DE19963490A1

DE19963490A1 - Genotyping multidrug resistance gene-1, useful for assessing doses of pharmaceuticals, by mass spectrometric analysis of primer extension products

Info

Publication number: DE19963490A1
Application number: DE19963490A
Authority: DE
Inventors: Markus Kostrzewa; Sven Hoffmeyer; Ulrich Brinkmann
Original assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Current assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2001-07-05

Abstract

Method for genotyping the MDR-1 (multidrug resistance-1) gene by mass spectrometric detection of the mutational status at some or all of 16 point mutations (single nucleotide polymorphism; SNPs). The sequences around all these mutations (coding and non-coding strands) are reproduced as sequences (1)-(32). Independent claims are also included for the following: (a) chemical package used to process samples for the new method comprising at least the primer for selective amplification of a DNA segment surrounding an SNP, reagents for primer extension and a mixture of terminating and non-terminating nucleotide triphosphates (NTPs); (b) point mutations defined by sequences (1)-(32); and (c) oligonucleotides, sequences (33)-(64), given in the specification, as attachment sites for primers in a mutation-dependent primer extension process for analysis of SNP.

Description

Die Erfindung betrifft die Genotypisierung des "Multidrug Resistance Gene" MDR-1. Das durch dieses Gen exprimierte Eiweiß P-Glykoprotein PGP steuert den Durchtritt von Substanzen, unter anderem Arzneimitteln, durch die Zellmembran; Veränderungen der Expression oder Funktion können beispielsweise andere Dosierungen bedingen.The invention relates to the genotyping of the "multidrug resistance gene" MDR-1. The protein P-glycoprotein PGP expressed by this gene controls the passage of Substances, including drugs, through the cell membrane; Changes in Expression or function may, for example, require other dosages.

Die Erfindung besteht darin, das Gen MDR-1 durch eine massenspektrometrische Bestimmung der Mutationszustände von SNPs (Single Nucleotide Polimorphisms), die für diesen Zweck gezielt gesucht wurden, im Probenmaterial zu genotypisieren.The invention consists of the gene MDR-1 by mass spectrometric Determination of the mutation states of SNPs (Single Nucleotide Polimorphisms) for this purpose was specifically sought to genotype in the sample material.

State of the art

Das Multidrug Resistance Gene MDR-1 besteht aus 28 Exons. Es codiert ein Eiweiß namens P-Glycoprotein (PGP), das nach Glykosilierung als Bestandteil der Zellmembran an der Steuerung des Durchtritts von Substanzen durch die Zellmembran beteiligt ist. Für viele Substanzen, so auch für Arzneimittel, besteht eine Barriere für den Durchtritt durch die Zellmembran, deren Höhe zumindest durch das Eiweißprodukt PGP des Gens MDR-1 mitbestimmt wird. So wirkt die Stärke der Expression dieses Eiweißes wie auch eine Variabilität der Funktion dieses Eiweißes direkt auf die Bioverfügbarkeit von betroffenen Arzneimitteln.The Multidrug Resistance Gene MDR-1 consists of 28 exons. It encodes a protein called P-glycoprotein (PGP), which after glycosylation is part of the cell membrane on the Control of the passage of substances through the cell membrane is involved. For many Substances, including medicines, are a barrier to passage through the Cell membrane, the height of which is at least due to the protein product PGP of the gene MDR-1 is co-determined. So the level of expression of this protein works like one Variability of the function of this protein directly affects the bioavailability of the affected Medicines.

MDR-1 wirkt als Substanzbarriere sowohl für oral eingenommene Arzneimittel im Darmtrakt, wie auch an der Bluthirnschranke. In Tumoren ist das Gen MDR-1 hoch exprimiert, wodurch die Tumorzellen widerstandsfähig gegen den Angriff vieler Arzneimittel werden. Es ist sicher zu vermuten, dass die Expressionsrate und Funktionalität von MDR-1 von Veränderungen sowohl im Gen, als auch von genetischen Veränderungen in den zugehörigen Regulationseinheiten abhängen. Es ist daher außerordentlich wünschenswert, für weitere Forschungen, aber auch für Medikationen eine schnelle Methode zur Genotypisierung von MDR-1 zu haben.MDR-1 acts as a substance barrier for both oral drugs in the intestinal tract, as well as on the blood brain barrier. In tumors, the MDR-1 gene is highly expressed, causing the tumor cells become resistant to the attack of many drugs. It is save to suspect that the expression rate and functionality of MDR-1 vary both in the gene, and of genetic changes in the associated Depend on regulatory units. It is therefore extremely desirable for others Research, but also a quick method for genotyping medications To have MDR-1.

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), hier häufig auch "Punktmutationen" genannt, gewinnen in jüngster Zeit stark an Bedeutung für die Genotypisierung, für die Individualerkennung, aber auch für die klinische Diagnostik, weil sie sich im Gegensatz zu den bisher dafür verwendeten Mikrosatelliten variierender Länge oder STRs (Short Tandem Repeats) in viel höherer Dichte im Genom befinden und auch in den codierenden Regionen der Gene selbst vorhanden sind. Mikrosatelliten machen zwar etwa 1% des menschlichen Genoms aus, sie kommen aber ganz überwiegend nur in nichtcodierenden Sequenzbereichen vor, dagegen gibt es geschätzt etwa 3 Millionen SNPs, auch und zum Teil besonders in den codierenden Bereichen der Gene. Sie sind im Wesentlichen für die Unterschiede zwischen den Individuen verantwortlich.SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), often called "point mutations", have recently become increasingly important for genotyping, for which Individual recognition, but also for clinical diagnostics, because they are in contrast to the microsatellites of varying length or STRs (short tandem Repeats) are located in much higher density in the genome and also in the coding regions of the genes themselves are present. Microsatellites make up about 1% of human Genome, but most of them come only in non-coding sequence areas In contrast, there are an estimated 3 million SNPs, also and in some cases particularly in the coding areas of the genes. They are essentially for the differences between the two Individuals responsible.

