DE19956763A1 - Reducing interaction of adenoviral vectors with blood cells, useful for ex vivo gene therapy, by mutating the fiber-encoding gene in vectors or helper constructs, reduces toxicity - Google Patents

Reducing interaction of adenoviral vectors with blood cells, useful for ex vivo gene therapy, by mutating the fiber-encoding gene in vectors or helper constructs, reduces toxicity

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DE19956763A1 DE1999156763 DE19956763A DE19956763A1 DE 19956763 A1 DE19956763 A1 DE 19956763A1 DE 1999156763 DE1999156763 DE 1999156763 DE 19956763 A DE19956763 A DE 19956763A DE 19956763 A1 DE19956763 A1 DE 19956763A1
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Abstract

Reducing the interaction of recombinant adenoviruses (AdV) with cellular components of human blood by incorporating at least one targeted mutation into the base sequence of the fiber gene of AdV-derived vectors of (non-)human origin or into the (non-)viral helper constructs used to prepare such vectors. An Independent claim is also included for production of specific packaging lines that complement the fiber gene (or parts of it) and are used for production of AdV vectors.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reduzieren der Toxizität von rekombinan­ ten Adenoviren in der Gentherapie. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Maßnahmen zur Modifikation rekombinanter Adenoviren für die Gentherapie zur Verfügung mit dem Ziel, die Affinität rekombinanter Adenoviren zur Oberfläche hu­ maner Erythrozyten zu reduzieren. Hierdurch sollen unerwünschte Nebenwirkungen verringert und gleichzeitig die Verfügbarkeit der Adenoviren für die Zielzellen erhöht werden.The invention relates to a method for reducing the toxicity of recombinant ten adenoviruses in gene therapy. In particular, the present invention provides Measures to modify recombinant adenoviruses for gene therapy Available with the aim of increasing the affinity of recombinant adenoviruses for the surface to reduce some erythrocytes. This is said to have undesirable side effects decreased and at the same time increased the availability of the adenoviruses for the target cells become.

Rekombinante Adenoviren gewinnen bei der Entwicklung neuer medizinischer The­ rapieverfahren zunehmend an Bedeutung. Ihre Aufgabe ist es, therapeutische Gene in die Zellen des Zielgewebe einzuschleusen und dort zur Expression zu bringen. Die in der Gentherapie verwendeten rekombinanten Viren leiten sich überwiegend von Adenoviren des Serotyp 5 ab. Schwerpunkt ihres Einsatzes sind zur Zeit erste klinische Studien zur Behandlung bösartiger Tumore und zur Therapie schwerer angeborener Stoffwechseldefekte [1-7].Recombinant adenoviruses win in the development of new medical The Therapy procedures are becoming increasingly important. Your job is to create therapeutic genes into the cells of the target tissue and to express them there. The recombinant viruses used in gene therapy are predominantly derived from serotype 5 adenoviruses. The focus of their work is currently on the first clinical studies on the treatment of malignant tumors and the therapy of severe ones congenital metabolic defects [1-7].

