DE20216998U1

DE20216998U1 - calibration means

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Publication number: DE20216998U1
Application number: DE20216998U
Authority: DE
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2002-11-05
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2012-11-06
Also published as: DE10352123A1

Abstract

Kalibrierungsmittel zur Kalibrierung eines Messsystems, umfassend mindestens zwei Bereiche zur Aufnahme von Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Bereiche je eine zur Kalibrierung des Messsystems geeignete Kalibrierungslösung enthalten.Calibration means for calibrating a measuring system, comprising at least two areas for holding liquids, characterized in that the at least two areas each contain a calibration solution suitable for calibrating the measuring system.

Description

Die Erfindung betrifft ein Kalibrierungsmittel zur Kalibrierung von Messsystemen, insbesondere zur Kalibrierung optischer Detektionssysteme oder zur Kalibrierung von quantitativen Assays sowie zur Kalibrierung, d.h. zur Überprüfung, von Assay-Reagentien. Das Kalibrierungsmittel weist verschiedene Bereiche zur Aufnahme von Kalibrierungslösungen auf.The invention relates to a calibration means for Calibration of measuring systems, in particular for the calibration of optical ones Detection systems or for the calibration of quantitative assays as well as for calibration, i.e. for review of assay reagents. The calibration means has different areas for recording of calibration solutions.

In der Biotechnologie werden beispielsweise verschiedene sogenannte Assays angewandt, die als Modellsyssteme zur Untersuchung von chemischen und/oder biologischen Wechselwirkungen dienen. Ziel dieser Assays ist u.a. die effiziente Durchmusterung chemischer Substanzen, das sogenannte Screening, zum Auffinden von Substanzen, die ein Target in der gewünschten Art und Weise beeinflussen. Targets sind beispielsweise spezifische biologische Moleküle, wie Enzyme, Rezeptoren oder Ionenkanäle, die möglicherweise für bestimmte Krankheiten und ihre Symptome von Bedeutung sind. Die meisten Wirkstoffe beeinflussen durch die Bindung an ein Target dessen biologische Funktion. Die Untersuchung solcher Assays erfolgt durch sogenannte Screening-Anlagen. Diese Screening-Anlangen sollen insbesondere die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Effizienz der Wirkstoffforschung steigern. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der innerhalb dieser Screening-Anlagen eingesetzten Detektionssysteme und der oft sehr schwierigen Bestimmung der Bindung einer Substanz an ein Target ist eine genaue Kalibrierung der Detektionssysteme und/oder Assays erforderlich. Des Weiteren ist es von besonderer Bedeutung, die im Rahmen der Assays eingesetzten Assay-Reagentien beispielsweise hinsichtlich Reinheit oder Aktivität zu untersuchen.In biotechnology, for example, various So-called assays are used as model systems for investigation of chemical and / or biological interactions. aim These assays include the efficient screening of chemical Substances, the so-called screening, to find substances, which is a target in the desired one Affect way. For example, targets are specific biological molecules, like enzymes, receptors, or ion channels that may be specific for certain Diseases and their symptoms are important. Most active ingredients influence the biological target by binding to it Function. Such assays are examined by so-called screening systems. These screening systems should in particular: Increase the accuracy and efficiency of drug discovery. by virtue of the high sensitivity of those within these screening facilities used detection systems and the often very difficult determination the binding of a substance to a target is an exact calibration of the detection systems and / or assays required. Furthermore it is particularly important, for example, the assay reagents used in the assays to be examined for purity or activity.

Detektionssysteme, die der Untersuchung solcher Assays dienen, basieren in der Regel auf Radioaktivität, Kolorimetrie oder Lumineszenz, insbesondere Phosphoreszenz oder Fluoreszenz. Bei vielen Detektionssystemen, beispielsweise konfokalen Mikroskopen oder Spektrometern, die u.a. in Screening-Anlagen zur Wirkstoffsuche eingesetzt werden, werden zur Kalibierung besondere Kalibrierungslösungen verwendet, die bekannte definierte Eigenschaften aufweisen.Detection systems, the investigation of such Assays are usually based on radioactivity, colorimetry or luminescence, especially phosphorescence or fluorescence. With many detection systems, for example confocal microscopes or spectrometers, which among other things in screening facilities for drug discovery special calibration solutions are used for calibration, which have known defined properties.

In der Regel werden die Kalibrierungslösungen kurz vor den jeweiligen Kalibrierungen vom Anwender selbst hergestellt. Bei der Herstellung der Kalibrierungslösungen können eine Reihe von Fehlern auftreten. Hierbei handelt es sich um fehlerhafte Verdünnungen oder Fehler bei der Auswahl der Farbstoffe, Assay-Reagentien oder Lösungsmittel. Dies führt zu einer ungenauen Kalibrierung und somit zu einer Verfälschung der Messergebnisse bzw. zu einer Verringerung der Reproduzierbarkeit der Messungen. Des Weiteren ist diese Vorgehensweise für die Herstellung der Kalibrierungslösungen sehr zeitintensiv und ist somit beispielsweise im Zusammenhang mit den vorstehend beschriebenen Screening-Anlagen nicht anwendbar.Usually the calibration solutions are short manufactured by the user before the respective calibrations. A number of errors can occur in the preparation of the calibration solutions. These are incorrect dilutions or errors in the Choice of dyes, assay reagents or solvents. This leads to a inaccurate calibration and thus falsification of the measurement results or to reduce the reproducibility of the measurements. Furthermore, this procedure is very good for the preparation of the calibration solutions time-consuming and is therefore, for example, in connection with the Screening systems described above not applicable.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, Kalibrierungsmittel bereitzustellen, die eine einfache, reproduzierbare und schnelle Kalibierung von Messsystemen, insbesondere von Detektionssystemen, quantitativenr Assays oder Assay-Reagentien, ermöglichen.The object of the invention is therefore To provide calibration means that are simple, reproducible and quick calibration of measuring systems, especially detection systems, quantitative assays or assay reagents, enable.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Kalibrierungsmittel mit den Merkmalen von Anspruch 1.According to the invention, the object is achieved by a calibration means with the features of claim 1.