Für die Analyse der DNA auf bekannte Punktmutationen hin wurde bislang hauptsächlich die Sequenzierung in 2D-Gelen eingesetzt, ein Verfahren, das kostenintensiv und zeitaufwendig ist. Inzwischen wurden aber alternative Techniken entwickelt. So können für die simultane Identifizierung vieler bekannter Mutationen entsprechende DNA-Sequenzen durch Oberflächenfixierung auf einem DNA-Chip zusammengefaßt werden. Die Hybridisierung der DNA-Chips mit entsprechendem Genmaterial ermöglicht dann die simultane Identifizierung einer Vielzahl verschiedener Punktmutationen. So sind Chips mit 64 000 fixierten Sequenzen bekannt geworden. Diese DNA-Chiptechnologie hat jedoch einige wesentliche Nachteile, allen voran die, daß die Analysensicherheit nicht sehr hoch und die Herstellung der DNA- Chips recht kostspielig ist. Der Einsatz in der klinischen Diagnostik, die sehr hohe Anforderungen an die Richtigkeit der Ergebnisse stellt, ist daher als problematisch anzusehen. Für die schnelle und validierbar zuverlässige Analyse von SNPs hat sich die Massenspektrometrie bewährt. Dazu eignen sich verschiedene Verfahren, die in der Regel auf einer Amplifikation ausgewählter DNA-Segmente durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaktion) aufsetzen. Alle massenspektrometrischen Verfahren für die Analyse von DNA bedürfen aber einer sehr guten Aufreinigung des zu messenden Produkts, da die DNA sonst einer Adduktbildung unterliegt, die die Bestimmung der Masse stört. Es gibt dabei verschiedene Grundverfahren für die massenspektrometrische Messung der SNPs.So far, mainly has been used for the analysis of DNA for known point mutations Sequencing used in 2D gels, a process that is costly and time consuming is. However, alternative techniques have now been developed. So for simultaneous Identification of many known mutations by corresponding DNA sequences Surface fixation can be summarized on a DNA chip. The hybridization of the DNA chips with the appropriate genetic material then enable simultaneous identification a variety of different point mutations. So are chips with 64,000 fixed sequences known. However, this DNA chip technology has some major drawbacks above all that analytical security is not very high and the production of DNA Chips is quite expensive. The use in clinical diagnostics, the very high Requirements for the correctness of the results are therefore problematic. For the fast and validatable reliable analysis of SNPs the Mass spectrometry proven. There are various procedures that are usually used an amplification of selected DNA segments by the polymerase chain reaction (PCR, polymerase chain reaction). All mass spectrometric methods for the Analysis of DNA, however, requires very good purification of the product to be measured, otherwise the DNA is subject to adduct formation, which interferes with the determination of the mass. There are various basic methods for mass spectrometric measurement of the SNPs.

Einerseits kann man die Masse von amplifizierten DNA-Segmenten direkt messen, wobei sich aber aus verschiedenen Gründen (unter anderem die erwähnte Adduktbildung) größere Schwierigkeiten ergeben. Die amplifizierten DNA-Segmente sind etwa 40 bis 50 Basen lang, wiegen also etwa 12000 bis 15000 atomare Masseneinheiten, die Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutation betragen aber nur 9 bis 40 atomare Masseneinheiten. Durch unterschiedliche Massenbewehrungen der DNA-Basen lassen sich die Verhältnisse etwas verbessern.On the one hand, the mass of amplified DNA segments can be measured directly but for various reasons (including the mentioned adduct formation) larger ones Difficulties arise. The amplified DNA segments are about 40 to 50 bases long, So weigh about 12,000 to 15,000 atomic mass units, the differences between Wild type and mutation are only 9 to 40 atomic mass units. By different mass reinforcements of the DNA bases let the conditions somewhat improve.

Andererseits kann man das Verfahren der mutationsabhängig beendeten (terminierten) Primerverlängerung anwenden. Ein Primer wird dabei durch Polymerase in einer Kopierreaktion verlängert, wobei mindestens ein Desoxiribo-Nukleosidtriphosphat (dNTP) in Form eines Terminators, beispielsweise Didesoxiribo-Nukleosidtriphosphat (ddNTP), eingesetzt wird, und zwar so, dass die Verlängerung des Primers je nach Mutationsart an der Mutationsstelle oder jenseits der Mutationsstelle endet. Die Masse des verlängerten Primers ist daher von der Art der Mutation abhängig und erlaubt mit hoher Präzision und Einfachheit die Bestimmung einer zweialleligen Mutation.On the other hand, the process of mutation-dependent terminated Apply primer extension. A primer is made by polymerase in one Copy reaction prolonged, with at least one deoxiribo-nucleoside triphosphate (dNTP) in Form of a terminator, for example dideoxiribo-nucleoside triphosphate (ddNTP), is used, in such a way that the extension of the primer depending on the type of mutation on the Mutation site or beyond the mutation site ends. The mass of the extended primer is therefore dependent on the type of mutation and allows with high precision and simplicity the determination of a mutually parallel mutation.

