DE202012007324U1

DE202012007324U1 - Apparatus for treating a filtration medium

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Publication number: DE202012007324U1
Application number: DE202012007324U
Authority: DE
Original assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2012-08-28
Anticipated expiration: 2022-08-01

Abstract

Vorrichtung (1) zur Behandlung eines porösen Filtrationsmediums (37) mit einer aus einem Aufnahmeteil (5) und einem Bodenteil (6) bestehenden Aufnahmeeinheit (2), wobei mit dem Aufnahmeteil (5) das poröse Filtrationsmedium (37) von einem Unterteil (33) einer Filtrationsvorrichtung (32) aufnehmbar und das Aufnahmeteil (5) mit dem porösen Filtrationsmedium (37) auf das Bodenteil (6) aufsetzbar ist, und wobei das Aufnahmeteil (5) mit dem Bodenteil (6) verrastbar ausgebildet ist,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Bodenteil (6) zum Filtrationsmedium (37) hin einen Inkubationsraum (17) aufweist, der mit einem dem Aufnahmeteil (5) abgewandten Auslass (3) des Bodenteils (6) verbunden ist, und
dass der Auslass (3) einen Ansatz (24) aufweist, auf den ein ein Lösungsmittel (28) zum Auflösen des porösen Filtrationsmediums (37) enthaltendes Auffanggefäß (4) lösbar aufsteckbar ist.Device (1) for treating a porous filtration medium (37) having a receiving unit (2) consisting of a receiving part (5) and a bottom part (6), the porous filtration medium (37) being connected to the receiving part (5) by a lower part (33 ) of a filtration device (32) and the receiving part (5) with the porous filtration medium (37) on the bottom part (6) can be placed, and wherein the receiving part (5) with the bottom part (6) is formed latched,
characterized,
that the bottom part (6) towards the filtration medium (37) has an incubation space (17) which is connected to an outlet (3) of the bottom part (6) facing away from the receiving part (5), and
the outlet (3) has a projection (24) onto which a collecting vessel (4) containing a solvent (28) for dissolving the porous filtration medium (37) can be detachably placed.

Description

Gebiet der ErfindungField of the invention

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Behandlung eines porösen Filtrationsmediums mit einer aus einem Aufnahmeteil und einem Bodenteil bestehenden Aufnahmeeinheit, wobei mit dem Aufnahmeteil das poröse Filtrationsmedium von einem Unterteil einer Filtrationseinrichtung aufnehmbar und das Aufnahmeteil mit dem porösen Filtrationsmedium auf das Bodenteil aufsetzbar ist, und wobei das Aufnahmeteil mit dem Bodenteil verrastbar ausgebildet ist.The invention relates to a device for treating a porous filtration medium with a receiving unit consisting of a receiving part and a bottom receiving unit, wherein the receiving part, the porous filtration medium from a lower part of a filtration device can be received and the receiving part with the porous filtration medium placed on the bottom part, and wherein the Receiving part is formed locked to the bottom part.

Stand der TechnikState of the art

Derzeit werden für Routineuntersuchungen hauptsächlich mikrobiologische Methoden angewandt, die einzelne Mikroorganismen mithilfe von Kultivierungsschritten nachweisen. Diese Methoden sind jedoch sehr zeitaufwändig und können mehrere Tage dauern, bis eine Kontamination des wässrigen Mediums nachgewiesen werden kann. Moderne und schnelle Nachweismethoden für Mikroorganismen, wie Realtime PCR, Antikörper-Assays oder analytische Mikroarrays ermöglichen eine schnelle Detektion von mikrobieller Kontamination. Um jedoch die Nachweisgrenzen für diese Detektionsverfahren zu senken und idealerweise auch einen einzelnen Keim ausfindig zu machen, sind zuvor schnelle und effektive Anreicherungsschritte notwendig, die ein großes Probevolumen von bis zu mehreren Litern auf wenige hundert Mikroliter einengen. Die aufkonzentrierte Probe bietet ein besseres Handling mit geringerem Verbrauch an Reagenzien und kann beliebig entsprechend der darauffolgenden Detektionsmethode prozessiert werden.Currently, microbiological methods are used for routine investigations, which detect single microorganisms by means of cultivation steps. However, these methods are very time consuming and can take several days to detect contamination of the aqueous medium. Modern and rapid detection methods for microorganisms, such as real-time PCR, antibody assays or analytical microarrays enable rapid detection of microbial contamination. However, to reduce the detection limits for these detection methods, and ideally also to locate a single seed, rapid and effective enrichment steps, which narrow a large sample volume of up to several liters to a few hundred microliters, are previously necessary. The concentrated sample offers better handling with lower reagent consumption and can be processed arbitrarily according to the subsequent detection method.

In der Analytik von Flüssigkeiten und Gasen haben sich verschiedene Behandlungsmethoden etabliert, die poröse Medien, wie Filter und Membranen, einsetzen. Zum Beispiel hat sich das Filtrationsverfahren zur Abreicherung und Konzentrierung von gelösten oder partikulären Inhaltsstoffen etabliert. Diese Konzentrierung ist meist notwendig, da die Konzentrationen der Verunreinigungen zu gering sind, um direkte Auswertungen durchzuführen. Die Filtrationsmethoden dienen als Vorstufe für weitere analytische Methoden, wie optische Auswertungen, sowie für weitere physikalische und chemische Reaktionen zur Signalverstärkung.In the analysis of liquids and gases, various treatment methods have become established, using porous media such as filters and membranes. For example, the filtration process has become established for the depletion and concentration of dissolved or particulate ingredients. This concentration is usually necessary because the concentrations of impurities are too low to perform direct evaluations. The filtration methods serve as precursors for further analytical methods, such as optical evaluations, as well as for further physical and chemical reactions for signal amplification.

Für neuere, sensitivere Analysemethoden, zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion (PCR), sowie deren Probenvorbereitung können nur geringe Probevolumina verwendet werden. Um die in vielen Fällen typischen Probevolumina von mehr als 100 ml für eine Konzentrierung filtrieren zu können, werden typischerweise Filtrationsmembranen mit 47 mm oder 25 mm Durchmesser eingesetzt. Auch nach der Filtration, wenn die Inhaltsstoffe oder Partikel auf der Filtrationsmembran konzentriert vorliegen, können die membrangebundenen Partikel aufgrund der Membrangröße nicht direkt der Analytik zugeführt werden. Es ist notwendig, die zurückgehaltenen Inhaltsstoffe in ein Probevolumen zu überführen, das idealerweise 1 ml nicht überschreiten sollte, um eine Probenvorbereitung für die anschließende Analytik in Standardreaktionsgefäßen zu ermöglichen, die in Tischzentrifugen passen, die üblicherweise zum Standardequipment eines jeden Labors gehören.For newer, more sensitive analysis methods, for example the polymerase chain reaction (PCR), as well as their sample preparation, only small sample volumes can be used. In order to be able to filter the typically more than 100 ml sample volumes for concentration, filtration membranes of 47 mm or 25 mm diameter are typically used. Even after the filtration, when the ingredients or particles are concentrated on the filtration membrane, the membrane-bound particles can not be directly supplied to the analytics due to the membrane size. It is necessary to transfer the retained ingredients to a sample volume that ideally should not exceed 1 ml to allow sample preparation for subsequent analysis in standard reaction vessels that fit into desktop centrifuges, which are usually standard equipment in each laboratory.

Aus der WO 2011/057707 A2 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Behandlung eines porösen Filtrationsmediums mit einer aus einem Aufnahmeteil und einem Bodenteil bestehenden Aufnahmeeinheit bekannt. Mit dem Aufnahmeteil ist das poröse Filtrationsmedium von einem Unterteil einer Filtrationseinrichtung aufnehmbar und das Aufnahmeteil mit dem porösen Filtrationsmedium ist auf das Bodenteil aufsetzbar, wobei das Aufnahmeteil und das Bodenteil miteinander reversibel verbindbar ausgebildet sind. Die bekannte Vorrichtung, die sich grundsätzlich bewährt hat, dient zur Überführung von filtrierten Inhaltsstoffen aus einem Filter (Filtrationsmedium) durch Rückspülung in ein Auffanggefäß, das mit dem Aufnahmeteil verbunden ist.From the WO 2011/057707 A2 For example, an apparatus and a method for treating a porous filtration medium with a receiving unit consisting of a receiving part and a bottom part are known. With the receiving part, the porous filtration medium from a lower part of a filtration device is receivable and the receiving part with the porous filtration medium can be placed on the bottom part, wherein the receiving part and the bottom part are formed reversibly connectable with each other. The known device, which has proven itself in principle, is used to transfer filtered ingredients from a filter (filtration medium) by backwashing in a collecting vessel, which is connected to the receiving part.

Nachteilig dabei ist, dass aufgrund der Porengrößenverteilung der meisten Membranfilter zahlreiche Partikel nicht auf der Oberfläche der Membranfilter abgeschieden werden, sondern in tieferen Schichten, so dass keine quantitativ vollständige Rückspülung der Partikel möglich ist. Unspezifische Adsorptionsereignisse der zurückgehaltenen Partikel an der Membran verstärken dieses Problem zusätzlich.A disadvantage is that due to the pore size distribution of most membrane filters numerous particles are not deposited on the surface of the membrane filter, but in deeper layers, so that no quantitatively complete backwashing of the particles is possible. Unspecific adsorption events of the retained particles on the membrane additionally amplify this problem.

Aus der DE 10 2008 005 968 A1 ist eine Nährmedieneinheit und ein Verfahren zur Aufnahme eines Filters aus einer Filtrationsvorrichtung bekannt. Die Nährmedieneinheit besteht dabei aus einem Deckel bzw. einem Aufnahmeteil, das die eigentliche Transfereinheit bildet, und einem mit Nährmedium gefüllten Unterteil. Das als Aufnahmeteil ausgebildete Oberteil weist dabei einen Fixierrand auf, der zur Entnahme des Filtrationsmediums aus der Filtrations- oder Behandlungsvorrichtung mit einem Rand des Filters über eine Klebehaftung verbindbar ist. From the DE 10 2008 005 968 A1 For example, a nutrient media unit and a method for receiving a filter from a filtration device are known. The Nährmedieneinheit consists of a lid or a receiving part, which forms the actual transfer unit, and a filled with nutrient medium lower part. The upper part formed as a receiving part has a fixing edge, which can be connected to an edge of the filter via an adhesive bond in order to remove the filtration medium from the filtration or treatment device.

