DE202004019128U1 - Transgenic non-human mammal for laboratory investigations, has construct integrated into genome, causing inactivation of type one interferon receptor - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Säugetiere, die einen konditionellen Knock-Out, d.h. Inaktivierung des Typ I Interferon-Rezeptors aufweisen, Säugetiere in denen der Typ I Interferonrezeptor in bestimmten Geweben inaktiviert worden ist oder aktivier bar ist, sowie davon abgeleitete Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung Mäuse, die diesen konditionellen Knock-Out kongen im C57BL/6 Hintergrund aufweisen.The The present invention relates to transgenic mammals having a conditional Knock-out, i. Inactivation of the type I interferon receptor, mammals where type I inactivates interferon receptor in certain tissues been or is activating bar, as well as derived cells. In particular, the invention relates to mice that have this conditional Knock-out congenes in the C57BL / 6 have background.
Hintergrund der Erfindungbackground the invention
Type I Interferone (IFN-α/-β) waren die ersten Cytokine, die entdeckt wurden. Cytokine spielen eine entscheidende Rolle bei der angeborenen Antwort auf vitale Infektion. Sie haben eine stark anti-proliferative Wirkung, fördern die Apoptose und aktivieren anti-mikrobielle Funktionen von Makrophagen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle bei der Verbindung zwischen der erworbenen und der angeborenen Immunantwort (siehe bspw. Taniguchi T. und Takaoka A. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 111 – 116; G Bon A. und Tough D. F. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 432 – 436; Biron C. A. (2001) Immunity 14: 661 – 664. Die Induktion der Typ I Interferongenexpression in Antwort auf eine vitale Infektion wird durch das Wechselspiel der Transkriptionsfaktoren der IFN-regulatorischen Faktorfamilie (IRF) erreicht (Kanigushi, T. K. et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19: 623 – 655). Beispielsweise wird nachdem eine Zelle das Eindringen eines Virus in das Cytoplasma erkannt hat, das Protein IRF-3 phosphoryliert und in den Zellkern transloziert, um dort die Transkription des IFN-β-Gens zu stimulieren. Die Bindung von IFN-β an den Typ I IFN-Rezeptor (IFNAR), der sich aus den Untereinheiten IFNAR1 und IFNAR2 zusammensetzt, führt zur Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors STAT1α–β, was wiederum zur Induktion der IFN-Zielgene führt (siehe zum Beispiel Tanigushi T. und Takaoka A. (2002) supra.).grade I interferons (IFN-α / -β) were the first cytokines that were discovered. Cytokines play a crucial Role in the innate response to vital infection. They have a strong anti-proliferative effect, promote apoptosis and activate anti-microbial functions of macrophages and natural killer cells (NK cells). About that They also play an important role in the connection between the acquired and the innate immune response (see, for example, Taniguchi T. and Takaoka A. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 111-116; G Bon A. and Tough D.F. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 432-436; Biron C.A. (2001) Immunity 14: 661-664. Induction of type I interferon gene expression in response to a Vital infection is caused by the interplay of transcription factors the IFN regulatory factor family (IRF) (Kanigushi, T.K. et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19: 623-655). For example after a cell invades a virus into the cytoplasm has detected, the protein phosphorylated IRF-3 and into the nucleus translocated there to stimulate transcription of the IFN-β gene. The connection of IFN-β the type I IFN receptor (IFNAR), which consists of the subunits IFNAR1 and IFNAR2 leads to the phosphorylation of the Transcription factor STAT1α-β, which in turn leads to the induction of IFN target genes (See, for example, Tanigushi T. and Takaoka A. (2002) supra.).
In einem transgenen Mausmodell wurde die Funktion des Typ I IFN-Rezeptors zuerst von Müller U. et al. (1994) Science 264: 1918 im Hintergrund der SV129 Maus untersucht. Dieses Mausmodell ließ allerdings nur die Analyse des Effekts der globalen Deletion, d.h. des Verlusts der Expression des Typ I IFN-Rezeptors in allen Zellen zu. Die Herstellung von Tieren mit einer gewebespezifischen Typ I-Interferonrezeptordeletion war bisher nur sehr eingeschränkt möglich. So konnten bisher, z.B. durch Rekonstitution bestrahlter Wildtyp Mäuse mit Knochenmark aus Tieren mit einer vollständigen Typ I Interferonrezeptordeletion, Tiere hergestellt werden, bei denen alle Immunzellen Typ I Interferonrezeptor defizient waren, wobei alle anderen Körperzellen Typ I Interferonrezeptor kompetent waren. Eine Analyse der Wirkmechanismen von endogen produziertem oder exogen verabreichtem Typ I Interferon ist auch in diesem System stark eingeschränkt, da nicht zwischen den einzelnen Zellen des Immunsystems differenziert werden kann. Darüber hinaus sind Knochenmarksrekonstitutionen aufwendig und erlauben aus praktischen Gründen nur die Analyse von begrenzten Gruppengrößen. Weiterhin kann sich die Rekonstitutionseffizienz von Individuum zu Individuum unterscheiden. Somit kann innerhalb verschiedener experimenteller Gruppen z.T. eine erhebliche Variation auftreten. Schließlich können durch Knochenmarksrekonstitutionen nur bestimmte Immunzelltypen ersetzt werden. Tiere mit einer Deletion des Typ I Interferonrezeptors z.B. nur auf Neuronen des zentralen Nervensystems sind mit bisher verfügbaren Methoden nicht herstellbar. Die Bestimmung der Typ I-IFN-Rezeptorfunktion in einem bestimmten Zelltyp, beispielsweise nur in T-Zellen, Neuronen oder NK-Zellen ist jedoch von überragender Bedeutung, um zu verstehen, wie die Typ I Interferone das Immunsystem und dessen Wechselspiel mit anderen Körperzellen regeln und beeinflussen.In a transgenic mouse model became the function of the type I IFN receptor first from Müller U. et al. (1994) Science 264: 1918 in the background of the SV129 mouse examined. However, this mouse model left only the analysis the effect of the global deletion, i. the loss of expression of the type I IFN receptor in all cells too. The production of Animals with a tissue-specific type I interferon receptor deletion so far only very limited possible. So far, e.g. by reconstitution of irradiated wild type mice with Bone marrow from animals with a complete type I interferon receptor deletion, Animals are produced in which all immune cells type I interferon receptor were deficient, with all other body cells type I interferon receptor were competent. An analysis of the mechanisms of action of endogenously produced or exogenously administered type I interferon is also in this system highly limited, because not differentiated between the individual cells of the immune system can be. About that In addition, bone marrow reconstitutions are expensive and allow because of practical reasons only the analysis of limited group sizes. Furthermore, the Distinguish reconstitution efficiency from individual to individual. Thus, within several experimental groups, z. a significant variation occurs. Finally, by bone marrow reconstitution only certain immune cell types are replaced. Animals with a deletion of the Type I interferon receptor e.g. only on neurons of the central nervous system are using previously available methods not produceable. The determination of type I IFN receptor function in a particular cell type, for example, only in T cells, neurons or NK cells, however, is superior Importance to Understand How the Type I Interferons the Immune System and regulate and influence its interaction with other body cells.
Beschreibung der Erfindungdescription the invention
Die vorliegende Erfindung stellt nunmehr nicht-menschliche Säugetiere, insbesondere Mäuse, mit einem konditionellen Knock-Out des Typ I Interferonrezeptors zur Verfügung. In diesen Säugetieren ist es möglich in einem beliebigen Gewebe- oder Zelltyp und/oder nach einem geeigneten Stimulus den Typ I Interferonrezeptor zu inaktivieren. Dadurch kann die Funktion des Typ I IFN-Rezeptors in jedem Gewebe, Zelltyp, Zeitpunkt, z.B. vor, während oder nach einer viralen Infektion, oder Entwicklungsstadium untersucht werden. Im Ergebnis läßt sich durch die gezielte räumlich und zeitlich kontrollierte Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors erstmalig räumlich und zeitlich aufgelöst die Funktion des Typ I IFN-Rezeptors untersuchen.The present invention now provides non-human mammals, especially mice, with a conditional knockout of the type I interferon receptor to disposal. In these mammals Is it possible in any tissue or cell type and / or suitable Stimulus to inactivate the type I interferon receptor. This can the function of the type I IFN receptor in each tissue, cell type, time, e.g. before, while or after a viral infection, or developmental stage become. As a result, can be through the targeted spatial and timed inactivation of the type I IFN receptor for the first time spatial and temporally resolved investigate the function of the type I IFN receptor.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung daher ein transgenes nicht-menschliches Säugetier zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in sein Genom integriert ein Konstrukt aufweist, das die Inaktivierung des Typ I Interferon-Rezeptors zuläßt.In In a first aspect, therefore, the invention provides a transgenic non-human mammal to disposal, which is characterized in that it integrates into its genome a construct that has the inactivation of the type I interferon receptor allows.