Das erfindungsgemäße Kalibrierungsmittel weist mindestens zwei Bereiche zur Aufnahme von Flüssigkeiten auf. Die mindestens zwei Bereiche enthalten jeweils mindestens eine zur Kalibrierung des Systems geeignete Kalibrierungslösung. Durch das erfindungsgemäße Kalibrierungsmittel ist es möglich, mit einer hohen Reproduzierbarkeit, konstanter Qualität und sehr guter Handhabbarkeit eine Vielzahl unterschiedlicher Messsysteme in kurzer Zeit zu kalibrieren. Messysteme in erfindungsgemäßen Sinne sind beispielsweise Detektionssysteme, quantitative Assays oder Assay-Reagentien.The calibration means according to the invention has at least two areas for absorbing liquids. The least two areas each contain at least one for calibration system suitable calibration solution. By means of the calibration means according to the invention it is possible with high reproducibility, constant quality and very easy handling a variety of different measuring systems calibrate in a short time. Measurement systems in the sense of the invention for example detection systems, quantitative assays or assay reagents.

Die mindestens zwei Bereiche des Kalibrierungsmittels enthalten vorzugsweise identische oder unterschiedliche Kalibrierungslösungen. Die Verwendung unterschiedlicher Kalibrierungslösungen in Zusammenhang mit einem Kalibrierungsmittel ist bevorzugt, um eine schnelle Kalibrierung einer Vielzahl unterschiedlicher Parameter und/oder eine Aufnahme kompletter Eichkurven zu ermöglichen.The at least two areas of the Calibration means preferably contain identical or different ones Calibration solutions. The use of different calibration solutions related to A calibration means is preferred for quick calibration a variety of different parameters and / or a complete recording To enable calibration curves.

Bei den Kalibrierungslösungen handelt es sich vorzugsweise um wässrige Lösungen eines oder mehrerer Kalibrierungsstoffe. Bei diesen Kalibrierungsstoffen handelt es sich vorzugsweise um Farbstoffe, die von vorne herein die zu detektierenden Eigenschaften aufweisen oder um Stoffe, die erst nach einer (i) Komplexierung, d.h. insbesondere einer Anlagerung, (ii) Interkalation oder (iii) Reaktion an andere Komponenten die zu detektierenden Eigenschaften erhalten. Die Kalibrierungsstoffe können dem Kalibrierungsmittel als fertige Kalibrierungsstoffe zugegeben oder erst in den Bereichen des Kalibrierungsmittels selbst hergestellt werden.The calibration solutions it is preferably aqueous solutions one or more calibration substances. With these calibration substances it is preferably dyes that work from the start which have properties to be detected or substances which only after (i) complexation, i.e. especially an addition, (ii) intercalation or (iii) reaction to other components get properties to be detected. The calibration substances can added to the calibration agent as finished calibration substances or only manufactured in the areas of the calibration agent itself become.

Die Verwendung von mehreren Kalibrierungsstoffen in einer Kalibrierungslösung ist insbesondere bei Mehr-Farben-Anwendungen, beispielsweise Mehr-Farben-Fluoreszenzmessungen relevant.The use of multiple calibration substances in a calibration solution is particularly useful in multi-color applications, for example multi-color fluorescence measurements relevant.

Die Farbstoffe bzw. Stoffe können als freie Farbstoffe bzw. Stoffe oder als an andere Moleküle oder Partikel gebundene Farbstoffe bzw. Stoffe, d.h. in der Form von Konjugaten, verwendet werden. Bei solchen Molekülen oder Partikeln handelt es sich beispielsweise um Antikörper, Peptide, Proteine, Oligonukleotide oder synthetische Partikel (sogenannte Beads).The dyes or substances can be used as free dyes or substances or as to other molecules or Particle-bound dyes or substances, i.e. in the form of Conjugates. Such molecules or particles are concerned for example, antibodies, Peptides, proteins, oligonucleotides or synthetic particles (so-called beads).

Bei den Farbstoffen handelt es sich beispielsweise um UV-, VIS-, Infrarot-, Phosphoreszenz- und/oder Fluoreszenz-Farbstoffe. Beispiele für Fluoreszenzfarbstoffe sind Coumarine, Xanthene (Rhodamine, Oxazine) oder Cyanine. Für Phosphoreszenzmessungen sind insbesondere Seltenerdmetall-Komplex-Farbstoffe geeignet. Für Absorptionsmessungen können insbesondere UV-, VIS- oder Infrarot-Farbstoffe verwendet werden.The dyes are, for example, UV, VIS, infrared, phosphorescent and / or fluorescent dyes. examples for Fluorescent dyes are coumarins, xanthenes (Rhodamine, Oxazine) or cyanines. Rare earth metal complex dyes are particularly suitable for phosphorescence measurements. In particular, UV, VIS or infrared dyes can be used for absorption measurements.

Beispiele für Stoffe, die beispielsweise durch Komplexierung, Interkalation oder Reaktion die zu detektierenden Eigenschaften erhalten sind bei Proteinbestimmungen Coomassie Brillant Blue, Bicinchininic Acid, Biuret Reagenz und o-Phthalaldehyd. Beispiele für Stoffe, die in Nukleinsäurebestimmungen eingesetzt werden können sind beispielsweise Hoechst Farbstoffe, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen, TOTO, JOJO und Ethidiumbromid. Beispiele für Stoffe, die für Kationenbestimmungen geeignet sind, sind Calcein, Calcium Green, Fluo-3, Newport Green und APTRA-BTC.Examples of substances that, for example through complexation, intercalation or reaction Properties are preserved in protein determinations Coomassie Brillant Blue, Bicinchininic Acid, Biuret Reagent and o-Phthalaldehyde. Examples for fabrics, those in nucleic acid determinations can be used are, for example, Hoechst dyes, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen, TOTO, JOJO and ethidium bromide. Examples of substances used for cation determinations suitable are Calcein, Calcium Green, Fluo-3, Newport Green and APTRA-BTC.

