DE202015002414U1 - Kit for genotyping laboratory rodents - Google Patents
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Abstract
Kit für die Genotypisierung von Labornagern nach nicht-invasiver Probennahme dadurch gekennzeichnet, dass aufeinander abgestimmte Komponenten zur Verfügung gestellt werden, enthaltend: Tupfer für die nicht-invasive Probennahme von Abstrichen der inneren Wangenschleimhaut bei Mäusen und Ratten, einen Puffer für die schnelle und direkte DNA-Extraktion aus den Tupfern, einen Cocktail von Enzymen und Chemikalien für die Durchführung der Genotypisierung mittels Vervielfältigung von DNA-Abschnitten bei Maus oder Ratte.Kit for genotyping laboratory rodents after non-invasive sampling, characterized by providing matched components comprising: swabs for non-invasive sampling of internal buccal mucosal swabs in mice and rats, a buffer for rapid and direct DNA - Extraction from the swabs, a cocktail of enzymes and chemicals for performing the genotyping by amplification of DNA sections in mouse or rat.
Description
Gegenstand der ErfindungSubject of the invention
Gegenstand des vorliegenden Gebrauchsmusters ist ein Komplettkit, bestehend aus aufeinander abgestimmten Komponenten für Probennahme, DNA-Extraktion und in vitro Vervielfältigung von DNA, welches die bestehenden technischen Probleme erfolgreich löst und eine Genotypisierung von Labornagern anhand von nicht-invasiv gewonnenem Untersuchungsmaterial ermöglicht.The subject of the present utility model is a complete kit, consisting of matched components for sampling, DNA extraction and in vitro amplification of DNA, which successfully solves the existing technical problems and allows genotyping of laboratory camps using non-invasively obtained test material.
Stand der TechnikState of the art
Genotypisierungen aus Referenzproben gehören beim Menschen und bei Tieren zur gängigen Routineanalytik. Bis Mitte der 90er Jahre wurden dafür beim Menschen Gewebe- oder Blutproben entnommen, aus denen anschließend die enthaltene DNA gewonnen wurde. Diese Art der Probennahme zählt zu den invasiven Verfahren, bei denen die körperliche Unversehrtheit des Probanden verletzt wird. In den 90er Jahren erfolgte ein Wandel der genetischen Nachweisverfahren für die Genotypisierung, insbesondere durch die Einführung der PCR-Technik und die Entwicklung von empfindlichen Testsystemen. Im Ergebnis dieser Entwicklung wird wesentlich weniger DNA-Material für die erfolgreiche Genotypisierung benötigt. Nachdem festgestellt wurde, dass beim Menschen Abriebe der Mundschleimhaut ausreichende Mengen an DNA für die Durchführung solcher Analysen enthalten, wurde das invasive Verfahren der Entnahme von Blutproben nach und nach durch die nicht-invasive Probennahme in Form von Abrieben von Zellen der inneren Wangenschleimhaut ersetzt.Genotyping from reference samples is routine routine in humans and animals. Until the mid-90s, tissue or blood samples were taken from this in humans, from which subsequently the contained DNA was recovered. This type of sampling is one of the most invasive procedures in which the physical integrity of the subject is violated. In the 1990s, genetic modification methods for genotyping changed, in particular through the introduction of PCR technology and the development of sensitive test systems. As a result of this development, much less DNA material is needed for successful genotyping. After determining that human oral abrasions contain sufficient amounts of DNA to perform such analyzes, the invasive method of taking blood samples has been progressively replaced by non-invasive sampling in the form of abraded cells of the inner buccal mucosa.
Völlig anders sieht es dagegen bei der Genotypisierung von Labornagern, wie Ratten und Mäusen aus. Hier stellt die Biopsie von Schwanzspitzen nach wie vor die wichtigste Methode zur Probennahme beim lebenden Tier dar. Das Abschneiden von Schwanzspitzen ist ein Eingriff in die körperliche Unversehrtheit. Die Forderung nach der Verbesserung des Tierschutzes steht seit Jahren permanent auf der Tagesordnung.On the other hand, it looks quite different in the genotyping of laboratory rodents, such as rats and mice. Here, tail tip biopsy is still the most important method of sampling in living animals. The cutting of tail tips is an invasion of physical integrity. The demand to improve animal welfare has been on the agenda for many years.