Für dieses Verfahren gibt es verschiedene Ausführungsformen. Ein unter dem Namen "PROBE" bekanntgewordenes Verfahren (WO 97/37 041 A3, oder "Detection of RET proto oncogene codon 634 mutations using mass spectrometry", D.P. Little, A. Braun, B. Darnhofer-Demar, A. Frilling, Y. Li, R. T. McIver und H. Köster, J. Mol. Med. 75, 745-750, 1997) verwendet Primer, die reversibel durch Biotin-Streptavidin-Bindung an magnetische Partikel angebunden sind und sich daher gut waschen lassen lassen. Ein anderes Verfahren wandelt die DNA-Segmente durch Neutralisierung und Anbinden einer positiven Ladung in adduktfeindliche, hochempfindlich nachzuweisende DNA-Analoge um (WO 96/27 681). Ein weiteres Verfahren benutzt magnetische Partikel mit reversibler Adsorptivbindung nur zum Waschen der DNA-Produkte. Diese drei hier genannten Verfahren der mutationsabhängigen Primerverlängerung haben den Vorteil, dass zwischen Wildtyp und Mutation die Anzahl der Basen des verlängerten Primers variiert, der Massenunterschied also mindestens 300 atomare Masseneinheiten beträgt, meist sogar ein mehrfaches davon. Ein weiteres Verfahren (WO 98/14 616 A1) bedient sich einer Verlängerung um jeweils nur eine einzige Base durch die Verwendung von vier Terminatoren; hier muss der Unterschied von 9 bis 40 atomaren Masseneinheiten gemessen werden. There are various embodiments for this method. One under the name "PROBE" known method (WO 97/37 041 A3, or "Detection of RET proto oncogene codon 634 mutations using mass spectrometry ", D.P. Little, A. Braun, B. Darnhofer-Demar, A. Frilling, Y. Li, R. T. McIver and H. Köster, J. Mol. Med. 75, 745-750, 1997) used primers that are reversible through biotin streptavidin binding to magnetic Particles are attached and can therefore be washed well. Another process converts the DNA segments into by neutralizing and binding a positive charge anti-adduct, highly sensitive DNA analogues around (WO 96/27 681). On Another method uses magnetic particles with reversible adsorptive binding only for Wash the DNA products. These three mutation-dependent methods mentioned here Primer extensions have the advantage that between the wild type and mutation the number of Bases of the extended primer varies, i.e. the mass difference is at least 300 atomic Units of mass, usually even a multiple thereof. Another procedure (WO 98/14 616 A1) uses an extension by only one base at a time Use of four terminators; here the difference must be from 9 to 40 atomic Mass units can be measured.

Templat des Wildtyps Wild-type template

Kettenverlängerung mit dATP, dTTP, ddCTP und ddGTP ergibt:
Chain extension with dATP, dTTP, ddCTP and ddGTP results in:

Templat der Mutante Template of the mutant

Tabelle 1 zeigt ein Prinzipbeispiel der mutationsspezifisch beendeten Primerverlängerung, einmal am Wildtyp (oben) und einmal an der Mutante (unten). Der Primer wurde im Falle des Wildtyps um insgesamt sechs Basen, im Falle der Mutante um insgesamt neun Basen verlängert. Die Produkte der Primenverlängerungen haben jeweils sehr verschiedene Molekulargewichte und sind daher massenspektrometrisch voneinander gut zu unterscheiden.Table 1 shows a basic example of the mutation-specific completed primer extension, once on the wild type (above) and once on the mutant (below). In the case of the Wild types by a total of six bases, in the case of the mutant by a total of nine bases extended. The products of the primer extensions each have very different ones Molecular weights and are therefore easily distinguishable from each other by mass spectrometry.

Die Probenvorbereitung einschließlich des Waschens ist heute relativ gut beherrschbar und kann von Automaten mit Pipettierrobotern ausgeführt werden. Der Primer (eine DNA-Kette, die als Erkennungssequenz fungiert) wird dabei so synthetisiert, daß er sich in unmittelbarer Nähe einer bekannten Mutation an einen durch PCR vervielfältigten Templatstrang anlagen ("hybridisiert"). Zwischen der Position dieser Mutation und dem 3'-Ende des Primers (an diesem Ende wird der Primer verlängert) darf die Sequenz des Templatstrangs aus maximal drei der vier Nucleobasen zusammengesetzt sein. An der Mutationsposition tritt eine weitere Base zum ersten Mal auf. Mit einer Polymerase und einem besonderen Satz von desoxy- Nucleotidtriphosphaten (die maximal drei komplementären, die bis zur Mutationsposition auftreten) und einem Didesoxy-Nucleotidtriphosphat (mit der Base, die komplementär zu der potentiellen Mutation ist) wird der Primer verlängert. Das Didesoxy-Nucleotidtriphosphat beendet ("terminiert") die Kettenverlängerung. Je nach An- oder Abwesenheit der Mutation wird die Polymerasereaktion auf der Mutationsposition terminiert oder sie terminiert erst bei der nächsten entsprechenden Base jenseits der potentiellen Mutationsstelle. Sample preparation, including washing, is relatively manageable today can be carried out by machines with pipetting robots. The primer (a DNA chain, which acts as a recognition sequence) is synthesized so that it is immediately Attach a proximity to a known mutation to a template amplified by PCR ("hybridized"). Between the position of this mutation and the 3 'end of the primer (at the primer is extended at this end) the sequence of the template strand may be maximal three of the four nucleobases are composed. Another occurs at the mutation position Base on for the first time. With a polymerase and a special set of deoxy- Nucleotide triphosphates (the maximum of three complementary ones up to the mutation position occur) and a dideoxy nucleotide triphosphate (with the base complementary to that potential mutation) the primer is extended. The dideoxy nucleotide triphosphate ends ("terminates") the chain extension. Depending on the presence or absence of the mutation the polymerase reaction is terminated at the mutation position or it only terminates at the next corresponding base beyond the potential mutation site.

