DE2050714C2 - Polysaccharide with anti-tumor activity, process for its preparation and its use as an active ingredient in anti-tumor agents - Google Patents
Polysaccharide with anti-tumor activity, process for its preparation and its use as an active ingredient in anti-tumor agentsInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit Antitumoraktivität und das Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung als Wirkstoff in Antitumormitteln.The invention relates to a polysaccharide with antitumor activity and the process for its preparation and its use as an active ingredient in anti-tumor drugs.
Mit dem Begriff »Polysaccharid« wird im folgenden nicht nur das chemisch reine Polysaccharid, sondern auch das Polysaccharid- Protein (Mucopolysaccharid) bezeichnet.In the following, the term "polysaccharide" not only refers to the chemically pure polysaccharide, but also denotes the polysaccharide protein (mucopolysaccharide).
Die das Polysaccharid gemäß der Erfindung enthaltende Substanz ist aus dem Myzel von Pilzen der Familie Polyporaceae der Gattung Basidiomycetes oder aus einer Fleischbrühenkultur der zur Familie Polyporaceae gehörenden Spezies extrahierbar.The substance containing the polysaccharide according to the invention is from the mycelium of the fungi of the family Polyporaceae of the genus Basidiomycetes or from a broth culture of the family Polyporaceae belonging species extractable.
Einige Verfahren zum Extrahieren von Wirkstoffen mit Antitumoraktivität aus den Basidiofruchtständen von zur Gattung der Basidiomyceten gehörenden Spezies sind bereits früher bekanntgeworden, so z. B. aus den veröffentlichten japanischen Patentanmeldungen 18 196/1962, 16 048/1968 und 25 563/1968. Diese Verfahren sind jedoch mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. So ist beispielsweise die Herstellung des Antitumorwirkstoffes in kommerziellem Maßstab wegen der Benutzung der Basidiofruchtstände als Ausgangsmalerial schwie-Some methods of extracting active substances with antitumor activity from the basidiofruit pods of species belonging to the genus Basidiomycetes have already become known earlier; B. from the Published Japanese Patent Applications 18 196/1962, 16 048/1968 and 25 563/1968. These procedures however, suffer from a number of disadvantages. For example, the production of the antitumor active ingredient on a commercial scale is difficult because of the use of the basidiofruit stands as the starting material. rig. Außerdem konnten bisher die physikochemi-ichen Eigenschaften des in der extrahierten antikanzerösen Substanz vorliegenden Wirkstoffes nicht angegeben werden. Dementsprechend sind die Verfahren zur Reinigung des Endproduktes noch so ungenügend, daß der Keinheitsgrad dieser Wirkstoffe nur gering ist.rig. In addition, the physico-chemical properties of the extracted anti-cancerous Substance present active substance are not specified. Accordingly, the processes for cleaning the end product are still so inadequate that these active ingredients are only minimally absent.
direkt „liter vermindertem Druck getrocknet und als Wirksubstanz verwendet. Daneben ist noch die Extraktion g|dried directly under reduced pressure and used as an active ingredient. In addition, there is still the extraction g |
mit Äther, Chloroform, Aceton, Benzol und Methanol geze'gt. In der JA-Patenlpublikation 16 048/1968 erfolgt $shown with ether, chloroform, acetone, benzene and methanol. In the JA patent publication 16 048/1968 $ occurs
die Reinigung, indem der Extrakt zuerst einer Gelfiltration oder Dialyse unterworfen und dann durch an sich ΐpurification by first subjecting the extract to gel filtration or dialysis and then by itself ΐ
bekannte weitere Schritte entproteinisiert und ganz zum Schluß dann der Wirkstoff mit einem mit Wasser |known further steps deproteinized and then at the very end the active ingredient with a water |
mischbaren organischen Lösungsmittel ausgefällt wird. In der JA.-Palentpublikation 25 563/1968 wird der Pilz :■miscible organic solvent is precipitated. In the JA.-Palentpublikation 25 563/1968 the fungus is: ■
Fisiolins hcpatica Fr. der Familie Fistulinaceae als Ausgangsmaterial verwendet und der wäßrige Extrakt nach Einengen mit Ammoniumsulfat versetzt, der gebildete Niederschlag wieder in Wasser gelöst und dann dialysiert, nach Einengen mit Eisessig und dann mit Anionenaustauscher behandelt, erneut dialysiert und dann mit Äthanol gefällt Man kann aber auch die Verfahrensschritte beliebig vertauschen. Wie die später folgenden Vergleichsversuche zeigen, ergibt Fistolina hepatica nur sehr geringe Ausbeuten, und das Material ist weniger wirksam als ein Material, das aus Polyporaceae gewonnen istFisiolins hcpatica Fr. of the family Fistulinaceae used as starting material and the aqueous extract according to Concentration mixed with ammonium sulfate, the precipitate formed was redissolved in water and then dialyzed, after concentration with glacial acetic acid and then treated with anion exchanger, dialyzed again and then with ethanol But you can also swap the process steps as you like. As the comparative experiments that follow later show, Fistolina hepatica gives only very low yields and the material is less effective than a material derived from Polyporaceae
Eine Arbeit in Japan. J. Exp. Med, VoL 38,6, Seiten 437—442 (1968), zeigt, daß ein Stamm von Basidomycetes extrazellulär Polysaccharid während der Submerskultur erzeugt Ein Stamm, der mit B-145 bezeichnet ist und als Crepidotus sp. identifiziert wurde, wurde mehrere Tage iubmers gezüchtet und die Brühe dann zentrifugiert und aus dem Überstand durch mehrfaches Fällen mit Aceton ausgefällt und dann durch Dialyse weiter gereinigt Ein Hinweis auf Pilze der Familie Polyporaceae findet sich auch dort nichtA job in Japan. J. Exp. Med, VoL 38.6, pp. 437-442 (1968) shows that a strain of Basidomycetes extracellular polysaccharide produced during submerged culture A strain designated B-145 and designated as Crepidotus sp. was identified, was cultured for several days and the broth was then centrifuged and precipitated from the supernatant by repeated precipitation with acetone and then further purified by dialysis There is no reference to fungi of the Polyporaceae family either
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung eines hinreichend reinen Antitumorwirkstoffes in technischem Maßstab sowie diesen Wirkstoff selbst zur Verfügung zu stellen.The object of the invention is to provide a method for obtaining a sufficiently pure anti-tumor agent in on an industrial scale and to provide this active ingredient itself.
Insbesondere wird vorgeschlagen, zur Gewinnung des Polysaccharids von in Fleischbrühe gezogenen Kulturen von Pilzen der Familie Polyporaceae auszugehen.In particular, it is proposed that the polysaccharide be obtained from cultures of fungi of the Polyporaceae family grown in meat broth.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird der Begriff »kultivierter Nährboden« für eine Brühe, Insbesondere für eine Fleischbrühe, aber auch ganz allgemein für ein beliebiges Kulturmedium, benutzt, die absichtlich mit der entsprechenden Pilzart zum Zwecke der Inkubation versetzt worden istIn connection with this invention, the term “cultivated nutrient medium” is used for a broth, in particular for a meat broth, but also in general for any culture medium that is intentionally used has been mixed with the corresponding species of fungus for the purpose of incubation
Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Arten von Polyporaceae sind für den Fall, daß ihr Myzel als Ausgangsmaterial benutzt werden soll, in den Tabellen 1 bis 4 zusammengestellt und sind für den Fall daß die mit ihnen kultivierten Nährboden als Ausgangsmaterial benutzt werden sollen, in den Tabellen 5 bis 12 zusammengestellt. Wenn das Myzel als Ausgangsmaterial benutzt wird, so kann es sowohl natürlichen Ursprungs sein als auch künstlich gezüchteten Kulturen entstammen. Zur Anwendung im Rahmen dieser Erfindung kann das Myzel sowohl unaufgearbeitet als auch durch Waschen mit Wasser und anschließendes Trocknen oder anschließende Gefriertrocknung konserviert vorliegen. Wenn ein mit Arten von Polyporaceae kultivierter Nährboden als Ausgangsmaterial benutzt wird, kann der Nährboden einer übliche:) Kultur dieser Arten selbst benutzt werden.The types of Polyporaceae used in the context of the invention are in the event that their mycelium as Starting material is to be used, compiled in Tables 1 to 4 and are for the event that the The culture medium cultivated with them is to be used as the starting material, summarized in Tables 5 to 12. If the mycelium is used as a starting material, it can be of natural origin as well as artificially grown cultures. For use in the context of this invention, the Mycelium is present both unprocessed and preserved by washing with water and subsequent drying or subsequent freeze-drying. If a breeding ground cultivated with species of Polyporaceae is used as a starting material, the breeding ground of a common :) culture of this species itself can be used will.
Zur Isolierung der wirksamen Substanz aus diesen Ausgangsmaierialien wird entweder da* Myzel mit warmem Wasser oder einem warmen wäßrigen Lösungsmittel extrahiert oder wird die kultivierte Nährlösung zur Gewinnung des Myzels filtriert. Beide Ausgangsmaterialien können auch miteinander gemischt benutzt werden.To isolate the active substance from these starting maerials, either the mycelium is extracted with warm water or a warm aqueous solvent, or the cultivated nutrient solution is used Filtration of the mycelium recovery. Both starting materials can also be used mixed together.
Die Temperatur des zur Extraktion benutzten Lösungsmittels bleibt unterhalb einer Temperatur von 1200C unkritisch. Vorzugsweise wird bei Temperaturen zwischen 60 und 1000C gearbeitet. Die Extraktion wird durch vorheriges Zerpulvern des Myzels begünstigt, jedoch ist eine solche vorherige Pulverisation nicht unerläßlich. Im allgemeinen wird die Extraktion mit warmem Wasser durchgeführt, jedoch können auch wäßrige Lösungsmittel benutzt werden, die wasserlösliche organische Lösungsmittel, Säuren, Basen oder Salze enthalten. Die für die Extraktion erforderliche Zeit ist eine Funktion der Extraktionstemperatur. Vorzugsweise wird die Extraktion bei einer Temperatur vn 60 bis 100"C in einem Zeitraum von 30 Minuten bis zu 10 Stunden durchgeführt. Am besten wird die Extraktion unter ständigem Rühren in einem Glasgefäß oder in einem Gefäß mit innerer Glasauskleidung, in emaillierten Gefäßen oder in Gefäßen aus rostfreiem Stahl durchgeführtThe temperature of the solvent used for extraction is not critical below a temperature of 120 0 C. Temperatures between 60 and 100 ° C. are preferably used. The extraction is promoted by previously pulverizing the mycelium, but such prior pulverization is not essential. In general, the extraction is carried out with warm water, but aqueous solvents can also be used which contain water-soluble organic solvents, acids, bases or salts. The time required for extraction is a function of the extraction temperature. The extraction is preferably carried out at a temperature of 60 to 100 ° C. for a period of 30 minutes to 10 hours. The extraction is best carried out with constant stirring in a glass vessel or in a vessel with an inner glass lining, in enamelled vessels or in vessels Made of stainless steel
Der auf diese Weise hergestellte Myzelextrakt wird zur Entfernung von Feststoffen filtriert oder zentrifugiert und anschließend wie nachstehend geschildert gereinigt.The mycelium extract produced in this way is filtered or centrifuged to remove solids and then cleaned as described below.
Für den Fall, daß von einem kultivierten Nährboden ausgegangen wird, wird der Nährboden vom Myzel getrennt, konzentriert und anschließend iii gleicher Weise dem unten beschriebenen Reinigungsprozeß unterworfen.In the event that a cultivated culture medium is assumed, the mycelium becomes the culture medium separately, concentrated and then subjected to the cleaning process described below in the same way.
Der auf diese Weise erhaltene wäßrige Extrakt bzw. die filtrierte Nährlösung enthält neben dem Polysaccharid, das der aktive Bestandteil der antikanzerösen Substanz ist noch eine Reihe unerwünschter anderer Substanzen, wie beispielsweise freie Proteine, Nukleinsäuren oder reduzierende Zucker. Zur Entfernung dieser Stoffe ist ein Reinigungsverfahren erforderlich.The aqueous extract or the filtered nutrient solution obtained in this way contains, in addition to the polysaccharide, which is the active component of the anti-cancerous substance, a number of other undesirable substances, such as free proteins, nucleic acids or reducing sugars. To remove these substances is a cleaning procedure is required.
Mit dem Reinigungsverfahren gemäß der Erfindung werden die unerwünschten Substanzen, vor allem die ausgesprochen schädlichen Komponenten, die freien Proteine, entfernt. Vorteilhaft wird diese Reinigung durch Kombination einer Reihe von Reinigungsverfahren durchgeführt, beispielsweise durch eine Kombination einer Entproteinisierung, einer Entionisierung (die eine Neutralisierung und Entsalzung einschließt) und gegebenenfalls Verfahren zur Eliminierung anderer organischer Substanzen. Zur Erreichung dieses Zweckes können Verfahren wie die Extraktion, das Zentrifugieren, die Filtration, Säurebehandlung, Aussalzen, Dialyse oder Verfahren unter Benutzung von Ionenaustauschern eingesetzt werden.With the cleaning method according to the invention, the undesirable substances, especially the Removes extremely harmful components, the free proteins. This cleaning is advantageous through Combination of a number of cleaning methods performed, for example by a combination of one Deproteinization, deionization (which includes neutralization and desalination) and, where appropriate, methods of eliminating other organic substances. To achieve this, you can Processes such as extraction, centrifugation, filtration, acid treatment, salting out, dialysis or Process using ion exchangers can be used.