Obwohl als alternative Methode auf der Hand liegend, hat sich die Methode der Abstriche der Wangenschleimhaut für Labormäuse dennoch bislang nicht etabliert. Ein bloßes Übertragen der Vorgehensweise bzw. der kommerziell verfügbaren Testkits aus der Forensik auf die Labormaus stößt auf Probleme und ist daher nicht umsetzbar. Ähnliches gilt für kommerzielle Anwendungen, die für die DNA-Extraktion aus Schwanzspitzen der Maus bekannt sind (z. B. Puregene Mouse Tail Kit, Qiagen; Mouse Tail Purification Kit, Promega; blackPREP Rodent tail DNA Kit, Analytik Jena AG). Einzelne Anbieter offerieren DNA-Extraktionskits aus Schwanzspitzen auch in Kombination mit zusätzlichen Komponenten für die nachfolgende Durchführung der PCR (DirectPCR Lysis Reagent (Mouse tail), Viagen Biotech Inc. oder EzWay Mouse Tail Direct PCR Kit, KOMA Biotech, Korea). All diese DNA-Extraktionssets sind hinsichtlich ihrer Zusammensetzung weitestgehend identisch mit solchen für die Arbeit mit Probenmaterial humanen Ursprungs. Es zeigt sich, dass auch hier die Anwendung auf eine Genotypisierung von Proben aus der Wangenschleimhaut der Maus auf analoge technische Probleme stößt. Somit gibt es bislang keine Methode und kein Musterset für die erfolgreiche Genotypisierung von Labornagern, die auf einem nicht-invasiven Verfahren der Probennahme basiert.Although an obvious alternative method, the method of swabbing the cheek mucosa has not yet been established for laboratory mice. A mere transfer of the procedure or the commercially available test kits from forensics to the laboratory mouse encounters problems and is therefore not feasible. The same applies to commercial applications known for mouse tail tail DNA extraction (eg, Puregene Mouse Tail Kit, Qiagen, Mouse Tail Purification Kit, Promega, blackPREP Rodent Tail DNA Kit, Analytik Jena AG). Individual suppliers also offer tail tip DNA extraction kits in combination with additional components for subsequent PCR (DirectPCR Lysis Reagent (Mouse tail), Viagen Biotech Inc. or EzWay Mouse Tail Direct PCR kit, KOMA Biotech, Korea). All of these DNA extraction kits are largely identical in composition to those used for human sample material. It turns out that the application to a genotyping of samples from the mucous membrane of the mouse encounters similar technical problems. Thus, to date, there is no method or pattern set for the successful genotyping of laboratory rodents based on a non-invasive method of sampling.
Ziel der Erfindung ist es, zur Vermeidung der obengenannten Nachteile der invasiven Gewebeentnahme, ein Komplettkit für die Genotypisierung von Labornagern zur Verfügung zu stellen, welches auf der nicht-invasiven Probenahme in Form von Abrieben aus dem Maul, speziell der Wangenschleimhaut basiert. Es versetzt den Anwender in die Lage, alle notwendigen Arbeitsschritte durchführen zu können, beginnend mit der nicht-invasiven Probennahme, der DNA-Extraktion bis hin zur Genotypisierung. Erfindungsgemäß benötigt der Anwender lediglich zusätzlich solche Komponenten (z. B. PCR-Primer), wie sie für den spezifischen Nachweis seiner Target-DNA eingesetzt werden.The aim of the invention is, in order to avoid the above-mentioned disadvantages of invasive tissue removal, to provide a complete kit for the genotyping of laboratory rodents, which is based on the non-invasive sampling in the form of abrasions from the mouth, especially the cheek mucosa. It enables the user to carry out all necessary work steps, starting with the non-invasive sampling, the DNA extraction up to the genotyping. According to the invention, the user merely additionally requires such components (eg PCR primers) as are used for the specific detection of his target DNA.