Die so mutationsabhängig verlängerten Primer können sowohl von Elektrosprüh-Ionenquellen (ESI) wie auch besonders durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) ionisiert werden, so dass sie der massenspektrometrischen Analyse zugänglich werden. Die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption wird durch Pulslaser erzeugt, die kurzzeitig produzierten Ionen eignen sich besonders für die Analyse in Flugzeitmassenspektrometern. Massenspektrometrie mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) ist eine sehr leistungsfähige Art der Analyse von Biomolekülen. Die Ionen können massenspek trometrisch, beispielsweise in Flugzeitmassenspektrometern, auf ihre Masse hin analysiert werden. Da die Fluggeschwindigkeit der Ionen im Massenspektrometer etwa 10⁷ mal schneller ist als die Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle im Gel der Elektrophorese, ist das massenspektrometrische Verfahren außerordentlich viel schneller als das elektrophoretische Verfahren, selbst wenn die Spektrenmessung 10- bis 100-mal wiederholt wird, um zu guten Signal-zu-Rausch-Verhältnissen zu kommen.The primers, which are extended depending on the mutation, can be ionized both by electrospray ion sources (ESI) and, in particular, by matrix-assisted laser desorption (MALDI), so that they are accessible for mass spectrometric analysis. The ionization by matrix-assisted laser desorption is generated by pulse lasers, the ions that are produced for a short time are particularly suitable for analysis in time-of-flight mass spectrometers. Mass spectrometry with ionization through matrix-assisted laser desorption (MALDI) is a very powerful way of analyzing biomolecules. The masses of the ions can be analyzed by mass spectrometry, for example in time-of-flight mass spectrometers. Since the flight speed of the ions in the mass spectrometer is about 10 ⁷ times faster than the migration speed of the molecules in the gel of electrophoresis, the mass spectrometric method is extremely much faster than the electrophoretic method, even if the spectral measurement is repeated 10 to 100 times to increase good signal-to-noise ratios.

Das gesamte MALDI-Präparations- und Meßverfahren besteht darin, daß zunächst die Analytmoleküle auf einem festen Probenträger in eine UV-absorbierende Matrix, meist eine organische Säure, eingebettet werden. Der Probenträger wird in die Ionenquelle eines Massenspektrometers eingeführt. Durch einen kurzen Laserpuls von etwa 3 Nanosekunden Länge wird die Matrix ins Vakuum verdampft; das Analytmolekül wird dabei unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit gleichzeitig entstehenden Matrixionen wird die Ionisation des Analytmoleküls erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen in der Ionenquelle auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere. Die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet.The entire MALDI preparation and measurement procedure consists in the fact that the Analyte molecules on a solid sample holder in a UV-absorbing matrix, usually one organic acid to be embedded. The sample carrier is placed in the ion source Mass spectrometer introduced. With a short laser pulse of about 3 nanoseconds Length the matrix is evaporated in vacuum; the analyte molecule is unfragmented transported into the gas phase. By collisions with matrix ions that arise at the same time Ionization of the analyte molecule reached. An applied voltage accelerates the ions in a field-free flight tube. Due to their different masses, the ions in the Ion source accelerated to different speeds. Reach smaller ions the detector earlier than larger ones. The flight time is converted into the mass of the ions.

Die massenspektrometrischen Nachweisverfahren für Mutationen sind in sich bereits sehr viel sicherer als die Verfahren der Gelelektrophorese oder Hybridisierung. Aber auch bei ihnen kann es - in sehr seltenen Fällen zwar - zu Fehlentscheidungen über das Vorhandensein einer Mutation kommen. Verschmutzungen, zufällige Rauschpeaks und andere Artefakte wie ein "Stolperverhalten" der Polymerase bei der Verlängerung des Primers, das zu einem unkontrollierten Abbruch der Verlängerung führt, können das Vorhandensein einer Mutation vortäuschen. The mass spectrometric detection methods for mutations are already very much in themselves safer than the methods of gel electrophoresis or hybridization. But also with them - in very rare cases - it can lead to wrong decisions about the existence of a Mutation coming. Contamination, random noise peaks and other artifacts such as a "Stumbling behavior" of the polymerase when extending the primer, which leads to a Uncontrolled termination of the extension leads to the presence of a mutation to pretend.

Object of the invention

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Genotypisierung des Gens MDR-1 schnell und validierbar mit geringen Kosten durchführen zu können, wobei ein hoher Durchsatz an Proben und eine eher geringe Anzahl an genotypischen Merkmalen zu erwarten sind.It is the object of the invention to rapidly and genotyped the MDR-1 gene to be validatable at low cost, with a high throughput of samples and a rather small number of genotypic traits are to be expected.

Brief description of the invention

Für die Genotypisierung des Gens MDR-1 wurden durch gezielte Suche bisher 16 Punktmutationen (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) gefunden, die in der Bevölkerung, abweichend vom so genannten Wildtyp, in höherer Anzahl vorkommen und von denen sicher zu vermuten ist, dass sie zum Teil die Expressionsstärke, zum Teil die Funktionalität des P-Glykoproteins PGP beeinflussen. Die SNPs befinden sich sowohl in den Exons wie auch in den Randgebieten der Introns, die zwar nicht zum codierenden Teil des Gens gehören, aber an der Steuerung der Expression oder am Splicing (der Befreiung der Messenger-RNA von nicht codierenden Bestandteilen) beteiligt sein können. Für einen der SNPs konnte bereits eine starke Korrelation sowohl zur PGP-Expression, als auch zur PGP- Aktivität nachgewiesen werden.For the genotyping of the MDR-1 gene, 16 have so far been searched by means of a targeted search Point mutations (single nucleotide polymorphisms, SNPs) found in the Population, deviating from the so-called wild type, occur in higher numbers and from who can be surmised that they partly express the strength of expression, partly the Affect functionality of the P-glycoprotein PGP. The SNPs are both in the Exons as well as in the peripheral areas of the introns, which are not part of the coding part Gens belong, but at the expression control or at the splicing (the liberation of the Messenger RNA from non-coding components) can be involved. For one of the SNPs could already show a strong correlation both to PGP expression and to PGP Activity can be demonstrated.