Bei der Arbeit mit rekombinanten Adenoviren wurde auf eine Eigenschaft der ver­ wendeten Viren gestoßen, die eine potentielle Gefahr bei der Anwendung am Men­ schen birgt. Eine Beschreibung der im Tiermodell und bei in vitro Untersuchungen erhobenen Befunde ist bereits publiziert worden [9]. Es handelt sich dabei dem We­ sen nach um eine nicht erwünschte Wechselwirkung zwischen den Oberflächen­ strukturen der Viren und der von roten Blutkörperchen. Im Zuge dieser Wechselwir­ kung entfalten die Viren eine erhöhte Affinität zur Oberfläche von roten Blutkörper­ chen (Erythrozyten), die zu einer Reaktion führt, die in der Medizin als Hämaggluti­ nation bezeichnet wird. Diese Erscheinung kann zu einer Verklumpung der Erythro­ zyten (Hämagglutination) und anderer zellulärer Bestandteile des Blutes führen, in deren Folge geringfügige bis hin zu schwersten Störungen der Blutzirkulation auftre­ ten können. Besondere Bedeutung kommt dieser Beobachtung zu, da ihre Existenz für den in klinischen Studien verwendeten Typ von adenoviralen Vektoren (Serotyp 5) nicht nur-nicht bekannt war, sondern seine Existenz in der Literatur aktiv bestrit­ ten wird [11-13]. Die in der Literatur gemachten Angaben beziehen sich allerdings auf Wildtypviren und berücksichtigen nicht mögliche Veränderung der Eigenschaf­ ten, die durch Veränderungen am Virusgenom oder durch spezielle Aspekte des Produktionsverfahrens auftreten können. Von anderen als Serotyp 5 Vektoren sind Hämagglutinationsreaktionen (z. B. gegenüber Rattenerythrozyten) in der Literatur beschrieben und gut untersucht worden [14, 15]. Die viralen Strukturproteine, die für eine Bindung an Oberflächenstrukturen von Säugerzellen, bzw. für Hämagglutinati­ onsreaktionen verantwortlich sind, sind bekannt [14-17].When working with recombinant adenoviruses, a property of ver encountered viruses that pose a potential danger when used on men hides. A description of the animal model and in vitro studies  Findings have already been published [9]. It is the We after an undesired interaction between the surfaces structures of viruses and red blood cells. In the course of this interaction The viruses develop an increased affinity for the surface of red blood cells chen (erythrocytes), which leads to a reaction, which in medicine as hemaggluti nation is called. This phenomenon can lead to clumping of the erythro lead to (hemagglutination) and other cellular components of the blood the consequence of which can range from minor to severe disturbances in blood circulation can. This observation is particularly important because of its existence for the type of adenoviral vectors used in clinical studies (serotype 5) was not only not known, but actively contested its existence in literature [11-13]. However, the information given in the literature relates on wild-type viruses and do not consider possible changes in properties caused by changes in the virus genome or by special aspects of the Production process can occur. Vectors other than serotype 5 Hemagglutination reactions (e.g. against rat erythrocytes) in the literature have been described and studied well [14, 15]. The viral structural proteins required for binding to surface structures of mammalian cells, or for hemagglutinati ons reactions are known [14-17].

Am 17. September 1999 ist der erste Patient an den direkten Folgen einer adenovi­ ralen Gentherapie verstorben [8]. Im Mittelpunkt des Krankheitsgeschehens standen akute und schwere Veränderungen des Blutbildes. Die genauen Ursachen für den Tod des jungen Mannes sind zur Zeit Gegenstand intensiver Untersuchungen durch die U.S. Food and Drug Administration (FDA).On September 17, 1999, the first patient suffered from the direct consequences of adenovi oral gene therapy died [8]. The focus of the disease was acute and severe changes in the blood count. The exact causes of the The young man's death is currently the subject of intense investigation the U.S. Food and Drug Administration (FDA).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Struktur des Fiberproteins a­ denoviraler Vektoren in einer Weise zu verändern, die zu einer Verringerung der Wechselwirkung rekombinanter Adenoviren mit zellulären Bestandteilen des huma­ nen Blutes - insbesondere der Erythrozyten - führen und dadurch das Risiko uner­ wünschter Nebenwirkungen einer adenoviralen Gentherapie zu senken vermag.The object of the present invention is therefore to determine the structure of the fiber protein a to change denoviral vectors in a way that leads to a decrease in Interaction of recombinant adenoviruses with cellular components of the huma blood, especially the erythrocytes, and thereby the risk desired side effects of adenoviral gene therapy.

Ferner soll die Struktur des Fiberproteins adenoviraler Vektoren in einer Weise ver­ ändern werden, die zu einer Verringerung der Wechselwirkung rekombinanter Adenoviren mit Nicht-Zielzellen, zugunsten eines verbesserten Gentransfer in Zielzellen einer Gentherapie führen. Furthermore, the structure of the fiber protein of adenoviral vectors is said to ver will change that to reduce the recombinant interaction Adenoviruses with non-target cells, in favor of an improved gene transfer in Lead target cells of a gene therapy.  