Der Begriff „Konstrukt" bezeichnet in diesem Zusammenhang ein exogen in das Genom des Säugetiers eingeführtes Polynukleotid. Durch die Integration in das Genom des Säugetiers der vorliegenden Erfindung wird eine stabile Weitergabe an alle Nachkommen des Säugetiers sichergestellt. Die Erzeugung transgener Säugetiere ist im Stand der Technik für eine Vielzahl von Säugetieren beschrieben worden, vor allem allerdings für transgene Mäuse, Ratten und Nutztiere wie, z.B. Kühe, Schafe und Schweine. In der Regel werden transgene Säugetiere dadurch erzeugt, daß zunächst embryonale Stammzellen des jeweiligen Tiers erzeugt und kultiviert werden und in diese dann das Konstrukt stabil, sei es durch Infektion mit einem in das Genom integrierenden Virus, z.B. einem Retrovirus, oder durch Transfektion mit einem DNA-Plasmid und anschließende Selektion in das Genom der ES-Zelle integriert wird. Die transgene ES-Zelle wiederum wird in ein Embryo des jeweiligen Säugetiers, z.B. im Blastozysten injiziert. Das sich ergebende Tier ist in der Regel ein sogenanntes Mosaiktier, das in einigen seiner Zellen das Transgen enthält. Wenn ein so erzeugtes Tier das Transgen in seinen Keimzellen enthält, ist es dazu in der Lage das Transgen an seine Nachkommen weiter zugeben. Diese Nachkommen enthalten nunmehr das Transgen in jeder Körperzelle allerdings nur in einer Kopie, d.h. sie sind heterozygote für das Transgen. Erneute Kreuzung zweier heterozygoter transgener Tiere führt schließlich zu homozygot transgenen Tieren.The term "construct" in this context refers to an exogenous polynucleotide introduced into the mammalian genome by integration into the mammalian genome of the present invention A stable distribution to all offspring of the mammal is ensured. The generation of transgenic mammals has been described in the art for a variety of mammals, but especially for transgenic mice, rats and farm animals such as cows, sheep and pigs. As a rule, transgenic mammals are produced by first producing and cultivating embryonic stem cells of the respective animal and then stably constructing the construct there, either by infection with a virus which integrates into the genome, for example a retrovirus, or by transfection with a DNA Plasmid and subsequent selection into the genome of the ES cell. The transgenic ES cell in turn is injected into an embryo of the respective mammal, for example in blastocysts. The resulting animal is usually a so-called mosaic animal that contains the transgene in some of its cells. When an animal so produced contains the transgene in its germ cells, it is able to pass on the transgene to its offspring. However, these offspring now only contain the transgene in each body cell in one copy, ie they are heterozygous for the transgene. Re-crossing of two heterozygous transgenic animals finally leads to homozygous transgenic animals.
Ein Konstrukt, das die Inaktivierung des Typ I Interferon-Rezeptors zuläßt, ist ein Konstrukt, das die Deletion oder Mutation eines Genes oder Teil eines Gens ermöglicht, das für den Typ I Interferonrezeptor kodieren, d.h. für eine der Typ I IFN-Rezeptoruntereinheiten (IFNAR1 und IFNAR2). Ein solches Konstrukt wird auch als konditionelles Knock-Out-Konstrukt bezeichnet.One Construct the inactivation of the type I interferon receptor admits is a construct that is the deletion or mutation of a gene or part a gene allows that for encode the type I interferon receptor, i. for one of the type I IFN receptor subunits (IFNAR1 and IFNAR2). Such a construct is also called conditional Knock-out construct called.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das transgene Säugetier ein Nagetier, z.B. eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Hasentier, ein Raubtier, z.B. eine Hauskatze oder ein Paarhufer, z.B. ein Schwein, eine Kuh, ein Schaf oder eine Ziege. Ein besonders bevorzugtes Säugetier für das Studium der Typ I IFN-Funktion ist die Maus, so daß in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das Säugetier eine Maus ist. Mäuse sind deshalb besonders bevorzugt, da eine Vielzahl weiterer transgener Mäuse erhältlich sind, die andere konditionelle Knock-Outs, Knock-Ins oder Transgene aufweisen, so daß durch Kreuzung dieser Tiere mit den Mäusen der vorliegenden Erfindung Mäuse erzeugt werden können, denen bspw. andere IFN-Rezeptoren fehlen. Bei der Untersuchung transgener Mäuse und vor allem bei der weiteren Kreuzungen dieser Mäuse ist es wünschenswert, daß die Tiere kongen sind und daher nur der Effekt der Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors beobachtet wird und der Einfluß anderer Rassen-spezifischer genetischer Unterschiede möglichst gering gehalten wird. Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform die transgene Maus kongen zu häufig verwendeten Labormäusen, insbesondere zu C57BL/6-Mäusen. Die Kongenität kann durch die wiederholte Kreuzung der transgenen Maus mit einer Maus des Typs erzeugt werden, deren genetischer Hintergrund gewünscht wird. Aus den Nachkommen werden dann für die weitere Kreuzung nur die ausgewählt, die immer noch das Transgen aufweisen bzw. im vorliegenden Fall die Fähigkeit, den Typ I IFN-Rezeptor zu inaktivieren. Dieser Prozeß wird auch als Rückkreuzung bezeichnet. In der Regel gehen bei mehreren Runden der Rückkreuzung und Selektion all die Elemente des ursprünglich in die ES-Zelle eingebrachten Konstrukts verloren, die nicht unmittelbar an der Ausprägung der Eigenschaft beteiligt sind, auf die selektioniert wird. Wenn das Konstrukt beispielsweise sogenannte 1oxP-Stellen enthielt, die im Zusammenspiel mit der CRE-Rekombinase die gezielte Deletion bestimmter Genabschnitte ermöglichen, werden nach 10 bis 20 Rückkreuzungen vom Konstrukt in der Regel nur noch die 1oxP-Stellen zurückgeblieben sein. Daher ist das Konstrukt, das in den Säugetieren der vorliegenden Erfindung enthalten ist, nicht notwendigerweise mit dem Konstrukt identisch, das ursprünglich in die ES-Zellen eingebracht worden ist (das ES-Konstrukt).In a preferred embodiment In accordance with the invention, the transgenic mammal is a rodent, e.g. a Mouse, a rat, a hamster, a lagomorph, a predator, e.g. a domestic cat or a pair of cloven-hoofed animals, e.g. a pig, a cow, a Sheep or a goat. A particularly preferred mammal for the Studying the type I IFN function is the mouse, so that in one preferred embodiment invention of the mammal one Mouse is. mice are therefore particularly preferred because a variety of other transgenic Mice are available, have other conditional knock-outs, knock-ins or transgenes, so that through Crossing these animals with the mice of the present invention Mice can be generated which, for example, lack other IFN receptors. When investigating transgenic Mice and especially in the further crossings of these mice, it is desirable that the Animals are congenital and therefore only the effect of inactivation of the type I IFN receptor is observed and the influence of other races more specific genetic differences as possible is kept low. Therefore, in a preferred embodiment the transgenic mice congene too often used laboratory mice, in particular to C57BL / 6 mice. The congeniality can be characterized by the repeated crossing of the transgenic mouse with a Mouse of the type whose genetic background is desired. From the descendants are then for the further intersection is just the one that still selects the transgene or in the present case the ability to type I IFN receptor to inactivate. This process will also as a backcross designated. As a rule, the backcrossing takes place in several rounds and selecting all the elements of the original introduced into the ES cell Construct lost, not directly on the expression of the Property that is selected for. If that For example, the construct contained so-called 1oxP sites, which in the Interaction with the CRE recombinase the targeted deletion of certain Enable gene sections will be after 10 to 20 backcrosses from As a rule, only the 1oxP sites are left behind be. Therefore, the construct that is present in the mammals of the present Invention, not necessarily with the construct identical, originally into the ES cells (the ES construct).