Aus der DE 10 2008 005 968 A1 ist weiterhin ein Verfahren zur mikrobiologischen Untersuchung flüssiger Proben bekannt, bei dem ein Deckel bzw. Aufnahmeteil einer Nährmedieneinheit auf einen in einem Unterteil einer Filter- bzw. Behandlungsvorrichtung angeordneten, als Membranfilter ausgebildeten Filter mit einem Fixierrand aufgesetzt wird. Dabei wird der Fixierrand des Aufnahmeteils über eine Haftschicht mit einem Rand des Filters verbunden. Anschließend wird das Aufnahmeteil mit dem Filter von einer Filterunterstützung des Unterteils der Filtervorrichtung abgehoben und auf einer Oberfläche eines in dem Unterteil einer Nährmedieneinheit angeordneten Nährbodens abgelegt, wobei der Deckel bzw. das Aufnahmeteil das schalenförmig ausgebildete Unterteil abdeckt.From the DE 10 2008 005 968 A1 Furthermore, a method for the microbiological examination of liquid samples is known, in which a cover or receiving part of a nutrient medium unit is placed on a arranged in a lower part of a filter or treatment device, designed as a membrane filter filter with a fixing edge. In this case, the fixing edge of the receiving part is connected via an adhesive layer with an edge of the filter. Subsequently, the receiving part with the filter is lifted off a filter support of the lower part of the filter device and deposited on a surface of a nutrient medium arranged in the lower part of a culture medium unit, the cover or the receiving part covering the shell-shaped lower part.

Nachteilig bei den bekannten Filtrationseinheiten und den korrespondierenden Verfahren, die sich für klassische, mikrobiologische Membrananwendungen bewährt haben, in denen man lediglich Partikel entfernt oder im Bereich der Mikrobiologie entstandene Kolonien visuell auswertet, ist aber, dass nach der Filtration die zurückgehaltenen Partikel oder deren Inhaltsstoffe von der Membran nicht mehr in der Weise durch Abspülen zu entfernen sind, dass hochkonzentrierte Suspensionen entstehen.A disadvantage of the known filtration units and the corresponding methods, which have been proven for classical microbiological membrane applications, in which one only removes particles or visually evaluated in the field of microbiology colonies, but is that after filtration, the retained particles or their ingredients of The membrane can no longer be removed by rinsing in such a way that highly concentrated suspensions arise.

Ein Auflösen eines porösen Filtrationsmediums mit dem Ziel einer PCR-Analyse der Inhaltsstoffe ist aus der JP 2012-019723 A , aus L. J. DiMichele (Am. Soc. Brew. Chem., 1993, vol. 51, No. 2, S. 63–66) , aus K. Nakamura (Journal of Aerosol Research, 2003, Vol. 18, No. 3, S. 177–180) und aus K. Stärk (Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 2, S. 543–548) bekannt.Dissolution of a porous filtration medium for the purpose of PCR analysis of the ingredients is known from JP 2012-019723 A , out LJ DiMichele (Am Soc Soc Brew Chem., 1993, vol 51, No. 2, pp. 63-66). , out K. Nakamura (Journal of Aerosol Research, 2003, Vol. 18, No. 3, p. 177-180) and from K. Stärk (Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 2, pp. 543-548) known.

Nachteilig ist jedoch bei jedem dieser Dokumente ein hohes Kontaminationsrisiko, da das Filtrationsmedium mit einer Pinzette aufgenommen, gefaltet und in ein Reaktionsgefäß (meist 1,5 bis 2 ml Gefäß) überführt werden muss. Kontaminationsgefahr besteht ebenfalls durch den nachfolgenden Zusatz des Solvens für die Membran in einem offenen System.However, the disadvantage of each of these documents is a high risk of contamination, since the filtration medium has to be taken up with tweezers, folded and transferred into a reaction vessel (usually 1.5 to 2 ml vessel). Danger of contamination also exists due to the subsequent addition of the solvent for the membrane in an open system.

Aus JP 2012-019723 A ist weiterhin bekannt, Cellulosemembranen, auf welchen Mikroorganismen fixiert sind, in Aceton aufzulösen und wässrige Pufferlösungen zuzusetzen, um eine Lösung zu erhalten, welche die Mikroorganismen enthält.Out JP 2012-019723 A It is also known to dissolve cellulosic membranes on which microorganisms are fixed in acetone and to add aqueous buffer solutions to obtain a solution containing the microorganisms.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass bei diesem Prozess Cellulose in Faserform teilweise wieder ausgefällt wird, wobei die Cellulosefasern in unerwünschter Weise Anteile der Mikroorganismen bzw. der DNA binden und so die quantitative Analyse der Mikroorganismen erschwert wird. Um die unerwünschte Adsorption der Mikroorganismen bzw. DNA auf den Fasern zu verringern, werden bestimmte Additive, z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid, zugegeben. Aber eine vollständig quantitative Analyse kann nicht erreicht werden.A disadvantage of this process is that in this process, cellulose in the form of fibers is partly precipitated again, the cellulose fibers undesirably binding portions of the microorganisms or of the DNA, thus making the quantitative analysis of the microorganisms more difficult. In order to reduce the unwanted adsorption of microorganisms or DNA on the fibers, certain additives, for. As cetyltrimethylammonium bromide added. But a complete quantitative analysis can not be achieved.

Aus L. J. DiMichele (Am. Soc. Brew. Chem., 1993, vol. 51, No. 2, S. 63–66) ist weiterhin bekannt, Polycarbonatmembranen, auf welchen Mikroorganismen fixiert sind, in einem Gemisch aus Wasser und Chloroform zu lösen (200 μl Wasser und 300 μl Chloroform), mit dem Ziel der Anreicherung der Mikroorganismen in der wässrigen Phase. Nach Aufnahme der wässrigen Phase in ein neues Gefäß erfolgt das Pelletieren der Mikroorganismen mittels Zentrifugation. Es folgen ein Waschschritt und anschließend die PCR.Out LJ DiMichele (Am Soc Soc Brew Chem., 1993, vol 51, No. 2, pp. 63-66). It is also known to dissolve polycarbonate membranes, on which microorganisms are fixed, in a mixture of water and chloroform (200 μl of water and 300 μl of chloroform) with the aim of enrichment of the microorganisms in the aqueous phase. After the aqueous phase has been taken up in a new vessel, the microorganisms are pelleted by centrifugation. This is followed by a washing step and then the PCR.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass sich Mikroorganismen in der Praxis nicht in der oberen wässrigen Phase anreichern. Es kommt vielmehr zur Sedimentation der Mikroorganismen in die organische Phase (untere Phase) bzw. in die Grenzschicht, so dass mit dieser Methode keine vollständige Wiederfindung der Mikroorganismen erzielt werden kann. Des Weiteren enthält das beschriebene Verfahren keinen Lyseschritt, um die Mikroorganismen aufzuschließen, so dass davon ausgegangen werden muss, dass zahlreiche intakte Zellen für die PCR eingesetzt werden und somit die Amplifikation für den Großteil der DNA nicht möglich ist.A disadvantage of this method is that microorganisms do not accumulate in practice in the upper aqueous phase. Rather, it comes to the sedimentation of microorganisms in the organic phase (lower phase) or in the boundary layer, so that with this method no complete recovery of the microorganisms can be achieved. Furthermore, the described method does not contain a lysing step in order to digest the microorganisms, so that it must be assumed that numerous intact cells are used for the PCR and thus the amplification for the majority of the DNA is not possible.

Aus K. Stärk (Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 2, S. 543–548) ist weiterhin bekannt, Polyethersulfonmembranen, auf welchen Mikroorganismen fixiert sind, in Chloroform zu lösen. Anschließend erfolgen die Zugabe von TE-Puffer und eine zehnminütige Extraktion der DNA in die wässrige Phase unter Schütteln bei Raumtemperatur. Die wässrige Lösung soll anschließend einer alkoholischen DNA-Fällung unterzogen werden, bevor die Auswertung mittels PCR geschieht.Out K. Stärk (Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 2, pp. 543-548) It is also known to dissolve polyethersulfone membranes on which microorganisms are fixed in chloroform. Subsequently, the addition of TE buffer and a ten-minute extraction of the DNA in the aqueous phase with shaking at room temperature. The aqueous solution should then be subjected to an alcoholic DNA precipitation before the evaluation is carried out by means of PCR.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass nur ein geringer Anteil der DNA in die wässrige Phase extrahiert werden kann, da zuvor kein Lyseschritt erfolgt ist, um die Mikroorganismen aufzuschließen und somit die DNA frei zugänglich zu machen. Unter Verwendung dieser Methode kommt es vielmehr zur Sedimentation der noch intakten Mikroorganismen in die untere organische Phase bzw. in die Grenzschicht zwischen organischer und wässriger Phase.A disadvantage of this method is that only a small proportion of the DNA can be extracted into the aqueous phase, since previously no lysis step has taken place to unlock the microorganisms and thus make the DNA freely accessible. Using this method, it is rather the sedimentation of the still intact microorganisms in the lower organic phase or in the boundary layer between the organic and aqueous phase.