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale. Durch diese erfindungsgemäßen Maßnahmen werden Veränderungen am Fiber- Gen derart verändert, dass die Hämagglutinationseigenschaften rekombinanter A­ denoviren - bevorzugt des Seroytyp 5 [Subgenus C] - gegenüber humanen Erythro­ zyten in einer Weise verändert werden, dass es zu keiner Hämagglutination mehr kommt.This object is achieved by the features listed in claim 1. Through these measures according to the invention, changes in the fiber Gen changed so that the hemagglutination properties of recombinant A denoviruses - preferably of seroy type 5 [subgenus C] - over human erythro Cytes are changed in such a way that there is no more hemagglutination is coming.

Eine derartige Modifikation mit diesem vorgenannten Ergebnis ist bislang noch nie versucht worden, da diese Eigenschaft rekombinanter Adenoviren des Serotyp 5 bislang auch nicht bekannt war.Such a modification with this aforementioned result has never been done before has been attempted since this property of recombinant serotype 5 adenoviruses was also not yet known.

Es ist möglich, gezielt Veränderungen (Mutationen) in den verantwortlichen Genen zu setzen, die die Antigenen- und Bindungs-Eigenschaften der daraus synthetisier­ ten Proteine verändern [17]. Zum Zweck eines veränderten Tropismus der Vektoren, sind Veränderungen des Fiberproteins von Adenovirusvektoren für die Gentherapie zwar bereits beschrieben worden [18-21, 10]. Aus der großen Gruppe humaner A­ denoviren (über 42 Serotypen) jedoch ist eine Hämagglutination menschlicher E­ rythrozyten bislang nur vom Serotyp 9 (Subgenus D) bekannt [11-12]. Da die zur Diskussion stehenden Fiber-Gene zwischen den verschiedenen Serotypen teilweise austauschbar sind, existiert neben der Möglichkeit gezielte Mutationen in diesen Genen zu setzen, auch die Alternative, Gene aus nicht-hämagglutinierenden Viren teilweise oder komplett auszutauschen.It is possible to target changes (mutations) in the responsible genes to set up the antigen and binding properties of the synthesized from it change proteins [17]. For the purpose of changing the tropism of the vectors, are changes in the fiber protein of adenovirus vectors for gene therapy has already been described [18-21, 10]. From the large group of human A denovirus (over 42 serotypes), however, is a hemagglutination of human E rythrocytes are only known from serotype 9 (subgenus D) [11-12]. Since the for Partially discussed fiber genes between the different serotypes are interchangeable, there is the possibility of targeted mutations in these Genes, also the alternative, genes from non-hemagglutinating viruses to replace partially or completely.

Im folgenden werden zum besseren Verständnis der Erfindung einige Begriffe Im Sinne der vorliegenden Erfindung erläutert:In the following some terms are used for a better understanding of the invention In the sense of the present invention:

Zielzellen und Nicht-Zielzellen einer Gentherapie: In Abhängigkeit von der medizini­ schen Fragestellung gehören zu Zielgeweben eines therapeutischen Ansatzes z. B. die Zellen eines bösartigen Tumors oder Leber-, Herzmuskel- und oder andere Or­ ganzellen. Unabhängig davon, ob der Adenovirusvektor über die Blutbahn oder lokal direkt in das Zielgewebe appliziert wird, kommt es zu einem Kontakt des Virus' mit körpereigenen Strukturen, die nicht zum Zielgewebe gehören, wie z. B. zellulären Bestandteilen des Blutes oder Gefäßwänden. Besitzt der Vektor eine erhöhte Affini­ tät zu diesen Strukturen des Nicht-Zielgewebes führt dies zum einen zu einem quantitativ verringerten Gentransfer ins Zielgewebe und die unspezifischen Wech­ selwirkungen bergen ein erhöhte Gefahr für Nebenwirkungen.Target cells and non-target cells of a gene therapy: Depending on the medication The question is one of the target tissues of a therapeutic approach. B. the cells of a malignant tumor or liver, heart muscle and or other Or whole. Regardless of whether the adenovirus vector is via the bloodstream or locally If the virus is applied directly to the target tissue, the virus comes into contact with it endogenous structures that do not belong to the target tissue, such as B. cellular Components of the blood or vessel walls. If the vector has an elevated affini On the one hand, these structures of the non-target tissue lead to one  quantitatively reduced gene transfer to the target tissue and the non-specific changes Interactions pose an increased risk of side effects.