Zu allererst wird jedoch, wie die Beispiele zeigen, aus der von Feststoffen befreiten Brühe das Polysaccharid mit Ammoniumsulfat ausgefällt, gegebenenfalls nach Vorfällen mit Äthanol und Wiederaufnehmen der Fällung in Wasser. Erst dann schließen sich die weiteren Reinigungsschritte an.First of all, however, as the examples show, the polysaccharide is formed from the solids broth precipitated with ammonium sulfate, if necessary after incidents with ethanol and resumption of precipitation in water. Only then do the further cleaning steps follow.
Die Entproteinisierung des in flüssiger Phase vorliegenden, wiederaufgelösten Niederschlags wird durch Hinzusetzen von Säuren, beispielsweise zur Zusetzen von Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Trichloressigsäure, Picrinsäure, Sulfosalicylsäure, Tanninsäure und andere in einer Menge, die 0,1 bis 3 Gew.-% entspricht, wobei die freien Proteine gefällt werden, bewirkt, wobei die so gefällten Proteine anschließend von der flüssigen Phase abgetrennt werden. Die von den gefällten Proteinen befreite Lösung wird anschließend auf eine Säule mit Anionenaustauscherharz gegeben, die im Zusammenhang mit dem Reinigungsverfahren für den Fall, daß ein kult;". ierter Nährboden als Ausgangsmaterial benutzt wurde, näher beschrieben wird. Statt auf die Austauschersäule gegeben zu werden, kann der Extrakt auch einer Dialyse unterworfen werden, wobei zurThe deproteinization of the redissolved precipitate present in the liquid phase is carried out by adding acids, for example to add sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, picric acid, sulfosalicylic acid, tannic acid and others in an amount that amounts to 0.1 to 3 wt. % corresponds, with the free proteins being precipitated, the proteins thus precipitated being subsequently separated from the liquid phase. The solution freed from the precipitated proteins is then placed on a column with anion exchange resin, which is used in connection with the purification process in the event that a cult ; ". ated nutrient medium was used as the starting material, is described in more detail. Instead of being placed on the exchange column, the extract can also be subjected to dialysis, whereby for
Befreiung von der überschüssigen Säure Dialysemembranen, wie beispielsweise Cel'ophanfolien, benutzt werden können. Alternativ kann die Entprotcinisier ung auch direkt durch Ionenaustausch erfolgen.To get rid of the excess acid, dialysis membranes, such as Cel'ophan foils, can be used. Alternatively, the deprotection can also be carried out directly by ion exchange.
Nach Beendigung der Dialyse bzw. des Ionenaustausches wird die in der Membran bzw. im Auslauf gesammelte Flüssigkeit konzentriert und mit dem 3- bis lOfachen Volumen eines Alkohols zur Erzeugung eines Niederschlags versetzt, der dann der Gefriertrocknung unterworfen wird oder erst mit Alkohol und dann mit Aceton gewaschen und anschließend getrocknet wird. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist ein nicht hygroskopisches, hellgraues bis weißes Pulver, das antikanzerös wirksam istAfter the end of the dialysis or the ion exchange, the liquid collected in the membrane or in the outlet is concentrated and mixed with 3 to 10 times the volume of an alcohol to produce a Precipitation is added, which is then subjected to freeze-drying or first with alcohol and then with Acetone is washed and then dried. The product obtained in this way is a no hygroscopic, light gray to white powder that is anti-cancerous
Auch bei Verwendung der konzentrierten Kulturbrühe wird zuerst das Polysaccharid ausgefällt, wie oben angegeben. Um weitere unerwünschte Stoffe, wie beispielsweise freie Proteine, freie Nukleinsäuren, reduzierenEven when using the concentrated culture broth, the polysaccharide is precipitated first, as above specified. To reduce further undesirable substances such as free proteins, free nucleic acids de Zucker, verschiedene Ionen oder Vitamine, zu entfernen, stehen verschiedene Methoden zur Verfugung. So kann beispielsweise konzentriert werden, mit Säure behandelt werden, extrahiert werden, es kann dialysiert oder mit einem Ionenaustauscher behandelt werden. Auch Kombinationen dieser Verfahrensweisen sind möglich. Zur Entfernung der freien Proteine sind anorganische und organische Säuren geeignet, beispielsweise Trichloressigsäure. Schwefelsäure, Salzsäure, Eisessig, Sulfosalicylsäure, Picrinsäure oder Tanninsäure. Bezogen auf dieen Various methods are available to remove sugars, various ions or vitamins. So can for example be concentrated, treated with acid, extracted, dialyzed or treated with an ion exchanger. Combinations of these procedures are also possible. To the Inorganic and organic acids are suitable for removing the free proteins, for example trichloroacetic acid. Sulfuric acid, hydrochloric acid, glacial acetic acid, sulfosalicylic acid, picric acid or tannic acid. Referring to the gesamte flüssige Phase sollte die Konzentration dieser Säuren etwa 0,1 bis 3% betragen.In the entire liquid phase, the concentration of these acids should be about 0.1 to 3%.
Die Dialyse, die zur Entfernung niedrigerer Zucker, freier Aminosäuren, verschiedener Salze oder auch zur Entfernung verschiedener Nukleinsäuren dienen kann, kann mit Hilfe einer semipermeablen Membran, beispielsweise mit einer CeHophanfolie, einer Kollodiummembran oder auch mit einer Darmmembran durchgeführt werden. Der Ionenaustausch wird mit Anionen- und Kationen-Austauscherharzen durchgeführt AlsDialysis, which is used to remove lower sugars, free amino acids, various salts or even for Removal of various nucleic acids can be carried out with the aid of a semipermeable membrane, for example with a CeHophane film, a collodion membrane or also with an intestinal membrane. The ion exchange is carried out with anion and cation exchange resins Als Kationen-Austauscherharze kommen beispielsweise Amberlite IR-120 B, Amberlite 200, Amberlite IR-122, Amberlite IR-Cation exchange resins come, for example, Amberlite IR-120 B, Amberlite 200, Amberlite IR-122, Amberlite IR-
123, Amberlite XE-100, Amberlite IRC-50 und Amberiite IRC-84 (® alle Rohm & Haas); Dowex 50W (® von Dow Chemical); Duolite C-3, Duolite C-10, Duolite C-20, Duclite C-25, Duolite C 27, Duolite ES-63, Duolite ES-80 und DuoliteCS-101 (* alle von Diamond Alkali) sowie Diaion SK-IA, Diaion SK-IB, Diaion SK-102, Dk-123, Amberlite XE-100, Amberlite IRC-50 and Amberiite IRC-84 (® all Rohm &Haas); Dowex 50W (® from Dow Chemical); Duolite C-3, Duolite C-10, Duolite C-20, Duclite C-25, Duolite C 27, Duolite ES-63, Duolite ES-80 and DuoliteCS-101 (* all from Diamond Alkali) as well as Diaion SK-IA, Diaion SK-IB, Diaion SK-102, Dk- ion SK-103, Diaion SK-104, Diaion S K-106, Diaion SK-110, Diaion SK-112, Diaion SK-116, Diaion SKI, Diaion PK-204, Diaion PK-208, Diaion PK-212, Diaion PK-216 und Diaion PK-228 (® alle von Mitsubishi Chemical Industry Co, Ltd.) in Frage. Als Anionenaustauscher können beispielsweise eingesetzt werden: Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-401, Amberlite IRA-402, Amberlite IRA-405, Amberlite IRA-425, Amberlite IRA-900, Amberlite IRA-904, Amberlite IRA-410, Amberlite IRA-411, Amberlite IRA-911, Amberlite IRA-910, Amberli-ion SK-103, Diaion SK-104, Diaion S K-106, Diaion SK-110, Diaion SK-112, Diaion SK-116, Diaion SKI, Diaion PK-204, Diaion PK-208, Diaion PK-212, Diaion PK-216 and Diaion PK-228 (® all from Mitsubishi Chemical Industry Co, Ltd.) in question. The following can be used as anion exchangers: Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-401, Amberlite IRA-402, Amberlite IRA-405, Amberlite IRA-425, Amberlite IRA-900, Amberlite IRA-904, Amberlite IRA-410, Amberlite IRA- 411, Amberlite IRA-911, Amberlite IRA-910, Amberli- te 1R-45, Amberlite lRA-93, Amberlite IRA-68 und Amberlite IR-4B (Rohm & Haas); Dowex 1, Dowex 2, Dowex 44, Dowex 21K und Dowex 11 (Dow Chemical) sowie Duolite A-2, Duolite A-4, Duolite A-6, Duolite A-7, Duolite ES-15, Duolite A-30T, Duolite A-30B, Duolite A-41, Duolite A-43, Duolite ES-57, Duolite A-40, Duolite A-40LC, Duolite A-42, Duolite A-42LC, Duolite A-40, Duolite A-101D, Duolite A-102, Duolite A-102D und Duolite ES-111 (Diamond Alkali). Die freien Proteine werden durch die oben bereits genannten Verfahrente 1R-45, Amberlite IRA-93, Amberlite IRA-68, and Amberlite IR-4B (Rohm &Haas); Dowex 1, Dowex 2, Dowex 44, Dowex 21K and Dowex 11 (Dow Chemical) as well as Duolite A-2, Duolite A-4, Duolite A-6, Duolite A-7, Duolite ES-15, Duolite A-30T, Duolite A-30B, Duolite A-41, Duolite A-43, Duolite ES-57, Duolite A-40, Duolite A-40LC, Duolite A-42, Duolite A-42LC, Duolite A-40, Duolite A-101D, Duolite A-102, Duolite A-102D and Duolite ES-111 (Diamond Alkali). The free proteins are produced by the procedures already mentioned above entfernt, wobei die Säurebehandlung besonders geeignet ist. Die Entfernung der überflüssigen Säure und die Entfärbung wird durch Ionenaustausch erreicht. Die Austauscher Duolite S-30 oder Duolite ES-33 (Diamond Alkali) und die diesen verwandten Austauscher zeigen vor allem einen besonders günstigen Entfärbungseffekt. Die Austauscher Dowex 5OWX2 (Η-Typ) und Dowex 44 (OH-Typ) sind zur Entfernung der Nukleinsäuren aus der flüssigen Phase besonders geeignet.removed, the acid treatment being particularly suitable. The removal of the excess acid and the Discoloration is achieved through ion exchange. The exchanger Duolite S-30 or Duolite ES-33 (Diamond Alkali) and the exchangers related to these show above all a particularly favorable decolorization effect. The exchangers Dowex 5OWX2 (Η-type) and Dowex 44 (OH-type) are made for the removal of nucleic acids particularly suitable for the liquid phase.
Das Endprodukt kann auch durch Hinzufügen stark polarer organischer Lösungsmittel, beispielsweise wasserlöslicher Alkohole und Ketone, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol oder Aceton, ausgefällt werden. Unter einer Behandlung mit Bleiacetat wird das Hinzufügen von Bleiacetat zur flüssigen Phase verstanden, wodurch das Endprodukt als Bleisalz ausgefällt wird. Aus diesem Bleisalz kann das reine Endprodukt durch Entfernen des Bleis erhalten werden, was beispielsweise durch Einleiten von Schwefelwasserstoff in eine AufThe end product can also be precipitated by adding strongly polar organic solvents, for example water-soluble alcohols and ketones such as methanol, ethanol, propanol, butanol or acetone. Treatment with lead acetate is understood to mean the addition of lead acetate to the liquid phase, whereby the end product is precipitated as lead salt. The pure end product can come through from this lead salt Removal of the lead can be obtained, for example, by introducing hydrogen sulfide into a Auf schlämmung des Niederschlags bewirkt werden kann, wodurch das Blei als Bleisulfid gefällt wird.Elimination of the precipitate can be effected, whereby the lead is precipitated as lead sulfide.
Wie vorstehend beschrieben, ist der Zweck des Reinigungsverfahrens die Entfernung unerwünschter Substanzen aus dem Extrakt oder aus der Nährlösung, wobei diese unerwünschten Substanzen im wesentlichen aus Proteinen bestehen, und die Isolierung des wirksamen Polysaccharids aus der so erhaltenen gereinigten Lösung. Das erfinöungsgemäße Polysaccharid, das durch die im vorstehenden beschriebene Behandlung erhalten wird,As described above, the purpose of the purification process is to remove undesirable substances from the extract or from the nutrient solution, these undesirable substances being essentially made up Proteins exist, and the isolation of the active polysaccharide from the purified solution thus obtained. The polysaccharide according to the invention, which is obtained by the treatment described above,
so kann folgendermaßen charakterisiert werden: Es ist ein hellgraues bis weißes Pulver, nicht dialysierbar, hat keinen scharfen Schmelzpunkt, verkohlt bei stärkerem Erhitzen, ist unlöslich in gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln und in organischen Säuren, jedoch löslich in Wasser. Eine 10%ige wäßrige Lösung dieser Substanz reagiert neutral. Eine 0,1%ige wäßrige Lösung zeigt keine charakteristischen Absorptionen im UV-Bereich.it can be characterized as follows: It is a light gray to white powder that cannot be dialysed no sharp melting point, charred on intense heating, is insoluble in common organic Solvents and organic acids, but soluble in water. A 10% aqueous solution of this Substance reacts neutrally. A 0.1% strength aqueous solution shows no characteristic absorptions in the UV range.