Auch aus K. Sen (Applied and Environmental Microbiology, 2007, vol. 73, No. 22, S. 7380–7387) ist bekannt, das Filtrationsmedium mit einer Pinzette zu falten und in ein Reaktionsgefäß zu überführen. Es folgt kein Auflöseschritt der Membran, sondern lediglich ein Abspülschritt mit beispielsweise einem kommerziellen Lysepuffer oder eine mechanische Beanspruchung der Membran durch Vortexen in Anwesenheit von Mahlkugeln, was dem Zellaufschluss dient. Bei K. Sen kommen verschiedene kommerzielle Kits zur DNA-Isolierung zum Einsatz. Also from K. Sen (Applied and Environmental Microbiology, 2007, vol. 73, No. 22, pp. 7380-7387). It is known to fold the filtration medium with tweezers and transfer it into a reaction vessel. This is not followed by a disintegration step of the membrane, but merely a rinsing step with, for example, a commercial lysis buffer or mechanical stress on the membrane by vortexing in the presence of grinding balls, which serves for cell disruption. K. Sen uses various commercial DNA isolation kits.

Nachteilig bei den beschriebenen Verfahren ist nicht nur die erhöhte Kontaminationsgefahr durch das Falten und Überführen der Membran mithilfe einer Pinzette, sondern auch, dass ein vollständiges Abspülen der Mikroorganismen von der Membran nicht möglich ist, da Mikroorganismen häufig auch in tieferen Schichten der Membran abgeschieden werden und es zusätzlich zu unspezifischer Adsorption an die Membran kommen kann, so dass ein oberflächlicher Spülschritt nicht effektiv ist. Erschwerend kommt hinzu, dass bei einer klein zusammengefalteten Membran in einem Reaktionsgefäß keine gezielte reverse Spülung der Membran erfolgen kann, lediglich ein ungerichtetes Mixen bzw. Vortexen von Membran und Spüllösung kann erreicht werden.A disadvantage of the described method is not only the increased risk of contamination by folding and transferring the membrane by means of tweezers, but also that a complete rinsing of the microorganisms from the membrane is not possible because microorganisms are often deposited in deeper layers of the membrane and In addition to unspecific adsorption, it may also come to the membrane such that a superficial rinse step is not effective. To make matters worse, that in a small collapsed membrane in a reaction vessel targeted reverse flushing of the membrane can not be done, only an undirected mixing or vortexing of membrane and rinse solution can be achieved.

Aus der WO 2012/031156 A1 ist eine Filtrationsvorrichtung bekannt, die ein kontaminationsfreies Arbeiten dadurch ermöglicht, dass das Filtrationsmedium (13 mm Durchmesser der Filtrationsfläche) in der verschließbaren Vorrichtung verbleibt und der Zellaufschluss direkt auf der Membran mithilfe von Mahlkugeln und Vortexen erfolgt. Die freie DNA passiert in einem anschließenden Filtrationsschritt die Membran.From the WO 2012/031156 A1 For example, a filtration device is known that allows contamination-free operation by leaving the filtration medium (13 mm diameter of filtration area) in the sealable device and disrupting cells directly on the membrane using grinding balls and vortexing. The free DNA passes through the membrane in a subsequent filtration step.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass kein quantitativ vollständiger Zellaufschluss möglich ist, da meist ein Großteil der Mikroorganismen in tiefere Membranschichten eindringt und somit vor den Mahlkugeln abgeschirmt wird. Des Weiteren hat diese Pufferwirkung einen negativen Einfluss auf den Aufschlussgrad der Mikroorganismen, da ein Großteil der Stöße von der Membran abgefangen wird. Auch wird der anschließende Filtrationsschritt der DNA durch die Membran nicht vollständig ablaufen, da DNA dazu neigt, unspezifische Bindungen, in diesem Fall an der Membran, einzugehen. Des Weiteren ist der Durchmesser der Filtrationsfläche bei dieser Vorrichtung auf 13 m limitiert, aufgrund der Kompatibilität zu gängigen Zentrifugenmodellen und -adaptoren. Dieser geringe Durchmesser des Filtrationsmediums führt jedoch bei größeren Probevolumina zu deutlich längeren Filtrationszeiten.A disadvantage of this method is that no quantitatively complete cell disruption is possible, since usually a large part of the microorganisms penetrates into deeper membrane layers and thus shielded from the grinding balls. Furthermore, this buffer effect has a negative influence on the degree of digestion of the microorganisms, since a large part of the shocks is trapped by the membrane. Also, the subsequent filtration step of the DNA through the membrane will not be complete, as DNA tends to undergo non-specific binding, in this case to the membrane. Furthermore, the diameter of the filtration area is limited to 13 m in this device, due to the compatibility with common centrifuge models and adapters. However, this small diameter of the filtration medium leads to significantly longer filtration times with larger sample volumes.

Die EP 2 402 456 A1 offenbart ein Verfahren zur Analyse von Mikroorganismen in Wasserproben, bei welchem mittels einer ersten Spritze eine Mikroorganismen enthaltende Wasserprobe in einen Minisart^®-Spritzenvorsatzfilter mit einer Celluloseestermembran zur Retention der Mikroorganismen gespritzt wird. Nach Entfernung der Spritze wird das eine Ende des Spritzenvorsatzfilters mit einem Auffanggefäß verbunden, während das zweite Ende des Spritzenvorsatzfilters mit einer zweiten, mit einem polar aprotischen Lösungsmittel, wie DMSO (Dimethylsulfoxid), gefüllten Spritze verbunden wird. DMSO wird bis zum Erreichen des Druckpunkts in den Spritzenvorsatzfilter gespritzt, um die Membran mit den zurückgehaltenen Mikroorganismen aufzulösen und die Lösung in dem Auffanggefäß aufzufangen. An die Zentrifugation der Lösung in dem Auffanggefäß schließen sich eine Zelllyse und weitere mikrobiologische Analyseschritte, wie eine PCR, an.The EP 2 402 456 A1 there is disclosed a method for the analysis of microorganisms in water samples, in which a microorganism containing by means of a first syringe into a sample of water with a Minisart ^® -Spritzenvorsatzfilter Celluloseestermembran for retention of microorganisms injected. After removal of the syringe, one end of the syringe filter is connected to a receptacle, while the second end of the syringe filter is connected to a second syringe filled with a polar aprotic solvent such as DMSO (dimethyl sulfoxide). DMSO is injected into the syringe barrel filter until the point of pressure is reached to dissolve the membrane with the retained microorganisms and trap the solution in the trap. Centrifugation of the solution in the receiver is followed by cell lysis and further microbiological analysis such as PCR.

Nachteilig bei dem aus EP 2 402 465 A1 bekannten Verfahren sind das sukzessive Hantieren mit zwei verschiedenen Spritzen, von denen eine die Wasserprobe und die andere das Lösungsmittel für die Celluloseestermembran enthält, und die Tatsache, dass beim Einspritzen von DMSO in den Spritzenvorsatzfilter der Einspritzdruck nicht zu hoch, d. h. unterhalb des Druckpunkts, sein darf, damit der Spritzenvorsatzfilter nicht beschädigt wird.A disadvantage of the EP 2 402 465 A1 Known methods are successively handling two different syringes, one containing the water sample and the other the solvent for the cellulose ester membrane, and the fact that when injecting DMSO into the syringe filter, the injection pressure will not be too high, ie below the pressure point so that the syringe filter is not damaged.

Aufgabenstellungtask

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung bereitzustellen, bei der es möglich ist, ein poröses Filtrationsmedium einschließlich zurückgehaltener Mikroorganismen kontaminationsfrei, einfach und sicher in ein Auffanggefäß zu überführen, um die Probe quantitativ vollständig für eine DNA-Extraktion und molekularbiologische Analysemethoden zugänglich zu machen.It is therefore an object of the present invention to provide a device in which it is possible to transfer a porous filtration medium, including retained microorganisms, contamination-free, simple and safe into a collecting vessel in order to make the sample completely quantitatively accessible for DNA extraction and molecular biological analysis methods do.

Darstellung der ErfindungPresentation of the invention

Die Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass das Bodenteil zum Filtrationsmedium hin einen Inkubationsraum aufweist, der mit einem dem Aufnahmeteil abgewandten Auslass des Bodenteils verbunden ist, und dass der Auslass einen Ansatz aufweist, auf den ein ein Lösungsmittel zum Auflösen des porösen Filtrationsmediums enthaltendes Auffanggefäß lösbar aufsteckbar ist.The object is achieved in conjunction with the preamble of claim 1, characterized in that the bottom part of the filtration medium towards an incubation chamber which is connected to a receiving part facing away from the outlet part of the bottom part, and that the outlet has a lug on which a solvent for Dissolving the porous filtration medium containing collecting vessel is releasably attachable.