Fiber-Gen: Das Fiber-Gen adenoviraler Vektoren codiert für ein Kapsid- bzw. ein kapsidassozüertes Protein, das wesentlich für Bindung an zelluläre Rezeptoren und andere zelluläre Oberflächenstrukturen verantwortlich ist. Das Fiberprotein ist maß­ geblich an der Induktion sog. Hämagglutinationsreaktionen beteiligt [14, 17]. Die La­ ge des Gens im Adenovirusgenom ist genau bekannt [26]. Es ist mit Hilfe moleku­ larbiologischer Techniken möglich, gezielte Veränderungen an einzelnen Sequenz­ abschnitten vorzunehmen oder komplette Gene verschiedener Seroytpen miteinan­ der zu tauschen [19, 20, 21, 27].Fiber gene: The fiber gene of adenoviral vectors codes for a capsid or a capsid-associated protein essential for binding to cellular receptors and other cellular surface structures is responsible. The fiber protein is measured involved in the induction of so-called hemagglutination reactions [14, 17]. The La gene of the gene in the adenovirus genome is well known [26]. It is with the help of moleku larbiological techniques possible, targeted changes to individual sequences sections or complete genes of different serotypes to exchange [19, 20, 21, 27].

Verpackungszelllinie: Wildtypadenoviren können sich in fast allen Körpergeweben und einer sehr großen Zahl von etablierten Zelllinien replizieren. Den in der Genthe­ rapie verwendeten Adenoviren ist durch eine Deletion in der sog. E1-Region die Fähigkeit sich auf jeder Zelle zu replizieren genommen worden. Auf dieses Weise wird verhindert, dass die Viren sich nach Gentherapie im Körper aktiv vermehren und die Gesundheit des Empfängers bedrohen. Allerdings ist zur Herstellung dieser replikationsdefekten Viren die Gegenwart der sog. E1-Region notwendig. Dieses Problem wird gelöst, indem die Gene der E1-Region stabil in das Genom einer Zell­ linie eingebaut werden. Infiziert man nun einen an sich replikationsdefekten Virus auf diese Zelllinie kann er sich dort replizieren, nicht jedoch auf Zellen die das fragli­ che Gen nicht tragen. Zelllinien die Gene tragen, die für die Replikation eines partiell deletierten Virus notwendig sind, werden als sogenannte Verpackungszellen be­ zeichnet.Packaging cell line: Wild type adenoviruses can be found in almost all body tissues and replicate a very large number of established cell lines. The one in Genthe The adenovirus used in therapy is the deletion in the so-called E1 region Ability to replicate on every cell has been taken. That way prevents the virus from actively multiplying in the body after gene therapy and threaten the health of the recipient. However, this is to be done replication-defective viruses require the presence of the so-called E1 region. This Problem is solved by keeping the genes of the E1 region stable in the genome of a cell line can be installed. If you now infect a replication-defective virus it can replicate there on this cell line, but not on cells that are fragile che gene do not carry. Cell lines carry the genes necessary for the replication of a partial deleted virus are necessary, so-called packaging cells be draws.

