containing 0.05-m lysine, eluted. The lysine is dialysed against a 0.1 m Tris solution removed and then the solution obtained against a 0.1 M sodium phosphate buffer of pH 7.5. dialsed. The end product obtained is 20 ml of a 0.25% solution with 6700 Chr-U / ml. Based on the starting plasma with 4800 Chr-E / ml the yield is 134,000 Chr-E = 39%.
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DE2057401A1 DE2057401A1 (en) | 1972-05-31 |
DE2057401B2 DE2057401B2 (en) | 1977-04-21 |
DE2057401C3 true DE2057401C3 (en) | 1977-12-08 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4297344A (en) | 1979-04-25 | 1981-10-27 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Blood coagulation factors and process for their manufacture |
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US4297344A (en) | 1979-04-25 | 1981-10-27 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Blood coagulation factors and process for their manufacture |
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