Die Erfindung besteht darin, einige oder alle dieser SNPs, die als Sequenzen unter den Identifikationsnummern 1 bis 32 beschrieben werden und in Tabelle 2 aufgelistet sond, für die Genotypisierung dieses Gens MDR-1 heranzuziehen und die Mutationszustände dieser SNPs dabei massenspektrometrisch nachzuweisen. Für eine volle Genotypisierung können dabei durchaus weitere Merkmale, auch bisher noch nicht gefundene SNPs, benutzt werden.The invention consists of some or all of these SNPs, which are sequences among the Identification numbers 1 to 32 are described and listed in Table 2 for which Genotyping of this MDR-1 gene and using the mutation states of these SNPs to be proven by mass spectrometry. For full genotyping, you can other features, including SNPs not yet found, can be used.

Für die Messung der Mutationszustände dieser SNPs kann bevorzugt die mutationsabhängig beendete Primerverlängerung eingesetzt werden. Wiederum bevorzugt kann eine Ionisierung durch MALDI erfolgen, die Ionen können dann wiederum bevorzugt in einem Flugzeitmassenspektrometer auf ihre präzise Masse hin vermessen werden. Dieses Verfahren lässt heute einen Messtakt von etwa vier Sekunden zu, das heißt, alle vier Sekunden kann eine neue Probe vermessen werden. Damit beschränkt sich die Messung aller 16 SNPs auf etwa eine Minute, eine Halbierung dieser Zeit ist für die nahe Zukunft zu erwarten.For the measurement of the mutation states of these SNPs, the mutation-dependent can preferably be used completed primer extension can be used. Again, ionization may be preferred by MALDI, the ions can then preferably be in one Time-of-flight mass spectrometers are measured for their precise mass. This method allows a measuring cycle of about four seconds today, which means that every four seconds one can new sample can be measured. The measurement of all 16 SNPs is thus limited to approximately a minute, a halving of this time is expected in the near future.

Für die Probenvorbereitung und Messung kann des weiteren eine so genannte Multiplexierung vorgenommen werden. Dabei werden bereits in der PCR-Amplifikation die DNA-Segmente für mehrere SNPs gleichzeitig vervielfacht. Auch die Primerverlängerung und die massenspektrometrische Messung werden multiplexiert. Bei einer vierfachen Multiplexierung sind dann nur noch vier Proben zu messen, die gesamte Messzeit für die Genotypisierung reduziert sich dann heute auf etwa 16 Sekunden. Damit wird die Inanspruchnahme des teueren Massenspektrometers, aber auch die der Probenvorbereitungsautomaten verkürzt, das gesamte Verfahren wird dabei außerordentlich verbilligt. Auch der Einsatz der teueren Enzyme, insbesondere der Polymerase, wird verbilligt.So-called multiplexing can also be used for sample preparation and measurement be made. The DNA segments are already in the PCR amplification multiplied for several SNPs at the same time. The primer extension and the Mass spectrometric measurements are multiplexed. With a fourfold multiplexing then only four samples have to be measured, the total measuring time for genotyping then reduced to about 16 seconds today. This will make use of the expensive Mass spectrometers, but also that of the sample preparation machines, shortened the whole The process is extremely cheaper. Even the use of expensive enzymes, especially the polymerase is cheaper.

Für eine noch bessere Validierbarkeit des Verfahrens bietet es sich an, die Primer auf Strang und Gegenstrang der DNA gleichzeitig mutationsabhängig terminiert zu verlängern. Damit besitzt jede Probe in sich selbst bereits eine unabhängige Bestätigung. Natürlich kann zur weiteren Qualitätserhöhung der Analyse eine Doppelmessung aller Proben vorgenommen werden.
For an even better validability of the method, it is advisable to extend the primers on the strand and the counter strand of the DNA at the same time, depending on the mutation. This means that each sample already has an independent confirmation in itself. Of course, a double measurement of all samples can be carried out to further increase the quality of the analysis.

Tabelle 2 zeigt die 16 SNPs im Gen MDR-1 mit gemessenen Häufigkeiten. Die als redundant bezeichneten SNPs bewirken wegen der Redundanz des genetischen Codes keine Änderung der Aminosäuresequenz, können aber Einfluss auf die Expressionsstärke haben. Längere Sequenzen dieser SNPs sind für Strang und Gegenstrang als Sequenzen der Identifikationsnummern 1 bis 32 im Anhang nach WIPO Standard ST 25 gegeben.Table 2 shows the 16 SNPs in the MDR-1 gene with measured frequencies. The as redundant designated SNPs do not change due to the redundancy of the genetic code the amino acid sequence, but can influence the expression level. Longer Sequences of these SNPs are for strand and counter strand as sequences of Identification numbers 1 to 32 are given in the appendix according to WIPO Standard ST 25.