Hämagglutination: Die Klassifikation humaner Adenoviren - z. Z. sind etwa 45 ver­ schiedene Serotypen bekannt - werden anhand ihres Hämagglutinationsverhalten in 6 verschiedene Subgeni (A-F) unterteilt [10-12]. Nur von Subgenus-D ist bekannt, dass sie humane Erythrozyten zu agglutinieren vermögen, nicht jedoch von Subge­ nus-C-Viren, zu denen auch der Serotyp 5 gehört. Aus Untersuchungen über die Fähigkeit von Subgenus D Adenoviren Ratten-, Affen- und Humane-Erythrozyten zu hämagglutinieren ist bekannt, dass ein relativ kurzer Sequenzabschnitt im Bereich der sog. Gamma (y)-Domäne des Fiberproteins hauptverantwortlich für die Hä­ magglutinationsneigung dieser Serotypen ist [14, 16, 17]. Der Austausch der Gam­ ma-Domäne aus Viren mit anderen Hämagglutinationsspezifitäten führt zu einer Übertragung der entsprechenden Hämagglutinationseigenschaften [17].Hemagglutination: The classification of human adenoviruses - e.g. Currently there are about 45 ver different serotypes are known - are based on their hemagglutination behavior in 6 different subgeni (A-F) divided [10-12]. Only from Subgenus-D is known that they are able to agglutinate human erythrocytes, but not from Subge nus-C viruses, which also includes serotype 5. From studies on the Ability of Subgenus D adenoviruses to rat, monkey and human erythrocytes Hemagglutinating is known to have a relatively short sequence section in the area the so-called gamma (y) domain of the fiber protein is primarily responsible for the ha magglutination tendency of these serotypes is [14, 16, 17]. The exchange of the gam  ma domain from viruses with other hemagglutination specificities leads to a Transfer of the corresponding hemagglutination properties [17].

Dies ist auch bei der Herstellung rekombinanter Adenoviren möglich und führt zu einer Veränderung der antigenen Struktur und zu einem veränderten Neutralisati­ onsneigung gegenüber neutralisierender Antikörper und einem verändertem Zelltro­ pismus [19, 20, 21].This is also possible in the production of recombinant adenoviruses and leads to a change in the antigenic structure and a changed neutralization tendency towards neutralizing antibodies and an altered cell tro pism [19, 20, 21].

Vorteilhaft im Sinne der Erfindung ist die Tatsache, dass Erythrozyten prinzipiell keine Zielzellen einer Adenovirusinfektion sind, da sie nicht zur Virusvermehrung geeignet sind. Die Modifikation der Bindungseigenschaften gegenüber Erythrozyten dient daher hier auch nicht dem Ziel der Veränderung des Virustropimus.The fact that erythrocytes are principally advantageous in the sense of the invention are not target cells of an adenovirus infection since they are not used for virus multiplication are suitable. The modification of the binding properties against erythrocytes therefore does not serve the goal of changing the viral tropus here.

Aus diesen Gründen ist es möglich, virale Vektoren zu konstruieren, die eine ver­ minderte unspezifische Affinität zu Nicht-Zielzellen haben und dadurch unerwünsch­ te Wechselwirkungen und in der Folge das Risiko ernster Nebenwirkungen verrin­ gern helfen.For these reasons, it is possible to construct viral vectors that ver have reduced non-specific affinity for non-target cells and thereby undesirable interactions and consequently the risk of serious side effects happy to help.

Bevorzugt ist die Ausführung gemäß Anspruch 2 und 3. Über den Austausch von einzelnen Strukturgenen hinaus ist es möglich, ein Vektorsystem auf der Basis an­ derer Serotypen humanen und auch nicht-humanen Ursprungs aufzubauen. Dazu müssen, analog zum Vorgehen bei Seroytyp 5 Vektoren, essentielle Steuerungs­ elemente analog der E1-Region bei Ad5 aus dem Virus entfernt und stabil auf eine Zelllinie übertragen werden. In dieser Weise veränderte Viren können auf ihren normalen Wirtszellen nicht mehr replizieren. Ihre Vermehrung ist an Zelllinien ge­ bunden, die die ausgelagerten Sequenzen stabil in ihrem Genom tragen und da­ durch zur Verpackungszelle werden. Im Falle von E1-deletierten Adenoviren der ersten und folgender Generationen sind dies überwiegend von 293 Zellen abgeleite­ te Linien.The embodiment according to claims 2 and 3 is preferred individual structural genes it is possible to base on a vector system to build up their serotypes of human and non-human origin. To analogous to the procedure for Seroytype 5 vectors, essential control elements analogous to the E1 region in Ad5 removed from the virus and stable on one Cell line are transmitted. Viruses modified in this way can affect their no longer replicate normal host cells. Their multiplication is on cell lines bound, which carry the outsourced sequences stable in their genome and there through to the packaging cell. In the case of E1 deleted adenoviruses first and subsequent generations, these are predominantly derived from 293 cells lines.