Für bestimmte Untersuchungen ist es wünschenswert, daß die Typ I IFN-Rezeptorfunktion nicht vollständig verloren geht. Dies kann beispielsweise durch die Inaktivierung nur einer Kopie einer der Untereinheiten des Typ I IFN-Rezeptors erreicht werden, d.h. das Konstrukt ist nur heterozygot vorhanden. Hierdurch ergibt sich in der Regel eine Verringerung der Expressionsstärke des Typ I IFN-Rezeptors. Es ist allerdings bevorzugt, daß die Funktion des Typ I IFN-Rezeptors in dem jeweils interessierenden Zelltyp vollständig verlorengeht und daher ist es bevorzugt, daß das transgene Säugetier der vorliegenden Erfindung homozygot für das Konstrukt ist, so daß sich bei Bedarf, z.B. beide Kopien des Typ I Interferonrezeptor α-Kettegens inaktivieren lassen.For certain Investigations it is desirable that the Type I IFN receptor function is not completely lost. This can for example, by inactivating only a copy of one of the Subunits of the type I IFN receptor can be achieved, i. the Construct is only heterozygous. This results in usually a reduction in the expression level of the type I IFN receptor. However, it is preferred that the Function of the type I IFN receptor in the respective one of interest Complete cell type lost and therefore it is preferred that the transgenic mammal of the present invention is homozygous for the construct, so that in Need, e.g. both copies of the type I interferon receptor α-chain gene inactivate.
Grundsätzlich kann jede der zwei Untereinheiten des Typ I IFN-Rezeptors allein oder auch beide zusammen deletiert oder mutiert werden. Die Erfinder haben gezeigt, daß die Inaktivierung der gesamten Typ I IFN-Rezeptorfunktion bereits durch die Inaktivierung des α-Kette-Gens erreicht werden kann. Somit wird das Konstrukt, das die Inaktivierung des Typ I Interferon-Rezeptors erlaubt vorzugsweise in das Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gen eingeführt. Das Es-Konstrukt enthält somit vorzugsweise das gesamte Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gen oder einen Teil davon und weitere Elemente, die eine Insertion in, Deletion oder Mutation des α-Kette-Gen erlauben. Somit ersetzt das Konstrukt vorzugsweise das gesamte native Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gen oder einen Teil davon durch das gesamte Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gen oder einen Teil davon, wobei das resultierende Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gen für eine im wesentlichen funktionelle Typ I Interferonrezeptor α-Kette kodiert.In principle, either of the two subunits of the type I IFN receptor alone or both can be deleted or mutated together. The inventors have shown that inactivation of the entire type I IFN receptor function can already be achieved by inactivating the α chain gene. Thus, the construct that allows inactivation of the type I interferon receptor is preferably introduced into the type I interferon receptor α-chain gene. The Es construct thus preferably contains all or part of the type I interferon receptor α-chain gene and other elements which permit insertion, deletion or mutation of the α-chain gene. Thus, the construct preferably replaces the entire native type I interferon receptor α-chain gene, or a portion thereof, with the entire type I interferon receptor α-chain gene or one Part thereof, wherein the resulting type I interferon receptor α-chain gene encodes a substantially functional type I interferon receptor α-chain.
Im Stand der Technik sind eine Reihe von DNA-Elementen bekannt, die spezifisch durch prokaryontische, virale oder eukaryontische Rekombinasen erkannt werden können. Wenn zwei dieser Elemente vorhanden sind, kann beispielsweise ein zwischen diesen Elementen liegender DNA-Abschnitt deletiert werden. Alle im Stand der Technik bekannten und für diesen Zweck verwendeten DNA-Elemente können im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden und daher im Säugetier der vorliegenden Erfindung enthalten sein, bevorzugt ist es jedoch, daß das Konstrukt mindestens zwei 1oxP- oder mindestens zwei flip-Sequenzelemente 5', 3' und/oder innerhalb des Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gens aufweist.in the State of the art are known a number of DNA elements that specifically by prokaryotic, viral or eukaryotic recombinases can be recognized. If two of these elements are present, for example, a between these elements lying DNA section are deleted. All known in the art and used for this purpose DNA elements can used in the context of the present invention and therefore in the mammal of the present invention, but it is preferred that that this Construct at least two 1oxP or at least two flip-sequence elements 5 ', 3' and / or within of type I interferon receptor α-chain gene having.
Überraschender Weise haben die Erfinder beobachtet, daß die Funktion des Typ I IFN-Rezeptors bereits dann vollständig verlorengeht, wenn das Exon 10 des α-Kette-Gens deletiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des transgenen Säugetiers der vorliegenden Erfindung sind daher zwei DNA-Elemente, die von einer Rekombinase erkannt werden können, 5' und 3' vom Exon 10 des α-Kette-Gens angeordnet, insbesondere ist es bevorzugt, daß die 1oxP-Sequenzen 5' bzw. 3' des Exons 10 des Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gens angeordnet sind.surprisingly Way, the inventors have observed that the function of the type I IFN receptor already then completely is lost when the exon 10 of the α-chain gene is deleted. In a preferred embodiment of the transgenic mammal The present invention therefore includes two DNA elements derived from a recombinase can be detected, 5 'and 3' of the exon 10 of the α-chain gene arranged, in particular it is preferred that the 1oxP sequences 5 'and 3 'of the exon 10 of type I interferon receptor α-chain gene are arranged.
Das transgene Säugetier der vorliegenden Erfindung, das ein Konstrukt enthält, das die Möglichkeit eröffnet den Typ I IFN-Rezeptor zu inaktivieren, muß, um tatsächlich zu einem Säugetier zu führen, in dem der Typ I IFN-Rezeptor zeitlich und/oder räumlich gesteuert inaktiviert ist, noch ein Gen umfassen, dessen Expression zur Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors führt. Im Stand der Technik sind eine Vielzahl von Expressionselementen bekannt, die nur unter bestimmten Bedingungen zu einer Expression des durch sie kontrollierten Gens führen. Alle diese Elemente können je nach gewünschten Expressionsmuster verwendet werden. Überall wo dieses Gen exprimiert wird, wird dann der Typ I IFN-Rezeptor inaktiviert. Vorzugsweise enthält das transgene Säugetier das Gen, dessen Expression zur Inaktivierung des Typ I Interferonrezeptors führt, unter Kontrolle eines induzierbaren, gewebsspezifischen, zellzyklus-spezifischen, stoffwechselspezifischen Promotors/Enhancers.The transgenic mammal of the present invention containing a construct which the possibility opens the In order to inactivate type I IFN receptor, in order to actually become a mammal respectively, in which the type I IFN receptor is temporally and / or spatially controlled is inactivated, nor include a gene whose expression is inactivating the type I IFN receptor leads. In the prior art are a variety of expression elements known to be expressed only under certain conditions lead the gene controlled by them. All these elements can ever according to desired Expression patterns are used. Wherever this gene is expressed then the type I IFN receptor is inactivated. Preferably contains the transgenic mammal the gene whose expression leads to inactivation of the type I interferon receptor leads, under the control of an inducible, tissue-specific, cell cycle-specific, metabolism-specific promoter / enhancer.
Das Gen, das im Zusammenspiel mit dem Konstrukt die Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors bewirkt, ist vorzugsweise eine Rekombinase. Wie vorangehend ausgeführt, ist eine Vielzahl prokaryontischer, eukaryontischer und viraler Rekombinasen bekannt, die alle gleichermaßen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Besonders bevorzugte Rekombinasen sind jedoch die CRE-Rekombinase und die FLIP-Rekombinase, insbesondere die CRE-Rekombinase.The Gene that interacts with the construct to inactivate the Type I IFN receptor is preferably a recombinase. As stated above a variety of prokaryotic, eukaryotic and viral recombinases known, all alike can be used in the present invention. Especially preferred However, recombinases are CRE recombinase and FLIP recombinase, in particular the CRE recombinase.