Brief description of the pictures

Abb. 1 zeigt Massenspektren der drei Mutationszustände homozygot C/C, homozygot T/T und heterozygot C/T von SNP Ex26/3435 an Hand von Realproben. Die mit Sternchen (*) versehenen Massenpeaks geben Reste unverlängerter Primer wieder, die als Massenreferenz benutzt werden können. Die mutative Veränderung dieses Gens führt nicht zu einem veränderten Eiweiß PGP, wohl aber zu einer veränderten Expressionsrate. Fig. 1 shows mass spectra of the three mutation states homozygous C / C, homozygous T / T and heterozygous C / T of SNP Ex26 / 3435 on the basis of real samples. The mass peaks marked with an asterisk (*) represent residues of unextended primers that can be used as a mass reference. The mutative change in this gene does not lead to an altered protein PGP, but does, however, to an altered expression rate.

Abb. 2 zeigt die Spektren dreier Proben aus einer Duplexanalvse der beiden SNPs ex2/-1 und ex2/61, die verschiedene Mutationszustände beider SNPs widerspiegeln. SNP ex2/61 verändert das durch das Gen MDR-1 exprimierte Eiweiß PGP. Fig. 2 shows the spectra of three samples from a duplex analysis of the two SNPs ex2 / -1 and ex2 / 61, which reflect different mutation states of both SNPs. SNP ex2 / 61 changes the PGP protein expressed by the MDR-1 gene.

Particularly favorable embodiments

Wie oben bereits angeführt, konnten durch unsere Arbeitsgruppe für die Genotypisierung des Gens MDR-1 durch gezielte Suche bisher 16 Punktmutationen (Single Nucleotide Polymorph isms, SNPs) gefunden werden. Diese sind in Tabelle 2 wie auch, als längere Sequenzstücke, im Anhang nach WIPO Standard ST 25 mit Identifikationsnummern 1 bis 32 wiedergegeben. Sie kommen alle in der Bevölkerung, abweichend vom so genannten Wildtyp, durchaus häufig vor. Die Prozentzahlen sind in Tabelle 2 angegeben. Es ist zu vermuten, dass von jedem von ihnen zum Teil die Expressionsstärke, zum Teil die Funktionalität des Glykoproteins beeinflusst wird.As already mentioned above, our working group for genotyping the The MDR-1 gene has so far been searched for 16 point mutations (single nucleotide polymorph isms, SNPs) can be found. These are in Table 2 as well, as longer sequence pieces, reproduced in the Appendix according to WIPO Standard ST 25 with identification numbers 1 to 32. They all come in the population, deviating from the so-called wild type frequently. The percentages are given in Table 2. It can be assumed that from each of them partly the level of expression, partly the functionality of the Glycoproteins is affected.

Sieben der 16 SNPs befinden sich in den Exons. Drei von ihnen verändern die Aminosäuresequenz des Produkts PGP, drei verändern wegen der Redundanz des genetischen Codes die Aminosäuresequenz nicht, können aber auf die Expressionsstärke einwirken. Für eine dieser so genannten Wobble-SNPs konnten wir bereits einen starken Einfluss auf die Expression und auf die Aufnahme einer Modellsubstanz durch den Darmtrakt signifikant an wenigen Probanden nachweisen. Ein weiteres nicht direkt codierendes SNP in den Exons geht direkt dem Startcodon (ATG) voraus. Die SNPs in den Randgebieten der Introns gehören zwar nicht zum codierenden Teil des Gens, können aber an der Regulation der Expression oder am Splicing (der Befreiung der Messenger-RNA von nicht codierenden Bestandteilen) beteiligt sein.Seven of the 16 SNPs are in the exons. Three of them change that Amino acid sequence of the PGP product, three change because of the redundancy of the genetic Codes do not indicate the amino acid sequence, but can affect the level of expression. For one of these so-called wobble SNPs we have already had a strong impact on Expression and on the absorption of a model substance through the intestinal tract significantly a few test persons. Another non-coding SNP in the exons goes directly ahead of the start codon (ATG). The SNPs in the peripheral areas of the introns belong not the coding part of the gene, but they can help regulate expression or splicing (the release of messenger RNA from non-coding components) be involved.

Die Erfindung besteht nun darin, einige oder alle dieser SNPs für die Genotypisierung dieses Gens MDR-1 zu benutzen und dabei massenspektrometrisch nachzuweisen. Werden weitere charakterisierende SNPs gefunden, so können die bisher gefundenen SNPs eine Teilmenge für die Genotypisierung bilden.The invention now consists of some or all of these SNPs for genotyping this To use the MDR-1 gene and thereby demonstrate it by mass spectrometry. Will be more characterizing SNPs found, the previously found SNPs can be a subset for form the genotyping.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens benutzt dabei die mutationsabhängig beendete Primerverlängerung, wie sie oben bereits ausführlich beschrieben wurde. Wiederum bevorzugt kann eine Ionisierung durch MALDI erfolgen: die dabei gepulst erzeugten Ionen können dann in einem Flugzeitmassenspektrometer auf ihre präzise Masse hin vermessen werden. Die Anlagerungsstellen für die Primer zur Messung der 16 SNPs in Strang und Gegenstrang sind als Sequenzen der Identifikationsnummern 33 bis 64 im Anhang nach WIPO Standard ST 25 angegeben. Die Massenspektren für Proben mit den drei Mutationszuständen ist in Abb. 1 wiedergegeben, Abb. 2 zeigt eine Duplexanalyse zweier SNPs gleichzeitig.A preferred embodiment of the method uses the mutation-dependent primer extension, as has already been described in detail above. Again, ionization can preferably be carried out by MALDI: the ions generated in a pulsed manner can then be measured for their precise mass in a time-of-flight mass spectrometer. The attachment sites for the primers for measuring the 16 SNPs in strand and counter strand are given as sequences of identification numbers 33 to 64 in the appendix according to WIPO Standard ST 25. The mass spectra for samples with the three mutation states is shown in Fig. 1, Fig. 2 shows a duplex analysis of two SNPs simultaneously.