Die erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel eignen sind insbesondere für die Kalibrierung von Detektionssystemen. Dabei müssen zum einen optische Parameter, wie beispielsweise die Fokusgeometrie oder zum anderen Parameter, d.h. Eigenschaften, verschiedener zu messender Analyten oder Komponenten, wie beispielsweise Proteinen, Nukleinsäuren, Anionen, Kationen oder Rezeptor-Ligand-Komplexen, kalibriert werden. Beispiele für solche Parameter sind Fluoreszenintensität, Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzlebensdauer, Rotationskorrelationszeit, translationale Diffusion, Kreuzkorrelationsintensität, Teilchenzahlen) oder Konzentrationen) des (der) Kalibrierungsstoffe(s). Des Weiteren kann beispielsweise die Absorption der Kalibrierungsstoffe gemessen werden.The calibration means according to the invention are suitable are especially for the calibration of detection systems. On the one hand, optical parameters, such as the focus geometry or another parameter, i.e. Properties of various analytes or components to be measured, such as proteins, nucleic acids, anions, cations or Receptor-ligand complexes are calibrated. Examples of such Parameters are fluorescence intensity, fluorescence polarization, Fluorescence lifetime, rotation correlation time, translational Diffusion, cross-correlation intensity, particle numbers) or concentrations) of the calibration substance (s). Furthermore, for example the absorption of the calibration substances can be measured.

Kalibrierungsmittel sind beispielsweise auch für die Kalibrierung quantitativer Assays, wie Protein- oder Nukleinsäurebestimmungen, von großer Bedeutung. Des Weiteren können Kalibrierungslösungen zur Kalibrierung intra-und extrazellulärer Anionen wie Chlorid, Nitrit, Phosphat, sowie von Kationen verwendet werden. Bei den Kalibrierungslösungen handelt es sich in diesen Fällen vorzugsweise um wässrige Pufferlösungen. Diese enthalten den zu bestimmenden Analyten, wie beispielsweise das Protein oder die Nukleinsäure, sowie das (die) zur Quantifizierung notwendige Reagenz (Reagentien). Die Verwendung von Kalibrierungslösungen mehrerer Analytkonzentrationen innerhalb eines Kalibrierungsmittels ist hierbei zur Aufnahme der kompletten Eichkurve relevant. Der Analyt und das (die) Reagenz (Reagentien) bilden beispielsweie einen Komplex, der in Abhängigkeit von der Analytkonzentration unterschiedliche kolorimetrische oder fluorimetrische Signale ergibt.Calibration means are for example also for the calibration of quantitative assays, such as protein or nucleic acid determinations, of great Importance. Furthermore, you can calibration solutions for the calibration of intra- and extracellular anions such as chloride, nitrite, Phosphate, as well as cations. The calibration solutions in these cases preferably aqueous Buffer solutions. These contain the analyte to be determined, such as the protein or the nucleic acid, and the reagent (s) necessary for quantification. The use of calibration solutions of multiple analyte concentrations within a calibration medium is to record the relevant calibration curve. The analyte and the reagent (s) form, for example, a complex that depends on the analyte concentration results in different colorimetric or fluorimetric signals.

Beispiele für in solchen Fällen untersuchte Signale sind Fluoreszenintensität, Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzlebensdauer, Rotationskorrelationszeit, translationale Diffusion, Kreuzkorrelationsintensität, Teilchenzahlen) oder Konzentration(en). Des Weiteren können beispielsweise die Absorptionen gemessen werden.Examples of signals examined in such cases are fluorescence intensity, Fluorescence polarization, fluorescence lifetime, rotation correlation time, translational diffusion, cross-correlation intensity, particle numbers) or concentration (s). Furthermore, for example, the absorptions be measured.

Die Bestimmung der Konzentration eines Analyten unbekannter Konzentration erfolgt dann durch den Vergleich des erhaltenen Messwertes mit der Kalibrierungskurve. Wie bereits vorstehend beschrieben, werden vorzugsweise Farbstoffe, die die zu detektierenden Eigenschaften von vorne herein aufweisen oder Stoffe, die erst nach einer Komplexierung, d.h. insbesondere einer Anlagerung, Interkalation oder Reaktion an andere Komponenten die zu detektierenden Eigenschaften erhalten, eingesetzt.Determining the concentration of an analyte of unknown concentration is then carried out by the Comparison of the measured value obtained with the calibration curve. As already described above, dyes, which have the properties to be detected from the outset or substances that are only after complexation, i.e. in particular an attachment, intercalation or reaction to other components receive the properties to be used.