Neben der Vereinfachung für den Anwender liegt die wesentliche Begründung für so ein Kit darin, standardisierte Bedingungen bei allen Arbeitsschritten zu schaffen und damit die Aussicht auf eine erfolgreiche Durchführung der Genotypisierung zu maximieren. Als qualitätsentscheidende Schritte gelten vor allem die korrekte Probenahme und die DNA-Extraktion. Zusätzliche Komponenten für die nachfolgende Durchführung der Genotypisierung von DNA-Extrakten ergänzen das Kit. Sie sind zwar allgemein bekannt, bedürfen aber zwingend einer Optimierung auf die Gegebenheiten der DNA-Extraktion. Daher ergänzen sorgfältig aufeinander abgestimmte Komponenten für die Durchführung der Genotypisierung das Komplettkit.In addition to simplification for the user, the essential rationale for such a kit is to create standardized conditions at all stages of work, thereby maximizing the chance of successful genotyping. Above all, the correct sampling and the extraction of DNA are regarded as quality-decisive steps. Additional components for subsequent genotyping of DNA extracts supplement the kit. Although they are generally known, they necessarily require optimization for the conditions of DNA extraction. Therefore, carefully matched components for performing genotyping complement the complete kit.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Detailed description of the invention
Erfindungsgemäß wird ein Kit beschrieben, das einfach handhabbar ist und dessen einzelne Komponenten die mit der Miniaturisierung einher gehenden technischen Probleme lösen. Die erfindungsgemäße Identifizierung qualitätskritischer Parameter für die Probennahme und Probenaufarbeitung bei der Maus und das darauf aufbauende zielgerichtete Zusammenfassen geeigneter Komponenten in ein aufeinander abgestimmtes Komplettkit ermöglicht die erfolgreiche Anwendung der Genotypisierung von Labornagern aus nicht-invasiv gewonnenem Vergleichsmaterial. Nachfolgend werden die einzelnen Komponenten und deren wesentlichen qualitätskritische Eigenschaften beschrieben.According to the invention, a kit is described which is easy to handle and whose individual components solve the technical problems associated with miniaturization. The identification according to the invention of quality-critical parameters for the sampling and sample processing in the mouse and the subsequent constructive combination of suitable components in a coordinated complete kit allow the successful application of the genotyping of laboratory bearings from non-invasively obtained comparison material. The individual components and their essential quality-critical properties are described below.
Im Gegensatz zum Menschen ist die Probennahme bei der Maus mit verschiedenen technischen Schwierigkeiten verbunden. Genotypisierungen werden überwiegend bei nur wenige Tage oder wenige Wochen alten Jungtieren durchgeführt, die im Vergleich zur erwachsenen Maus noch sehr klein sind. Die in der Forensik eingesetzten Wattetupfer sind schon allein wegen ihrer relativen Größe nicht für den Einsatz bei der Maus geeignet. Erschwerend kommt hinzu, dass die für die Probennahme zur Verfügung stehende Fläche der Wangentasche im Vergleich zum Menschen nur einen winzigen Bruchteil ausmacht, was die Menge des zur Verfügung stehenden Ausgangsmaterials erheblich minimiert. Das beim Menschen praktizierte Verfahren der Probennahme kann daher nicht auf die Maus übertragen werden. Verfahren zur Gewinnung von ausreichenden Mengen an Epithelzellen aus der Wangeninnenseite der Maus sind nicht bekannt.In contrast to humans, sampling in the mouse involves various technical difficulties. Genotyping is predominantly performed on juveniles only days or weeks old that are still very small compared to the adult mouse. The cotton swabs used in forensics, because of their relative size alone, are not suitable for use with the mouse. To make matters worse, the available for sampling area of the cheek pouch makes up only a tiny fraction compared to humans, which significantly minimizes the amount of available starting material. Therefore, the human sampling procedure can not be transferred to the mouse. Methods for obtaining sufficient amounts of epithelial cells from the inside of the mouse cheek are not known.