Um die gezielte Expression des Gens, das im Zusammenspiel mit dem Konstrukt die Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors bewirkt, zu erlauben, sind besonders bevorzugte Expressionssyteme die Tet-on-Promotorkonstrukte und Tet-off-Promotorkonstrukte und Derivate davon, die durch Gossen et al. (Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20) beschrieben wurden. Der hochaffin an tet-DNA-Bindungselement bindende bakterielle Tet-Repressor erlaubt die effiziente Kontrolle der Expression von Genen. Je nach System läßt sich ein unter der Kontrolle des Tet-Repressors stehendes Gen durch die Gabe von Tetracylin an das Tier an- oder abschalten. Weitere bevorzugte Promotoren, die die Expression des Gens kontrollieren können sind T-Zell-spezifische Promotoren, B-Zellspezifische Promotoren, Myeloid-spezifische Promotoren, Endothelzell-spezifische Promotoren, Hirn-spezifische Promotoren, Entwickungs-spezifische Promotor und Promotoren, die durch Hypoxie, durch Glukosekonzentration, durch Phosphatkonzentration, durch Hormone oder Hormonderivate oder durch Hitzeschock reguliert werden. Eine Vielzahl solcher Promotoren ist im Stand der Technik bekannt. Das Gen, das im Zusammenspiel mit dem Konstrukt die Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors bewirkt, und dieses Gen steuernde DNA-Elemente, z.B. Enhancer oder Promotoren, können wie anfänglich für die Erzeugung eines transgenen Säugetiers beschrieben, in das Säugetier der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, in dem beispielsweise ES-Zellen aus dem Säugetier kultiviert werden und in diese ein weiteres Konstrukt, das das Gen und das Kontrollelement umfaßt, eingebracht wird. Dies ist allerdings für jedes neue Säugetier mit einem sehr großen Aufwand verbunden. Es ist daher bevorzugt, daß ein Säugetier, das sowohl ein Konstrukt, das die Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors erlaubt, als auch das Gen, das im Zusammenspiel mit dem Konstrukt die Inaktivierung des Typ I IFN-Rezeptors bewirkt, und das Gen steuernde DNA-Elemente enthält, durch Kreuzung zweier Säugetiere, wobei eines das Konstrukt enthält und das andere das Gen und die DNA-Element enthält, erzeugt wird. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Säugetieren, insbesondere Mäusen bekannt, die bspw. CRE-Rekombinase nur in einigen Zelltypen oder nach der Verfütterung bestimmter Substanzen exprimieren. Die Kreuzung einer solchen Maus mit einer Maus die 1oxP-Stellen an geeigneter Position, bspw, 3' und 5' des Exons 10 des Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gens enthält führt zur Inaktivierung des Typ I Interferonrezeptors in allen Zellen in denen die CRE-Rekombinase exprimiert wird.Around the targeted expression of the gene that interacts with the construct the inactivation of the type I IFN receptor causes to allow Particularly preferred expression systems are the tet-on-promoter constructs and tet-off promoter constructs and derivatives thereof derived from guts et al. (Gossen M. et al. (1994) Curr Opin. Biotechnol. 5, 516-20) have been described. The high affinity tet-DNA binding element binding bacterial Tet repressor allows efficient control of expression of genes. Depending on the system can be a gene under the control of the Tet repressor by the Turn on or off administration of tetracycline to the animal. Further preferred Promoters that can control the expression of the gene are T-cell specific Promoters, B cell-specific promoters, myeloid-specific promoters, Endothelial cell-specific promoters, brain-specific promoters, Development-specific promoter and promoters by hypoxia, by glucose concentration, by phosphate concentration, by hormones or hormone derivatives or by heat shock. A Variety of such promoters is known in the art. The Gene that interacts with the construct to inactivate the Type I IFN receptor causes, and this gene controlling DNA elements, e.g. Enhancers or promoters as initially for the Generation of a transgenic mammal described in the mammal of the present invention, in which, for example ES cells from the mammal be cultured and into this another construct that is the gene and the control element comprises is introduced. This, however, is for every new mammal with a very big one Effort connected. It is therefore preferred that a mammal carrying both a construct, which allows inactivation of the type I IFN receptor as well the gene that interacts with the construct inactivation of the type I IFN receptor, and the gene contains controlling DNA elements Crossing two mammals, where one contains the construct and the other contains the gene and the DNA element is generated. In the state the art is known to a variety of mammals, especially mice, the. CRE recombinase only in some cell types or after the feeding express certain substances. The intersection of such a mouse with a mouse, the 1oxP sites at a suitable position, for example, 3 'and 5' of the exon 10 of Type I interferon receptor α-chain gene contains leads to Inactivation of the type I interferon receptor in all cells in which the CRE recombinase is expressed.
Um die Funktion des Typ I Interferonrezeptors zu untersuchen ist es besonders bevorzugt, daß das Gen unter der Kontrolle eines Promotors bzw. Enhancers steht, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Mox2- Promotor, dem Pax3-Promotor, dem Wnt1-Promotor, dem Wnt1-Tamoxifen-induzierbare Promotor, dem Hoxa 1-Promotor, dem Hoxb6-Promotor, Engrailed-2-Promotor, dem D6 Promotor/Enhancer, dem „upstream" DNA-Fragment des Emx-1 Gens, Foxg1 (BF-1)-Promotor, dem CamKII alpha-Promotor, dem c-kit Promotor, dem Neuronen-spezifische Enolase (NSE)-Promotor, dem Nestin-Promotor, dem Gonadotropin-freisetzendes Hormon-(GnRH)-Promotor, dem KA1-Promotor, dem Neurofilament-H (mNF-H) Genpromotor, dem CCDK-II RU-486 induzierbare Promotor, dem hGFAP-Promotor, dem CCDK-II, dem GluRepsilon3-Promotor, dem NMDA-Typ Glutamaterezeptor GluRepsilon3 Untereinheitgenpromotor, dem L7/pcp-2-Promotor, dem GFAP-Promotor, dem Myelin-basisches-Proteinpromotor, dem PO-Promotor, dem Protein O-Promotor, dem Krox20-Promotor, dem Six3-Promotor, dem RAR-Promotor, Dentin sialophosphoproteinpromotor, dem Muskelkreatinkinasepromotor, dem Myosin-leichte-Kettenpromotor, dem glatte Muskelzellen-schwere-Kettenpromotor, dem Tiel-Promotor, dem Tie2-Promotor, dem SM22-Promotor, dem NKx2-5-Promotor, dem alpha-Myosin-schwere-Kettenpromotor, dem α-skeletalen Actinpromotor, dem Typ II Collagenpromotor, dem Collagen Typ II-Promotor, dem OG2-Promotor, dem Colalpha1-Promotor, dem aP2-Promotor, dem vav-Promotor, dem lck-Promotor, dem endogenen M-Lysozyme Locus, dem LysM-Promotor, dem hCD2-Promotor + (LCR), dem CD19-Promotor, dem CD19-Tamoxifen-induzierbarer Promotor, dem Fabp-Promotor, dem Fabp-rtTA / tet-o-Cre, dem CMV enh.