In den durch die Entfernung von Steuerungselementen aus dem Virus entstandenen Raum können therapeutische Transgene eingesetzt werden. Diese Vorgehensweise ist ein grundlegendes Prinzip und gilt für die Nutzung rekombinanter Adenoviren als Gentransfervektor allgemein. In those created by removing control elements from the virus Therapeutic transgenes can be used in space. This approach is a basic principle and applies to the use of recombinant adenoviruses as General gene transfer vector.  

Die Produktion rekombinanter Adenoviren erfolgt auf sog. Verpackungszellen. Eini­ ge der Gene, die für Bausteine codieren, die für den Aufbau von funktionsfähigen Viren notwendig sind, können auch stabil in das Genom der Verpackungszelle integ­ riert sein, oder dort als sogenanntes Episom angesiedelt sein. Sie müssen nicht Bestandteil des Genoms des therapeutischen Virus oder eines viralen oder nicht­ viralen Helferkontsruktes sein. Am Beispiel der Supplementierung des Fiberproteins ist dies bereits gezeigt worden [25].Recombinant adenoviruses are produced on so-called packaging cells. Eini ge of the genes that code for building blocks that are necessary for the construction of functional Viruses that are necessary can also be stably integrated into the genome of the packaging cell be, or be located there as a so-called episome. You do not have to Part of the genome of the therapeutic virus or a viral or not viral helper contract. Taking fiber protein supplementation as an example this has already been shown [25].

Die genaue Lage des Fiber-Gens ist bekannt. Es ist möglich Fiber-Gene aus einem anderen, nicht-agglutinierenden Adenoviren (Subgenus A, B, C außer Serotyp 5, E, F) mit Hilfe einer PCR-Reaktion oder eines Restriktionsverdaus des Virusgenoms zu isolieren. Über direkte Klonierungen oder über homologe Rekombinationen kann das ursprüngliche Fiber-Gen (des Serotyp-5-Vektors) oder Teile davon aus dem Vektor entfernt und durch Teile oder komplette Fiber-Gene anderer Serotypen er­ setzt werden. Aus dem in dieser Weise veränderten Virusgenom können Viren pro­ duziert werden, deren veränderte Hämagglutinationsneigung menschlichen Erythro­ zyten gegenüber anschließend in in vitro Untersuchungen bestimmt wird.The exact location of the fiber gene is known. It is possible to have fiber genes from one other non-agglutinating adenoviruses (subgenus A, B, C except serotype 5, E, F) with the help of a PCR reaction or a restriction digest of the virus genome isolate. Via direct cloning or via homologous recombinations the original fiber gene (of the serotype 5 vector) or parts thereof from the Vector removed and replaced by parts or complete fiber genes of other serotypes be set. From the virus genome modified in this way, viruses per be induced, their altered tendency to hemagglutination human erythro cytocytes is subsequently determined in in vitro tests.

Ein derart erfindungsgemäß behandeltes Virus, das eine verringerte bzw. keine Hä­ amagglutinatiosnneigung mehr zeigt, dessen Gentransferleistung aber durch die vorgenommen Veränderungen weitgehend unbeeinflusst gut ist, trägt ein geringeres medizinisches Risisko in sich, schwere hämatologische Veränderungen beim Men­ schen auszulösen. Der erfindungsgemäße Vorteil ist daher immens.A virus treated according to the invention in this way, which has a reduced or no ha amagglutinatiosnne shows more, but its gene transfer performance by changes that are largely unaffected are good, less medical risk in itself, severe hematological changes in the men trigger. The advantage of the invention is therefore immense.