Durch die Anordnung des Inkubationsraumes im Bodenteil und die Verbindung über den Auslass zum Auffanggefäß mit dem Lösungsmittel ist es möglich, das poröse Filtrationsmedium einschließlich zurückgehaltener Mikroorganismen kontaminationsfrei, einfach und sicher in das Auffanggefäß zu überführen, um die Probe quantitativ vollständig für eine DNA-Extraktion und molekularbiologische Analysemethoden zugänglich zu machen. The arrangement of the incubation space in the bottom part and the connection via the outlet to the collecting vessel with the solvent, it is possible to transfer the porous filtration medium including retained microorganisms contamination-free, easy and safe in the receptacle to quantitatively complete the sample for a DNA extraction and make molecular biological analysis methods accessible.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verläuft der Inkubationsraum des Bodenteiles zum Auslass hin konisch. Die konische Form garantiert, dass trotz des Zentrifugationswinkels einer Festrotorzentrifuge kein Totvolumen im Inkubationsraum der Aufnahmeeinheit entsteht, was zu Restflüssigkeit führen könnte. Ohne die konische Form würde wegen der Zentrifugalkraft, abhängig vom Zentrifugenmodell, Restflüssigkeit seitlich im Bodenteil der Aufnahmeeinheit verbleiben.According to a preferred embodiment of the invention, the incubation space of the bottom part runs conically towards the outlet. The conical shape guarantees that, despite the centrifugation angle of a solid rotor centrifuge, there is no dead volume in the incubation chamber of the receiving unit, which could lead to residual fluid. Without the conical shape, due to the centrifugal force, depending on the centrifuge model, residual liquid would remain laterally in the bottom part of the receiving unit.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Lösungsmittel zum Auflösen des Filtrationsmediums ein organisches Lösungsmittel, bevorzugt Chloroform oder Methylenchlorid.According to a further preferred embodiment of the invention, the solvent for dissolving the filtration medium is an organic solvent, preferably chloroform or methylene chloride.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das auf das Bodenteil aufzusteckende Auffanggefäß neben dem Lösungsmittel den Zellaufschluss unterstützende Mahlkugeln. Das Auffanggefäß ist an seinem offenen Ende durch einen Deckel flüssigkeitsdicht verschließbar. Dazu weist das Auffanggefäß beispielsweise an seinem offenen Ende ein Außengewinde auf, mit dem der Deckel verschraubt werden kann.According to a preferred embodiment of the invention, the collecting vessel to be placed on the bottom part contains, in addition to the solvent, grinding balls which assist the cell disruption. The collecting vessel is closed at its open end by a lid liquid-tight. For this purpose, the collecting vessel, for example, at its open end on an external thread with which the lid can be screwed.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist der Auslass des Bodenteils einen Auslasskanal auf, der quer zur Längsachse des Bodenteils als länglicher Schlitz ausgebildet ist, dessen schmale lichte Weite kleiner ist als die Außendurchmesser der Mahlkugeln. Dadurch wird sichergestellt, dass die Mahlkugeln nicht in den Inkubationsraum eindringen und im Auffanggefäß verbleiben.According to a further preferred embodiment of the invention, the outlet of the bottom part has an outlet channel, which is formed transversely to the longitudinal axis of the bottom part as an elongated slot whose narrow clear width is smaller than the outer diameter of the grinding balls. This ensures that the grinding balls do not penetrate into the incubation chamber and remain in the collecting vessel.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist eine Innenwandung des Aufnahmeteils außerhalb einer für eine Filtration nutzbaren Fläche des Filtrationsmediums positionierbar und ein in dem Aufnahmeteil angeordneter Fixierrand ist auf einem Rand des Filtrationsmediums positionierbar, und der Fixierrand des Aufnahmeteils ist mit dem Rand des Filtrationsmediums über eine Klebehaftung verbindbar. Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist ein Fixierrand des Aufnahmeteils durch eine mechanische Klemmverbindung mit einem korrespondierenden ringförmigen Klemmteil am Rand des Filtrationsmediums verbindbar. Damit lässt sich das Aufnahmeteil leicht mit dem Filtrationsmedium verbinden und Aufnahmeteil und Filtrationsmedium lassen sich einfach und kontaminationsfrei auf das Bodenteil aufsetzen. Das Filtrationsmedium ist bevorzugt aus Polycarbonat oder Polyethersulfon ausgebildet.According to a further preferred embodiment of the invention, an inner wall of the receiving part is positioned outside a usable for filtration surface of the filtration medium and arranged in the receiving part Fixierrand is positioned on an edge of the filtration medium, and the fixing edge of the receiving part is connected to the edge of the filtration medium via a Adhesive adhesion connectable. In an alternative embodiment of the invention, a fixing edge of the receiving part is connectable by a mechanical clamping connection with a corresponding annular clamping part at the edge of the filtration medium. Thus, the receiving part can be easily connect to the filtration medium and receiving part and filtration medium can be easily and without contamination put on the bottom part. The filtration medium is preferably formed from polycarbonate or polyethersulfone.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Aufnahmeeinheit mit dem in vertikaler Richtung unten angeordneten Auffanggefäß in einem Zentrifugenadapter befestigbar und kann mit dem Zentrifugenadapter in einer Zentrifuge zentrifugiert werden, wobei das in dem Lösungsmittel gelöste Filtrationsmedium einschließlich zurückgehaltener Mikroorganismen vollständig in das Auffanggefäß überführbar ist.According to a further preferred embodiment of the invention, the receiving unit with the arranged vertically in the bottom collecting vessel in a centrifuge adapter can be mounted and can be centrifuged with the centrifuge adapter in a centrifuge, wherein the dissolved in the solvent filtration medium including retained microorganisms is completely transferred into the receptacle.

Das Filtrationsmedium kann einfach mit dem Aufnahmeteil der Aufnahmeeinheit von einem Unterteil einer Filtrationsvorrichtung abgenommen und auf das Bodenteil aufgesetzt werden. Nach Entfernen eines Deckels von dem Auffanggefäß mit Lösungsmittel lässt sich das Auffanggefäß einfach und kontaminationsfrei auf einen Auslass des Bodenteils aufstecken. Durch ein leichtes Schütteln der kopfüber gewendeten Aufnahmeeinheit wird das Lösungsmittel dem Inkubationsraum zugeführt und das Filtrationsmedium innerhalb weniger Sekunden aufgelöst und anschließend in das Auffanggefäß überführt. Obwohl im Inkubationsraum der Aufnahmeeinheit ein erhöhter Druck aufgrund des teilweise verdampfenden organischen Lösungsmittels entsteht, bleiben das Aufnahmeteil und das Bodenteil aufgrund ihrer Verrastung miteinander verbunden.The filtration medium can be easily removed with the receiving part of the receiving unit of a lower part of a filtration device and placed on the bottom part. After removing a lid from the collecting vessel with solvent, the collecting vessel can be easily and without contamination plugged onto an outlet of the bottom part. By gently shaking the head-turned recording unit, the solvent is supplied to the incubation room and the filtration medium dissolved within a few seconds and then transferred to the collecting vessel. Although an increased pressure due to the partially evaporating organic solvent arises in the incubation of the receiving unit, the receiving part and the bottom part remain connected to each other due to their locking.

Das aufgelöste Filtrationsmedium mit den zurückgehaltenen Partikeln bietet einen guten Ausgangspunkt für eine weitere Probenvorbereitung, z. B. eine DNA-Extraktion, und für verschiedene analytische Methoden, wie beispielsweise PCR.The dissolved filtration medium with the retained particles provides a good starting point for further sample preparation, eg. As a DNA extraction, and for various analytical methods, such as PCR.

Dem Auffanggefäß können neben dem Lösungsmittel Mahlkugeln zugeführt werden, die den Zellaufschluss fördern.In addition to the solvent, the collecting vessel can be fed with grinding balls which promote cell disruption.

Die Aufnahmeeinheit wird mit dem in vertikaler Richtung unten angeordneten Auffanggefäß in einem Zentrifugenadapter befestigt und in einer Zentrifuge zentrifugiert, wobei das in dem Lösungsmittel gelöste Filtrationsmedium einschließlich zurückgehaltener Mikroorganismen vollständig in das Auffanggefäß überführt wird. Im Anschluss wird das Auffanggefäß von der Aufnahmeeinheit entfernt und mit einem Deckel verschlossen.The receiving unit is mounted in a centrifuge adapter with the collecting vessel arranged vertically downwards and centrifuged in a centrifuge, wherein the filtration medium dissolved in the solvent, including retained microorganisms, is transferred completely into the collecting vessel becomes. Subsequently, the collecting vessel is removed from the receiving unit and closed with a lid.

Das verschlossene Auffanggefäß wird in einem Homogenisator prozessiert, wobei ein Zellaufschluss der Mikroorganismen mithilfe der Mahlkugeln ermöglicht wird.The sealed collecting vessel is processed in a homogenizer, whereby a cell disruption of the microorganisms is made possible by means of the grinding balls.

Die Vorrichtung zur Behandlung des Filtrationsmediums kann steril verpackt geliefert werden.The device for treating the filtration medium can be delivered sterile packed.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft veranschaulicht sind.Further features of the invention will become apparent from the following detailed description and the accompanying drawings, in which preferred embodiments of the invention are illustrated by way of example.

Kurzbeschreibungen der ZeichnungenBrief descriptions of the drawings

In den Zeichnungen zeigen:In the drawings show:

1: eine Seitenansicht im Schnitt eines Aufnahmeteils einer Vorrichtung zur Behandlung eines porösen Filtrationsmediums, 1 FIG. 2 is a side view in section of a receiving part of a device for treating a porous filtration medium. FIG.

2: eine Seitenansicht im Schnitt eines Bodenteils einer Vorrichtung zur Behandlung eines porösen Filtrationsmediums, 2 FIG. 4 is a side view in section of a bottom part of a device for treating a porous filtration medium. FIG.

3: eine Untersicht auf das Bodenteil von 2, 3 : a bottom view of the bottom part of 2 .

4: eine Seitenansicht im Schnitt einer Aufnahmeeinheit mit aufgenommenem porösen Filtrationsmedium, deren Aufnahmeteil und Bodenteil miteinander verrastet sind, und aufgestecktem Auffangbehälter mit Lösungsmittel und Mahlkugeln, 4 FIG. 2: a side view in section of a receiving unit with a porous filtration medium accommodated, the receiving part and base part of which are latched together, and attached collecting container with solvent and grinding balls, FIG.

5: eine vergrößerte Darstellung der Einzelheit V (Verrastung) von 4, 5 : an enlarged view of the detail V (locking) of 4 .

6: eine vergrößerte Darstellung einer weiteren Verrastung entsprechend der Einzelheit V von 4, 6 : an enlarged view of a further latching according to the detail V of 4 .

7: eine Seitenansicht im Schnitt einer weiteren Aufnahmeeinheit mit aufgenommenem porösen Filtrationsmedium, deren Aufnahmeteil und Bodenteil miteinander verrastet sind, und aufgestecktem Auffangbehälter mit Lösungsmittel und Mahlkugeln, 7 FIG. 2: a side view in section of a further receiving unit with accommodated porous filtration medium, whose receiving part and bottom part are locked together, and attached collecting container with solvent and grinding balls, FIG.

8: eine Seitenansicht im Schnitt des Zentrifugenadapters von 10 entlang der Linie VIII-VIII geschnitten, 8th : A side view in section of the centrifuge adapter of 10 cut along the line VIII-VIII,

9: eine Seitenansicht des Zentrifugenadapters von 10 aus Richtung IX, 9 : a side view of the centrifuge adapter of 10 from direction IX,

10: eine Draufsicht auf den Zentrifugenadapter der 8 und 9 und 10 : a top view of the centrifuge adapter the 8th and 9 and

11: eine Seitenansicht im Schnitt einer Filtrationsvorrichtung nach dem Stand der Technik mit auf einem Unterteil angeordnetem Filtrationsmedium. 11 FIG. 2: a side sectional view of a prior art filtration device with filtration media disposed on a base. FIG.