-modifizierten beta-Actinpromotor, dem „mouse mammary tumor virus (MMTV) long terminal repeat" (LTR), dem Insulinpromotor, dem Glucagonpromotor, dem PP-Promotor, dem Pdx1-Promotor, dem Nphs1-Promotor, dem NPHS2-Promotor, dem Transthyretinpromotor, dem Albuminpromotor, dem Albumin/alpha-Fetoproteinpromotor, dem Alpha 1-Antitrypsinpromotor, dem K5 (Keratinpromotor), dem K5-Tamoxifen induzierbaren-Promotor, dem Keratin 14-Promotor, dem K14-Tamoxifen-induzierbarem Promotor, dem ß-Lactoglobulinpromotor, dem WAP-Promotor, dem WAP- rtTA / tet-o-Cre, dem ARR2PB Compositpromotor, dem Prostata-spezifischen Probasin-(PB)-Promotor, dem Amhr2-Promotor, dem TNAP-Promotor, dem Pgk-2-Promotor, dem Protamine-1-Promotor (Prm1), dem Sycp1-Promotor, dem PrP-Promotor (Tamoxifen-induzierbar), dem ZP3-Promotor, dem Msx2-Promotor, dem hCMV-Promotor, dem modifizierte CMV minimal Promotor, dem früh wirkende PGK-1-Promotor, dem PGK-Promotor, dem X-verknüpfte Hprt locus-Promotor, dem CMVenh-Ch-Actinpromotor, dem „Doxycyclin responsive" Promotor, dem Msx-1-Promotor, dem „Tetracycline-responsive" CMV-minimal Promotor und dem Hsp70-1-Promotor. Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Säugetieren, insbesondere Mäusen erhältlich, die Rekombinasen, insbesondere die CRE-Rekombinase unter Kontrolle eines der oben angeführten Promotor- bzw. Enhancerelements enthält. Die Kreuzung von einem solchen Säugetier mit einer erfindungsgemäßen Säugetier, daß ein Konstrukt enthält, das die Inaktivierung des Typ I Interferonrezeptors zuläßt, führt zu einem Säugetier in dem der Typ I Interferonrezeptor in allen Zellen inaktiviert ist, in denen der jeweilige Enhancer/Promotor aktiv ist bzw. aktiviert wird.Around it is to study the function of the type I interferon receptor particularly preferred that the gene under the control of a promoter or enhancer selected from the group consisting of the Mox2 promoter, the Pax3 promoter, the Wnt1 promoter, the Wnt1 tamoxifen inducible promoter, the Hoxa 1 promoter, the Hoxb6 promoter, Engrailed 2 promoter, the D6 Promoter / enhancer, the "upstream" DNA fragment of the Emx-1 gene, Foxg1 (BF-1) promoter, the CamKII alpha promoter, the c-kit promoter, the neuron-specific enolase (NSE) promoter, the nestin promoter, the gonadotropin releasing hormone (GnRH) promoter, the KA1 promoter, the neurofilament H (mNF-H) gene promoter, the CCDK-II RU-486 inducible promoter, the hGFAP promoter, the CCDK-II, the GluRepsilon3 promoter, the NMDA-type glutamate receptor gluRepsilon3 Subunit gene promoter, the L7 / pcp-2 promoter, the GFAP promoter, the myelin basic protein promoter, the PO promoter, the protein O promoter, the Krox20 promoter, the Six3 promoter, the RAR promoter, dentin sialophosphoprotein promoter, the muscle creatine kinase promoter, the myosin light chain promoter, the smooth muscle cell heavy-chain promoter, the Tiel promoter, the Tie2 promoter, the SM22 promoter, the NKx2-5 promoter, the alpha-myosin heavy chain promoter, the α-skeletal Actin promoter, the type II collagen promoter, the collagen type II promoter, the OG2 promoter, the Colalpha1 promoter, the aP2 promoter, the vav promoter, the lck promoter, the endogenous M-Lysozyme Locus, the LysM promoter, the hCD2 promoter + (LCR), the CD19 promoter, the CD19 tamoxifen-inducible Promoter, the Fabp promoter, the Fabp-rtTA / tet-o-Cre, the CMV enh. modified beta-actin promoter, the mouse mammary tumor virus (MMTV) long terminal repeat "(LTR), the insulin promoter, the glucagon promoter, the PP promoter, the Pdx1 promoter, the Nphs1 promoter, the NPHS2 promoter, the transthyretin promoter, the Albumin promoter, the albumin / alpha-fetoprotein promoter, the alpha 1-antitrypsin promoter, the K5 (keratin promoter), the K5 tamoxifen inducible promoter, the keratin 14 promoter, the K14 tamoxifen inducible Promoter, the β-lactoglobulin promoter, the WAP promoter, the WAP-rtTA / tet-o-Cre, the ARR2PB composite promoter, the Prostate-specific probasin (PB) promoter, the Amhr2 promoter, the TNAP promoter, the Pgk-2 promoter, the protamine-1 promoter (Prm1), the Sycp1 promoter, the PrP promoter (tamoxifen-inducible), the ZP3 promoter, the Msx2 promoter, the hCMV promoter, the modified CMV minimal promoter, in the morning acting PGK-1 promoter, the PGK promoter, the X-linked Hprt locus promoter, the CMVenh-Ch-actin promoter, the "doxycyclin responsive "promoter, the Msx-1 promoter, the "tetracycline-responsive" CMV minimal promoter and the Hsp70-1 promoter. In the prior art is a variety of mammals, especially mice available, the recombinases, in particular the CRE recombinase under control one of the above Contains promoter or enhancer element. The crossing of one such mammal with a mammal according to the invention, the existence Contains construct, which allows the inactivation of the type I interferon receptor leads to a mammal in which the type I inactivates interferon receptor in all cells is in which the respective enhancer / promoter is active or activated becomes.
Isolierte Zellen erlauben bspw. die weitere Untersuchung der Funktion des Typ I IFN-Rezeptors in in vitro Experimenten. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zelle aus einem nicht-menschlichen transgenen Säugetier der vorliegenden Erfindung. In einer solchen Zelle bspw. aus einer Maus, die ein Konstrukt der vorliegenden Erfindung, z.B. zwei 1oxP-Stellen 3' und 5' vom Exon 10 des Typ I Interferonrezeptor α-Kette-Gens und ein CRE-Rekombinasegen unter Kontrolle eines Tet-On-Promotors enthält, kann in vitro durch Zugabe von Tetracyclin die Funktion des Typ I IFN-Rezptors inaktiviert werden. Bevorzugte Zelltypen, die aus einem Säugetier der vorliegenden Erfindung isoliert werden können sind embryonale Stammzellen (ES), T-Zellen, B-Zellen, Neuronen, Makrophagen oder Gliazellen.isolated Cells allow, for example, the further investigation of the function of the Type I IFN receptor in in vitro experiments. Therefore, another aspect of the present Invention a cell from a non-human transgenic mammal of the present invention. In such a cell, for example, from a mouse, which is a construct of the present invention, e.g. two 1oxP sites 3 'and 5' from the exon 10 of the Type I interferon receptor α-chain gene and a CRE recombinase gene under the control of a Tet-on promoter contains can in vitro by adding tetracycline the function of the type I IFN-Rezptors be inactivated. Preferred cell types that a mammal can be isolated according to the present invention are embryonic stem cells (ES), T cells, B cells, neurons, macrophages or glial cells.
Die folgenden Beispiele illustrieren lediglich bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung und sind in keiner Weise limitierend für den Umfang der Erfindung, der durch die angefügten Ansprüche bestimmt wird. Alle Literaturzitate werden hierin durch Verweis aufgenommen.The The following examples illustrate only preferred embodiments of the invention and are in no way limiting on the scope the invention, which is determined by the appended claims. All literature quotes are incorporated herein by reference.
Experimenteexperiments
Konditionelle IFNAR Konck-Out Mäuse als Modell für die Säugetiere der ErfindungConditional IFNAR Konck-Out Mice as Model for the mammals the invention
Erfindungsgemäße Mäuse mit einem konditionellen Typ I Interferonrezeptor (IFNARcond) erlauben dank der Cre/1oxP Technologie die Zelltyp- oder Gewebe-spezifische Deletion, eine induzierbare Deletion, oder eine Zelltyp- oder Gewebe-spezifisch induzierbare Deletion des Typ I Interferonrezeptors.Mice according to the invention a conditional type I interferon receptor (IFNARcond) allow thanks Cre / 1oxP technology, the cell-type or tissue-specific deletion, an inducible deletion, or a cell type or tissue specific inducible deletion of the type I interferon receptor.