Unterwirft man das erfindungsgemäß erhaltene Polysaccharid in einer 0,Q5molaren Natriumboratlösung der Elektrophorese (Celluloseacetatmembran, 20 bis 25 V/cm, 90 min), so wird auf der Anodenscite nur ein einziger Fleck erhalten.If the polysaccharide obtained according to the invention is subjected to a 0.05 molar sodium borate solution Electrophoresis (cellulose acetate membrane, 20 to 25 V / cm, 90 min), so only one is on the anode scite Stain received.
Wird jedoch eine 0,l%ige wäßrige Lösung des Polysaccharids dadurch hydrolisiert, daß zur Lösung so lange Schwefelsäure hinzugefügt wird, bis die Gesamtlösung 1 normal ist und daß diese Lösung anschließend 5 StundenIf, however, a 0.1% strength aqueous solution of the polysaccharide is hydrolyzed, it takes so long to dissolve Sulfuric acid is added until the total solution is 1 and that this solution is then 5 hours auf 1000C erwärmt wird, dann durch Hinzufügen von Bariumcarbonat neutralisiert und papierchromatographiert wird, kann stets Glukose nachgewiesen werden.is heated to 100 0 C, then neutralized by adding barium carbonate and paper chromatographed, glucose can always be detected.
Das Polysaccharid selbst zeigte auch unter den verschiedensten Bedingungen im Papierchromatogramm keine Wanderung. Unterwirft man die 1%ige wäßrige Lösung der Substanz jedoch der oben beschriebenen schwefelsauren Hydrolyse und neutralisiert sie anschließend mit Bariumcarbonat, so zeigt das PapierchromatoThe polysaccharide itself also showed under the most varied of conditions in the paper chromatogram no hike. However, if the 1% strength aqueous solution of the substance is subjected to that described above sulfuric acid hydrolysis and then neutralized with barium carbonate, as the paper chromatography shows gramm deutlich die Glukose.gram clearly shows the glucose.
Das Hydrolyseprodukt des Polysaccharids reagiert positiv auf die folgenden Reaktionen: Anisaldehydreaktion, Molisch-Reaktion, Anthronreaktion, Tryptophanschwefelsäurereaktion, Chromotropsäureschwefelsäurereaktion, Carbazol-Cystein-Schwefelsäsure-Reaktion, Anilinsalzsäurereaktion. Resorcinsalzsäurereaktion, ToI-The hydrolysis product of the polysaccharide reacts positively to the following reactions: anisaldehyde reaction, Molisch reaction, anthrone reaction, tryptophane sulfuric acid reaction, chromotropic acid sulfuric acid reaction, carbazole-cysteine-sulfuric acid reaction, aniline hydrochloric acid reaction. Resorcinol hydrochloric acid reaction, ToI-
lens-Reaktion und Thioglykolschwefelsäurereaktion. Das Hydrolysat reagiert nicht auf Eisen(III)-chlorid und Fehlingsche Lösung.lens reaction and thioglycolsulfuric acid reaction. The hydrolyzate does not react to ferric chloride and Fehling's solution.
Das erfindungsgemäße Polysaccharid zeigt keine antimikrobische Wirkung gegenüber Bakterien, Pilzen und Hefen, wie beispielsweise Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aspergillus nigel oder Candida albicans und unterscheidet sich damit ganz wesentlich von den antibakteriellen und antikarzinogenen Wirkstoffen, die aus den zur Gattung Actinomycetes gehörenden Spezies erhalten werden.The polysaccharide according to the invention shows no antimicrobial effect against bacteria, fungi and Yeasts such as, for example, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aspergillus nigel or Candida albicans and thus differs significantly from the antibacterial and anti-carcinogenic agents, obtained from the species belonging to the genus Actinomycetes.
Darüber hinaus zeigt das Polysaccharid keinerlei Cytotoxizität oder andere unerwünschte Nebeneffekte, die bei den bekannten antikarzinogenen Wirkstoffen auftreten, so z. B. die Abnahme der Leukocyten, Anämie der Leber und anderer Organe, Atrophie der Milz, Verlust an Körpergewicht und Appetitlosigkeit. Die akute Toxizität (LD50) der Substanz liegt bei oraler Applikation über 20 g/kg und bei subkutaner, intramuskulärer oder intravenöser Injektion über 100 mg/kg.In addition, the polysaccharide does not show any cytotoxicity or other undesirable side effects occur in the known anti-carcinogenic agents, such. B. the decrease in leukocytes, anemia the Liver and other organs, atrophy of the spleen, loss of body weight and loss of appetite. The acute one The toxicity (LD50) of the substance is above 20 g / kg after oral administration and subcutaneous, intramuscular or intravenous injection over 100 mg / kg.
Der antikarzinogene Effekt des Polysaccharide gemäß der Erfindung wurde durch die folgenden Versuche sichergestellt: f The anti-carcinogenic effect of the polysaccharide according to the invention was verified by the following tests: f
Eine Maus der ICR-JCL-Reihe mit einem Körpergewicht von 20 g wurde intraperitoneal mit festen Zellen des |;An ICR-JCL series mouse weighing 20 g was intraperitoneally injected with solid cells of the |;
Ehrlich-Karzinoms oder des Sarcoma-180 infiziert. Eine Woche, nachdem eine hinreichende Zunahme der 15 ,"4 Bauchwasserflüssigkeit in dieser Maus beobachtet werden konnte, wurden die darin enthaltenen KrebszellenEhrlich's carcinoma or Sarcoma-180 infected. One week after a sufficient increase in 15, "4 Ascension fluid could be observed in this mouse, the cancer cells it contained were
subkutan in einer Konzentration von 6 Mill, pro Maus auf andere Mäuse übertragen. Diese Mäuse wurden zu \transferred subcutaneously to other mice at a concentration of 6 million per mouse. These mice became \
Gruppen von je 10 Tieren aufgeteilt, von denen die erste Gruppe nur mit Salzlösungen behandelt wurde, \ Groups of 10 animals each divided, of which the first group was only treated with saline solutions, \
während die anderen Gruppen mit antikanzerösen Wirkstoffen und mit der Substanz gemäß der Erfindung behandelt wurden. Die erste Anwendung geschah intraperitoneal eine Woche nach der Transplantation, während die folgende Behandlung neunmal jeden zweiten Tag wiederholt wurde. Die mit den festen Krebszellen infizierten Mäuse wurden fünf Tage nach der letzten, der zehnten Behandlung auf die Zunahme des Körpergewichtes untersucht und anschließend zur Aufspürung von Nebeneffekten anatomisch untersucht.while the other groups with anticancer agents and with the substance according to the invention were treated. The first application was intraperitoneally during a week after the transplant the following treatment was repeated nine times every other day. The ones with the solid cancer cells infected mice were checked for body weight gain five days after the last, the tenth, treatment examined and then examined anatomically to detect side effects.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den Tabellen 1 bis 12 zusammengestellt.The results of these tests are compiled in Tables 1 to 12.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen im einzelnen näher erläutert.The invention is explained in more detail below with the aid of examples.
Zu 301 destilliertem Wasser wurden 2 kg getrocknetes und kleingehacktes Myzel von Coriolus pubescens (Fr.) Quel. gegeben. In einem mit Rückflußkühler versehenen Glasgefäß wurde die Mischung auf 95 bis 1000C unter Rühren drei Stunden lang erhitzt, um so eine Extraktion zu bewirken. Anschließend wurde die Mischung auf Zimmertemperatur abgekühlt, durch ein Tuch filtriert und das Filtrat auf einen Liter eingeengt Nach Hinzufügen von 700 g Ammoniumsulfat wurde das Filtrat über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Der Niederschlag, der sich über Nacht gebildet hatte, wurde am nächsten Morgen durch eine Papierfiltration abgetrennt Der ι2 kg of dried and finely chopped mycelium from Coriolus pubescens (Fr.) Quel. given. In a glass vessel equipped with reflux condenser the mixture to 95 to 100 0 C under stirring was heated for three hours, to thereby effect extraction. The mixture was then cooled to room temperature, filtered through a cloth and the filtrate was concentrated to one liter. After adding 700 g of ammonium sulfate, the filtrate was left to stand in the refrigerator overnight. The precipitate, which had formed overnight, was separated off the next morning by paper filtration
Rückstand wurde sechsmal mit je 4 1 einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung, d. h. also mit 24 1 insgesamt, 35 'The residue was washed six times with 4 l each time of a saturated ammonium sulfate solution, d. H. so with 24 1 in total, 35 '
gewaschen. Anschließend wurde der Niederschlag in etwa 1 I Wasser gelöst und in ein Visking-Cellulosegefäß gegeben, wo er einer 40stündigen Dialyse in strömendem Wasser unterworfen wurde. Nach der Konzentration der flüssigen Phase in der Membran auf 1 I wurden 100 ml 10%igerTrichloressigsäure hinzugefügt, um die freien Proteine zu entfernen. Nach der Entfärbung mit 10 g Aktivkohle wurde das Gemisch entfärbt. Das Filtrat wurde noch einmal für 40 Stunden einer Dialyse in fließendem Wasser unterworfen, wonach die flüssige Phase in der Membran auf 100 ml konzentriert wurde. Der Niederschlag, der sich nach Hinzufügen von 400 ml Äthanol gebildet hatte, wurde der Reihe nach mil S0%igem Äthanol, 99%igem Äthanol und mit Aceton gewaschen und r washed. The precipitate was then dissolved in about 1 l of water and placed in a Visking cellulose jar, where it was subjected to dialysis for 40 hours in flowing water. After the concentration of the liquid phase in the membrane to 1 l, 100 ml of 10% trichloroacetic acid was added to remove the free proteins. After decolorization with 10 g of activated charcoal, the mixture was decolorized. The filtrate was again subjected to dialysis for 40 hours in running water, after which the liquid phase in the membrane was concentrated to 100 ml. The precipitate which had formed after the addition of 400 ml of ethanol was washed in sequence with SO% ethanol, 99% ethanol and with acetone and r
anschließend getrocknet. Auf diese Weise wurden 60 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten. ,.t then dried. In this way, 60 g of a light gray to white powder was obtained. , .t
Die auf diese Weise erhaltene Substanz ist ein Polysaccharid, was durch die im vorstehenden genannten Tests nachgewiesen wurde. Sowohl diese Substanz als auch andere Polysaccharide, die aus dem Myzel anderer Spezies der Familie Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten wurden, wurden auf ihre antikarzinogene Wirkung hin untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßtThe substance obtained in this way is a polysaccharide, as evidenced by the tests mentioned above has been proven. Both this substance and other polysaccharides obtained from the mycelium of other species The Polyporaceae family obtained by the same procedure were tested for their anti-carcinogens Effect investigated. The results are summarized in Table 1
Das für diese Versuche benutzte Myzel wurde auf die folgende Weise erhalten:The mycelium used for these experiments was obtained in the following way:
Eintausend 11-Erlenmayer-KoIben wurden mit je 150 ml der im nachstehenden angegebenen Nährlösung ^1 One thousand 11-Erlenmeyer KoIben were washed with 150 ml of the following nutrient solution stated in the ^ 1
gefüllt: 50 ;filled: 50;
Die Kolben wurden mit einem Wattebausch verschlossen und 30 Minuten bei 120°C sterilisiert Die Nährflüssigkeiten wurden anschließend in üblicher Weise mit Coriolus pubescens (Fr.) Quel. geimpft, der auf einem schrägstehenden Kulturboden kultiviert worden war. Nach einer stationären Inkubationszeit der Kulturen in den Erlenmayer-Kolben von 20 Tagen bei 23 bis 25°C wurde der Inhalt der Kolben filtriert Das auf den Filtern zurückgebliebene Myzel wurde mit 501 Wasser gewaschen und anschließend getrocknetThe flasks were closed with a cotton ball and sterilized for 30 minutes at 120 ° C. The nutrient liquids were then queled in the usual way with Coriolus pubescens (Fr.). inoculated which had been cultivated on an inclined culture soil. After a stationary incubation time of the cultures in the Erlenmayer flasks for 20 days at 23 to 25 ° C., the contents of the flasks were filtered. The mycelium remaining on the filters was washed with 50 liters of water and then dried
Familiefamily
Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma-180Efficacy against solid cancer Sarcoma-180
Polyporaceae —► Corbolus pubescens (Fr.) Quel. Polyporaceae —► Tyromyces lacteus (Fr.) Murr. Polyporaceae Polyporus confluens (A. et S.) Fr. Polyporaceae —► Microporus affinis (Blume et NeesJKuntze. Polyporaceae Trametes gibbosa Fr. Polyporaceae Cryptoporus volvatus (PK.) Hubb. Polyporaceae Trametes albida (Fr.) Bourdot et Garzin Polyporaceae —► Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. Polyporaceae —► Hirschioporusabietinus(Fr.)Donk Polyporaceae —► Tyromyces incarnatus ImazekiPolyporaceae - ► Corbolus pubescens (Fr.) Quel. Polyporaceae - ► Tyromyces lacteus (Fr.) Murr. Polyporaceae Polyporus confluens (A. et S.) Fr. Polyporaceae - ► Microporus affinis (Blume et NeesJKuntze. Polyporaceae Trametes gibbosa Fr. Polyporaceae Cryptoporus volvatus (PK.) Hubb. Polyporaceae Trametes albida (Fr.) Bourdot et Garzin Polyporaceae - ► Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. Polyporaceae - ► Hirschioporusabietinus (Fr.) Donk Polyporaceae - ► Tyromyces incarnatus Imazeki
80 100 80 70 60 60 70 70 70 9080 100 80 70 60 60 70 70 70 90
Zu 3 kg von getrocknetem und pulverisiertem Myzel von Grifola gigantea (Fr.) Pilat wurden 451 destilliertes Wasser gegeben. In einem mit RückflußkUhler versehenen, glasausgekleideten Gefäß wurde das Gemisch unter Rühren zum Zwecke der Extraktion fünf Stunden lang auf 9O0C erhitzt. Nach Abkühlen wurde durch ein Tuch filtriert und das Filtrat anschließend auf 51 konzentriert. Das Konzentrat wurde anschließend 30 Minuten lang zentrifugiert (1500 g), die überstehende Lösung dekantiert und unter Rühren mit 4250 g Ammoniumsulfat versetzt und über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde filtriert, der Rückstand gesammelt und in Wasser aufgelöst und die so erhaltene Lösung anschließend auf eine mit 1 η Salzsäure aktivierte Säule gegeben, die Amberlite IR-120B enthielt Zur Entfernung des überschüssigen Ammoniumsulfats wurde der Durchlauf anschließend auf eine mit einer 1 η NaOH-Lösung aktivierte Säule gegeben, die Duolite A-7 enthielt Der Auslauf wurde auf einen Liter konzentriert durch Hinzugabe von 41 Äthanol homogenisiert und anschließend filtriert Der Rückstand wurde mit Äthanol und anschließend mit Aceton gewaschen, getrocknet und lieferte eine Ausbeute von 55 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz.45 liters of distilled water were added to 3 kg of dried and powdered mycelium from Grifola gigantea (Fr.) Pilat. In one provided with reflux condenser, glass-lined vessel under stirring the mixture was heated for the purpose of extraction for five hours at 9O 0 C. After cooling, it was filtered through a cloth and the filtrate was then concentrated to 51%. The concentrate was then centrifuged for 30 minutes (1500 g), the supernatant solution decanted and mixed with 4250 g ammonium sulfate while stirring and left to stand overnight in the refrigerator. The next morning it was filtered, the residue was collected and dissolved in water and the solution obtained in this way was then applied to a column activated with 1 η hydrochloric acid and containing Amberlite IR-120B NaOH solution added to activated column, which contained Duolite A-7. The effluent was concentrated to one liter by adding 41% ethanol and then filtered. The residue was washed with ethanol and then with acetone, dried and gave a yield of 55 g of a light gray to white powdery substance.