Die optimale Probennahme ist der wesentliche qualitätskritische Schritt für eine erfolgreiche Genotypisierung bei der Maus. Es muss ein Tupfer zum Einsatz kommen, der gleichzeitig mehrere Aufgaben zu erfüllen hat. Die Größe sollte so bemessen sein, dass der effektive Bereich zur Probennahme mit den Abmaßen des Rachenraums bei einer jungen Maus vereinbar ist, der ca. 1 cm in der Länge und 2–3 mm in der Breite nicht übersteigt. Versuche mit verschiedenen von der Größe her geeigneten Arten von Tupfern ergaben überraschend, dass das Kriterium der Größe als alleiniger Faktor nicht ausreichend ist. Es zeigt sich, dass das Reiben in der Wangentasche der Maus häufig zu Blutungen führt. Das ist daran erkennbar, dass sich der Tupfer nach der Entnahme bluttypisch rötlich verfärbt. Dies ist vor allem für Jungtiere nicht hinnehmbar, da dadurch Quellen für Infektionen geschaffen werden. Vergleichende Tests haben ergeben, dass für diesen negativen Effekt sowohl das verwendete Tupfermaterial als auch die Steifheit des Tupferstieles beim Reiben verantwortlich sind. Ein Großteil von kommerziell erhältlichen Tupfern, die zwar anhand der Abmaße geeignet erscheinen, können daher nicht für die Tierschutz-konforme Probennahme eingesetzt werden.Optimal sampling is the essential quality-critical step for successful mouse genotyping. A swab must be used, which has to fulfill several tasks at the same time. The size should be such that the effective sampling area is consistent with the throat area dimensions of a young mouse not exceeding about 1 cm in length and 2-3 mm in width. Surprisingly, experiments with various size-appropriate types of swabs revealed that the criterion of size as the sole factor is insufficient. It turns out that the rubbing in the cheek pouch of the mouse often leads to bleeding. This is recognizable by the fact that the swab turns red blood-red after removal. This is unacceptable, especially for juveniles, as it creates sources of infection. Comparative tests have shown that both the swab material used and the stiffness of the swab stem during rubbing are responsible for this negative effect. Therefore, a large part of commercially available swabs, which appear suitable on the basis of the dimensions, can not be used for animal welfare-compliant sampling.
Erfindungsgemäß werden daher sterile Tupfer mit einem flexiblen Steg eingesetzt, die dadurch nur einen mäßigen Druck auf die Wangenschleimhaut ausüben und sich bei übermäßigem Druck verbiegen können. Gleichzeitig besteht der ins Maul einzuführende Bereich des Tupfers aus einem solchen Material, das nur geringfügig auf die Wangenschleimhaut einwirkt und ungewollte Blutungen vermeidet. Damit wird die Unversehrtheit des Tieres bestmöglich gewährleistet.According to the invention therefore sterile swabs are used with a flexible web, which thereby exert only a moderate pressure on the cheek mucosa and can bend at excessive pressure. At the same time, the area of the swab to be introduced into the mouth consists of such a material, which has only a slight effect on the cheek mucosa and avoids unwanted bleeding. This ensures the integrity of the animal in the best possible way.
Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn das ins Maul einzuführende Endstück des Tupfers aus einem nicht saugenden Material besteht. So wird erreicht, dass nur wenig Speichelflüssigkeit auf den Tupfer übertragen wird, was den anschließenden Trocknungsprozess des Probenmaterials wesentlich beschleunigt und beginnende Prozesse der Degradierung von DNA schnellstmöglich unterbindet.It is also advantageous if the end piece of the swab to be introduced into the mouth consists of a non-absorbent material. This ensures that only a small amount of saliva is transferred to the swab, which significantly accelerates the subsequent drying process of the sample material and prevents the beginning of DNA degradation processes as quickly as possible.