Die Cre/1oxP Technologie basiert darauf, daß ein Zielgen (in diesem Fall das alpha-Ketten Gen des Typ I Interferonrezeptor) in der Keimbahn der Maus so modifiziert wird, daß für die Genfunktion entscheidende Genabschnitte mit den 1oxP Erkennungssequenzen der Bakteriophagenrekombinase Cre flankiert sind. Nach Expression der Rekombinase Cre werden 1oxP flankierte Genabschnitte deletiert. Wird Cre nur in bestimmten Zelltypen oder Geweben exprimiert, so wird nur in den betreffenden Zelltypen oder Geweben die Genfunktion unterbunden. Analog kann in induzierbaren Systemen durch Induktion der Cre-Expression das Zielgen inaktiviert werden. Da mittlerweile verschiedenste transgene Mäuse verfügbar sind, die Cre in bestimmten Zelltypen oder Geweben exprimieren (u.a. in B oder T Lymphozyten, in myeloiden Zellen, in Zellen des zentralen Nervensystems), oder in denen die Cre Rekombinase-Aktivität ubiquitär induzierbar ist (z.B. hormon-induzierbare Systeme, auf dem Tet-Operon basierende induzierbare Systeme, oder durch Typ I Interferon induzierbare Systeme), oder in denen die Cre Rekombinase-Aktivität nur in bestimmten Zelltypen induzierbar ist (u.a. MerCreMer Mäuse, in denen nur in frühen B Zellentwicklungsstadien die Cre-Aktivität hormonabhängig induziert werden kann), kann durch Verkreuzen der entsprechenden "Cre-Mäuse" mit IFNARcond Mäusen je nach Fragestellung die gewünschte Deletion des Typ I Interferonrezeptors herbeigeführt werden.The Cre / 1oxP technology is based on the fact that a target gene (in this case the alpha-chain gene of the type I interferon receptor) is modified in the germline of the mouse so that gene sections critical for gene function are flanked by the 1oxP recognition sequences of the bacteriophage recombinase Cre. After expression of the recombinase Cre 1oxP flanked gene segments are deleted. Will Cre only in certain Expressed cell types or tissues, so only in the cell types or tissues, the gene function is suppressed. Similarly, in inducible systems, the target gene can be inactivated by induction of Cre expression. Since a variety of transgenic mice are now available that express Cre in certain cell types or tissues (including B or T lymphocytes, in myeloid cells, in cells of the central nervous system), or in which the Cre recombinase activity is ubiquitously inducible (eg hormone) inducible systems, tet-operon-based inducible systems, or type I interferon-inducible systems), or in which Cre recombinase activity is inducible only in certain cell types (eg, MerCreMer mice in which only in early B cell development stages Activity can be induced hormone-dependent), the desired deletion of the type I interferon receptor can be brought about by cross-breeding of the corresponding "Cre mice" with IFNARcond mice, depending on the problem.
Bei der Cre/1oxP Technologie handelt es sich um eine genetische Methode, die die Produktion einer großen Anzahl von untereinander praktisch identischen Individuen erlaubt. Die IFNARcond Mäuse sind insgesamt 10-fach auf den C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzt worden, ebenso sind viele Cre-Mäuse auf dem C57BL/6 Hintergrund verfügbar. Daher ist eine hohe Reproduzierbarkeit von Ergebnissen innerhalb verschiedener Gruppen im Fall des IFNARcond Modells gewährt.at the Cre / 1oxP technology is a genetic method the production of a big one Number of virtually identical individuals allowed. The IFNARcond mice have a total of 10-fold back crossed to the C57BL / 6 background have been, as are many Cre mice available on the C57BL / 6 background. Therefore, a high reproducibility of results within various groups in the case of the IFNARcond model.
Erzeugen einer Maus mit konditionellem Typ-I IFN-Rezeptor α-Kette Knock-Out Um das Zielkonstrukt pF1oxEx10 zu erzeugen, wurde das Exon 10, das ein SmaI/Eco RV 780 by Fragment aus pMS81 (das die Exons 4 bis 11 des Typ I IFN-Rezeptor α-Kettengens der Maus enthält), wurde in die aufgefüllte Sal I-Stelle des pEasyFlox-Vektors ligiert. Der kurze 3'-homologe Arm wurde aus IB10 ES-Zellen unter Verwendung des Primers #08 (5'-TTTTGCGGCCGCGGTGGGTTAGGGGTGCTG-3'; SEQ ID NR: 1) und #09 (5'-TTTTGGATCCAAAAAGTTGTCAGTCTGGTGTGA-3'; SEQ ID NR: 2) vervielfältigt, was zu einem 1234 by PCR-Fragment mit BamH I- und Not I-Restriktionsschnittstellen an den Enden führt. Nach Ligation mit klebrigen Enden des 3'-homologen Arms in BamH I/Not I-Restriktionsstellen, die stromabwärts von der 3'-1oxP-Stelle des pEasyFlox-Vektors liegen. Die PCR-abgeleiteten Nukleotidsequenzen wurden durch automatische Sequenzierung bestätigt. Nach der Zerstörung der erhaltenen BamH I-Stelle wurde ein synthetischer Linker, der für eine BamH I/Sma I 81 pb Fragment des α-Kettengens kodiert, in die einzige Xho I/Hind III-Stelle, die stromaufwärts von der 5'-1oxP-Stelle angeordnet ist, ligiert. Schließlich wurde das 4,1 kb BamH I-Fragment, das aus pMS81 abgeleitet war, und das die Exons 7 bis 9 enthielt, in die neu erzeugte BamH I-Restriktionsschnittstelle einkloniert.Produce a mouse with conditional type I IFN receptor α-chain knock-out To generate the target construct pF1oxEx10, exon 10, the a SmaI / Eco RV 780 by fragment from pMS81 (which is the exons 4 to 11 the type I IFN receptor α-chain gene the mouse contains), was filled in the Sal I site of the pEasyFlox vector ligated. The short 3'-homologous arm was from IB10 ES cells using primer # 08 (5'-TTTTGCGGCCGCGGTGGGTTAGGGGTGCTG-3 '; SEQ ID NO: 1) and # 09 (5'-TTTTGGATCCAAAAGTTGTCAGTCTGGTGTGA-3 '; SEQ ID NO: 2) replicates what to a 1234 bp PCR fragment with BamH I and Not I restriction sites at the ends leads. After ligation with sticky ends of the 3 'homologue arm into BamH I / Not I restriction sites, the downstream from the 3'-1oxP site of the pEasyFlox vector. The PCR-derived nucleotide sequences were confirmed by automatic sequencing. After the destruction of the obtained BamH I site was a synthetic linker, which for a BamH I / Sma I 81 pb fragment of the α-chain gene into the unique Xho I / Hind III site upstream of the Xho I / Hind III site 5'-1oxP site arranged is, ligated. After all was the 4.1 kb BamH I fragment derived from pMS81, and containing exons 7 to 9 into the newly generated BamH I restriction site cloned.
Nach Elektroporation mit Not I-linearisierten pF1oxEx10 wurden IB10 ES-Zellen in 20% DMEM mit hoher Glukosemenge bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurde die G418 Selektion begonnen (300 μg/ml) und weitere 24 h später wurde Cymevene in einer Konzentration von 0,54 μg/ml in das Medium gegeben. Ungefähr 7 Tage nach der Elektroporation wurden die Klone ausgewählt und mit PCR unter Verwendung der Primer #10 (5'-CTACCGGTGGATGTGGAATG-3'; SEQ ID NR: 3) und #11 (5'-TGGGTAAACCTGTGAAGAAT-3'; SEQ ID NR: 4) analysiert, die im Falle einer homologen Rekombination zu einem 1,5 kb Fragment führten. Nach der Bestätigung des Vorhandenseins der 5'-1oxP-Stelle wurden Klone, die dieses Gen enthielten, transient mit dem Cre-Expressionsvektor pGKpuroCre transfiziert. Am Tag +1, wurde die Puromycin-Selektion für genau 24 h (1,25 μg/ml) angewendet und am Tag +4 wurden die Zellen in frische Platten eingesetzt, um Klone an den Tagen +9 – 10 auszuwählen. Die Klone, die immer noch das Exon 10 enthielten und die Neokassette nicht mehr enthielten, wurden mit den Primern # 36 (5'-CAGGCCACTCTGCATTTCCTC-3'; SEQ ID NR: 5) und #49 (5'-CTTTTTGGATCGATCCATAACTTCG-3; SEQ ID NR: 6) durchsucht, was zu einem 350 bp-Fragment führte.After electroporation with Not I-linearized pF1oxEx10, IB10 ES cells were incubated in 20% DMEM with high glucose at 37 ° C, 5% CO 2 . After incubation for 24 hours, G418 selection was started (300 μg / ml) and an additional 24 h later, cymevene was added to the medium at a concentration of 0.54 μg / ml. Approximately 7 days after electroporation, the clones were selected and amplified by PCR using primers # 10 (5'-CTACCGGTGGATGTGGAATG-3 '; SEQ ID NO: 3) and # 11 (5'-TGGGTAAACCTGTGAAGAAT-3'; 4), which resulted in a 1.5 kb fragment in the case of homologous recombination. After confirming the presence of the 5'-1oxP site, clones containing this gene were transiently transfected with the Cre expression vector pGKpuroCre. On day +1, puromycin selection was applied for exactly 24 hours (1.25 μg / ml) and on day +4 cells were placed in fresh plates to select clones on days +9-10. The clones which still contained exon 10 and no longer contained the neocassette were probed with primers # 36 (5'-CAGGCCACTCTGCATTTCCTC-3 '; SEQ ID NO: 5) and # 49 (5'-CTTTTTGGATCGATCCATAACTTCG-3; SEQ ID NR: 6), resulting in a 350 bp fragment.