Beschreibung der AusführungsbeispieleDescription of the embodiments

Eine Vorrichtung 1 besteht im Wesentlichen aus einer Aufnahmeeinheit 2 mit einem Auslass 3 und einem Auffanggefäß 4.A device 1 consists essentially of a recording unit 2 with an outlet 3 and a collecting vessel 4 ,

Die Aufnahmeeinheit 2 ist zweiteilig ausgebildet und besteht aus einem Aufnahmeteil 5 und einem Bodenteil 6.The recording unit 2 is formed in two parts and consists of a receiving part 5 and a bottom part 6 ,

Das Aufnahmeteil 5 bildet eine umlaufende Kontur mit einer Außenwandung 7 und einer parallel verlaufenden Innenwandung 8. Das Aufnahmeteil 5 wird in vertikaler Richtung oben von einer Deckenwandung 9 abgeschlossen. Die Deckenwandung 9 weist auf ihrer dem Bodenteil 6 zugewandten Aufnahmeteilinnenfläche 10 die Innenwandung 8 auf, deren freies Ende mit seiner Stirnfläche einen Fixierrand 11 bildet. In den Ausführungsbeispielen weist der Fixierrand 11 eine Haftschicht 12 aus einem geeigneten Klebestoff auf.The recording part 5 forms a circumferential contour with an outer wall 7 and a parallel inner wall 8th , The recording part 5 is vertically upwards from a ceiling wall 9 completed. The ceiling wall 9 points to her the bottom part 6 facing receiving part inner surface 10 the inner wall 8th on whose free end with its end face a fixing edge 11 forms. In the embodiments, the fixing edge 11 an adhesive layer 12 made of a suitable adhesive.

Die Haftschicht 12 ist beispielsweise aus einem PSA-Dispersionsklebstoff oder aus Acrylat-Copolymer-Mikrokugeln ausgebildet. Geeignete Kleber sind Kleber, die auf organischen Lösungsmittel(n) basieren und im organischen Lösungsmittel lösbar sind, welche im Rahmen des Auflöseprozesses eines Filtrationsmediums Anwendung finden. Des Weiteren müssen die Kleber eine permanente Haftkraft zeigen (ab Produktion der Vorrichtung bis zum Einsatz beim Anwender). Der Kleber sollte mittels ETO (Ethylenoxid) sterilisierbar sein. Zudem werden Kleber eingesetzt, die keine unspezifischen Reaktionen oder Signale mit in der nachfolgenden Analytik eingesetzten Reagenzien und Reaktionsmethoden zeigen. Insbesondere ist der Kleber bevorzugt DNA-frei und weist keine Substanzen auf, die durch Färbung, Fluoreszenz oder chemische Reaktion die anschließende Analytik stören. The adhesive layer 12 is formed for example of a PSA dispersion adhesive or of acrylate copolymer microspheres. Suitable adhesives are adhesives which are based on organic solvents and are soluble in the organic solvent which are used in the course of the dissolution process of a filtration medium. Furthermore, the adhesives must show a permanent adhesive force (from production of the device to use at the user). The adhesive should be sterilizable by means of ETO (ethylene oxide). In addition, adhesives are used which show no unspecific reactions or signals with reagents and reaction methods used in the subsequent analysis. In particular, the adhesive is preferably DNA-free and has no substances that interfere with the subsequent analysis by staining, fluorescence or chemical reaction.

Die Außenwandung 7 weist eine innere Außenwandungsfläche 13 mit einer umlaufenden Wulst 14 auf.The outer wall 7 has an inner outer wall surface 13 with a circumferential bead 14 on.

Das Bodenteil 6 weist eine umlaufende Außenwandung 15 mit einer Außenfläche 16 auf, die mit der Innenwandung 13 des Aufnahmeteils 5 korrespondiert, also zusammenwirkt. Zum Aufnahmeteil 5 hin weist das Bodenteil 6 einen trichterförmigen Inkubationsraum 17 mit einer konischen Abflussfläche 18 auf, die gegenüber einer Horizontalen mit einem zu dem Auslass 3 hin abfallenden Winkel 20 von beispielsweise 25° geneigt ist. Der Auslass 3 weist einen Auslasskanal 21 auf, der quer zur Längsachse 22 des Bodenteils 6 als länglicher Schlitz mit einer schmalen lichten Weite 23 ausgebildet ist.The bottom part 6 has a circumferential outer wall 15 with an outer surface 16 on that with the inner wall 13 of the receiving part 5 corresponds, ie cooperates. To the recording part 5 towards the bottom part 6 a funnel-shaped incubation room 17 with a conical discharge surface 18 on the opposite to a horizontal with one to the outlet 3 sloping angle 20 is inclined by, for example, 25 °. The outlet 3 has an outlet channel 21 on, which is transverse to the longitudinal axis 22 of the bottom part 6 as an elongated slot with a narrow clear width 23 is trained.

Die außenliegende Mantelfläche des Auslasses 3 bildet einen leicht konischen Absatz 24, auf den das Auffanggefäß 4 lösbar aufsteckbar ist. An seinem offenen Ende 26 weist das Auffanggefäß 4 ein Außengewinde 27 auf und ist mit einem nicht dargestellten Deckel mit Innengewinde durch Verschrauben dicht verschließbar. In dem Auffanggefäß 4 sind ein Lösungsmittel 28 und Mahlkugeln 29 vorgelegt.The outer surface of the outlet 3 forms a slightly conical heel 24 on which the collecting vessel 4 is releasably attachable. At its open end 26 has the collecting vessel 4 an external thread 27 is and with a lid, not shown, with internal thread by screwing tightly closed. In the collecting vessel 4 are a solvent 28 and grinding balls 29 submitted.

Das Bodenteil 6 weist an seiner Außenfläche 16 eine umlaufende ringförmige Vertiefung 30 auf, die mit der Wulst 14 des Aufnahmeteils 5 korrespondiert und eine Verrastung 31 bildet (s. 4, 5, 7). Die Verrastung 31 kann auch entsprechend 6 irreversibel ausgebildet sein.The bottom part 6 indicates on its outer surface 16 a circumferential annular recess 30 on that with the bead 14 of the receiving part 5 corresponds and a catch 31 forms (s. 4 . 5 . 7 ). The locking 31 can also be appropriate 6 be formed irreversible.

Eine an sich bekannte Filtrationsvorrichtung 32 entsprechend 11 besteht aus einem Unterteil 33 mit einem Aufnahmeabsatz 34, auf dem ein trichterförmiger Aufsatz 35 aufsetzbar ist. Zwischen dem Aufsatz 35 und einer Filterunterstützungsfläche 36 des Unterteils 33 ist ein bevorzugt scheibenförmiges Filtrationsmedium 37, das beispielsweise als eine poröse Filtermembran ausgebildet ist, angeordnet.A known filtration device 32 corresponding 11 consists of a lower part 33 with a receiving heel 34 on which a funnel-shaped attachment 35 can be placed. Between the tower 35 and a filter support surface 36 of the lower part 33 is a preferred disc-shaped filtration medium 37 , which is formed for example as a porous filter membrane arranged.

Nach einem Filtrationsvorgang kann der Aufsatz 35 von dem Unterteil 33 abgenommen werden und das Aufnahmeteil 5 der Vorrichtung 1 kann anstelle des Aufsatzes 35 auf das Unterteil 33 aufgesetzt werden. Dabei wird das Aufnahmeteil 5 mit seinem Fixierrand 11 auf einen Rand 38 des scheibenförmigen Filtrationsmediums 37 aufgesetzt, so dass das scheibenförmige Filtrationsmedium 37 an der Haftschicht 12 des Fixierrandes 11 haftet und von dem Unterteil 33 aufgenommen werden kann.After a filtration process, the essay 35 from the lower part 33 be removed and the receiving part 5 the device 1 may instead of the essay 35 on the lower part 33 be put on. This is the receiving part 5 with its fixing edge 11 on one edge 38 the disc-shaped filtration medium 37 put on so that the disc-shaped filtration medium 37 at the adhesive layer 12 of the fixation margin 11 sticks and from the bottom part 33 can be included.

Die Vorrichtung 1 kann mit dem Auffanggefäß 4 in einen Zentrifugenadapter 39 eingesetzt werden, der eine entsprechend angepasste Aussparung 40 aufweist.The device 1 can with the collecting vessel 4 in a centrifuge adapter 39 can be used, which has a correspondingly adapted recess 40 having.

Zur Behandlung des porösen Filtrationsmediums 37 mit der aus dem Aufnahmeteil 5 und dem Bodenteil 6 bestehenden Aufnahmeeinheit 2 der Vorrichtung 1 werden die folgenden Schritte durchgeführt:

– das Aufnahmeteil 5 wird auf das in dem Unterteil 33 der Filtrationsvorrichtung 32 angeordnete und einer flüssigen Probe ausgesetzte Filtrationsmedium 37 aufgesetzt, wobei ein in dem Aufnahmeteil 5 angeordneter Fixierrand 11 mit einem Rand 38 des Filtrationsmediums 37 verbunden wird,
– das Aufnahmeteil 5 mit dem verbundenen Filtrationsmedium 37 wird von dem Unterteil 33 abgehoben und auf das Bodenteil 6 aufgesetzt, wobei das Aufnahmeteil 5 und das Bodenteil 6 miteinander über die Verrastung 31, 31' verrastet werden,
– ein Lösungsmittel 28 zum Auflösen des porösen Filtrationsmediums 37 und Mahlkugeln 29 enthaltendes Auffanggefäß 4 wird mit dem am Bodenteil 6 angeordneten Auslass 3 lösbar verbunden,
– die Aufnahmeeinheit 2 mit dem Auffanggefäß 4 wird kopfüber leicht geschüttelt, wobei das Lösungsmittel 28 über den Auslass 3 des Bodenteils 6 dem Filtrationsmedium 37 zugeführt wird und das Filtrationsmedium 37 auflöst.