Die DNA um die SNPs herum wird vor der mutationsabhängig terminierten Primerverlängerung im Allgemeinen durch PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert, um genügend Templates für die Primerverlängerung zu haben. Da das Gen MDR-1 vollständig entschlüsselt und die Sequenz publiziert ist, brauchen hier die Primer für diese Amplifizierung nicht angegeben werden; sie können von jedem Fachmann leicht beschafft werden.The DNA around the SNPs is terminated before the mutation dependent Primer extension generally amplified by PCR (polymerase chain reaction), to have enough templates for the primer extension. Because the MDR-1 completely decrypted and the sequence published, the primers for this need here Amplification not specified; they can be easily obtained by any professional become.

Dieses Verfahren lässt heute einen massenspektrometrischen Messtakt von etwa vier Sekunden zu, das heißt, alle vier Sekunden kann eine neue Probe vermessen werden. Damit beschränkt sich die Messung aller 16 SNPs auf nur eine Minute, eine Halbierung dieser Zeit ist für die nahe Zukunft zu erwarten.This method leaves a mass spectrometric measuring cycle of around four today Seconds, that is, a new sample can be measured every four seconds. In order to the measurement of all 16 SNPs is limited to just one minute, halving this time is expected in the near future.

Für die Probenvorbereitung und Messung kann des weiteren eine so genannte Multiplexierung vorgenommen werden. Dabei werden bereits in der PCR-Amplifikation die DNA-Segmente für mehrere SNPs gleichzeitig vervielfacht. Auch die Primerverlängerung und die massenspektrometrische Messung werden multiplexiert. Bei einer vierfachen Multiplexierung sind dann nur noch vier Proben zu messen, die gesamte Messzeit für die Genotypisierung reduziert sich dann heute auf etwa 16 Sekunden, in Zukunft ist eine Reduzierung auf nur 8 Sekunden zu erwarten. Damit wird die Inanspruchnahme des teueren Massenspektrometers, aber auch die der Probenvorbereitungsautomaten verkürzt, das gesamte Verfahren wird dabei außerordentlich verbilligt. Auch der Einsatz der teueren Enzyme, insbesondere der Polymerase, wird verbilligt. Die Gesamtkosten der Genotypisierung einer Probe können bei Inanspruchnahme aller Kostenverringerungen auf unter eine Deutsche Mark gedrückt werden. Ein Beispiel für eine Duplexierung des Messverfahrens ist bereits in Abb. 2 gegeben, das die Massenspektren aus realen Proben für drei verschiedene Zustandskombinationen der SNPs Ex2/-1 und Ex2/61 wiedergibt. Die Spektren wurden mit einem Flugzeitmassenspektrometer unter MALDI-Ionisierung gewonnen.So-called multiplexing can also be used for sample preparation and measurement. The DNA segments for several SNPs are multiplied simultaneously in the PCR amplification. The primer extension and the mass spectrometric measurement are also multiplexed. With four-fold multiplexing, only four samples are then to be measured, the total measuring time for the genotyping is then reduced to about 16 seconds today, and a reduction to only 8 seconds is expected in the future. This shortens the use of the expensive mass spectrometer, but also that of the automatic sample preparation machine, and the entire process is extremely cheaper. The use of expensive enzymes, especially polymerase, is also cheaper. The total cost of genotyping a sample can be reduced to under one German mark if all cost reductions are used. An example of a duplexing of the measurement method is already given in Fig. 2, which shows the mass spectra from real samples for three different state combinations of the SNPs Ex2 / -1 and Ex2 / 61. The spectra were obtained with a time-of-flight mass spectrometer under MALDI ionization.

Die Massenspektrometrie mit ihrer präzisen Massenmessung ist an sich gut validierbar. Eine Fehlmessung, die auch hier vorkommen kann, wird im Allgemeinen bereits an Besonderheiten des Massenspektrums erkannt. Natürlich kann zur weiteren Qualitätserhöhung der Analyse eine Doppel- oder Dreifachmessung aller Proben vorgenommen werden.The mass spectrometry with its precise mass measurement can be validated in itself. A Incorrect measurement, which can also occur here, is generally already on Peculiarities of the mass spectrum recognized. Of course, you can continue to increase quality double or triple measurement of all samples during the analysis.