Positive ES-Zellen wurden nach Standardverfahren in Mäuseblastozysten mikroinjiziert und in Leihmuttertiere transferiert. Die Leihmütter trugen die Embryonen aus und zogen nach der Geburt Nachkommen heran. In jedem Wurf befanden sich mehrere chimäre Tiere, die zu großen Teilen aus ES Zell-abgeleiteten Zellen bestanden. Diese Tiere wurden nach Erreichen der Geschlechtsreife verpaart. Aus den Nachkommen wurden bei erfolgter Keimbahntransmission Nachkommen mit der gewünschten Mutation in dem α-Ketten-Gen des Typ I Interferonrezeptors identifiziert. Diese Nachkommen wurden insgesamt 10-fach auf den C57BL76 Hintergrund zurückgekreuzt. Zu diesem Zweck wurden jeweils transgene IFNARcond Männchen mit einem C57BL/6 Weibchen verpaart. Nach 3 Wochen Schwangerschaft wurden Nachkommen geboren, die nach weiteren 3 Wochen mit molekularbiologischen Techniken analysiert wurden. Männchen, die ein IFNARcond Allel trugen wurden weitere 4 Wochen gehalten und bei Erreichen der Geschlechtsreife wieder mit einem C57BL/6 Weibchen verpaart. Nach 10-facher Wiederholung dieser Prozedur wurden IFNARcond positive Nachkommen untereinander verpaart, so daß nun homozygote IFNARcond/cond Tiere erhalten werden konnten.positive ES cells were microinjected by standard methods in mouse blastocysts and transferred to surrogate animals. The surrogate mothers bore the embryos and brought offspring after birth. In each litter were yourself several chimeras Animals that are too big Parts of ES cell-derived cells passed. These animals were mated after reaching sexual maturity. From the descendants were germplasm transmittance offspring with the desired Mutation in the α-chain gene of Type I interferon receptor identified. These descendants were a total of 10 times backcrossed to the C57BL76 background. Transgenic IFNARcond males were used for this purpose mated to a C57BL / 6 female. After 3 weeks of pregnancy were Offspring born after another 3 weeks with molecular biology Techniques were analyzed. Male, who carried an IFNARcond allele were kept for another 4 weeks and when reaching sexual maturity again with a C57BL / 6 female mated. After 10-fold repetition of this procedure, IFNARcond positive offspring mated with each other, so now homozygous IFNARcond / cond animals could be obtained.
Ubiquitäre Inaktivierung des Typ I InterferonrezeptorsUbiquitous inactivation the type I interferon receptor
Theoretisch sollte durch die Deletion des Exons 10 des α-Ketten-Gens des Typ I Interferonrezeptors der Leserahmen der α-Kette so verschoben werden, daß nur noch eine verkürzte α-Kette ohne Signaldomäne kodiert wird. Dadurch sollte die Funktion des gesamten Typ I Interferonrezeptors vollständig inaktiviert sein. Zur Überprüfung der vollständigen Inaktivierung des IFNARcond Allels durch Deletion des Exons 10 wurden IFNARcond/cond Tiere mit „Deleter" Mäusen verpaart, die Cre ubiquitär exprimieren. Nachkommen, die eine Deletion des Exons 10 zeigten, wurden untereinander verpaart und Nachkommen mit einer homozygoten Deletion des Exons 10 wurden identifiziert (IFNARΔEx10/ΔEx10). Derartige Tiere wurden wieder untereinander verpaart, so daß größere Mengen von IFNARΔEx10/ΔEx10 Tieren für weitere Untersuchungen produziert wurden.Theoretically should be replaced by the deletion of exon 10 of the α-chain gene of the type I interferon receptor Reading frame of the α-chain be moved so that only still a shortened α-chain without Signal domain coded becomes. This should be the function of the entire type I interferon receptor Completely be inactivated. To check the complete Inactivation of the IFNARcond allele by deletion of exon 10 was IFNARcond / cond Animals mated with "Deleter" mice, the cre ubiquitous express. Progeny showing deletion of exon 10, were mated with each other and offspring with a homozygous Deletion of exon 10 was identified (IFNARΔEx10 / ΔEx10). such Animals were again mated with each other, so that larger quantities of IFNARΔEx10 / ΔEx10 animals for further Investigations were produced.
Tatsächlich zeigten die IFNARΔEx10/ΔEx10 Mäuse die gleiche extrem erhöhte Sensitivität für letale Infektionen mit dem vesikulären stomatitis Virus (VSV) wie konventionelle Typ I Interferonrezeptor defiziente Mäuse (IFNAR-/-): während Wildtyp (WT) Mäuse nach Injektion von bis zu 108 replikationskompetenten VSV-Partikeln eine Infektion kontrollieren konnten, verstarben konventionelle IFNAR-/- Mäuse genauso wie IFNARΔEx10/ΔEx10 Mäuse nach der Injektion von nur 10 replikationskompetenten VSV-Partikeln innerhalb weniger Tage.In fact, the IFNARΔEx10 / ΔEx10 mice showed the same extremely increased sensitivity for lethal infections with the vesicular stomatitis virus (VSV) as conventional type I interferon-receptor deficient mice (IFNAR - / -): during wild-type (WT) mice after injection of up to 10 8 Conventional IFNAR - / - mice as well as IFNARΔEx10 / ΔEx10 mice died after injection of only 10 replication competent VSV particles within a few days.
Gewebsspezifische Inaktivierung des Typ I InterferonrezeptorsTissue specific inactivation the type I interferon receptor
Analog zur Herstellung von IFNARΔEx10/ΔEx10 Mäusen konnten Mäuse mit einer Zelltypspezifischen Deletion des Typ I Interferonrezeptors zum Beispiel nur auf B Zellen gezüchtet werden. Dazu wurden Mäuse, die die Cre Rekombinase nur in B Zellen exprimieren (CD19-Cre) mit IFNARcond/cond Mäusen verpaart. Nachkommen mit einem IFNAR Wildtyp und einem cond Allel (IFNARcond/WT), die ein CD19-Cre Allel trugen, wurden wiederum mit IFNARcond/cond Tieren verpaart. Nachkommen, die ein CD 19-Cre Allel und 2 IFNARcon Allele trugen (CD19-Cre+IFNARcond/cond), zeigten eine B Zell-spezifische Deletion des Typ I Interferonrezeptors. Als Kontrollen wurden in Experimenten CD19-Cre+IFNARWT/WT Tiere eingesetzt, bei denen Cre wegen Abwesenheit von 1oxP Erkennungssequenzen keine genetischen Veränderungen bedingten.Analogous for the production of IFNARΔEx10 / ΔEx10 mice Mice with a cell type-specific deletion of the type I interferon receptor For example, only be bred on B cells. These were mice that express the Cre recombinase only in B cells (CD19-Cre) with IFNARcond / cond mice mated. Offspring with an IFNAR wild type and a cond allele (IFNARcond / WT), who carried a CD19-Cre allele, were again with IFNARcond / cond animals mated. Offspring having a CD 19-cre allele and 2 IFNARcon alleles (CD19-Cre + IFNARcond / cond) a B cell-specific deletion of the type I interferon receptor. As controls, CD19-Cre + IFNARWT / WT animals were used in experiments in experiments which are not genetically encoded due to the absence of 1oxP recognition sequences changes related.