Der beschriebene milde Abrieb der Oberfläche der Wangenschleimhaut ist ein gangbarer Weg. Eine solche vorsichtige Probennahme hat den negativen Effekt zur Folge, dass letztendlich nur sehr wenig Zellmaterial gesichert werden kann. Die darin enthaltene Menge an DNA beträgt ca. 1–5 ng, das ist weniger als 1/100 der Menge, die normalerweise bei der Biopsie von Schwanzspitzen erhalten wird (ca. 400–800 ng DNA). Es muss daher davon ausgegangen werden, dass selbst bei einer überwiegend verlustfreien Lagerung und DNA-Extraktion zwischen 1% und 10% des Gesamtextraktes für eine Genotypisierung bei der Maus benötigt werden. Für die DNA-Extraktion aus dem Tupfer ist daher erforderlich, dass die in den Zellen vorliegende DNA möglichst quantitativ gewonnen werden kann. Ein weiteres Kriterium ist eine einfache Handhabbarkeit und Schnelligkeit der Durchführung der Extraktion. Typische allgemein bekannte aufwendige Methoden, wie die Extraktion mittels Phenol/Chloroform oder der Einsatz von Lysepuffern mit einer nachfolgenden Aufreinigung über entsprechendes Säulenmaterial sind personal-, kosten- und zeitintensiv und daher nicht vorteilhaft.The described mild abrasion of the surface of the buccal mucosa is a viable option. Such careful sampling has the negative effect that ultimately very little cell material can be secured. The amount of DNA contained therein is about 1-5 ng, which is less than 1/100 of the amount normally obtained in tail tip biopsy (about 400-800 ng of DNA). It must therefore be assumed that even with predominantly lossless storage and DNA extraction between 1% and 10% of the total extract is required for genotyping in the mouse. For the DNA extraction from the swab, it is therefore necessary that the DNA present in the cells can be obtained as quantitatively as possible. Another criterion is ease of handling and rapid execution of the extraction. Typical well-known elaborate methods, such as the extraction by means of phenol / chloroform or the use of lysis buffers with a subsequent purification via appropriate column material are labor-intensive, expensive and time-consuming and therefore not advantageous.
In den letzten Jahren etablierten sich verschiedene kommerzielle Anwendungen, bei denen die Tupfer in einen Extraktionspuffer gegeben werden und nachfolgend die Flüssigkeit ohne weitere Aufreinigung für die Durchführung der PCR eingesetzt werden kann. Solche Direktpuffer haben den Vorteil, dass in der Extraktionsflüssigkeit die gesamte DNA enthalten ist, also keine Verluste auftreten. Die Aufgabe des Extraktionspuffers ist die Zerstörung der Schleimhautzellen und die Freisetzung der enthaltenen DNA. Nachfolgend muss diese an sich aggressive Flüssigkeit entsprechend neutralisiert werden. Geschieht dies nicht, so werden die für die nachfolgende Genotypisierung benötigten Enzyme ebenso geschädigt (z. B. Taq DNA Polymerase).In recent years, various commercial applications have been established, in which the swabs are placed in an extraction buffer and subsequently the liquid can be used without further purification for carrying out the PCR. Such direct buffers have the advantage that the entire DNA is contained in the extraction liquid, so no losses occur. The task of Extraction buffer is the destruction of mucosal cells and the release of the contained DNA. Subsequently, this aggressive liquid must be neutralized accordingly. If this is not done, the enzymes required for the subsequent genotyping are also damaged (eg Taq DNA polymerase).
Ziel des Gebrauchsmusters ist es, ein komplettes Komplettkit zur Verfügung zu stellen, welches den Anwender in die Lage versetzt, alle notwendigen Arbeitsschritte von der nicht-invasiven Probennahme bis hin zur Genotypisierung durchführen zu können. Erfindungsgemäß benötigt der Anwender lediglich zusätzlich solche Komponenten (z. B. PCR-Primer), wie sie für den spezifischen Nachweis seiner Target-DNA eingesetzt werden.The aim of the utility model is to provide a complete complete kit, which enables the user to perform all necessary work steps from non-invasive sampling to genotyping. According to the invention, the user merely additionally requires such components (eg PCR primers) as are used for the specific detection of his target DNA.