Die erfindungsgemäßen Kalibrierungslösungen können des Weiteren auch zur Qualitätskontrolle von Assay-Reagentien verwendet werden. Bei diesen Kalibrierungslösungen handelt es sich vorzugsweise um wässrige Pufferlösungen. Diese enthalten beispielsweise das Rezeptorprotein, einen mit einem Farbstoff markierten Liganden und bei Bedarf auch Kompetitoren oder Inhibitoren. Die Verwendung von Kalibrierungslösungen mehrerer Rezeptor-/Ligandkonzentrationen ist hierbei zur Aufnahme der Bindungskurve relevant. Der markierte Ligand bindet an das Rezeptorprotein und bildet einen Rezeptor-Ligand-Komplex, der in Abhängigkeit der Rezeptor-/Ligandkonzentration beispielsweise unterschiedliche kolorimetrische oder fluorimetrische Signale ergibt. Die Bestimmung der Qualität von Assay-Reagentien erfolgt dann durch den Vergleich des erhaltenen Messwertes mit der Bindekurve.The calibration solutions according to the invention can Also for quality control of Assay reagents are used. These calibration solutions act it is preferably aqueous Buffer solutions. These contain, for example, the receptor protein, one with a dye labeled ligands and, if necessary, also competitors or inhibitors. The use of calibration solutions of multiple receptor / ligand concentrations is relevant for recording the binding curve. The marked Ligand binds to the receptor protein and forms a receptor-ligand complex that dependent on the receptor / ligand concentration, for example, different colorimetric or fluorimetric signals. The quality of assay reagents is determined then by comparing the measured value obtained with the binding curve.

Die Kalibrierungslösungen können neben den Farbstoffen bzw. den Quantifizierungsreagentien verschiedene Zusätze enthalten, die insbesondere zur Stabilisierung der Lösungen dienen. Vorzugsweise handelt es sich bei solchen Zusätzen um Photostabilisatoren, Fungizide, anti-bakerielle Verbindungen (ein Beispiel für einen Zusatz ist Natriumazid) oder Detergentien. In verschiedenen Anwendungen kann es des Weiteren bevorzugt sein, Zusätze zu verwenden, die die optische Eigenschaften der Kalibrierungslösungen verändern oder solche, die zur Angleichung an die unterschiedlichen Messmedien dienen.The calibration solutions can in addition to the Dyes or the quantification reagents contain various additives, which are used in particular to stabilize the solutions. Preferably are such additives for photo stabilizers, fungicides, anti-bacterial compounds (an example for an additive is sodium azide) or detergents. In different For applications, it may also be preferred to use additives that change the optical properties of the calibration solutions or those that serve to adapt to the different measurement media.

Für die einzelnen Kalibrierungen kann es erforderlich sein, bestimmte pH-Werte in den einzelnen Kalbrierungslösungen einzustellen. Dies erfolgt in der Regel durch die Verwendung verschiedener Puffer. Welcher Puffer verwendet wird, hängt von dem Farbstoff und dem angestrebten pH-Wert ab. Generell können alle kommerziell erhältlichen Puffer, die die Wirkung der Farbstoffe nicht oder nur in gewünschter Weise beeinflussen verwendet werden. Beispiele für solche Puffer umfassen PBS-, HEPES-, Phosphat-, Citrat- sowie Acetat-Puffer.For The individual calibrations may need to be determined pH values in the individual calibration solutions adjust. This is usually done by using different ones Buffer. Which buffer is used depends on the dye and the target pH. Generally, all commercially available Buffers that do not have the effect of the dyes or only in the desired Way influence can be used. Examples of such buffers include PBS, HEPES, phosphate, citrate and acetate buffers.

Die Stabilität bzw. Handhabbarkeit der einzelnen Kalibrierungslösungen kann weiter erhöht bzw. verbessert werden, indem das Kalibrierungsmittel mittels einer Abdeckung verschlossen wird. Vorzugsweise erfolgt durch die Abdeckung ein im Wesentlichen luftdichter Abschluss der Kalibrierungslösungen gegenüber der Außenluft. Vorzugsweise handelt es sich bei der Abdeckung um eine luftdichte Folie oder um einen festen, massiven Deckel aus Kunststoff. Als Kunststoffmaterial ist insbesondere Polypropylen geeignet.The stability or manageability of the individual calibration solutions can be further increased or improved by closing the calibration means by means of a cover. The cover preferably provides an essentially airtight seal for the calibration solutions with respect to the outside air. Preferably the cover is an airtight film or a solid, solid plastic cover. Polypropylene is particularly suitable as the plastic material.

Je nach verwendetem Farbstoff kann die Abdeckung transparent, d.h. durchsichtig, oder nicht transparent ausgebildet sein. Durch die Verwendung einer nicht transparenten Abdeckung kann bei verschiedenen Farbstoffen die Stabilität weiter erhöht werden, da die Kalibrierungslösungen in geringerem Masse dem Außenlicht ausgesetzt sind.Depending on the dye used can the cover is transparent, i.e. transparent or not transparent be trained. By using a non-transparent Coverage can further enhance stability with different dyes increase, because the calibration solutions to a lesser extent the outside light are exposed.

Das Kalibrierungsmittel kann Bereiche aufweisen, die keine Kalibrierungslösungen enthalten. Dies ist insbesondere relevant bei der Durchführung individueller Assays. Insbesondere bei der Durchführung quantitativer Assays und bei der Kalbrierung, d.h. Überprüfung von Assay-Ragentien unter Einsatz des Kalibrierungsmittels, ermöglicht dies aufgrund identischer Versuchsbedingingen einen optimalen Vergleich der Messdaten.The calibration agent can range have no calibration solutions. This is particularly relevant when performing individual assays. Especially in the implementation quantitative assays and in calibration, i.e. Review of Assay Ragentien using the calibration agent, this enables due to identical Experimental conditions an optimal comparison of the measurement data.