For the treatment of the porous filtration medium 37 with the from the receiving part 5 and the bottom part 6 existing recording unit 2 the device 1 The following steps are performed:

- the recording part 5 gets on that in the bottom part 33 the filtration device 32 arranged and exposed to a liquid sample filtration medium 37 put on, one in the receiving part 5 arranged fixing edge 11 with a border 38 of the filtration medium 37 is connected
- the recording part 5 with the associated filtration medium 37 is from the lower part 33 lifted off and on the bottom part 6 put on, with the receiving part 5 and the bottom part 6 with each other about the locking 31 . 31 ' be locked,
- a solvent 28 for dissolving the porous filtration medium 37 and grinding balls 29 containing collecting vessel 4 will be with the bottom part 6 arranged outlet 3 releasably connected,
- the recording unit 2 with the collecting vessel 4 is gently shaken upside down with the solvent 28 over the outlet 3 of the bottom part 6 the filtration medium 37 is fed and the filtration medium 37 dissolves.

Danach können die nachfolgenden Schritte durchgeführt werden:

– die Aufnahmeeinheit 2 mit dem in vertikaler Richtung unten angeordneten Auffanggefäß 4 wird in dem Zentrifugenadapter 39 befestigt und in einer Zentrifuge zentrifugiert, wobei das in dem Lösungsmittel 28 gelöste Filtrationsmedium 37 einschließlich zurückgehaltener Mikroorganismen vollständig in das Auffanggefäß 4 überführt wird,
– das Auffanggefäß 4 wird von der Aufnahmeeinheit 2 entfernt und mit einem Deckel durch Verschrauben verschlossen,
– das verschlossene Auffanggefäß 4 wird in einem Homogenisator prozessiert, wobei ein Zellaufschluss der Mikroorganismen mithilfe der Mahlkugeln 29 ermöglicht wird.

After that, the following steps can be performed:

- the recording unit 2 with the collecting vessel arranged in the vertical direction at the bottom 4 is in the centrifuge adapter 39 attached and centrifuged in a centrifuge, which is in the solvent 28 dissolved filtration medium 37 including retained microorganisms completely into the collecting vessel 4 is transferred
- the collecting vessel 4 is from the recording unit 2 removed and closed with a lid by screwing,
- the closed collecting vessel 4 is processed in a homogenizer, wherein a cell disruption of the microorganisms using the grinding balls 29 is possible.

Es wurden die folgenden Versuche durchgeführt:The following experiments were carried out:

Beispiel 1example 1

Bestimmung der Sensitivität für den Nachweis von Bacillus subtilis unter Verwendung der Vorrichtung 1 inklusive Auffanggefäß 4.Determination of sensitivity for the detection of Bacillus subtilis using the device 1 including collecting vessel 4 ,

Es wurde eine Verdünnungsreihe in 0,9% NaCl-Lösung einer in der exponentiellen Phase befindlichen Bacillus subtilis Kultivierung in Doppelbestimmung nach Filtration auf Sartorius-Nähragar inkubiert (47 mm Cellulosenitratmembran mit 0,45 μm Porendurchmesser; Auszählung der Kolonien nach 24 h) und parallel pro Verdünnungsstufe wurde eine Probe nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung prozessiert.A dilution series was incubated in 0.9% NaCl solution of exponential phase Bacillus subtilis cultivation in duplicate after filtration on Sartorius nutrient agar (47 mm cellulose nitrate membrane with 0.45 μm pore diameter, count of colonies after 24 h) and in parallel per dilution step, a sample was processed according to a preferred embodiment of the invention.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst folgende Prozessschritte:

1. Membranfiltration einer wässrigen Probe (47 mm Membrandurchmesser, ”Track-Etched”-Polycarbonatmembran, 0,4 μm Porendurchmesser, 6 bis 11 μm Membrandicke) unter Verwendung eines Unterteils 33 (idealerweise aus Plastik; ETO-steril) wie in 11 dargestellt.
2. Entfernung des Aufsatzes 35 und Aufnahme des Membranfilters/Filtrationsmediums 37 mithilfe der Klebhaftung am Fixierrand 11 vom Aufnahmeteil 5 (aus Polypropylen; ETO-steril).
3. Verbinden des Aufnahmeteils 5 und Bodenteils 6 der Aufnahmeeinheit 2 mittels Verrastung 31.
4. Auffanggefäß 4 (aus Polypropylen; ETO-steril) mit anhängendem Schraubdeckel mit einem Fassungsvolumen von 2 ml enthält 15 Stahlkugeln/Mahlkugeln 29 (3 mm Durchmesser) und 750 μl Chloroform („Molecular Biology Grade”; vor allem DNA- und DNase-frei). Nach dem Öffnen des Auffanggefäßes 4 ist dieses am Auslass 3 des Bodenteils 6 über eine Steckverbindung zu befestigen (sich nach unten hin verjüngender Ansatz 24 wird in offenes Ende 26 des Auffanggefäßes 4 gesteckt).
5. Die Aufnahmeeinheit 2 mit Auffanggefäß 4 wird kopfüber leicht geschüttelt, um das Chloroform vollständig vom Auffanggefäß 4 in die Aufnahmeeinheit 2 zu überführen. Anschließend wird die Aufnahmeeinheit 2 mit dem Auffanggefäß 4 kopfüber wenige Sekunden leicht geschwenkt, um ein vollständiges Auflösen des Membranfilters/Filtrationsmediums 37 zu gewährleisten.
6. Die Aufnahmeeinheit 2 mit befestigtem Auffanggefäß 4 wird aufrecht (Aufnahmeteil 5 zeigt nach oben, Auffanggefäß 4 zeigt nach unten) in den speziellen Zentrifugenadapter 39 überführt. Es handelt sich hierbei um einen Ausschwingzentrifugenadapter, um ein quantitativ vollständiges Überführen der gelösten Membran/des Filtrationsmediums 37 inklusive der durch die Membran 37 zurückgehaltenen Partikel und des Lösungsmittels 28 zu gewährleisten. Des Weiteren ist der Zentrifugenadapter 39 derart konstruiert, dass ein Abfallen/Lösen des Auffanggefäßes 4 während des Zentrifugationsschrittes unterbunden wird. Der Zentrifugenadapter 39 wird in eine passende Zentrifuge montiert und es folgt eine einminütige Zentrifugation bei mind. 3.000 × g, um die im Chloroform gelöste Membran 37 inkl. zurückgehaltenen Mikroorganismen vollständig in das Auffanggefäß 4 mit den Mahlkugeln 29 aus Stahl zu überführen.
7. Das Auffanggefäß 4 wird von der Aufnahmeeinheit 2 entfernt und mithilfe des anhängenden Schraubdeckels fest verschlossen.
8. Um die Mikroorganismen aufzuschließen und deren DNA zugänglich zu machen, wird das Auffanggefäß 4 2 min bei 6,5 m/s im Homogenisator „FastPrep-24 Instrument” (MP Biomedicals) prozessiert (Alternativ sind auch andere Homogenisatoren mit vergleichbarer Leistung einsetzbar).
9. Das Auffanggefäß 4 wird aus dem Homogenisator entnommen und es werden 500 μl 1 × TE-Puffer (Tris-EDTA) mit 0,01% SDS (Natriumdodecylsulfat) hinzugefügt („Molecular Biology Grade”).
10. Es folgt eine 10-minütige Extraktion (DNA aus organischer in wässrige Phase extrahieren) bei Raumtemperatur. Hierfür ist das Auffanggefäß 4 entweder horizontal auf einem Vortexer oder horizontal auf einem Thermomixer bei 750 rpm zu befestigen.
11. In die Öffnung des Auffanggefäßes 4 eine Spatelspitze DNA- und DNase-freie Silikonpaste geben (z. B. Phase Lock Gel von 5 Prime oder GE Bayer Silicones, hochviskos).
12. Das Auffanggefäß 4 3 min bei 16.000 × g zentrifugieren.
13. Es haben sich drei Phasen aufgrund der unterschiedlichen Dichten separiert: Die obere wässrige Phase inkl. DNA, die mittlere Silikongelphase als Sperrschicht und die untere organische Phase. Die obere wässrige Phase wird mithilfe einer Pipette vollständig in ein neues, leeres Auffanggefäß 4 überführt (ein 1,5 ml Reaktionsgefäß ist ausreichend).
14. 600 μl Isopropanol („Molecular Biology Grade”) und 2 μl Glycogen als -Carrier („Molecular Biology Grade”) hinzufügen und 50-mal das Reaktionsgefäß 4 invertieren.
15. Das Reaktionsgefäß 4 3 min bei 16.000 × g zentrifugieren, so dass ein kleines weißes DNA-Glycogen-Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes 4 entsteht.
16. Isopropanol verwerfen, das DNA-Glycogen-Pellet verbleibt im Reaktionsgefäß 4.
17. Zum DNA-Glycogen-Pellet 600 μl 70% Ethanol pipettieren und das Reaktionsgefäß 4 20-mal invertieren.
18. Das Reaktionsgefäß 4 1 min bei 16.000 × g zentrifugieren.
19. 70% Ethanol verwerfen (mit Pipette entfernen), das DNA-Glycogen-Pellet verbleibt im Reaktionsgefäß 4.
20. Das DNA-Glycogen-Pellet im geöffneten Reaktionsgefäß 4 entweder 10 min bei 37°C im verschlossenen Thermoblock oder 15 bis 20 min unter der Sterilwerkbank trocknen.
21. Pellet in 50 bis 100 μl Rehydratisierungspuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7–8, DNA- und DNase-frei) 1 h lösen bei 65°C im Thermoblock (im geschlossenen Reaktionsgefäß).
22. Analyse/Detektion mit quantitativer Realtime-PCR, z. B. mit universellen oder spezifischen bakteriellen Primern.