Das Komplettkit enthält daher auch Komponenten, die für die Durchführung der eigentlichen Genotypisierung benötigt werden. Welche Komponenten dabei zum Einsatz kommen können, ist allgemein bekannt und gehört zum Stand der Technik. Es handelt sich dabei um Enzym/Puffersysteme für die Vervielfältigung (Amplifikation) der DNA, Zusätze wie Primer für interne Kontrollen oder Gel-Ladepuffer. Aufgrund der Besonderheit des Komplettkits bei der Extraktion der DNA, die keiner nachträglichen Aufreinigung unterzogen wird, können nicht beliebige kommerzielle Enzym/Puffersysteme eingesetzt werden. Um eine erfolgreiche Genotypisierung zu garantieren, ist es erforderlich, dass nur solche Substanzen eingesetzt werden, die den Gegebenheiten des DNA-Extraktes Rechnung tragen. Diese Aufgabe kann am besten dadurch gelöst werden, indem gleichzeitig optimierte Komponenten als Bestandteil des Komplettkits zur Verfügung gestellt werden.The complete kit therefore also contains components that are needed to perform the actual genotyping. Which components can be used here is well known and belongs to the state of the art. These are enzyme / buffer systems for the amplification of the DNA, additives such as primers for internal controls or gel loading buffer. Due to the peculiarity of the complete kit in the extraction of the DNA, which is subjected to no subsequent purification, not any commercial enzyme / buffer systems can be used. In order to guarantee successful genotyping, it is necessary to use only those substances which take into account the conditions of the DNA extract. This task can best be solved by simultaneously providing optimized components as part of the complete kit.
Bei dem erfindungsgemäßen Gebrauchsmuster handelt es sich um ein vollständiges Kit, das eine nicht-invasive Probennahme, die DNA-Extraktion sowie anschließenden Genotypisierung bei Labornagern ermöglicht und das aus folgenden, aufeinander abgestimmten einzelnen Komponenten besteht:
- – sterile, DNA-freie Tupfer für die Abnahme von Proben aus der inneren Wangentasche bei Maus/Ratte
- – Puffer für die schnelle, direkte DNA-Extraktion
- – ein Enzym/Puffersystem für die Durchführung der Genotypisierung (z. B. Taq DNA Polymerase, Taq-Antikörper und PCR-Puffer)
- – optional steriles Wasser
- – ein Gel-Ladepuffer als optionaler Zusatz zum Enzym/Puffersystem
- – optionale, interne Kontrollen zum Nachweis von DNA der Maus/Ratte und zum Nachweis der Funktionsfähigkeit des Enzym/Puffersystems
- - sterile, DNA-free swabs for the removal of samples from the inner cheek pouch in mouse / rat
- - Buffer for fast, direct DNA extraction
- An enzyme / buffer system for performing genotyping (eg Taq DNA polymerase, Taq antibody and PCR buffer)
- - optional sterile water
- A gel loading buffer as an optional addition to the enzyme / buffer system
- Optional internal controls for detecting mouse / rat DNA and for demonstrating the functionality of the enzyme / buffer system
Erfindungsgemäß benötigt der Anwender lediglich zusätzlich solche Komponenten (z. B. PCR-Primer), wie sie für den spezifischen Nachweis seiner Target-DNA eingesetzt werden.According to the invention, the user merely additionally requires such components (eg PCR primers) as are used for the specific detection of his target DNA.
Ausführungsbeispiel 1
Genotypisierung der Maus des Stammes C57BL/6JCrl mit Hilfe von STR-MarkernGenotyping of mouse strain C57BL / 6JCrl using STR markers
Aus dem erfindungsgemäßen Komplettkit zur nicht-invasiven Probennahme, DNA-Extraktion und anschließenden Genotypisierung bei Labornagern werden folgende Komponenten eingesetzt:
- – Sterile, DNA-freie Tupfer für die Abnahme von Proben aus der inneren Wangentasche der Maus/Ratte
- – Puffer für die schnelle, direkte DNA-Extraktion
- – ein Enzym/Puffersystem für die Durchführung der Genotypisierung (Taq DNA Polymerase, Taq-Antikörper und PCR-Puffer)
- – steriles Wasser
- - Sterile, DNA-free swabs for the removal of samples from the inner cheek pouch of the mouse / rat
- - Buffer for fast, direct DNA extraction
- An enzyme / buffer system for carrying out the genotyping (Taq DNA polymerase, Taq antibody and PCR buffer)
- - sterile water
Probenahme:Sampling:
Eine Maus des Stammes C57BL/6JCrl wird im Nacken fixiert, ein Tupfer wird seitlich in den Rachenraum der Maus geschoben und entsprechend der Vorschrift dreifach um seine Achse gedreht. Anschließend wird das bürstenförmige Endstück des Tupfers mittels einer Schere abgeschnitten und solcherart in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit Deckel überführt, dass sich die „Bürste” unten am Boden der Reaktionsgefäßes befindet.A mouse strain C57BL / 6JCrl is fixed in the neck, a swab is pushed laterally into the throat of the mouse and rotated in accordance with the rule three times around its axis. Subsequently, the brush-shaped end of the swab is cut off with a pair of scissors and transferred in such a way in a 1.5 ml reaction vessel with a lid that the "brush" is located at the bottom of the reaction vessel.