Diese Substanz ist ein Polysaccharid, wie durch die im vorstehenden beschriebenen Tests nachgewiesen wurde. Die so erhaltene Substanz wurde mit den an deren Polysacchariden, die aus dem Myzel anderer Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten wurden, auf ihre Antitumorwirkung untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefaßtThis substance is a polysaccharide as demonstrated by the tests described above became. The substance obtained in this way was combined with the other polysaccharides obtained from the mycelium of others Polyporaceae obtained by the same procedure were examined for their anti-tumor effects. The results are summarized in Table 2
Familiefamily
Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma-180Efficacy against solid cancer Sarcoma-180
Polyporaceae Trametes cinnabarina Fr. Polyporaceae — Deadaleopsis confragosa (Fr.) Schroet Polyporaceae -* Favolus arcularius (Fr.) Arnes. Polyporaceae Gloeoporus amorphus (Fr.) Clem, et Shear. Polyporaceae Fomitopsis castanea imaz. Polyporaceae Ischnoderma resinosum (Fr.) Karst. Polyporpceae —► Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray Polyporaceae Amauroderma scopulosum (Berk.) Imaz. Polyporaceae Grifola gigantea (Fr.) Pilat Polyporaceae Tyromyces caesius (Fr.) Karst Polyporaceae Trametes sanguinea (Fr.) Lloyd Polyporaceae Elfvingia applanata (Pers.) KarstPolyporaceae Trametes cinnabarina Fr. Polyporaceae - Deadaleopsis confragosa (Fr.) Schroet Polyporaceae - * Favolus arcularius (Fr.) Arnes. Polyporaceae Gloeoporus amorphus (Fr.) Clem, et Shear. Polyporaceae Fomitopsis castanea imaz. Polyporaceae Ischnoderma resinosum (Fr.) Karst. Polyporpceae - ► Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray Polyporaceae Amauroderma scopulosum (Berk.) Imaz. Polyporaceae Grifola gigantea (Fr.) Pilat Polyporaceae Tyromyces caesius (Fr.) Karst Polyporaceae Trametes sanguinea (Fr.) Lloyd Polyporaceae Elfvingia applanata (Pers.) Karst
90 90 90 60 80 70 80 90 90 70 90 8090 90 90 60 80 70 80 90 90 70 90 80
Zu 1 kg von getrocknetem und pulverisiertem Myzel von Microporus flabelliformis (Fr.) Kuntze wurden 35 I destilliertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren zum Zwecke der Extraktion 5 Stunden lang in einem Gefäß aus rostfreiem Stahl, das mit einem RückflußkUhler und einer Rührvorrichtung ausgerüstet war, auf 95 bis 98DC erhitzt Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde durch ein Tuch filtriert Der Rückstand wurde zum Zwecke der weiteren Extraktion mit weiteren 301 destilliertem Wasser drei Stunden lang unter Rühren auf 98 bis 100" C erhitzt anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt und erneut durch ein Tuch filtriert Beide Filtrate wurden vereinigt und unter verringertem Druck auf 51 eingeengt In das Konzentrat wurden unter gutem Rühren 4 kg Ammoniumsulfat eingetragen. Nach Stehenlassen über Nacht bei 5 bis 8° C wurde das Reaktionsgemisch am nächsten Tag 20 Minuten bei 1300 G zentrifugiert Der Rückstand wurde in 11 destilliertem Wasser aufgelöst und 200 Stunden lang der Ultrafiltration unterworfen, wobei mit einem Ultrafilter Modell35 l of distilled water were added to 1 kg of dried and powdered mycelium from Microporus flabelliformis (Fr.) Kuntze. The mixture was heated to 95 to 98 D C for 5 hours with stirring for the purpose of extraction in a stainless steel vessel equipped with a reflux condenser and a stirrer. After cooling to room temperature, it was filtered through a cloth. The residue was filtered for the purpose the further extraction with a further 301 distilled water for three hours with stirring at 98 to 100 "C then cooled to room temperature and filtered again through a cloth. Both filtrates were combined and concentrated to 51 under reduced pressure. 4 kg were added to the concentrate with thorough stirring After standing overnight at 5 to 8 ° C., the reaction mixture was centrifuged for 20 minutes at 1300 G the next day
2000 (Amicon Corporation) unter Benutzung einer Diaflo-Membran UM-2(Amicon Corporation) bei 5 bis 10°C ein Druck von 4,9 bar (5 kg/cm2) erreicht wurde. Die Flüssickeit in der Membran wurde in einen Erlenrnayer-Kolben gegeben und, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, mit 3 Gew.-% Tanninsäure versetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und anschließend 20 Minuten lang bei 300G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde erneut ultrafiltriert, wobei wiederum ein Ultrafilter Modell 2000 mit einer Diaflo-Membran benutzt wurde. Die Ultrafiltration wurde 200 Stunden bei 5 bis 8°C und 4,9 bar (5 kg/cm2) durchgeführt. Die Flüssigkeit in der Membran wurde mit der dreifachen Volumenmerge Äthanol versetzt. Das Gemisch wurde gut gerührt und der so gebildete Niederschlag anschließend auf einem Papierfilter gesammelt. Der Rückstand auf dem Filterpapier wurde der Reihe nach mit 5 I 75%igem Äthanol, mit 3 I 95%igem Äthanol und schließlich mit einem Liter 99%igem Äthanol und abschließend mit einem Liter Aceton gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet. Es wurden auf diese Weise 23 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz erhalten.2000 (Amicon Corporation) using a Diaflo UM-2 membrane (Amicon Corporation) at 5 to 10 ° C a pressure of 4.9 bar (5 kg / cm 2 ) was achieved. The liquid in the membrane was placed in an Erlenayer flask and, based on the total weight of the mixture, 3% by weight of tannic acid was added. The mixture was stirred for 30 minutes and then centrifuged at 300G for 20 minutes. The supernatant liquid was again ultrafiltered, again using a model 2000 ultrafilter with a Diaflo membrane. The ultrafiltration was carried out for 200 hours at 5 to 8 ° C. and 4.9 bar (5 kg / cm 2 ). The liquid in the membrane was mixed with three times the volume merge of ethanol. The mixture was stirred well and the precipitate so formed was then collected on a paper filter. The residue on the filter paper was washed in sequence with 5 l of 75% ethanol, with 3 l of 95% ethanol and finally with one liter of 99% ethanol and finally with one liter of acetone and dried under reduced pressure. In this way, 23 g of a light gray to white powdery substance were obtained.
Die auf diese Weise erhaltene Substanz konnte mit den im vorstehenden beschriebenen Tests als Polysaccharid identifiziert werden. Diese Substanz wurde zusammen mit anderen Polysaccharide die aus dem Myzel anderer Polyporaceae nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden, auf ihre antikarzinogene Wirksamkeit hin untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefaßt.The substance obtained in this way was found to be a polysaccharide by the tests described above be identified. This substance, along with other polysaccharides, was extracted from the mycelium other Polyporaceae obtained by the method described above for their anticarcinogens Effectiveness examined. The results are summarized in Table 3.
Das für diese Versuche benutzte Myzel wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestelltThe mycelium used for these experiments was prepared in the manner described in Example 1
_ _— _ _—
Familie Organismus Wirkungsgrad gegenFamily organism efficiency against
festen Krebs Sarcoma-180solid cancer sarcoma-180
Polyporaceae Daedaleopsis styracina (P. Henn.etShir)lmazeki 80 2sPolyporaceae Daedaleopsis styracina (P. Henn.etShir) lmazeki 80 2s
Polyporaceae Gloeophyllum saepiarium (Fr.) Karst. 80Polyporaceae Gloeophyllum saepiarium (Fr.) Karst. 80
Polyporaceae Fomitopsis officinalis (Fr.) Bond, et Sing. 80Polyporaceae Fomitopsis officinalis (Fr.) Bond, et Sing. 80
Polyporaceae—» Coriolus consors (Berk) Imaz. 60Polyporaceae - »Coriolus consors (Berk) Imaz. 60
Polyporaceae Tyromyces sambuceus (Lloyd.) Imaz. 80Polyporaceae Tyromyces sambuceus (Lloyd.) Imaz. 80
Polyporaceae Polyoporus pes-caprae Fr. 90Polyporaceae Polyoporus pes-caprae Fr. 90
Polyporaceae Microporusflabelliformis(Fr.)Kuntze 100Polyporaceae Microporusflabelliformis (Fr.) Kuntze 100
Polyporaceae —» Coriolus flabelliformis (Fr.) Kuntze 70Polyporaceae - »Coriolus flabelliformis (Fr.) Kuntze 70
Polyporaceae—» Fomesfomentarius(Fr.)Kickx 80Polyporaceae— »Fomesfomentarius (Fr.) Kickx 80
Polyporaceae Ganoderma neo-japonicum Imaz. 80Polyporaceae Ganoderma neo-japonicum Imaz. 80
Polyporaceae Trametes dickinsii Berk. 70Polyporaceae Trametes dickinsii Berk. 70
Polyporaceae Oxyporus ravidus (Fr.) Bond, et Sing. 60Polyporaceae Oxyporus ravidus (Fr.) Bond, et Sing. 60
Polyporaceae—* Hirschioporusfusco-violaceus(Fr.)Donk 60Polyporaceae— * Hirschioporusfusco-violaceus (Fr.) Donk 60
Polyporaceae Coltrioiaperennis(Fr.)Murrill 80Polyporaceae Coltrioiaperennis (Fr.) Murrill 80
Polyporaceae Favolusalveolarius(Fr.)Quel. 80Polyporaceae Favolusalveolarius (Fr.) Quel. 80
Zu 2,5 kg von getrocknetem und pulverisiertem Myzel von Coriolus hirsuius (Fr.) Quel wurden 751 destilliertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde zum Zwecke der Extraktion unter Rühren in einem Glasgefäß 3 Kunden lang auf 95 bis 100° C erh itzt, wobei gelegentlich etwas destilliertes Wasser in der Weise ergänzt wurde, daß das Gemisch nach dem Erlvizen auf eine Menge von 251 eingeengt war. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde zunächst durch c-ir Tuch, dann durch ein Filterpapier filtriert und das Filtrat anschließend unter verringertem Druck auf 2,5 1 «.ingeengt. Nach Zufügen von 2 kg Ammoniumsulfat wurde das Gemisch kräftig gerührt, über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen durch ein Filterpapier filtriert Der Rückstand auf dem Filterpapier wurde mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (101) gewaschen und anschließend in 24 1 so destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde dann auf eine Säule mit Duolite C-25-D und anschließend auf eine Säule mit Amberlite IRA-400 gegeben, um das überschüssige Ammoniumsulfat zu entfernen. Der Auslauf wurde unter vermindertem Druck auf 500 ml eingeengt und auf eine Säule mit Scphadex G-75 gegeben. Diese Säule wurde zusätzlich mit 101 Waschwasser beaufschlagt, wobei die Fraktion mit dem höchsten Molekulargewicht gesammelt und der Gefriertrocknung unterworfen wurde. Nach der Trocknung wurden 3,26 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz erhalten.To 2.5 kg of dried and powdered mycelium from Coriolus hirsuius (Fr.) Quel were 751 distilled Given water. The mixture was placed in a glass vessel 3 with stirring for the purpose of extraction The customer is heated to 95 to 100 ° C for a long time, occasionally adding a little distilled water in such a way that that the mixture was concentrated to an amount of 25 liters after the Erlvizen. After cooling to room temperature was first filtered through c-ir cloth, then through a filter paper and the filtrate then under reduced pressure to 2.5 liters. After adding 2 kg of ammonium sulfate, the mixture became vigorous stirred, left to stand overnight and filtered through a filter paper the next morning. The residue is taken up The filter paper was washed with a saturated ammonium sulfate solution (101) and then in 24 liters of so dissolved in distilled water. The solution was then put on a column of Duolite C-25-D and then on placed on a column of Amberlite IRA-400 to remove the excess ammonium sulfate. The outlet was concentrated to 500 ml under reduced pressure and applied to a column of Scphadex G-75. These Column was additionally charged with 101 washing water, whereby the fraction with the highest molecular weight was collected and subjected to freeze-drying. After drying, 3.26 g of a light gray to white powdery substance obtained.