Für eine noch bessere Validierbarkeit des Verfahrens bietet es sich an, die Primer auf Strang und Gegenstrang der DNA gleichzeitig mutationsabhängig beendet zu verlängern. Damit besitzt jede Probe in sich selbst bereits eine unabhängige Bestätigung. Dabei werden die beiden Stränge der nach der PCR-Amplifizierung anfallenden DNA-Segmente als Template für je eine mutationsspezifisch beschränkte Primerverlängerung benutzt, und die Molekulargewichte der Produkte beider unabhängiger Primerverlängerungen in einer einzigen massenspektrometrischen Analyse gemessen, so dass die Auswertung der Massenspektren jeweils ein Analysenresultat des einen DNA-Stranges liefert, das durch ein bestätigendes, unabhängig mit einem anderen Verfahren durch den anderen DNA-Strang gewonnenes Analysenresultat aus demselben Spektrum gestützt wird. Die Anlagerungsstellen für die Primer auf Strang und Gegenstrang sind im Anhang nach WIPO Standard ST 25 als Sequenzen 33 bis 64 angegeben. Im Falle von zweialleligen Basenaustauschmutationen (SNPs) ist es dabei grundsätzlich notwendig, zwei Terminatoren für die Basen der beiden allelen Modifikationen einzuführen und die Primer so auszuwählen, daß auf dem Templat zwischen dem hybridisierten Primer und der Mutationsstelle nur die beiden nicht zur Terminierung führenden Basen vorkommen. Es ist dies jedoch keine prinzipielle Einschränkung des Verfahrens der mutationsspezifisch beschränkten Primerverlängerung, nur die Freiheit in der Wahl der Hybridisierungsstelle wird leicht eingeschränkt.For an even better validability of the method, it is advisable to use the primers on a strand and to extend the counter strand of the DNA at the same time, depending on the mutation. In order to Every sample already has an independent confirmation in itself. The two strands of the DNA segments obtained after the PCR amplification as a template used for each a mutation-specific limited primer extension, and the Molecular weights of the products of both independent primer extensions in one Mass spectrometric analysis measured so that the evaluation of the mass spectra each delivers an analysis result of the one DNA strand, which is confirmed by an affirmative independently obtained by the other strand of DNA by another method Analysis result from the same spectrum is supported. The depository for the Primers on strand and counter strand are in the annex according to WIPO Standard ST 25 as Sequences 33 to 64 are given. In the case of bilateral base exchange mutations (SNPs) it is basically necessary to have two terminators for the bases of the two introduce allelic modifications and select the primers so that on the template between the hybridized primer and the mutation site only the two are not Leading bases occur. However, this is not a fundamental one Restriction of the method of mutation-specific limited primer extension, only the freedom in the choice of the hybridization site is slightly restricted.

Es wird hier keine detaillierte Schilderung der verschiedenen Verfahren der mutationsspezifisch beschränkten Primerverlängerung gegeben; diese können den oben angegebenen Zitaten und Patenten entnommen werden. Die Beschreibung beschränkt sich an dieser Stelle auf die grundsätzlichen Schritte dieses Verfahrens, der Fachmann auf diesem Gebiet kann die Grundsätze der Erfindung leicht auf die detaillierten Verfahren anwenden.There is no detailed description of the different procedures of the given mutation-specific limited primer extension; these can do the above quoted quotations and patents. The description is limited to at this point on the basic steps of this process, the expert on this Field can easily apply the principles of the invention to the detailed methods.

Eine Fehlmessung kann darin bestehen, dass die Primerverlängerung durch einen so genannten Stolperabbruch endet, statt durch den Abbruch nach Einbau des Terminators. Eine besonders sichere Variante besteht daher darin, die ddNTPs so zu modifizieren, daß sich ihre Masse von der der normal eingebauten Basenbausteine unterscheidet, so daß zwischen einem Stolperabbruch und einem Terminatorabbruch massenspektrometrisch unterschieden werden kann.An incorrect measurement can consist in the primer being extended by such a method stumbling stop ends instead of the termination after installing the terminator. A A particularly safe variant therefore consists in modifying the ddNTPs in such a way that their Mass differs from that of the normal built base modules, so that between one A trip and a terminator trip can be distinguished by mass spectrometry can.

Weitere Verbesserungen lassen sich durch Modifikationen der dNTPs und ddNTPs erreichen, die zu stabileren Analogen von DNA-Produkten führen, oder die die Ionisierung der Primerverlängerungsprodukte erleichtern. Solche Modifikationen sind im oben zitierten Patent WO96/27681 beschrieben. Es lassen sich auch Verkürzungen der Primerverlängerungsprodukte herbeiführen, wie in DE 198 24 280 beschrieben. Further improvements can be achieved by modifying the dNTPs and ddNTPs, which lead to more stable analogues of DNA products, or which ionize the Lighten primer extension products. Such modifications are cited in the above Patent WO96 / 27681. You can also shorten the Introduce primer extension products as described in DE 198 24 280.

Anhang zu Anmeldung EPI 87/99 Appendix to application EPI 87/99

Sequence Listing (WIPO ST 25) Sequence Listing (WIPO ST 25)

Claims

1. A method for genotyping the gene MDR-1, characterized in that the gene is genotyped at least in part by some or all of the mutation states of the point mutations (SNPs), which are described by the sequences of the identification numbers 1 to 32, and that Mutation states of these point mutations can be measured by mass spectrometry.

2. The method according to claim 1, characterized in that for the mass spectrometric measurement the method of mutation-dependent ended Primer extension is applied.

3. The method according to claim 2, characterized in that as the attachment points of Primer for primer extension parts of the sequences with identification numbers 33 up to 64 can be used.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that a Ionization using matrix-assisted laser desorption (MALDI) and a determination the ion mass is carried out by time-of-flight mass spectrometry.

5. The method according to any one of the preceding claims 2 to 4, characterized characterized by multiple SNPs in a sample at the same time Primer extensions can be demonstrated (multiplexing).

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a increased quality of the genotyping analysis is generated by both Strand like counter strand are subjected to a primer extension.

7. Chemical package for sample preparation for the method according to one of the Claims 2 to 6, characterized, that they have at least the primers for the selective amplification of the DNA pieces around the SNPs around, the primers for the primer extension and the mixtures of the contains terminating and non-terminating nucleoside triphosphates.

8. Chemical package according to claim 7, characterized in that it also Polymerases, buffers, agents for the purification of the PCR and extension products and / or matrix substances for matrix-assisted laser desorption and ionization (MALDI) contains.

9. Chemical package according to one of claims 7 or 8, characterized in that the mixtures of primers and required for multiplex determination of the SNPs Contains nucleoside triphosphates.

10. point mutations for mass spectrometric genotyping of the MDR-1 gene, described by the oligonucleotide sequences of identification numbers 1 to 32.

11. Oligonucleotide sequences of identification numbers 33 to 64 for the attachment of Primers for the method of mutation dependent primer extension for Analysis of the point mutations from claim 10.