Bei dem Kalibrierungsmittel handelt es sich beispielsweise um eine Glasplatte, die so ausgestaltet ist, dass es sich bei den mindestens zwei Bereichen zur Aufnahme der Kalibrierungslösungen um durch die Kalibrierungslösungen benetzbare Flächen handelt. Die Umgebung dieser Flächen ist derart ausgestaltet, dass die jeweiligen Kalibrierungslösungen diese nicht benetzen. Die einzelnen Bereiche können beispielsweise durch eine entsprechende Oberflächenbehandlung der Glasplatte erhalten werden. Im Falle einer Glasplatte als Kalibrierungsmittel handelt es sich bei der Abdeckung vorzugsweise um einen festen, massiven Deckel, der luftdicht auf die Glasplatte aufgesetzt wird.Acting with the calibration agent it is, for example, a glass plate that is designed that there are at least two areas to accommodate the calibration solutions to get through the calibration solutions wettable surfaces. The area surrounding these areas is designed in such a way that the respective calibration solutions do not wet. The individual areas can, for example, by a appropriate surface treatment the glass plate can be obtained. In the case of a glass plate as a calibration medium the cover is preferably a solid, massive lid, which is placed airtight on the glass plate.

Des Weiteren kann es sich bei dem Kalibrierungsmittel um eine Titerplatte handeln. Diese Titerplatte weist üblicherweise eine Basisplatte mit durchgehenden Vertiefungen auf, die durch eine Bodenplatte, beispielsweise eine Glasplatte, verschlossen werden. Bei solchen Titerplatten sind die einzelnen Vertiefungen vorzugsweise in regelmäßigen Abständen angeordnet, um in die einzelnen Vertiefungen, Kalibierungslösungen mit Hilfe eines automatisierten Prozesses einführen und anschließend vermessen zu können. Insbesondere handelt es sich bei den Vertiefungen um solche mit einem Volumen im μl-Bereich oder darunter. Im Falle einer Titerplatte erfolgt der luftdichte Verschluß der Vertiefungen vorzugsweise über eine Kunststofffolie, die die Titerplatte auf der der Bodenplatte gegenüberliegenden Seite verschließt. Der luftdichte Abschluß wird in diesem Falle dadurch erreicht, dass die Abdeckung und die Titerplatte miteinander verschweißt werden.Furthermore, it can Act the calibration medium around a titer plate. This titer plate usually points a base plate with continuous recesses through a Bottom plate, for example a glass plate, are closed. In such titer plates, the individual wells are preferred arranged at regular intervals, to get into the individual wells, calibration solutions with the help of an automated process introduce and subsequently to be able to measure. In particular, the wells are those with a volume in the μl range or below. In the case of a titer plate, it is airtight Closure of the Wells preferably over a plastic film that the titer plate on the bottom plate opposite Side closes. The airtight seal will in this case achieved by the cover and the titer plate welded together become.

Bei der Bodenplatte handelt es sich vorzugsweise um eine durchsichtige Glasplatte oder eine durchsichtige Kunststofffolie.The bottom plate is preferably a clear glass plate or a clear one Plastic film.

Die Basisplatten der Kalibrierungmittel werden vorzugsweise aus einem inerten Material, vorzugsweise einem inerten Kunststoff oder Glas, hergestellt. Beispiele für bevorzugte Kunststoffe umfassen Polyproplyen oder Polystyrol.The base plates of the calibration means are preferably made of an inert material, preferably a inert plastic or glass. Examples of preferred Plastics include polypropylene or polystyrene.

Zur Erhöhung der Stabilität des Kalibrierungmittels kann in die Basisplatte ein die Vertiefungen umgebender Trägerkern aus höherschmelzendem Material eingebettet werden. Das Kalibrierungmittel kann somit bei automatisierten Kalibrierungen nicht so leicht verbogen werden. Dies hat den Vorteil, dass die Postionen der einzelnen Vertiefungen nicht durch die Einwirkung von äußeren Kräften beeinträchtigt werden. Somit können Verfälschungen der Kalibrierungen durch verbogene Titerplatten vermieden werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Trägerkern um eine Metallplatte mit zu den Vertiefungen korrespondierenden Öffnungen. Des Weiteren ist es bevorzugt, dass jede Vertiefung von dem Trägerkern umgeben ist. Die Öffnungen des Trägerkerns sind vorzugsweise in ihren Abmessungen geringfügig größer als die Vertiefungen der Basisplatte.To increase the stability of the calibration agent can a carrier core surrounding the recesses in the base plate made of higher melting material be embedded. The calibration means can thus be used in automated Calibrations are not easily bent. This has the advantage that the positions of the individual wells are not affected by the action be affected by external forces. So you can falsifications calibrations due to bent titer plates are avoided. The carrier core is preferably a metal plate with openings corresponding to the depressions. Furthermore is it is preferred that each recess be surrounded by the carrier core. The openings of the carrier core are preferably slightly larger in size than the depressions of the Baseplate.

Wenn es sich bei der Bodenplatte um eine Glasplatte handelt, wird diese vorzugsweise aufgeklebt. Werden als Bodenplatte Kunststofffolien verwendet, erfolgt die Befestigung vorzugsweise durch Aufschweißen.If it is the bottom plate is a glass plate, this is preferably glued on. If plastic foils are used as the base plate, they are attached preferably by welding.

Die Basisplatten weisen beispielsweise 24, 96, 384, 1536 oder 2080 Vertiefungen auf. Besonders bevorzugt weist die Basisplatte 24, 96 oder 384 Vertiefungen auf. Ganz besonders bevorzugt weist die Basisplatte 24 Vertiefungen auf, die mit Kalibrierunglösungen befüllt werden können.The base plates have, for example 24, 96, 384, 1536 or 2080 wells. Particularly preferred the base plate has 24, 96 or 384 depressions. Most notably the base plate 24 preferably has depressions which are filled with calibration solutions can.