Die auf diese Weise erhaltene Substanz wurde mit Hilfe der im vorstehenden beschriebenen Tests als Polysaccharid identifiziert Diese Substanz wurde gemeinsam mit anderen Polysacchariden, die aus dem Myzel anderer Polyporaceae nach dem im vorstehenden beschriebenen Verfahren erhalten wurden, auf ihre antikarzinogene Wirksamkeit hin untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.The substance thus obtained was tested using the tests described above as Polysaccharide Identified This substance was identified in common with other polysaccharides derived from the mycelium other Polyporaceae obtained by the method described above for their anticarcinogens Effectiveness examined. The results are shown in Table 4.
Das für diese Versuche benutzte Myzel wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhalten.The mycelium used for these experiments was obtained in the manner described in Example 1.
Familiefamily
Organismusorganism
Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma-180Efficacy against solid cancer Sarcoma-180
Polyporaceae Porodiscuius penduius (Schw.) Murr:!!Polyporaceae Porodiscuius penduius (Schw.) Murr: !!
Polyporaceae Fomitopsis cytisina (Berk.) Bond, et Sing.Polyporaceae Fomitopsis cytisina (Berk.) Bond, et Sing.
Polyporaceae Polyporus caeruleoprus PeckPolyporaceae Polyporus caeruleoprus Peck
Polyporaceae Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst.Polyporaceae Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst.
Polyporaceae Polyporellus brumalis (Fr.) Karst.Polyporaceae Polyporellus brumalis (Fr.) Karst.
Polyporaceae —► CoriolushirsutusiFr.JQuel.Polyporaceae - ► CoriolushirsutusiFr.JQuel.
Polyporaceae Coriolellus heteromorphus (Fr.) Bond, et Sing.Polyporaceae Coriolellus heteromorphus (Fr.) Bond, et Sing.
Polyporaceae —* Coriolus conchifer (Schw.) Pat.Polyporaceae - * Coriolus conchifer (Schw.) Pat.
Polyporaceae Fomitopsis latissima (Bres.) Imazeki, comb. nov.Polyporaceae Fomitopsis latissima (Bres.) Imazeki, comb. nov.
Polyporaceae Polyporellus elegans (Fr.) Karst.Polyporaceae Polyporellus elegans (Fr.) Karst.
Polyporaceae Pclyporus dispansus LloydPolyporaceae Pclyporus dispansus Lloyd
Polyporaceae Trachyderma tsunodae (Yasuda) ImazekiPolyporaceae Trachyderma tsunodae (Yasuda) Imazeki
Polyporaceae Lenzites betulina Fr.Polyporaceae Lenzites betulina Fr.
60 60 90 80 90 90 70 70 80 90 60 60 9060 60 90 80 90 90 70 70 80 90 60 60 90
Nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde eine Kultur von Fomitopsis rhodophaea (Lev.) Imaz. gezogen, und die Nährflüssigkeit wurde zur Entfernung des Myzels durch ein Tuch filtriert Das erhaltene Filtrat (i001) wurde unter vermindertem Druck auf 151 konzentriert und mit 12,75 kg Ammoniumsulfat versetzt. Das zugefügte Salz wurde anschließend unter Rühren gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen eine Stunde lang bei 6000 G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Rückstand in 3 I destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2550 g Ammoniumsulfat gegeben und die Mischung erneut über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde eine Stunde lang bei 6000G zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt. Der schließlich erhaltene Niederschlag wurde in 31 destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch ein Papier mit der Porenweite Nr. 2 filtriert und das in eine Cellophanzelle gegebene Filtrat anschließend 50 Stunden lang in strömendem Wasser dialysiert. Die in der Zelle gesammelte Flüssigkeit wurde bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 11 eingeengt und in der Weise mit Trichloressigsäure versetzt, daß, bezogen auf die Gesamtlösung, eine Konzentration der Trichloressigsäure von 4 Gew.-% erhalten wurde. Die Lösung wurde über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und anschließend eine Stunde lang bei 10 000 G zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde wiederum in eine Cellophanzelle gegeben und weitere 150 Stunden lang bei 10° C dialysiert Die in der Zelle gesammelte Flüssigkeit wurde bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 11 eingeengt und anschließend mit 31 Äthanol versetzt. Die erhaltene Mischung wurde über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen durch Zentrifugieren (15 Minuten bei 1500 G) der Niederschlag, der sich gebildet hatte, abgetrennt, mit absolutem Äthanol, Aceton und Äther gewaschen und getrocknet. Es wurden 19,2 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz erhalten.A culture of Fomitopsis rhodophaea (Lev.) Imaz. and the nutrient liquid was filtered through a cloth to remove the mycelium. The resulting filtrate (i001) was concentrated to 151 under reduced pressure, and 12.75 kg of ammonium sulfate were added. The added salt was then dissolved with stirring. The resulting solution was left to stand in the refrigerator overnight and centrifuged at 6000 G for one hour the next morning. The supernatant liquid was decanted and the residue was dissolved in 3 l of distilled water. 2550 g of ammonium sulfate were added to this solution and the mixture was again left to stand in the refrigerator overnight. The next morning it was centrifuged at 6000G for one hour. This procedure was repeated five times. The precipitate finally obtained was dissolved in 31% of distilled water. The solution was filtered through No. 2 pore size paper, and the filtrate placed in a cellophane cell was then dialyzed in flowing water for 50 hours. The liquid collected in the cell was concentrated to 11 at room temperature under reduced pressure, and trichloroacetic acid was added so that the trichloroacetic acid concentration was 4% by weight based on the total solution. The solution was left to stand in the refrigerator overnight and then centrifuged at 10,000 G for one hour. The supernatant was again placed in a cellophane cell and dialyzed at 10 ° C for another 150 hours. The liquid collected in the cell was vacuumed at room temperature 11 concentrated and then treated with 31 ethanol. The mixture obtained was left to stand overnight and the next morning the precipitate which had formed was separated off by centrifugation (15 minutes at 1500 G), washed with absolute ethanol, acetone and ether and dried. 19.2 g of a light gray to white, powdery substance were obtained.
In Tabelle 5 sind die Ergebnisse der Tests auf die antikarzinogene Wirksamkeit des auf diese Weise erhaltenen Mucoplysaccharids zusammen mit den Ergebnissen für andere Mucopolysaccharide dargestellt, die in der gleichen Weise aus anderen Polyporaceae erhalten wurden.In Table 5 are the results of tests on the anticarcinogenic efficacy of the thus obtained Mucopolysaccharide presented along with the results for other mucopolysaccharides included in the similarly obtained from other Polyporaceae.
55 Polyporaceae Polyporaceae55 Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae PolyporaceaePolyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
65 Polyporaceae65 Polyporaceae
Fomitopsis rhodophaea (Lev.) Imaz.Fomitopsis rhodophaea (Lev.) Imaz.
Coltricia pusilla Imazeki etYsk-Kobayashi Polyporellus picipes (Fr.) KarstColtricia pusilla Imazeki etYsk-Kobayashi Polyporellus picipes (Fr.) Karst
Daedaleopsis styracina (P. Henn et Shir.) Imazeki Gloeophyllum saepiarium (Fr.) Karst Fomitopsis officinalis (Fr.) Bond, et Sing.Daedaleopsis styracina (P. Henn et Shir.) Imazeki Gloeophyllum saepiarium (Fr.) Karst Fomitopsis officinalis (Fr.) Bond, et Sing.
4235 531 0,934235 531 0.93
40,02 41,4140.02 41.41
5,1! 0,60 634 0,615.1! 0.60 634 0.61
4230 631 037 3835 6,88 0,22 42,94 5,16 0,614230 631 037 3835 6.88 0.22 42.94 5.16 0.61
300 300 300 300 300 300300 300 300 300 300 300
80 100 70 80 60 8080 100 70 80 60 80
70 90 60 90 60 8070 90 60 90 60 80
Eine Kühlflüssigkeit von Ganoderma tsugae Murrill, die in der gleichen Weise wie in Seispiel 5 beschrieben erhalten worden war. wurde zur Entfernung des Myzels durch ein Tuch filtriert Je 451 des Filtrats wurden bei Zimmertemperatur unter verringertem Druck auf 4,51 eingeengt. Die unlöslichen Rückstände wurden durch Zentrifugieren (20 Minuten bei 1300 G) entfernt 3285 g Ammoniumsulfat wurden zu der überstehenden Flüssigkeit hinzugefügt das Gemisch wurde gut gerührt und über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde erneut 20 Minuten bei 1500 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde gesammelt mit 31 gesättigter Ammoniumsulfatlösung homogenisiert und erneut 20 Minuten lang bei 1500G zentrifugiert Der so erhaltene Rückstand wurde in einem Liter destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine mit Salzsäure aktivierte Amberlite lR-120-Säule gegeben, um einen Teil der Proteine und einen Teil des Ammoniumsulfats zu entfernen. Anschließend wurde die Säule mit 51 destilliertem Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Auslauf vereinigt und anschließend bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 1,51 eingeengt Der eingeengten Flüssigkeit wurde bis zu einer Gesamtkonzentration von 3,5 Gew.-% Trichloressigsäure zugesetzt Der Ansatz wurde über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und zur Abtrennung der Proteine am nächsten Morgen 40 Minuten lang mit 10 000 G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule mit Duolite A-7 gegeben, die mit 4%iger Sodalösung aktiviert worden war. Dadurch wurde das restliche Ammoniumsulfat und die farbigen Nebenprodukte abgetrennt Die Säule wurde anschließend mit 51 destilliertem Wasser gewaschen und das Waschwasser dem vorher erhaltenen Durchlauf hinzugefügt Die vereinigten Durchläufe wurden bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 1,51 eingeengt. Zu der eingeengten Flüssigkeit wurden 4,5 I Äthanol hinzugefügt das Gemisch wurde über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen 20 Minuten lang mit 1400 G zentrifugiert. Der Niederschlag wurde gesammelt und in zwei Litern 75°/oigem Äthanol aufgenommen und homogenisiert und erneut 20 Minuten lang mit 1400 G zentrifugiert Diese Behandlung wurde fünfmal wiederholt und der schließlich erhaltene Rückstand nacheinander mit absolutem Äthanol, Aceton und Äther gewaschen und anschließend getrocknet Die Ausbeute a.. hellgrauem bis weißem Pulver betrug 2,5 g.A cooling liquid from Ganoderma tsugae Murrill prepared in the same manner as in Example 5 had been received. was filtered through a cloth to remove the mycelium. 451 each of the filtrate were used in Concentrated to 4.51 at room temperature under reduced pressure. The insoluble residues were through Centrifugation (20 minutes at 1300 G) removed 3285 g of ammonium sulfate was added to the supernatant liquid, the mixture was stirred well and left to stand in the refrigerator overnight. The next It was centrifuged again at 1500 G for 20 minutes tomorrow. The residue was collected with 31 saturates Ammonium sulfate solution homogenized and centrifuged again for 20 minutes at 1500G The residue was dissolved in one liter of distilled water and applied to an Amberlite IR-120 column activated with hydrochloric acid to remove some of the proteins and some of the ammonium sulfate. The column was then washed with distilled water and the wash water with the outlet combined and then concentrated to 1.5 l at room temperature under reduced pressure. Trichloroacetic acid was added to the concentrated liquid up to a total concentration of 3.5% by weight The batch was left to stand in the refrigerator overnight and the next to separate the proteins Centrifuged at 10,000 G for 40 minutes tomorrow. The supernatant liquid was passed through a column with Duolite A-7, which had been activated with 4% soda solution. This separated the remaining ammonium sulfate and the colored by-products. The column was then distilled with 51% Washed water and the wash water added to the previously obtained run. The combined run was concentrated to 1.5 liters at room temperature under reduced pressure. 4.5 l of ethanol were added to the concentrated liquid and the mixture was left to stand overnight and the next morning Centrifuged at 1400 G for 20 minutes. The precipitate was collected and poured into two liters of 75% Ethanol was taken up and homogenized and centrifuged again for 20 minutes at 1400 G. This treatment was repeated five times and the residue finally obtained was successively washed with absolute ethanol, Acetone and ether washed and then dried. The yield a .. light gray to white powder was 2.5 g.