DNA-Extraktion:DNA extraction:
In das Reaktionsgefäß mit dem Endstück des Tupfers werden 100 μl des Lysepuffers zugegeben. Anschließend wird das Gefäß mit dem Deckel verschlossen. Das Reaktionsgefäß wird in einen Thermoschüttler gesetzt, der einen entsprechenden Einsatz für die Aufnahme solcher Gefäße besitzt. Die DNA-Extraktion erfolgt im Zeitraum von 15 Minuten bei einer Inkubationstemperatur von 70°C und gleichzeitigem Schütteln bei 1.300 U/min. Dadurch werden die Zellen der Wangenschleimhaut zerstört und die darin befindliche DNA freigesetzt. Gleichzeitig erfolgt eine Denaturierung von schädlichen Enzymen, die sich ebenfalls in den Zellen befinden und die DNA zerstören können (sog. DNasen) Nach dem anschließenden Abkühlen steht der vorliegende DNA-Extrakt sofort für die Durchführung der Genotypisierung zur Verfügung.In the reaction vessel with the tail of the
Herstellung des Gemisches für die Durchführung der PCR:Preparation of the mixture for carrying out the PCR:
Folgende Komponenten des Enzym/Puffergemisches werden bei Raumtemperatur miteinander zu einem sog. Mastermix kombiniert und in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß überführt:
5 μl 5× CR-Reaktionspuffer,
1 μl Taq DNA Polymerase, kombiniert mit einem Taq-Antikörper,
12 μl Wasser.The following components of the enzyme / buffer mixture are combined with each other at room temperature to form a so-called master mix and transferred into a 0.2 ml reaction vessel:
5 μl 5 × CR reaction buffer,
1 μl of Taq DNA polymerase combined with a Taq antibody,
12 μl of water.
Anschließend werden noch folgende Komponenten hinzugefügt, so dass das Endvolumen des Reaktionsgemisches 25 μl ergibt:
2 μl DNA-Extrakt,
5 μl PCR-Primer für die Amplifikation von STR-Loci mit folgenden DNA-Sequenzen: 
2 μl of DNA extract,
5 μl PCR primer for the amplification of STR loci with the following DNA sequences:
Durchführung der PCR:Execution of the PCR:
Die PCR erfolgt in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 
Der Nachweis der PCR-Produkte erfolgt am ABI 3500 entsprechend den Vorgaben. Das Ergebnis der Genotypisierung ist in
Ausführungsbeispiel 2
Genotypisierung von Mäusen auf das Vorhandensein des DNA-Targets Mx1Genotyping of mice for the presence of the DNA target Mx1
Aus dem erfindungsgemäßen Komplettkit zur nicht-invasiven Probennahme, DNA-Extraktion und anschließenden Genotypisierung bei Labornagern werden folgende Komponenten eingesetzt:
- – Sterile, DNA-freie Tupfer für die Abnahme von Proben aus der inneren Wangentasche der Maus/Ratte
- – Puffer für die schnelle, direkte DNA-Extraktion
- – ein Enzym/Puffersystem für die Durchführung der Genotypisierung (Taq DNA Polymerase, Taq-Antikörper und PCR-Puffer)
- – Gel-Ladepuffer
- – interne Kontrolle auf die Anwesenheit von Maus-DNA (
PCR Produkt 231 bp, Primersequenzen MusACTB231 up 5'-TTC TCC ATG TCG TCC CAG TTG GTA AC-3', MusACTB231 down 5'-CCG CCC TAG GCA CCA GGT AAG TG-3') - – steriles Wasser
- - Sterile, DNA-free swabs for the removal of samples from the inner cheek pouch of the mouse / rat
- - Buffer for fast, direct DNA extraction
- An enzyme / buffer system for carrying out the genotyping (Taq DNA polymerase, Taq antibody and PCR buffer)
- - Gel loading buffer
- Internal control for the presence of mouse DNA (
PCR product 231 bp, priming sequences MusACTB231 up 5'-TTC TCC ATG TCG TCC CAG TTG GTA AC-3 ', MusACTB231 down 5'-CCG CCC TAG GCA CCA GGT AAG TG-3 ') - - sterile water
Die Probenahme und DNA-Extraktion erfolgt analog wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Abstriche der Wangenschleimhaut werden von jeweils einer Maus mit (Mx1+) und ohne das DNA-Target (Mx1–) abgenommen. The sampling and DNA extraction is carried out analogously as described in Example 1. Smears of the buccal mucosa are taken from one mouse each with (Mx1 + ) and without the DNA target (Mx1 - ).