Hochempfindliche Messgeräte wie sie beispielsweise in den vorstehend beschriebenen Untersuchungen verwendet werden, erfordern oft mehrstufige Kalibrierungsverfahren. Beispielsweise kann in einer ersten Stufe mit bestimmten Kalbrierungslösungen eine Vorkalibrierung vorgenommen werden. In einer zweiten Stufe kann anschließend mit anderen Kalibrierungslösungen eine Feinkalibrierung vorgenommen werden. Dieser mehrstufige Prozess ist mit den herkömmlichen Kalibrierungsmitteln nur mit sehr hohem Zeitaufwand durchführbar. Die Art und die Konzentrationen der Farbstoffe, insbesondere der Fluoreszenfarbstoffe, in den Kalibrierungslösungen ist in dem erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel so ausgewählt, dass für jede zu kalibrierende Wellenlänge mindestens eine Kalibrierungslösung zur Vorkalibrierung und mindestens eine Kalibrierungslösung zur Feinkalibrierung geeignet ist. Vorzugsweise liegen die Konzentrationen der Fluoreszenzfarbstoffe für die Vorkalibrierung im Bereich von 100 μM – 1 mM und die Konzentrationen der Fluoreszenzfarbstoffe für die Feinkalibrierung im nanomolaren Bereich. Für Feinkalibrierungen werden Fluoreszenzfarbstoffe mit einer Konzentration im Bereich von 0,1 nM – 5 nM verwendet. Die tatsächlichen Konzentrationen sind abhängig von den zu kalibrierenden Parametern.Highly sensitive measuring devices like them used for example in the studies described above often require multi-step calibration procedures. For example can in the first stage with certain calibration solutions Pre-calibration can be carried out. In a second stage subsequently with other calibration solutions a fine calibration can be carried out. This multi-step process is with the conventional Calibration means can only be carried out with a very high expenditure of time. The Type and concentrations of dyes, especially fluorescent dyes, in the calibration solutions in the calibration agent according to the invention selected so that for any wavelength to be calibrated at least one calibration solution for pre-calibration and at least one calibration solution for Fine calibration is suitable. The concentrations are preferably of fluorescent dyes for the pre-calibration in the range of 100 μM - 1 mM and the concentrations of fluorescent dyes for fine calibration in the nanomolar range. For fine calibrations Fluorescent dyes with a concentration in the range of 0.1 nM - 5 nM used. The actual Concentrations are dependent of the parameters to be calibrated.

Das erfindungsgemäße Kalibrierungsmittel eignet sich insbesondere für die Kalibrierung von absoluten Parametern. Beispiele für absolute Parameter, die mit dem erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel kalibriert werden können, sind Fluoreszenintensität, Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzlebensdauer, Rotationskorrelationszeit, translationale Diffusion, Kreuzkorrelationsintensität, Teilchenzahlen) bzw. Konzentrationen) des (der) Kalibrierungsfarbstoffe(s), sowie die Bestimmung der Fokusgeometrie. Durch die Verwendung dieser Parameter ist eine absolute Kalibrierung der Messgeräte möglich, da die entsprechenden Parameter der Moleküle bekannt oder mit anderen Methoden zuvor ermittelt wurden. Solche absoluten Kalibrierungen ermöglichen wesentlich aussagekräftigere Messungen als relative Kalibrierungen.The calibration means according to the invention is particularly suitable for the calibration of absolute parameters. Examples of absolute parameters that can be calibrated with the calibration agent according to the invention are fluoreszenin intensity, fluorescence polarization, fluorescence lifetime, rotation correlation time, translational diffusion, cross-correlation intensity, number of particles) or concentrations) of the calibration dye (s), and the determination of the focus geometry. By using these parameters, an absolute calibration of the measuring devices is possible, since the corresponding parameters of the molecules are known or previously determined using other methods. Such absolute calibrations enable much more meaningful measurements than relative calibrations.

Die erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel können auch Justiermarkierungen zur Orientierung der Kalibrierungsmittel in Bezug auf die Messgeräte aufweisen. Die Justiermarkierungen sind beispielsweise punkt- oder kreuzförmige Ausnehmungen auf der Unter- und/oder Oberseite der Kalibrierungsmittel.The calibration means according to the invention can also Adjustment marks to orient the calibration means in Have reference to the measuring devices. The adjustment marks are, for example, punctiform or cross-shaped recesses on the bottom and / or top of the calibration means.

Anschließend wird die Erfindung anhand einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme auf die anliegende Zeichnungen näher erläutert.The invention is then based on a preferred embodiment with reference to the accompanying drawings.

Es zeigen:Show it:

1 eine schematisch perspektivische Ansicht einer bevorzugten Ausführungsform des Kalibrierungsmittels in Form einer Titerplatte von unten ohne Bodenplatte, 1 2 shows a schematic perspective view of a preferred embodiment of the calibration means in the form of a titer plate from below without a base plate,

2 eine Schnittansicht entlang der Linie II – II in 1 mit Bodenplatte und Abdeckung auf der der Bodenplatte gegenüberliegenden Seite der Basisplatte der Titerplatte. 2 a sectional view taken along the line II - II in 1 with base plate and cover on the side of the base plate of the titer plate opposite the base plate.