In Tabelle 6 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so erhaltenen Mucopolysaccharids mit den Ergebnissen zusammengefaßt, die für andere Mucopolysaccharide erhalten wurden, die in der gleichen Weise aus anderen Polyporaceae erhalten worden waren.Table 6 shows the results of the tests for demonstrating the anticarcinogenic effectiveness of the so obtained mucopolysaccharide are combined with the results obtained for other mucopolysaccharides obtained in the same manner from other Polyporaceae.
Durch Inkubation in 300 ml einer Nährflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung: Zusammensetzung (I):By incubation in 300 ml of a nutrient liquid with the following composition: Composition (I):
6060
wurde nach dem stationären Verfahren nach 14 Tagen bei 23 bis 25°C ein Myzel von Tramets gibbosa Fr. erhalten. Das Myzel wurde mit 100 ml einer aphysiologischen Salzlösung homogenisiert und zur Impfung in 23 1after 14 days at 23 to 25 ° C, a mycelium of Tramets gibbosa Fr. obtain. The mycelium was homogenized with 100 ml of an aphysiological saline solution and for inoculation in 23 1
eines Nihrbodens in einen 361 fassenden Fermentierbottich aus rostfreiem Stahl gegeben.one bottom into a 361 capacity stainless steel fermentation vat.
Der Nährboden, der die im folgenden angegebene Zusammensetzung hatte, war 30 Minuten lang bei 1200C sterilisiert worden:The nutrient medium, which had the composition given below, had been sterilized at 120 ° C. for 30 minutes:
Der Nährboden wurde der aeroben Inkubation unterworfen, und zwar 10 Tage lang bei einer Rührgeschwindigkeit von 110 bis 120 U/min und 23 bis 25° C und einer Belüftungsrate von 0,15 Liter/Liter/min.The medium was subjected to aerobic incubation for 10 days at a stirring speed of 110 to 120 rpm and 23 to 25 ° C. and an aeration rate of 0.15 liters / liter / min.
Der Nährboden (151) wurde durch ein Tuch filtriert und das Filtrat bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf einen Liter eingeengt Dem Konzentrat wurden 850 g Ammoniumsulfat zugesetzt, das Gemisch anschließend gut gerührt und Ober Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde 20 Minuten lang mit 1600G zentrifugiert. Der so erhaltene Rückstand wurde in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und die erhaltene Lösung ultrafiltriert, wobei ein Ultrafilter Modell 2000 mit einer Diaflo-Membran UM-2 (Amicon Corporation, USA) verwendet wurde. Es wurde 150 Stunden lang unter einem Druck von 6,87 bar (7 kg/cm2) filtriert Die im Filter gesammelte Flüssigkeit wurde in ein 3-Liter-Becherglas gegeben und bis zu einer Gesamtkonzentration von 3 Gew.-% mit Trichloressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde gut durchgerührt, über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen eine Stunde lang bei 10 000 G zsntrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Duolite A-7-Säule gegeben, die mit 4%iger NaOH-Lösung behandelt worden war. Die Säule wurde anschließend mit 31 destilliertem Wasser gewaschen, wobei das Waschwasser mit dem vorher erhaltenen Durchlauf vereinigt wurde. Die vereinigten Durchläufe wurden unter vermindertem Druck auf einen Liter eingeengt. Dem Konzentrat wurden 31 Aceton zugesetzt und der so erhaltene Niederschlag wurde mit reinem Aceton und mit Äther gewaschen und anschließend getrocknet. Es wurden 3,0 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.The nutrient medium (151) was filtered through a cloth and the filtrate was concentrated to one liter at room temperature under reduced pressure. 850 g of ammonium sulfate were added to the concentrate, and the mixture was then stirred well and left to stand in the refrigerator overnight. The next morning it was centrifuged at 1600G for 20 minutes. The residue thus obtained was dissolved in one liter of distilled water and the resulting solution was ultrafiltered using an ultrafilter model 2000 with a Diaflo UM-2 membrane (Amicon Corporation, USA). It was filtered for 150 hours under a pressure of 6.87 bar (7 kg / cm 2 ). The liquid collected in the filter was placed in a 3 liter beaker and trichloroacetic acid was added to a total concentration of 3% by weight. The mixture was stirred well, left in the refrigerator overnight and centrifuged at 10,000 G for one hour the next morning. The supernatant was applied to a Duolite A-7 column which had been treated with 4% NaOH solution. The column was then washed with 31% of distilled water, the wash water being combined with the previously obtained run-through. The combined runs were concentrated to one liter in vacuo. Acetone was added to the concentrate, and the precipitate thus obtained was washed with pure acetone and with ether and then dried. 3.0 g of a light gray to white powder were obtained.
In Tabelle 7 sind die Ergebnisse der Prüfungen auf die antikarzinogene Wirksamkeit des so erhaltenen Mucopolysaccharids zusammen mit den Ergebnissen für die anderen Mucopolysaccharide wiedergegeben, die nach dem im vorstehenden genannten Verfahren aus anderen Polyporaceae erhalten wurden.In Table 7 are the results of the anticarcinogenic efficacy tests of the thus obtained Mucopolysaccharide is given along with the results for the other mucopolysaccharides that obtained from other Polyporaceae by the above process.
analyseanalysis
C HC H
aufon
Zuckersugar
basisBase
(%)(%)
mg/kgmg / kg
grad gegenstraight against
festen Krebssolid cancer
Sarcoma-180Sarcoma-180
(%)(%)
grad gegenstraight against
festen Krebssolid cancer
vom Ehrlich-from the honest
Typ(%)Type(%)
(Fr.) Karst(Fr.) Karst
Coriolus pubescensCoriolus pubescens
(Fr.)Qu6l.(Fr.) Qu6l.
Tyromyces lacteusTyromyces lacteus
/Cr \ Murr/ Cr \ Murr
Polyporus confluensPolyporus confluens
(A. et S.) Fr.(A. et S.) Fr.
Microporus af finisMicroporus af finis
(Blume et Nees) Kuntze(Blume et Nees) Kuntze
Trametes gibbosa Fr.Trametes gibbosa Fr.
5,595.59
5,865.86
38,2038.20
39,2539.25
0.200.20
0,250.25
300300
300300
7070
8080
8080
9090
PolyporaceaePolyporaceae
PolyporaceaePolyporaceae
220 1-Liter-Inkubationsflaschen wurden mit je 200 ml einer Malzextrakt-Nährflüssigkeit der folgenden ZusamiTK Setzung gefüllt:220 1 liter incubation bottles were filled with 200 ml each of a malt extract nutrient liquid with the following composition:
Malzextrakte (Difco) WasserMalt extracts (Difco) water
50 g 1 Liter50 g 1 liter
Die Flaschen wurden mit Wattestopfen verschlossen, 30 Minuten lang bei 1200C sterilisiert, zum Abkühlen stehengelassen und anschließend mit einem Myzel von Fomhopsis castanea Imaz. geimpft, das auf einer Schrägfläche gezogen worden war. Die stationäre Inkubation wurde über 20 Tage bei 25 bis 28° C durchgeführt Zur Entfernung des Myzels wurde der fermentierte Nährboden anschließend durch ein Filtertuch filtriert Das Filirat wurde ultrafiltriert, wobei eine Diaflo-Membran UM-2 bei einem Druck von 637 bar {7,0 kg/cm2) benutzt wurde. Die durch die Ultrafiltration auf 31 eingeengte Flüssigkeit wurde aus dem Filter ausgetragen und zur Entfernung der Rückstände 15 Minuten lang bei 1500G zentrifugiert Der überstehenden Flüssigkeit wurden 2550 g Ammoniumsulfat zugesetzt Das Gemisch wurde über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen 15 Minuten lang mit 1500 G zentrifugiert Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde in 31 einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung aufgenommen und homogenisiert und erneut 15 Minuten lang bei 1500 G zentrifugiert Diese Behandlung wurde fünfmal wiederholt, worauf die Flüssigkeit auf eine Amberlitc IR-200-Säule gegeben wurde, die mit 1 η Salzsäure aktiviert worden war. Die Säule wurde anschließend mit einem Liter destilliertem Wasser gewaschen, das dem vorher erhaltenen Durchlauf zugefügt wurde. Die vereinigten Durchläufe wurden über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 30 Minuten lang mit 10 000 G zentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit auf eine aktivierte Dowex 1-Säule gegeben. Der Durchlauf wurde bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf einen Liter eingeengt, mit 31 Äthanol versetzt und der nach der Filtration erhaltene Rückstand der Reihe nach mit absolutem Alkohol, Aceton und Äther gewaschen und anschließend getrocknet Es wurden 103 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.The bottles were closed with cotton plugs 30 minutes sterilized at 120 0 C, allowed to stand for cooling and then with a mycelium of Fomhopsis castanea Imaz. vaccinated that had been grown on a sloping surface. The stationary incubation was carried out for 20 days at 25 to 28 ° C. To remove the mycelium, the fermented nutrient medium was then filtered through a filter cloth kg / cm 2 ) was used. The liquid concentrated by ultrafiltration was discharged from the filter and centrifuged at 1500 G for 15 minutes to remove the residues. 2550 g of ammonium sulfate was added to the supernatant liquid. The mixture was left to stand overnight and centrifuged at 1500 G for 15 minutes the next morning residue obtained in this way was taken up in 31% of a saturated ammonium sulfate solution and homogenized and centrifuged again for 15 minutes at 1500 G. This treatment was repeated five times, whereupon the liquid was applied to an Amberlitc IR-200 column which had been activated with 1 η hydrochloric acid was. The column was then washed with one liter of distilled water added to the previously obtained run-through. The pooled runs were left in the refrigerator overnight and centrifuged at 10,000 G for 30 minutes the next morning. The residue obtained in this way was separated off and the supernatant liquid was applied to an activated Dowex 1 column. The run-through was concentrated to one liter at room temperature under reduced pressure, treated with 31% ethanol and the residue obtained after filtration was washed in succession with absolute alcohol, acetone and ether and then dried. 103 g of a light gray to white powder were obtained.
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so erhaltenen Mucopolysaccharids zusammen mit den Ergebnissen anderer Mucopolysaccharide wiedergegeben, die aus verschiedenen anderen Polyporaceae nach dem im vorstehenden beschriebenen Verfahren erhalten worden waren.Table 8 shows the results of the tests for demonstrating the anti-carcinogenic effectiveness of the so obtained mucopolysaccharide together with the results of other mucopolysaccharides, obtained from various other Polyporaceae by the method described above had been.
Polyporaceae PolyporaceaePolyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae PolyporaceaePolyporaceae Polyporaceae
Favolus arcularius (Fr.) ArnesFavolus arcularius (Fr.) Arnes
Gloeoporus amorphus (Fr.) Clem et Shear Fomitopsis castanea Imaz. Ischnoderma resinosum (Fr.) Karst.Gloeoporus amorphus (Fr.) Clem et Shear Fomitopsis castanea Imaz. Ischnoderma resinosum (Fr.) Karst.