A preferred embodiment of the invention comprises the following process steps:

1. Membrane filtration of an aqueous sample (47 mm membrane diameter, "track-etched" polycarbonate membrane, 0.4 μm pore diameter, 6 to 11 μm membrane thickness) using a lower part 33 (ideally plastic, ETO-sterile) as in 11 shown.
2. Removal of the attachment 35 and receiving the membrane filter / filtration medium 37 using the adhesive bond on the fixing edge 11 from the receiving part 5 (polypropylene, ETO-sterile).
3. Connect the receiving part 5 and bottom part 6 the recording unit 2 by means of locking 31 ,
4. Collection vessel 4 (made of polypropylene, ETO-sterile) with attached screw cap with a capacity of 2 ml contains 15 steel balls / grinding balls 29 (3 mm diameter) and 750 μl chloroform ("Molecular Biology Grade", especially DNA and DNase free). After opening the collecting vessel 4 this is at the outlet 3 of the bottom part 6 to attach via a plug connection (downwardly tapered approach 24 will be in the open 26 of the collecting vessel 4 plugged in).
5. The recording unit 2 with collecting vessel 4 shake lightly upside down to completely remove the chloroform from the collection vessel 4 in the receiving unit 2 to convict. Subsequently, the recording unit 2 with the collecting vessel 4 slightly tilted upside down for a few seconds to completely dissolve the membrane filter / filtration medium 37 to ensure.
6. The recording unit 2 with attached collecting vessel 4 becomes upright (receiving part 5 points upwards, collecting vessel 4 points down) into the special centrifuge adapter 39 transferred. This is a swing-out centrifuge adapter to provide quantitatively complete transfer of the dissolved membrane / filtration media 37 including the through the membrane 37 retained particles and the solvent 28 to ensure. Furthermore, the centrifuge adapter 39 designed such that a drop / release of the collecting vessel 4 is inhibited during the centrifugation step. The centrifuge adapter 39 is mounted in a suitable centrifuge and followed by a one-minute centrifugation at least 3,000 × g to the membrane dissolved in the chloroform 37 including retained microorganisms completely into the collecting vessel 4 with the grinding balls 29 made of steel.
7. The collecting vessel 4 is from the recording unit 2 removed and firmly closed with the attached screw cap.
8. To unlock the microorganisms and make their DNA accessible, the collecting vessel 4 2 min at 6.5 m / s in the homogenizer "FastPrep-24 Instrument" (MP Biomedicals) processed (Alternatively, other homogenizers with comparable performance can be used).
9. The collecting vessel 4 is removed from the homogenizer and 500 μl of 1 × TE buffer (Tris-EDTA) with 0.01% SDS (sodium dodecyl sulfate) added ("Molecular Biology Grade").
10. This is followed by a 10 minute extraction (extract DNA from organic into aqueous phase) at room temperature. For this purpose, the collecting vessel 4 either horizontally on a vortexer or horizontally on a thermomixer at 750 rpm.
11. Into the opening of the collecting vessel 4 Apply a spatula tip of DNA- and DNase-free silicone paste (eg Phase Lock Gel from 5 Prime or GE Bayer Silicones, highly viscous).
12. The collecting vessel 4 Centrifuge at 16,000 x g for 3 min.
13. Three phases have separated due to the different densities: the upper aqueous phase including DNA, the middle silicone gel phase as a barrier layer and the lower organic phase. The upper aqueous phase is completely pipetted into a new, empty receptacle 4 transferred (a 1.5 ml reaction vessel is sufficient).
14. Add 600 μl of isopropanol ("Molecular Biology Grade") and 2 μl of glycogen as carrier ("Molecular Biology Grade") and 50 times the reaction vessel 4 invert.
15. The reaction vessel 4 Centrifuge for 3 min at 16,000 x g, leaving a small white DNA glycogen pellet at the bottom of the reaction vessel 4 arises.
16. Discard isopropanol, the DNA glycogen pellet remains in the reaction vessel 4 ,
17. Pipette 600 μL of 70% ethanol into the DNA glycogen pellet and the reaction tube 4 Invert 20 times.
18. The reaction vessel 4 Centrifuge for 1 min at 16,000 x g.
19. Discard 70% ethanol (remove with pipette), the DNA glycogen pellet remains in the reaction vessel 4 ,
20. The DNA glycogen pellet in the open reaction tube 4 either 10 minutes at 37 ° C in a sealed thermoblock or 15 to 20 minutes under the sterile workbench.
21. Pellet in 50 to 100 .mu.l Rehydration buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7-8, DNA and DNase-free) for 1 h at 65 ° C in a thermoblock (in a closed reaction vessel).
22. Analysis / detection with quantitative real-time PCR, z. B. with universal or specific bacterial primers.

Reaktionsbedingungen Beispiel 1:Reaction Conditions Example 1

25 μL PCR reaction volume (12.5 μL of "MAXIMA SYBR Green qPCR Master Mix" from Fermentas, 10 nM ROX, 0.3 μM forward primer SEQ 1 5'-AAGTCGAGCGGACAGATGG-3 ', 0.3 μM reverse primer SEQ 2 5'-TGCGGTTCAAACAACCATCCG-3 ', 10 μl of DNA (obtained according to a preferred embodiment of the invention), make up to 25 μl with water ("PCR grade"). Temperature profile: 10 min 95 ° C; 40 cycles of 15 seconds 95 ° C, 30 seconds 60 ° C, 30 seconds 72 ° C (fluorescence detection at 72 ° C); Melting curve with 1 min at 95 ° C, 30 seconds at 55 ° C, temperature ramp up to 95 ° C with fluorescence measurement, 30 seconds 95 ° C.

Ergebnisse des Ausführungsbeispiels 1:Results of Embodiment 1:

Tabelle: Ct-Werte („Cycle Threshold”, Schwellenwert-Zyklus) und Schmelzpunkte von Ausführungsbeispiel 1 Probenbezeichnung Cycle Threshold Schmelztemperatur des Amplikons [°C] 2 × 10² CFU/ml* 34,22 83,80 2 × 10² CFU/ml* 34,37 83,80 2 × 10³ CFU/ml* 33,48 83,80 2 × 10³ CFU/ml* 33,90 83,80 2 × 10⁴ CFU/ml* 32,18 83,80 2 × 10⁴ CFU/ml* 32,21 83,80 2 × 10⁵ CFU/ml* 29,05 83,80 2 × 10⁵ CFU/ml* 28,91 83,80 PCR-Negativkontrolle No Ct 69,38 PCR-Negativkontrolle No Ct 69,38 PCR-Negativkontrolle No Ct 69,38 * Durch Ausplattieren ermittelte CFU-Konzentrationen (CFU = Colony-forming unit).

Abbildung: Kurvenverläufe der nach der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung prozessierten B. subtilis Proben: Rhomben (2 × 10⁵ CFU/ml), Dreiecke (2 × 10⁴ CFU/ml), Quadrate (2 × 10³ CFU/ml), Kreise (2 × 10² CFU/ml), Sterne (0 CFU/ml, Extraktions-Negativkontrollen). Unter Verwendung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann in einem beliebig großen Probevolumen Bacillus subtilis mindestens mit einer Sensitivität von 2 × 10² CFU/ml nachgewiesen werden (unter Verwendung der Primer mit den Sequenzen SEQ 1 und SEQ 2).Table: Ct Values ("Cycle Threshold", Threshold Cycle) and Melting Points of Embodiment 1

sample name Cycle Threshold Melting temperature of the amplicon [° C] 2 × 10 ² CFU / ml * 34.22 83,80 2 × 10 ² CFU / ml * 34.37 83,80 2 × 10 ³ CFU / ml * 33.48 83,80 2 × 10 ³ CFU / ml * 33,90 83,80 2 × 10 ⁴ CFU / ml * 32.18 83,80 2 × 10 ⁴ CFU / ml * 32,21 83,80 2 × 10 ⁵ CFU / ml * 29.05 83,80 2 × 10 ⁵ CFU / ml * 28.91 83,80 PCR negative control No Ct 69.38 PCR negative control No Ct 69.38 PCR negative control No Ct 69.38

* CFU concentrations determined by plating (CFU = colony-forming unit).

Figure 3. Curves of the B. subtilis processed according to the preferred embodiment of the invention. Samples: rhombs (2 x 10 ⁵ CFU / ml), triangles (2 x 10 ⁴ CFU / ml), squares (2 x 10 ³ CFU / ml), circles (2 x 10 ² CFU / ml), stars (0 CFU / ml, negative extraction controls). Using the preferred embodiment of the invention, Bacillus subtilis can be detected at a sensitivity of 2 × 10 ² CFU / ml in an arbitrarily large sample volume (using the primers with the sequences SEQ 1 and SEQ 2).