Die in 1 dargestellte Basisplatte 10 eines Kalibrierungsmittels ist ohne Bodenplatte 12 (2), bei der es sich beispielsweise um eine Glasplatte handelt, dargestellt. Die Basisplatte 10 weist einen in diese eingebetteten Trägerkern 14, in Form einer Metallplatte, auf. Die Metallplatte 14 weist dieselbe Länge wie die Basisplatte 10 auf. Im mittleren Bereich der Basisplatte sind die Vertiefungen 16 zur Aufnahme der Kalibrierungslösungen vorgesehen. Die Vertiefungen 16 erstrecken sich über die gesamte Höhe der Basisplatte 10. Es handelt sich somit um durchgehende Vertiefungen 16. Dementsprechend weist die Metallplatte 14 zu den Vertiefungen 16 korrespondierende Öffnungen 18 (2) auf. Der Durchmesser der kreisrunden Öffnungen 18 ist geringfügig größer als der Durchmesser der Vertiefungen 16. Hierdurch weisen die Vertiefungen 16 im Bereich der Metallplatte 14 eine dünne Wandung 20 auf. Die Vertiefungen 16 sowie die korrespondierenden Öffnungen 18 können auch eine andere, beispielsweise achteckige Form haben. Ebenso können die Vertiefungen 16 und die Öffnungen 18 konisch ausgebildet sein. Die Wandstärke der Wandung 20 ist hierbei möglichst stets gleich dick.In the 1 shown base plate 10 a calibration medium is without a base plate 12 ( 2 ), which is, for example, a glass plate. The base plate 10 has a carrier core embedded in it 14 , in the form of a metal plate. The metal plate 14 has the same length as the base plate 10 on. In the middle area of the base plate are the depressions 16 intended to accommodate the calibration solutions. The wells 16 extend over the entire height of the base plate 10 , It is therefore a continuous deepening 16 , Accordingly, the metal plate 14 to the wells 16 corresponding openings 18 ( 2 ) on. The diameter of the circular openings 18 is slightly larger than the diameter of the recesses 16 , As a result, the depressions point 16 in the area of the metal plate 14 a thin wall 20 on. The wells 16 as well as the corresponding openings 18 can also have a different, for example octagonal, shape. Likewise, the wells 16 and the openings 18 be conical. The wall thickness of the wall 20 is always as thick as possible.

Die Vertiefungen 16 sind regelmäßig angeordnet. Im dargestellten Ausführungsbeispiel handelt es sich um vier Zeilen mit jeweils sechs Vertiefungen 16, so dass das dargestellte Ausführungsbeispiel des Kalibrierungsmittels vierundzwanzig Vertiefungen aufweist. Sämtliche Vertiefungen weisen denselben Durchmesser auf.The wells 16 are arranged regularly. In the illustrated embodiment, there are four rows, each with six wells 16 , so that the illustrated embodiment of the calibration means has twenty-four wells. All depressions have the same diameter.

Zum Verschließen der Vertiefungen 16 ist auf der Unterseite 22 der Basisplatte 10 eine Glasplatte 12 angebracht. Das Befestigen der Glasplatte 12 auf der Unterseite 22 erfolgt beispielsweise durch Aufkleben. Zur genauen Lagebestimmung der Glasplatte 12 sind an den Rahmenteilen 24, die an den Längskanten der Trägerplatte 10, vorgesehen sind, Ansätze 26 vorgesehen. Hierdurch ist ein Verrutschen der Glasplatte 12 beim Aufkleben vermieden, so dass die Glasplatte im Bereich der Vertiefungen 16 nicht durch Klebstoff verunreinigt wird.To close the wells 16 is on the bottom 22 the base plate 10 a glass plate 12 appropriate. Fastening the glass plate 12 on the bottom 22 takes place, for example, by gluing. For the exact determination of the position of the glass plate 12 are on the frame parts 24 that on the longitudinal edges of the carrier plate 10 approaches are provided 26 intended. This causes the glass plate to slip 12 avoided when gluing, so that the glass plate in the area of the depressions 16 is not contaminated by adhesive.

Die Höhe der Rahmenteile 24 ist so gewählt, dass die Rahmenteile auch bei eingeklebter Glasplatte über diese vorstehen. Hierdurch ist es möglich, mehrere Kalibrierungsmittel aufeinander zu stapeln, ohne dass eine Glasplatte ein darunter liegendes Kalibrierungsmittel berührt und hierbei beschädigt werden könnte. Zur seitlichen Fixierung gestapelter Kalibrierungsmittel weist die den Rahmenteilen 24 gegenüberliegende Seite, d.h. die Oberseite der Kalibrierungsmittel eine geringere Breite auf, so dass beim Aufeinanderstapeln die einzelnen Titerplatten ineinanderrutschen. Um ein Berühren der Glasplatte 12 zu vermeiden, sind zusätzlich zu den Ansätzen 26, zwischen denen die Glasplatte liegt, Ansätze 28 vorgesehen. Bei aufeinander gestapelten Kalibrierungsmitteln liegt das benachbarte Kalibrierungsmittel jeweils auf der Oberseite der Ansätze 26 und 28 auf.The height of the frame parts 24 is selected so that the frame parts protrude above it even when the glass plate is glued in place. This makes it possible to stack several calibration agents on top of one another without a glass plate touching a calibration agent underneath and thereby being damaged. For the lateral fixation of stacked calibration means, it has the frame parts 24 opposite side, ie the top of the calibration means to a smaller width, so that the individual titer plates slide into one another when stacked. To touch the glass plate 12 are to be avoided in addition to the approaches 26 , between which the glass plate lies, approaches 28 intended. In the case of calibration means stacked on top of one another, the adjacent calibration means lies on the top of the approaches 26 and 28 on.

Der sich über die gesamte Länge der Basisplatte 10 erstreckende Trägerkern 14 ist nicht notwendigerweise vollständig mit Kunststoff umspritzt, sondern weist an beiden Endbereichen jeweils eine Kontaktfläche 30 auf. Über die Kontaktfläche 30 kann in den Trägerkern, beispielsweise eine Metallplatte 14, Wärme zur Erwärmung zugeführt oder zur Kühlung abgeführt werden. Zur Lagefixierung der Kalibrierungsmitteln sind in den Kontaktflächen 30 zusätzlich Ausrichtbohrungen 32 vorgesehen.Which extends over the entire length of the base plate 10 extending support core 14 is not necessarily completely encapsulated with plastic, but has a contact surface at both end regions 30 on. About the contact area 30 can in the carrier core, for example a metal plate 14 , Heat for heating or removed for cooling. To fix the position of the calibration means are in the contact areas 30 additional alignment holes 32 intended.