Herstellung des Gemisches für die Durchführung der PCR:Preparation of the mixture for carrying out the PCR:
Für die PCR werden drei verschiedene Proben angesetzt, je eine für die beiden DNA-Extrakte und eine zusätzliche Negativkontrolle ohne DNA, in welche an Stelle der DNA die entsprechende Menge an sterilem Wasser zugegeben wird. Pro PCR-Ansatz werden folgende Komponenten des Enzym/Puffergemisches bei Raumtemperatur miteinander zu einem sog. Mastermix kombiniert und in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß überführt:
5 μl 5× PCR-Reaktionspuffer,
1 μl Taq DNA Polymerase, kombiniert mit einem Taq-Antikörper,
5 μl 5× Gel-Ladepuffer, Primer für die 231 bp interne Kontrolle enthaltend
6 μl Wasser.For the PCR, three different samples are prepared, one for each of the two DNA extracts and an additional negative control without DNA, in which instead of the DNA, the appropriate amount of sterile water is added. The following components of the enzyme / buffer mixture are combined with each other at room temperature to form a so-called master mix and transferred to a 0.2 ml reaction vessel for each PCR batch:
5 μl 5 × PCR reaction buffer,
1 μl of Taq DNA polymerase combined with a Taq antibody,
5 μl 5 × gel loading buffer containing primer for the 231 bp internal control
6 μl of water.
Anschließend werden noch folgende Komponenten hinzugefügt, so dass das Endvolumen des Reaktionsgemisches 25 μl ergibt:
5 μl DNA-Extrakt,
je 1 μl spezifischer PCR-Primer (10 pmol/μl) für die Amplifikation von Mx1 mit folgenden DNA-Sequenzen: 
5 μl of DNA extract,
1 μl of specific PCR primer (10 pmol / μl) for the amplification of Mx1 with the following DNA sequences:
Durchführung der PCR:Execution of the PCR:
Die PCR erfolgt in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 
Nach Abschluss der PCR werden 10 μl des PCR-Produkts direkt in die dafür vorgesehenen Kammern eines 2%igen Agarosegels (mit GelRed) überführt. Die Elektrophorese erfolgt für 45 min bei 130 V in 1× TAE Puffer. Die visuelle Bewertung des Analyseergebnisses erfolgt unter UV-Licht und wird fotografisch dokumentiert (
Erläuterungen zu den AbbildungenExplanations to the pictures
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE202015002414.9U DE202015002414U1 (en) | 2015-03-28 | 2015-03-28 | Kit for genotyping laboratory rodents |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE202015002414.9U DE202015002414U1 (en) | 2015-03-28 | 2015-03-28 | Kit for genotyping laboratory rodents |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE202015002414U1 true DE202015002414U1 (en) | 2015-06-25 |
Family
ID=53523229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE202015002414.9U Expired - Lifetime DE202015002414U1 (en) | 2015-03-28 | 2015-03-28 | Kit for genotyping laboratory rodents |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE202015002414U1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3631014B1 (en) * | 2017-05-24 | 2022-05-11 | GVG Genetic Monitoring GmbH | Method for the genotyping of mouse strains |
-
2015
- 2015-03-28 DE DE202015002414.9U patent/DE202015002414U1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3631014B1 (en) * | 2017-05-24 | 2022-05-11 | GVG Genetic Monitoring GmbH | Method for the genotyping of mouse strains |
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