Beispiel 2Example 2

Erfindung mit bevorzugter Ausführungsform vs. Stand der Technik ( L. J. DiMichele, Am. Soc. Brew. Chem., 1993, vol. 51 No. 2, S. 63–66 und K. Stärk, Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 2, S. 543–548 ; Weiterbehandlung des gelösten Filtrationsmediums 37 ohne Zelllyseschritt). Sensitivitätsvergleich für die Detektion von B. subtilis Sporen unter Verwendung der Vorrichtungen 1 inkl. Auffanggefäß 4 und Filtrationsvorrichtung 32.Invention with preferred embodiment vs. State of the art ( LJ DiMichele, Am. Soc. Brew. Chem., 1993, vol. 51 no. 2, pp. 63-66 and K. Stärk, Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 2, pp. 543-548 ; Further treatment of the dissolved filtration medium 37 without cell lysis step). Sensitivity comparison for the detection of B. subtilis spores using the devices 1 including collecting vessel 4 and filtration device 32 ,

Zwei Membranfilter/Filtrationsmedium 37 wurden nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung prozessiert (d. h. Zellaufschluss mithilfe von Mahlkugeln 29 in einem Homogenisator). Zwei Membranfilter/Filtrationsmedium 37 wurden nach dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung prozessiert, jedoch ohne Zelllyseschritt (entspricht Stand der Technik nach K. Stärk und L. J. DiMichele). Zwei Membranfilter/Filtrationsmedium 37 wurden als Extraktions-Negativkontrollen nach der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung prozessiert, jedoch ohne Beaufschlagung von Mikroorganismen. Jeder Membranfilter/Filtrationsmedium 37 wurde mit 10⁶ B. subtilis Sporen beaufschlagt bzw. die zwei Extraktions-Negativkontrollen wurden nur mit sterilem Wasser (PCR-Grade) in Kontakt gebracht. Die sechs Proben wurden analog wie in Beispiel 1 beschrieben nach der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung prozessiert (Schritt 1 bis 22). Bei den Proben nach dem Stand der Technik (nach K. Stärk und L. J. DiMichele) wurden Auffanggefäße 4 ohne Mahlkugeln 29 verwendet und der Zelllyseschritt im Homogenisator wurde ausgelassen.Two membrane filters / filtration medium 37 were processed according to a preferred embodiment of the invention (ie cell disruption using grinding balls 29 in a homogenizer). Two membrane filters / filtration medium 37 were processed according to this preferred embodiment of the invention, but without cell lysis step (corresponds to the state of the art after K. Stärk and LJ DiMichele). Two membrane filters / filtration medium 37 were processed as extraction negative controls according to the preferred embodiment of the invention, but without exposure to microorganisms. Each membrane filter / filtration medium 37 10 ⁶ B. subtilis spores were applied, respectively, and the two extraction negative controls were contacted only with sterile water (PCR grade). The six samples were processed analogously as described in Example 1 according to the preferred embodiment of the invention (steps 1 to 22). In the samples according to the prior art (after K. Stärk and LJ DiMichele) were collecting vessels 4 without grinding balls 29 used and the cell lysis step in the homogenizer was omitted.

Ergebnisse des Ausführungsbeispiels 2:Results of Embodiment 2:

Tabelle: Ct-Werte und Schmelzpunkte von Ausführungsbeispiel 2 Probenbezeichnung Cycle Threshold Schmelztemperatur des Amplikons [°C] PCR-Negativkontrolle No Ct 56,92 PCR-Negativkontrolle No Ct 56,91 Extraktions-Negativkontrolle No Ct 56,91 Extraktions-Negativkontrolle No Ct 56,46 Stand der Technik 33,23 83,97 Stand der Technik 33,55 83,97 Erfindung (bevorzugte Ausführungsform) 29,96 83,97 Erfindung (bevorzugte Ausführungsform) 29,86 83,97

Abbildung: Kurvenverläufe der nach der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung prozessierten B. subtilis Sporen-Proben im Vergleich zum Stand der Technik: Rhomben (Erfindung mit bevorzugter Ausführung), Dreiecke (Stand der Technik), Quadrate (PCR-Negativkontrollen und Extraktions-Negativkontrollen). Table: Ct values and melting points of Embodiment 2

sample name Cycle Threshold Melting temperature of the amplicon [° C] PCR negative control No Ct 56.92 PCR negative control No Ct 56.91 Extraction negative control No Ct 56.91 Extraction negative control No Ct 56.46 State of the art 33.23 83.97 State of the art 33.55 83.97 Invention (preferred embodiment) 29.96 83.97 Invention (preferred embodiment) 29.86 83.97

Figure: Curves of the B. subtilis spore samples processed according to the preferred embodiment of the invention compared to the prior art: rhombi (preferred embodiment), triangles (prior art), squares (PCR negative controls and negative extraction controls).

Beispiel 2 zeigt, dass die Erfindung in der bevorzugten Ausführungsform dem aktuellen Stand der Technik überlegen ist, da eine Sensitivitätssteigerung um mehr als 3 Ct-Einheiten erreicht werden konnte, was einem Faktor von etwa zehn Genomeinheiten/B. subtilis Sporen entspricht.Example 2 shows that in the preferred embodiment, the invention is superior to the current state of the art in that a sensitivity increase of more than 3 Ct units could be achieved, which is a factor of about ten genome units / B. subtilis spores corresponds.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11: Vorrichtungcontraption
22: Aufnahmeeinheitrecording unit
33: Auslass von 2 Outlet of 2
44: Auffanggefäßcollecting vessel
55: Aufnahmeteil von 2 Recording part of 2
66: Bodenteil von 2 Bottom part of 2
7 7: Außenwandung von 5 Outer wall of 5
88th: Innenwandung von 5 Inner wall of 5
99: Deckenwandungtop wall
1010: AufnahmeteilinnenflächeReceiving portion inner surface
1111: Fixierrandfixating
1212: Haftschichtadhesive layer
1313: innere Außenwandungsflächeinner outer wall surface
1414: Wulst von 5 Bead of 5
1515: Außenwandung von 6 Outer wall of 6
1616: Außenfläche von 15 Outer surface of 15
1717: Inkubationsraumincubation
1818: Abflussflächedrainage area
2020: Winkelangle
2121: Auslasskanalexhaust port
2222: Langsachse von 6 Langsachse of 6
2323: lichte Weite von 21 clear width of 21
2424: Absatz von 19 Sales of 19
2626: offenes Ende von 25 open end of 25
2727: Außengewinde von 25 External thread of 25
2828: Lösungsmittelsolvent
2929: Mahlkugelngrinding balls
3030: Vertiefung von 6 Deepening of 6
31, 31'31, 31 ': Verrastunglatching
3232: Filtrationsvorrichtungfiltration device
3333: Unterteil von 32 Lower part of 32
3434: Aufnahmeersatz von 33 Reception set of 33
3535: Aufsatzessay
3636: FilterunterstützungsflächeFilter support surface
3737: Filtrationsmediumfiltration media
3838: Rand von 37 Edge of 37
3939: Zentrifugenadaptercentrifuge adapter
4040: Aussparungrecess

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 2011/057707 A2 [0005]
DE 102008005968 A1 [0007, 0008]
JP 2012-019723 A [0010, 0012]
WO 2012/031156 A1 [0020]
EP 2402456 A1 [0022]
EP 2402465 A1 [0023]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

LJ DiMichele (Am Soc Brew Chem, 1993, vol 51, No. 2, pp. 63-66) [0010]
K. Nakamura (Journal of Aerosol Research, 2003, Vol. 18, No. 3, pp. 177-180). [0010]
K. Stärk (Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 2, pp. 543-548). [0010]
LJ DiMichele (Am Soc Brew Chem, 1993, vol 51, No. 2, pp. 63-66). [0014]
K. Stärk (Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 64, No. 2, pp. 543-548) [0016]
K. Sen (Applied and Environmental Microbiology, 2007, vol. 73, No. 22, pp. 7380-7387). [0018]
LJ DiMichele, Am. Soc. Brew. Chem., 1993, vol. 51 no. 2, pp. 63-66 [0069]
K. Stärk, Applied and Environmental Microbiology, 1998, Vol. 2, pp. 543-548 [0069]

Claims

Contraption ( 1 ) for the treatment of a porous filtration medium ( 37 ) with one of a receiving part ( 5 ) and a bottom part ( 6 ) existing recording unit ( 2 ), wherein with the receiving part ( 5 ) the porous filtration medium ( 37 ) of a lower part ( 33 ) a filtration device ( 32 ) and the receiving part ( 5 ) with the porous filtration medium ( 37 ) on the bottom part ( 6 ) is placed, and wherein the receiving part ( 5 ) with the bottom part ( 6 ) is latchable formed, characterized in that the bottom part ( 6 ) to the filtration medium ( 37 ) an incubation room ( 17 ), which is connected to a receiving part ( 5 ) facing away from the outlet ( 3 ) of the bottom part ( 6 ) and that the outlet ( 3 ) an approach ( 24 ), to which a solvent ( 28 ) for dissolving the porous filtration medium ( 37 ) containing collecting vessel ( 4 ) is releasably attachable.

Device according to claim 1, characterized in that the incubation space ( 17 ) of the floor part ( 6 ) to the outlet ( 3 ) runs conically.

Device according to claim 1 or 2, characterized in that the solvent ( 28 ) for dissolving the filtration medium ( 37 ) is an organic solvent.

Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the solvent ( 28 ) Is chloroform or methylene chloride.

Device according to one of claims 1 to 4, characterized in that on the bottom part ( 6 ) to be stowed collecting vessel ( 4 ) next to the solvent ( 28 ) the cell disruption supporting Mahlkugeln ( 29 ) contains.

Device according to one of claims 1 to 5, characterized in that the collecting vessel ( 4 ) at its open end ( 26 ) is liquid-tightly closed by a lid.

Device according to claim 5 or 6, characterized in that the outlet ( 3 ) of the bottom part ( 6 ) an outlet channel ( 21 ) which is transverse to the longitudinal axis ( 22 ) of the bottom part ( 6 ) is formed as an elongated slot whose narrow clear width ( 23 ) is smaller than the outer diameter of the grinding balls ( 29 ).

Device according to one of claims 1 to 7, characterized in that an inner wall ( 8th ) of the receiving part ( 5 ) outside of an area of the filtration medium usable for filtration ( 37 ) is positionable and a in the receiving part ( 5 ) arranged fixing edge ( 11 ) on a border ( 38 ) of the filtration medium ( 37 ) is positionable, and that the fixing edge ( 11 ) of the receiving part ( 5 ) with the edge ( 38 ) of the filtration medium ( 37 ) is connectable via an adhesive bond.

Device according to one of claims 1 to 8, characterized in that the filtration medium ( 37 ) is formed of polycarbonate or polyethersulfone.

Device according to one of claims 1 to 9, characterized in that the receiving unit ( 2 ) with the vertically arranged below collecting vessel ( 4 ) in a centrifuge adapter ( 39 ) and with the centrifuge adapter ( 39 ) is centrifugable in a centrifuge, wherein in the solvent ( 28 ) dissolved filtration medium ( 37 ) including retained microorganisms completely into the collecting vessel ( 4 ) is convertible.