39.48 6,21 0,50 38,31 5,81 0,%39.48 6.21 0.50 38.31 5.81 0.%
39,69 41,9939.69 41.99
5,15
5,765.15
5.76
0,72 0,790.72 0.79
300
300300
300
300
300300
300
90 9090 90
90 7090 70
100 90100 90
100
80100
80
Unter ständigem Hinzufügen von Wasser wurden 40 g Maismehl drei Stunden lang bei 100° in einem Liter Wasser gekocht. Nach Abkühlen wurde der Brei filtriert und wurden dem Filtrat 10 g Rohrzucker zugesetzt. 813 1-l-lnkubationsflaschen wurden mit je 180 ml dieses Kornextrakt-Nährbodens gefüllt. Die Flaschen wurden mit Wattebäuschen verschlossen und 30 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurden sie mit zuvor kultiviertem Myzel von Rigidoporus ulmarius (Fr.) Imaz. geimpft. Die stationäre Inkubation wurde 20 Tage lang bei 23 bis 27°C durchgeführt. Anschließend wurde das Myzel von dem fermentierten Nährboden abgetrennt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur auf 101 eingeengt und mit 8,5 kg Ammoniumsulfat versetzt. Nach kräftigem Durchrühren wurde die Flüssigkeit über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen filtriert. Der auf dem Filterpapier verbliebene Rückstand wurde mit 51 einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gewaschen, in 2 I destilliertem Wasser gelöst und anschließend 60 Stunden lang in strömendem Wasser dialysiert, wobei eine Cellophanzell<» benutzt wurde. Die Lösung in der Cellophanzelle wurde anschließend auf einen Liter eingeengt und bis zu einer Konzentration von 3,5 Gew.-% mit Trichloressigsäure versetzt. Nach erneutem Stehenlassen über Nacht im Kühlschrank wurde am nächsten Morgen 30 Minuten lang mit 10 000 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit der Ultrafiltration unterworfen, wobei eine Diaflo-Membran UM-2 mit einem Durchmesser von 150 mm bei einem Druck von 6,87 bar (7 kg/cm2) benutzt wurde. Die Filtration und das Waschen wurden mit 160 I destilliertem Wasser durchgeführt. Durch die Ultrafiltration wurde ein Einengen auf 600 ml erreicht. Zu der eingeengten Flüssigkeit wurden 1,8 I Äthanol gegeben und die Mischung anschließend über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde 20 Minuten lang mit 1600 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 3 I destilliertem Wasser aufgenommen und das überschüssige Äthanol unter ständiger Ergänzung des Wassers bei vermindertem Druck entfernt. Durch Gefriertrocknung dieser Flüssigkeit wurden 29,1 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.With constant addition of water, 40 g of corn flour were boiled for three hours at 100 ° in one liter of water. After cooling, the slurry was filtered and 10 g of cane sugar was added to the filtrate. 813 1 l incubation bottles were each filled with 180 ml of this grain extract nutrient medium. The bottles were sealed with cotton balls and sterilized at 120 ° C. for 30 minutes. After cooling to room temperature, they were treated with previously cultivated mycelium from Rigidoporus ulmarius (Fr.) Imaz. vaccinated. The stationary incubation was carried out at 23 to 27 ° C for 20 days. The mycelium was then separated from the fermented nutrient medium. The filtrate was concentrated to 101 under reduced pressure at room temperature, and 8.5 kg of ammonium sulfate were added. After stirring vigorously, the liquid was left to stand in the refrigerator overnight and filtered the next morning. The residue remaining on the filter paper was washed with a saturated ammonium sulfate solution, dissolved in 2 l of distilled water and then dialyzed in flowing water for 60 hours using a cellophane cell. The solution in the cellophane cell was then concentrated to one liter and trichloroacetic acid was added to a concentration of 3.5% by weight. After standing again overnight in the refrigerator, centrifugation was carried out at 10,000 G for 30 minutes the next morning. The residue was separated off and the supernatant liquid was subjected to ultrafiltration, using a Diaflo UM-2 membrane with a diameter of 150 mm at a pressure of 6.87 bar (7 kg / cm 2 ). Filtration and washing were carried out with 160 liters of distilled water. The ultrafiltration achieved a concentration to 600 ml. 1.8 l of ethanol were added to the concentrated liquid and the mixture was then left to stand in the refrigerator overnight. The next morning it was centrifuged at 1600 G for 20 minutes. The residue was taken up in 3 l of distilled water and the excess ethanol was removed under reduced pressure with constant replenishment of the water. Freeze-drying this liquid gave 29.1 g of a light gray to white powder.
In Tabelle 9 sind die Ergebnisse der Prüfungen auf die antikarzinogene Wirksamkeit des so erhaltenen Mucopolysaccharids zusammen mit den Ergebnissen für andere Mucopolysaccharide wiedergegeben, die aus verschiedenen anderen Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten worden waren.In Table 9 are the results of the anticarcinogenic efficacy tests of the thus obtained Mucopolysaccharide is given along with the results for other mucopolysaccharides obtained from various other Polyporaceae were obtained by the same procedure.
25 30 35 4025 30 35 40
5050
5555
6060
6565
Polyporaceae PolypoFjjCeae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae PolyporaceaePolyporaceae PolypoFjjCeae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray Hirschioporus versetiiis (Berk.) Imaz. Laetiporus versisporus (Lloyd) Imazeki Rigidoporus durus (Jungh.) Imaz. Polyporellus aquamosus (Fr.) Karst Rigidoporus ulmarius (Fr.) Imaz.Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray Hirschioporus versetiiis (Berk.) Imaz. Laetiporus versisporus (Lloyd) Imazeki Rigidoporus durus (Jungh.) Imaz. Polyporellus aquamosus (Fr.) Karst Rigidoporus ulmarius (Fr.) Imaz.
39,06 6,77 032 300 100 9039.06 6.77 032 300 100 90
42.65 537 0,25 300 70 7042.65 537 0.25 300 70 70
39.01 5,47 0,43 300 90 10039.01 5.47 0.43 300 90 100
42,71 6.74 0.62 300 100 10042.71 6.74 0.62 300 100 100
40.48 5,25 0,17 300 80 9040.48 5.25 0.17 300 80 90
42,01 5,21 0.97 300 70 8042.01 5.21 0.97 300 70 80
Das vorstehende Beispiel wurde mit den in der folgenden Tabelle 9a angegebenen Stämmen der Polyporaceaefamilie nachgearbeitet, wobei sich innerhalb der Fehlergrenzen die gleichen Ergebnisse ergaben wie in Beispiel 9. Für den Stamm Coriolus versicolor (Fr.) wurde der Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma 180 untersucht und zeigte gemäß der hier angegebenen Methode einen Wirkungsgrad von 100.The above example was reworked with the strains of the Polyporaceae family given in Table 9a below, the same results being obtained within the error limits as in Example 9. For the strain Coriolus versicolor (Fr.) the degree of effectiveness against solid cancer Sarcoma was 180 investigated and showed an efficiency of 100 according to the method given here.
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae PolyporaceaePolyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Trametes trogii Berkeley Fomitopsis rhodophaea(Lev.) Imaz. Coltricia pusilla Imazeki et Ysk. Kobayashi Polyporeilus pioipes(Fr.) Karst. Coriolus pargamenus (Fr.) Pat Tyromyces guttulatus (Pk.) Murr. Polyporus tuberaster Fr. Daedaleopsis nippenica Imazeki Coltrica dependens (Berk, et Curt.) Imaz. Polyporus ovinus Fr. Fomitopsis insularis (Murr.) imaz. Ganoderma tsugae Murrill Grifola albicans Imazeki Coriolus versicolor (Fr.) Qu6l. Grifola umbellata (Fr.) Pilät Piptoporus betulinus (Fr.) Karst. Daedaleopsis tricolor (Fr.) Bond, et Sing. Ganoderma boninense Pat. Trametes orientalis (Yas.) Irnaz. Favolus emerici (Cooke) Imazeki Fomitopsis pubertatis (Lloyd) Imaz. Fomitopsis vinosa (Berk.) Imaz. Porodisculus pendulus (Schw.) Murrill Fomitopsis cytisina (Berk.) Bond, et Sing. Polyporus caeruleoprus Peck Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst. Polyporus dispansus Lloyd Trachyderma tsunodae (Yasuda) Imaz. Lenzites betulina Fr. Fomitopsis rosea (Fr.) Karst. Oxyporus ravidus (Fr.) Bond, et Sing. Hirschioporus fuscoviolaces (Fr.) Donk Coltricia perennis (Fr.) Murr. Favolus aiveolarius (Fr.) Quel. Grifola gigantea (Fr.) Pilät Tyromyces caesius (Fr.) Karst. Trametes sanguinea (Fr.) Lloyd Elfvingia applanata (Pers.) Karst.Trametes trogii Berkeley Fomitopsis rhodophaea (Lev.) Imaz. Coltricia pusilla Imazeki et Ysk. Kobayashi Polyporeilus pioipes (Fr.) Karst. Coriolus pargamenus (Fr.) Pat Tyromyces guttulatus (Pk.) Murr. Polyporus tuberaster Fr. Daedaleopsis nippenica Imazeki Coltrica dependens (Berk, et Curt.) Imaz. Polyporus ovinus Fr. Fomitopsis insularis (Murr.) Imaz. Ganoderma tsugae Murrill Grifola albicans Imazeki Coriolus versicolor (Fr.) Qu6l. Grifola umbellata (Fr.) Pilät Piptoporus betulinus (Fr.) Karst. Daedaleopsis tricolor (Fr.) Bond, et Sing. Ganoderma boninense Pat. Trametes orientalis (Yas.) Irnaz. Favolus emerici (Cooke) Imazeki Fomitopsis pubertatis (Lloyd) Imaz. Fomitopsis vinosa (Berk.) Imaz. Porodisculus pendulus (Schw.) Murrill Fomitopsis cytisina (Berk.) Bond, et Sing. Polyporus caeruleoprus Peck Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst. Polyporus dispansus Lloyd Trachyderma tsunodae (Yasuda) Imaz. Lenzites betulina Fr. Fomitopsis rosea (Fr.) Karst. Oxyporus ravidus (Fr.) Bond, et Sing. Hirschioporus fuscoviolaces (Fr.) Donk Coltricia perennis (Fr.) Murr. Favolus aiveolarius (Fr.) Quel. Grifola gigantea (Fr.) Pilät Tyromyces caesius (Fr.) Karst. Trametes sanguinea (Fr.) Lloyd Elfvingia applanata (Pers.) Karst.
1212th
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae PolyporaceaePolyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Hirschiopcrus abietinus (Fr.) Donk Tyromyces incarnatus Imazcki Amauroderma scopulosum(Berk.) lmaz. Polyporus pes-caprae Fr. Microporusflabelliforrnis(Fr.) Kuntze Coriolus biformis (Klotz.) Pat. Fomes fomentarius (Fr.) Kickx Ganoderma neo-japonicum lmaz.Hirschiopcrus abietinus (Fr.) Donk Tyromyces incarnatus Imazcki Amauroderma scopulosum (Berk.) Lmaz. Polyporus pes-caprae Fr. Microporusflabelliforrnis (Fr.) Kuntze Coriolus biformis (Klotz.) Pat. Fomes fomentarius (Fr.) Kickx Ganoderma neo-japonicum lmaz.
Beispiel 10Example 10
1324 1-1-lnkubationsflaschen wurden mit je 200 ml einer Nährflüssigkeit gefüllt, die die folgende Zusammensetzung hatte:1324 1-1 incubation bottles were filled with 200 ml of a nutrient liquid each, which had the following composition:
Die eingefüllte Nährflüssigkeit wurde durch 30 Minuten langes Erwärmen auf 120° C sterilisiert und anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die Flüssigkeit wurde mit einem Myzel von Ganoderma boninense Pat geimpft, das zuvor nach der stationären Inkubation (21 Tage bei 20 bis 23°C) erhalten worden war. Zur Entfernung des Myzels wurde die Nährflüssigkeit nach der Inkubation filtriert und das Filtrat bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 101 eingeengt. Dem Konzentrat wurden 301 Äthanol zugesetzt, und nach Stehen über Nacht im Kühlschrank wurde am nächsten Morgen durch Filterpapier filtriert Der Rückstand auf dem Filterpapier wurde mit absolutem Äthanol und anschließend mit reinem Aceton und Äther gewaschen und anschließend getrocknet Der getrocknete Rückstand wurde in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und zur Entfernung unlöslicher Rückstände durch ein Filterpapier Nr. 5C filtriert. Das Filtrat wurde mit 850 g Ammoniumsulfat versetzt und gut durchrührt, über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen mit 1500G zentrifugiert. Der Rückstand wurde gesammelt, in einem Liter gesättigter Ammoniumsulfatlösung aufgenommen und homogenisiert und erneut 15 Minuten lang mit 1500G zentrifugiert Diese Behandlung wurde sechsmal wiederholt und der schließlich erhaltene Rückstand in einem Liter destilliertem Wasser aufgelöst und durch ein Filterpapier Nr. 2 filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander auf eine aktivierte Duolite C-27- und auf eine Amberlite IR-401-Säule gegeben, mit 2 I destilliertem Wasser gewaschen, wobei das Waschwasser wiederum den Durchläufen zugesetzt wurde, wobei die so vereinigten Durchliufe anschließend bei vermindertem Druck und Zimmertemperatur auf 830 ml eingeengt wurden. Dem Konzentrat wurden 2490 ml reines Aceton zugefügt, worauf das Gemisch über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 15 Minuten lang mit 1500G zentrifugiert wurde. Der Rückstand wurde aufgenommen, mit 31 75%igem Aceton gewaschen und anschließend in 31 destilliertem Wasser gelöst Unter ständigem Wasserzulauf wurde das Aceton unter vermindertem Druck abgezogen und die so erhaltene Lösung der Gefriertrocknung unterworfen. Es wurden 36,7 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz erhalten.The filled nutrient liquid was sterilized by heating for 30 minutes at 120 ° C. and then cooled to room temperature. The fluid was mixed with a mycelium from Ganoderma boninense Pat inoculated, which had previously been obtained after the stationary incubation (21 days at 20 to 23 ° C). To the Removal of the mycelium, the nutrient fluid was filtered after the incubation and the filtrate was concentrated to 101 at room temperature under reduced pressure. To the concentrate, 301 ethanol was added, and gradually Standing overnight in the refrigerator was filtered through filter paper the next morning. The residue was taken up the filter paper was washed with absolute ethanol and then with pure acetone and ether and then dried The dried residue was dissolved in one liter of distilled water and used for Removal of insoluble residue, filtered through No. 5C filter paper. The filtrate was mixed with 850 g of ammonium sulfate and stirred well, left to stand in the refrigerator overnight and the next morning centrifuged at 1500G. The residue was collected in one liter of saturated ammonium sulfate solution taken up and homogenized and centrifuged again at 1500G for 15 minutes. This treatment was repeated six times, and the residue finally obtained was dissolved in one liter of distilled water and filtered through No. 2 filter paper. The filtrate was successively on an activated Duolite C-27 and applied to an Amberlite IR-401 column, washed with 2 L of distilled water, the wash water was again added to the run-throughs, the run-throughs thus combined then being concentrated to 830 ml under reduced pressure and room temperature. The concentrate became 2490 ml pure Acetone was added, whereupon the mixture was left to stand overnight in the refrigerator and the next morning 15 Centrifuged at 1500G for minutes. The residue was taken up with 31% 75% acetone washed and then dissolved in 31% distilled water with constant water supply, the acetone stripped off under reduced pressure and the resulting solution was subjected to freeze-drying. It 36.7 g of a light gray to white powdery substance were obtained.