Anwendungsbeispiele für IFNARcond MäuseApplication examples for IFNARcond mice
Die IFNARcond Mäuse wurden mit Cre-Mäusen, die Cre spezifisch in T Zellen (CD4-Cre), spezifisch in B Zellen (CD 19-Cre), spezifisch in myeloiden Zellen (LysM-Cre) oder spezifisch in Neuronen des zentralen Nervensystems (Nestin-Cre) exprimieren, verpaart. Nachkommen mit einer B Zell- oder T Zell-spezifischen Typ I Interferonrezeptor-Deletion und Mäuse mit einer Deletion des Typ I Interferonrezeptors nur auf Neuroen des zentralen Nervensystems wurden erzeugt.The IFNARcond mice were with cre mice, the Cre specific in T cells (CD4-Cre), specifically in B cells (CD19-Cre), specifically in myeloid cells (LysM-Cre) or specific in neurons of the central nervous system (Nestin-Cre), mated. Offspring with a B cell or T cell-specific type I interferon receptor deletion and mice with a deletion of the Type I interferon receptor only on neurons of the central nervous system were generated.
Analyse der direkten Rolle des Typ I Interferons auf LymphozytenAnalysis of the direct role of type I interferon on lymphocytes
Verschiedene Befunde legten nahe, daß die stimulatorische Funktion von Typ I Interferon eine zentrale Rolle bei der Induktion von Immunantworten gegen Proteinantigene in Typ I Interferon als Adjuvanz spielt. So ist gefunden worden, daß bei der Immunisierung mit dem in der Immunologie oft benutzten Antigen „Hühner Immunglobulin der Subklasse G (CGG)" in Typ I Interferon in Abwesenheit eines funktionellen Typ I Interferonsystems nur sehr schwache oder keine Antikörperantworten induziert wurden, während in normalen Mäusen mit CGG in Typ I Interferon sehr gute Antikörperantworten induziert wurden. Nach Immunisierung von Mäusen mit einer B Zell-spezifischen Typ I Interferonrezeptor-Deletion wurde eine stark verminderte Immunglobulinantworten gefunden. Im Gegensatz dazu zeigten CD19-Cre+IFNARcond/cond Mäuse weitgehend normale Antikörperantworten gegen Viren wie VSV. Somit wurde gezeigt, daß die direkte Wirkung des Typ I Interferons auf die B Zellen bei der Immunisierung gegen Proteinantigene mit Typ I Interferon eine zentrale Rolle spielt, während bei „normalen" Infektionen Typ I Interferon eine weniger bedeutende Rolle auf der Ebene der B Zellen spielt.Various Findings suggested that the Stimulatory function of type I interferon plays a central role in the induction of immune responses against protein antigens in type I plays interferon as an adjuvant. Thus it has been found that in the Immunization with the antigen often used in immunology "chick immunoglobulin subclass G (CGG) "in Type I interferon in the absence of a functional type I interferon system only very weak or no antibody responses were induced, while in normal mice with CGG in type I interferon very good antibody responses were induced. After immunization of mice with was a B cell-specific type I interferon receptor deletion found a greatly diminished immunoglobulin response. In contrast CD19-Cre + IFNARcond / cond mice showed largely normal antibody responses against viruses like VSV. Thus it was shown that the direct effect of the type I interferons on the B cells in the immunization against protein antigens with type I interferon plays a central role, while with "normal" infections type I interferon plays a less significant role at the level of B cells.
Wenige Stunden nach einer Virusinfektion nimmt die Anzahl von B und T Lymphozyten im Blut drastisch ab. Dieses Phenomen wird auch als Lymphopenie bezeichnet. Untersuchungen mit CD19-Cre+IFNARcond/cond Mäusen CD4-Cre+IFNARcond/cond Mäusen haben gezeigt, daß das im Rahmen einer Virusinfektion gebildete Typ I Interferon in der sehr frühen Infektionsphase direkt auf Lymphozyten wirkt, und so die Lymphopenie bedingt. Das Mausmodell der vorliegenden Erfindung erlaubt nunmehr die Untersuchung der genauen molekularen Mechanismen der Lymphopenie.Few Hours after a viral infection decreases the number of B and T lymphocytes drastically in the blood. This phenomenon is also called lymphopenia designated. Studies with CD19-Cre + IFNARcond / cond mice CD4-Cre + IFNARcond / cond mice have shown that in the context of a viral infection formed type I interferon in the very early Infection phase acts directly on lymphocytes, and so the lymphopenia conditionally. The mouse model of the present invention now allows the study of the exact molecular mechanisms of lymphopenia.
Analyse der Rolle des Typ I Interferons im Rahmen der multiplen SkleroseAnalysis of the role of Type I interferons in the context of multiple sclerosis
IFNARcond Mäuse wurden zum Studium der experimentellen autoimmun Enzephaloymyelitis (EAE) eingesetzt. Bei der EAE handelt es sich um eine induzierbare Autoimmunerkrankung, die allgemein als Mausmodell für die Multiple Sklerose beim Menschen anerkannt ist. Interessanterweise zeigen konventionelle IFNAR-/- Tiere einen verstärkten Verlauf der EAE. Mit Mäusen, bei denen der Typ I Interferonrezeptor nur auf Neuronen des zentralen Nervensystems deletiert ist (Nes-Cre+IFNARcond/cond), konnte gezeigt werden, daß das bei der EAE gebildete Typ I Interferon nicht direkt auf Neuronen wirkt.IFNARcond Mice were used for the study of experimental autoimmune encephaloymyelitis (EAE). EAE is an inducible autoimmune disease, commonly referred to as a mouse model for Multiple sclerosis is recognized in humans. Interestingly, Conventional IFNAR - / - animals show an increased course of EAE. With mice, in which the type I interferon receptor only on neurons of the central Nerve system is deleted (Nes-Cre + IFNARcond / cond), could be shown be that in EAE, type I interferon is not directly on neurons acts.
Analyse der Bedeutung von Typ I Interferon bei der Virusinfektion des zentralen NervensystemsAnalysis of meaning of type I interferon in viral infection of the central nervous system
Bisher ist angenommen worden, daß nur wenn es dem Immunsystem nicht gelingt, eine Virusinfektionen im Körper erfolgreich zu bekämpfen, eine Infektion des zentralen Nervensystems möglich ist. Um diese Theorie zu überprüfen wurden Nes-Cre+IFNARcond/cond Mäuse mit einer Deletion des Typ I Interferonrezeptors nur auf Neuronen des zentralen Nervensystems mit VSV infiziert. Dabei wurde gefunden, daß Nes-Cre+IFNARcond/cond Mäuse nicht dazu in der Lage sind eine VSV Infektion unter Kontrolle zu bringen. Während WT Mäuse nach intranasaler Infektionen mit 1000 replikationskompetenten VSV-Partikeln Infektionen ohne Zeichen einer Erkrankung überstehen, sterben konventionelle IFNAR-/- Mäuse nach einer gleichen Behandlung innerhalb weniger Tage. Dagegen zeigten die Nes-Cre+IFNARcond/cond Mäuse zunächst keine Anzeichen einer Erkrankung. Nach ca. 6 Tagen traten jedoch untypische Augeninfektionen auf, am 7 Tag wurde oft Nasenbluten beobachtet, und um den B. Tag nach der Infektion verstarben die Tiere. Die Ergebnisse legen nahe, daß auch bei harmlosen Infektionen das Interferonsystem eine wichtige Rolle dabei spielt, Infektionen aus dem zentralen Nevensystem fern zu halten.So far has been assumed that only if the immune system fails to manage a viral infection in the body fight successfully, an infection of the central nervous system is possible. To this theory to be checked Nes-Cre + IFNARcond / cond Mice with a deletion of the type I interferon receptor only on neurons of the central nervous system infected with VSV. It was found that Nes-Cre + IFNARcond / cond Mice do not are able to control a VSV infection. While WT Mice after intranasal infections with 1000 replication competent VSV particles Withstood infections without signs of disease, the conventional IFNAR - / - mice after a similar treatment within a few days. On the other hand showed the Nes-Cre + IFNARcond / cond mice first no signs of illness. After about 6 days, however, occurred atypical eye infections on, on the 7th day was often nosebleeds observed and around the B. day after the infection died Animals. The results suggest that even with harmless infections the interferon system plays an important role in infection Keep away from the central Nevensystem system.
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| CN114958852A (en) * | 2022-06-09 | 2022-08-30 | 赛业（苏州）生物科技有限公司 | Construction method and application of Ifnar1 gene knockout mouse animal model |
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