Ferner kann die Basisplatte 10 im Bereich der Ausnehmungen 16 Homogenisierungsausnehmungen 34 aufweisen. Dies Homogenisierungsausnehmungen 34 sind zwischen den Vertiefungen 16 derart angeordnet, dass jede Vertiefung 16 zu mindestens einer Homogenisierungsausnehmung 34 benachbart ist. Homogenisierungsausnehmungen 34 erstrecken sich nicht durch die gesamte Basisplatte. Dies bedeutet, dass die Metallplatte keine korrespondierenden Öffnungen aufweist (2). Den in 1 dargestellten Homogenisierungsausnehmungen 34 ist jeweils eine weitere Homogenisierungsausnehmung 34 gegenüberliegend zugeordnet. Die Homogenisierungsausnehmungen dienen insbesondere bei der Erwärmung des Kalbrierungsmittels zum Ausgleich der Dehnungen des Kunststoffs der Basisplatte.Furthermore, the base plate 10 in the area of the recesses 16 homogenizing 34 exhibit. This is homogenization recesses 34 are between the wells 16 arranged so that each recess 16 to at least one homogenization recess 34 is adjacent. homogenizing 34 do not extend through the entire base plate. This means that the metal plate has no corresponding openings ( 2 ). The in 1 homogenization recesses shown 34 is a further homogenization recess 34 assigned opposite. The homogenization recesses are used, in particular, for heating the calibrating agent to compensate for the expansion of the plastic of the base plate.

Zusätzlich weist die Metallplatte 14 seitlich neben dem Bereich, an dem die Vertiefungen 16 bzw. die korrespondierenden Öffnungen 18 vorgesehen sind Öffnungen auf, die beim Umspritzen der Metallplatte 14 vollständig mit Kunststoff gefüllt werden. Diese Öffnungen dienen zur formschlüssigen Fixierung der Kunststoffhülle an der Metallplatte 14.In addition, the metal plate shows 14 to the side of the area where the depressions 16 or the corresponding openings 18 intended are openings on when the metal plate is overmolded 14 be completely filled with plastic. These openings are used for the form-fitting fixing of the plastic cover to the metal plate 14 ,

Die der Bodenplatte 12 gegenüberliegende Seite der Basisplatte 10 der als Kalibrierungsmittel dienenden Titerplatte kann bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform durch eine Abdeckung, vorzugsweise eine Kunststofffolie 36, die durch Verschweißen aufgebracht wird, luftdicht verschlossen werden.The bottom plate 12 opposite side of the base plate 10 In the embodiment described above, the titer plate serving as calibration means can be covered by a cover, preferably a plastic film 36 , which is applied by welding, are sealed airtight.

Claims

Calibration means for calibrating a measuring system, comprising at least two areas for holding liquids, characterized in that the at least two areas each contain a calibration solution suitable for calibrating the measuring system.

Calibration means according to claim 1, characterized in that the at least two areas contain identical calibration solutions.

Calibration means according to claim 1, characterized in that the at least two areas contain different calibration solutions.

Calibration means according to at least one of claims 1-3, characterized characterized in that the calibration means one or more Areas) that does not contain calibration solutions.

Calibration means according to at least one of claims 1-4, characterized marked that the calibration solutions aqueous solutions of a or several calibration substances (s).

Calibration agent according to claim 5, characterized in that the calibration substances are a dye selected from the group of UV, VIS, infrared, phosphorescent or fluorescent dyes, is.

Calibration agent according to claim 5, characterized in that the calibration substances are substances, which only comes through complexation, intercalation or reaction properties to be detected).

Calibration means according to claim 6, characterized in that the fluorescent dyes are xanthenes, in particular Rhodamine or Oxazine or cyanine.

Calibration means according to claim 7, characterized in that the fabric is a Hoechst dye, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen, TOTO, JOJO and ethidium bromide, Calcein, Calcium Green, Fluo-3, Newport Green or APTRA-BTC.

Calibration means according to at least one of claims 5-9, characterized characterized that the calibration substances the calibration agent added as finished calibration substances or only in the areas getting produced.

Calibration means according to at least one of claims 1-10, characterized characterized in that the calibration solutions selected at least one additive the group of fungicides, detergents, photostabilizers or Contain compounds with anti-bacterial activity.

Calibration means according to at least one of claims 1-11, characterized characterized that the calibration means by means of a cover is closed.

Calibration means according to claim 12, characterized in that the cover is an airtight plastic film is.

Calibration means according to at least one of claims 1-13, characterized characterized that the at least two areas are through the calibration solutions wettable areas or recesses that are continuous through a base plate.

Calibration means according to claim 14, characterized in that the wettable surfaces are on a glass plate.

Calibration means according to claim 15, characterized in the base plate is made of plastic and a transparent Has glass plate that closes recesses on one side.

Calibration means according to claim 16, characterized in that the plastic of the base plate is polypropylene or Polystyrene deals.

Calibration means according to claim 17, characterized in that in the base plate a carrier core surrounding the depressions from higher melting Material is embedded.

Calibration means according to claim 18, characterized in that the carrier core a metal plate with openings corresponding to the depressions is.

Calibration means according to at least one of claims 16-19, characterized in that the calibration means 24, 96 or 386 Vertie features.

Calibration means according to one of claims 16-20, characterized characterized in that the depressions on the side opposite the glass plate the base plate is sealed airtight with a plastic film be applied by welding becomes.

Calibration means according to at least one of claims 1-21, characterized characterized that the type and concentrations of fluorescent dyes in the calibration solutions is selected that at least one calibration solution for precalibration and at least one calibration solution is suitable for fine calibration.

Calibration means according to claim 22, characterized in that the concentrations of fluorescent dyes for pre-calibration are in the range of 100 μM - 1mM.

Calibration means according to claim 22, characterized in that the concentrations of fluorescent dyes for fine calibration in the range of 1 nM - 5 nM lie.