In Tabelle 10 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so erhaltenen Mucopolysaccharids wiedergegeben, wobei auch die Ergebnisse für andere Mucopolysaccharide aufgenommen sind, die aus anderen Spezies der Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten worden waren.Table 10 shows the results of the tests for demonstrating the anti-carcinogenic effectiveness of the so obtained mucopolysaccharide, with the results for other mucopolysaccharides as well obtained from other species of Polyporaceae by the same procedure was.
analyseanalysis
C HC H
aufon
Zuckersugar
basisBase
(%)(%)
mg/kgmg / kg
grad gegen grad gegendegree against degree against
festen Krebs festen Krebssolid cancer solid cancer
Sarcoma-180 vom Ehrlich-Sarcoma-180 vom Ehrlich-
(%) Typ(%)(%) Type(%)
100100
8080
(Fr.) Bond, et Sing.(Fr.) Bond, et Sing.
Ganoderma boninense PatGanoderma boninense Pat
Coriolus hirsutusCoriolus hirsutus
(Fr.)Quel.(Fr.) Source.
4137 6,134137 6.13
42,48 5,6842.48 5.68
Beispiel UExample U
0,510.51
0,170.17
300300
300300
100100
9090
PolyporaceaePolyporaceae
Polyporaceae —►Polyporaceae - ►
toto
20 25 30 35 40 45 50 55 60 6520 25 30 35 40 45 50 55 60 65
220 1-1-Inkubationsflaschen wurden mit je 220 ml einer Nährflüssigkeit gefällt, die die folgende Zusammensetzung hatte:220 1-1 incubation bottles were each precipitated with 220 ml of a nutrient liquid that had the following composition:
1313th
Peptone Glukose WasserPeptone Glucose Water
10g 40 g 1 Liter10g 40g 1 liter
Nach dem Einfüllen dieses Nährbodens, dem sogenannten Sabouraud-Medium, wurden die Flaschen mit Wattestopfen verschlossen und zur Sterilisation 30 Minuten lang auf 12O0C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Nährflüssigkeit mit Myzel von Ganodenna iucidum (Fr.) Karst geimpft. Das Impfmyzel wurde zuvor durch stationäre Inkubation (18 Tage bei 24 bis 26°C) hergestellt. Zur Entfernung des My/cls wurden die inkubierten Nährflüssigkeiten durch ein Tuch filtriert, bei Zimmertemperatur unter vermindertemAfter filling of this medium, the so-called Sabouraud medium, the bottles were sealed with cotton plugs and heated for sterilization for 30 minutes at 12O 0 C. After cooling to room temperature, the nutrient fluid was inoculated with mycelium from Ganodenna iucidum (Fr.) Karst. The inoculation mycelium was previously prepared by stationary incubation (18 days at 24 to 26 ° C). To remove the My / cls, the incubated nutrient fluids were filtered through a cloth, at room temperature under reduced pressure
to Druck auf 3,31 eingeengt und zur Entfernung verbliebener Rückstände mit 1300G zentrifugiert. Nach dem Zufügen von 2460 g Ammoniumsulfat zur überstehenden Flüssigkeit und nach anschließendem guten Rühren wurde die Flüssigkeit über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 20 Minuten lang bei 1500 G zentrifugiert. Der verbleibende Rückstand wurde aufgenommen, in 3,3 I gesättigter Ammoniumsulfatlösung homogen verteilt und 20 Minuten mit 1500 G zentrifugiert. Nach achtmaligem Wiederholen dieses Vor-Concentrated to pressure to 3.31 and centrifuged at 1300G to remove remaining residues. After this Add 2460 g of ammonium sulfate to the supernatant liquid and then stir well the liquid was left to stand in the refrigerator overnight and at the next morning for 20 minutes Centrifuged 1500 G. The remaining residue was taken up, distributed homogeneously in 3.3 l of saturated ammonium sulfate solution and centrifuged at 1500 G for 20 minutes. After repeating this procedure eight times gangs wurde der schließlich erhaltene Rückstand in 31 destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf eine Dowex 50W- und auf eine Amberlite IR-401-lonenaustauschersäule gegeben, die anschließend mit 3 I destilliertem Wasser gewaschen wurden. Das Waschwasser wurde den zuvor erhaltenen Durchlaufen zugefügt. Die vereinigten Durchläufe wurden anschließend ultrafiltriert. Nach Waschen mit 301 destilliertem Wasser wurde die Ultrafiltration so lange durchgeführt, bis das Gesamtvolumen der Flüssigkeit nur noch 1,1 1 betrug. Die soInitially, the residue finally obtained was dissolved in 31% of distilled water. The solution was to a Dowex 50W and placed on an Amberlite IR-401 ion exchange column, which were then washed with 3 l of distilled water. The wash water was added to the previously obtained runs. the pooled runs were then ultrafiltered. After washing with 301 distilled water it was the ultrafiltration carried out until the total volume of the liquid was only 1.1 l. The so erhaltene Flüssigkeit wurde auf eine Duolite S-30-Säule gegeben, die mit 4%iger Salzsäure und mit 4%iger Sodalösung aktiviert worden war. Die Säule wurde mit 31 destilliertem Wasser gewaschen, wobei das Waschwasser wieder dem Durchlauf hinzugefügt wurde. Anschließend wurde unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur auf 1,11 eingeengt. Nach Zusetzen von 3,31 Äthanol wurde das Konzentrat über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 15 Minuten lang mit 1500G zentrifugiert. Der erhalteneobtained liquid was applied to a Duolite S-30 column, which with 4% hydrochloric acid and with 4% Soda solution had been activated. The column was washed with 31% of distilled water, with the wash water being added back to the run-through. It was then concentrated to 1.11 under reduced pressure at room temperature. After adding 3.31 ethanol, the concentrate was left to stand in the refrigerator overnight and centrifuged at 1500G for 15 minutes the next morning. The received
Niederschlag wurde in 31 destilliertem Wasser gelöst und zur Entfernung des Äthanols unter ständigem Ausgleich des Wasserverlustes bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck behandelt. Nach der Gefriertrocknung der verbliebenen Flüssigkeit wurden 2,1 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.Precipitate was dissolved in 31% of distilled water and treated under reduced pressure at room temperature to remove the ethanol while constantly compensating for the loss of water. After freeze-drying the remaining liquid, 2.1 g of a light gray to white powder were obtained.
In Tabelle 11 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so erhaltenen Mucopolysaccharids zusammengestellt, wobei auch die Ergebnisse für die MucopolysaccharideTable 11 shows the results of the tests for demonstrating the anti-carcinogenic effectiveness of the so obtained mucopolysaccharide, including the results for the mucopolysaccharides angeführt sind, die nach dem gleichen Verfahren aus anderen Spezies der Polyporaceae erhalten worden waren.which have been obtained from other species of Polyporaceae by the same procedure.
(Fr.) KarsL(Fr.) KarsL
Cryptoporus volvatusCryptoporus volvatus
205 1-1-Inkubationsflaschen wurden mit je 180 ml des sogenannten Mayerschen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung gefüllt:205 1-1 incubation bottles were each filled with 180 ml of the so-called Mayer culture medium with the following composition:
Wasserwater
50g 10g 5g 50g 10g 5g
1 Liter1 liter
Nach dem Sterilisieren unter Druck (30 Minuten lang bei 1200C) und Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde das Medium mit Myzel von Coriolus pargamenus (Fr.) PaL geimpft, das zuvor durch eine stationäre InkubationAfter sterilization under pressure (30 minutes at 120 0 C) and cooling to room temperature, the medium with mycelia of Coriolus pargamenus (Fr.) PaL vaccinated was previously by a stationary incubation
1414th
(20 Tage lang bei 25 bis 27"C) erhalten worden war.(At 25-27 "C for 20 days).
Nach der Filtration der Nährflüssigkeit durch ein Tuch wurde bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 2,5 I eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 2 kg Ammoniumsulfat versetzt und anschließend gut gerührt. Nach Stehenlassen über Nacht wurde am nächsten Morgen 15 Minuten lang mit 1500G zentrifugiert. Der Rückstand wurde gesammelt und in 3 I destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf eine aktivierte Amberlite IR-200-Säule gegeben. Die Säule wurde mit einem Liter destilliertem Wasser gewaschen, das Waschwasser dem Durchlauf zugesetzt, und die vereinigten Durchläufe wurden nach Stehenlassen über Nacht im Kühlschrank durch ein Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde auf eine Duolite A-6-Säule gegeben, wobei die Säule mit 31 destilliertem Wasser gewaschen wurde und das Waschwasser wiederum dem Durchlauf zugesetzt wurde. Die vereinigten Durchläufe wurden bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf einen Liter eingeengt. Zu der eingeengten Flüssigkeit wurden unter Rühren 20 g Bleiacetat gegeben. Nach der Zugabe wurde noch eine Stunde gerührt. Nach Stehen über Nacht im Kühlschrank wurde am nächsten Morgen 30 Minuten lang mit 3000 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde aufgenommen und in einem Liter destilliertem Wasser homogenisiert. Anschließend wurde erneut 30 Minuten lang mit 3000 G zeinrifiJ«i": i. Diese Behandlung wurde fünfmal wiederholt und der schließlich erhaltene Rückstand in einem Liter Wasser suspendiert Der Niederschlag, der nach 30 Minuten langem Einleiten von Schwefelwasserstoff in die Suspension erhalten wurde, wurde abfiltriert. Dus Filtrat wurde in einer Abdampfschale auf ein Sandbad gesetzt und unter ständiger Ergänzung des abgedampften Wassers dann nach 10 Stunden zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand wurde in einem Liter destilliertes Wasser aufgenommen und durch ein Filterpapier Nr. 5C filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander durch eine filtrierte Duolite C-25D-, eine Amberlite IRA-410- und auf eine Duolite S-30-Säule gegeben. Die Säulen wurden mit einem Liter destilliertem Wasser gewaschen und das Waschwasser den Durchläufen zugesetzt. Nach Einengen bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf einen Liter wurden 3 1 Methanol zugesetzt und das Gemisch über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Der Rückstand, der durch Zentrifugieren (15 Minuten mit 1500 G) abgetrennt wurde, wurde anschließend in einem Liter destilliertem Wasser gelöst. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur und stetiger Wasserzufuhr zur Lösung abgezogen. Die verbliebene Flüssigkeit wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Die Ausbeute betrug 8,0 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz.After filtering the nutrient liquid through a cloth, it was reduced at room temperature under reduced pressure Pressure reduced to 2.5 l. The concentrate was mixed with 2 kg of ammonium sulfate and then good touched. After standing overnight, centrifugation was carried out at 1500 G for 15 minutes the next morning. The residue was collected and dissolved in 3 liters of distilled water. The solution was activated on an Amberlite IR-200 column. The column was washed with one liter of distilled water, the wash water added to the run-through, and the combined run-throughs were imbibed after standing overnight Filtered through a filter paper in the refrigerator. The filtrate was applied to a Duolite A-6 column, with the The column was washed with 31% distilled water and the wash water was again added to the run-through became. The combined runs were reduced to one liter at room temperature under reduced pressure constricted. 20 g of lead acetate were added to the concentrated liquid with stirring. After the addition was stirred for another hour. After standing in the refrigerator overnight, she turned 30 the next morning Centrifuged at 3000 G for minutes. The residue was taken up and distilled in one liter Homogenized water. This treatment was then repeated for 30 minutes with 3000 G zeinrifiJ "i": i was repeated five times and the residue finally obtained was suspended in one liter of water Precipitate obtained after introducing hydrogen sulfide into the suspension for 30 minutes, was filtered off. The filtrate was placed on a sand bath in an evaporation dish and kept under constant pressure Addition of the evaporated water then evaporated to dryness after 10 hours. The dry residue was taken up in one liter of distilled water and filtered through No. 5C filter paper. That Filtrate was sequentially passed through a filtered Duolite C-25D, an Amberlite IRA-410 and onto a Duolite S-30 column. The columns were washed with one liter of distilled water and the wash water added to the runs. After concentration at room temperature under reduced pressure to a 3 liters of methanol were added to liters and the mixture was left to stand in the refrigerator overnight. The residue, which was separated by centrifugation (15 minutes at 1500 G), was then poured into one liter dissolved in distilled water. The methanol was removed under reduced pressure at room temperature and deducted constant water supply to the solution. The remaining liquid was subjected to freeze-drying. The yield was 8.0 g of a light gray to white powdery substance.
In Tabelle 12 sind die Ergebnisse dieser Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so erhaltenen Mucopolysaccharids wiedergegeben, wobei auch die Ergebnisse für andere Mucopolysaccharide in die Tabelle aufgenommen wurden, die nach demselben wie im vorstehenden beschriebenen Verfahren aus anderen Arten der Polyporaceae erhalten worden waren.Table 12 shows the results of these tests demonstrating the anticarcinogenic efficacy of the so obtained mucopolysaccharide, the results for other mucopolysaccharides also being shown in The table was recorded using the same procedure as described above other species of Polyporaceae had been preserved.
(Pk.) Murr.(Pk.) Murr.
Cantharellus floccosusCantharellus floccosus
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