Über den Austausch von einzelnen Strukturgenen hinaus ist es möglich, ein Vektor­ system auf der Basis anderer Serotypen humanen und auch nicht-humanen Ur­ sprungs aufzubauen. Dazu müssen, analog zum Vorgehen bei Seroytyp 5 Vektoren, essentielle Steuerungselemente analog der E1-Region bei Ad5 aus dem Virus ent­ fernt und stabil auf eine Zelllinie übertragen werden. In dieser Weise veränderte Viren können auf ihren normalen Wirtszellen nicht mehr replizieren. Ihre Vermeh­ rung ist an Zelllinien gebunden, die die ausgelagerten Sequenzen stabil in ihrem Genom tragen und dadurch zur Verpackungszelle werden. Im Falle von E1-dele­ tierten Adenoviren der ersten und folgender Generationen sind dies überwiegend von 293 Zellen abgeleitete Linien. In addition to the exchange of individual structural genes, it is possible to create a vector system based on other serotypes human and non-human Ur to build jump. For this, analogous to the procedure for Seroytype 5 vectors, essential control elements analogous to the E1 region in Ad5 from the virus ent distant and stable transferred to a cell line. That changed Viruses can no longer replicate on their normal host cells. Your property tion is bound to cell lines that are stable in the outsourced sequences Wear the genome and thereby become a packaging cell. In the case of E1-dele Most of them are adenoviruses from the first and subsequent generations Lines derived from 293 cells.  

Der mit der vorliegenden Erfindung erzielte Vorteil stellt mithin ein überraschendes Ergebnis dar, welches aufgrund der einschlägigen Literatur nicht zu erwarten war. Der Vorteil der Nutzung derart erfindungsgemäß behandelter rekombinanter Adeno­ viren zu gentherapeutischen Zwecken liegt daher auf der Hand. Dabei spielt es grundsätzlich keine Rolle, ob es sich aus Serotyp-5 oder aus anderen als Serotyp 5 abgeleiteten Viren handelt.The advantage achieved with the present invention is therefore a surprising one Result that was not to be expected due to the relevant literature. The advantage of using recombinant adeno treated according to the invention Viruses for gene therapy purposes are therefore obvious. It plays basically does not matter whether it is from serotype 5 or from other than serotype 5 derived viruses.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung ist in den anliegenden Zeichnungen dargestellt und wird nachfolgend näher beschrieben. Es zeigtFurther advantageous measures are contained in the remaining subclaims. The invention is illustrated in the accompanying drawings and is as follows described in more detail. It shows

Fig. 1 einen beispielhaften erfindungsgemäßen Ver­ fahrensablauf, nämlich den Austausch der Fiber- Gene zwischen Adenovirus Serotyp 2 und 5. Fig. 1 shows an exemplary drive running Ver invention, namely the replacement of the genes between Fiber adenovirus serotype 2 and 5.

Die Plasmide, die zur Herstellung rekombinanter (E1-deletierter) Adenoviren der ersten und folgender Generationen verwendet werden, sind zu einem wesentlichen Teil von Graham an der McMaster Universität in Toronto in den achtziger und neun­ ziger Jahren entwickelt worden und sind weltweit verbreitet [22, 23, 24]. Die rekombi­ nanten Viren leiten sich nahezu ausschließlich von Serotyp 5 ab.The plasmids used to produce recombinant (E1 deleted) adenoviruses First and subsequent generations are used to become essential Part of Graham at McMaster University in Toronto in the eighties and nine nenties and are widespread worldwide [22, 23, 24]. The recombi Viruses are almost exclusively derived from serotype 5.

Die genaue Lage des Fiber-Gens ist bekannt. Es ist möglich Fiber-Gene, aus ande­ ren, nicht-agglutinierenden Adenoviren [Subgenus A,B,C außer Serotyp 5, E, F] mit Hilfe einer PCR-Reaktion oder eines Restriktionsverdau des Virusgenoms zu isolie­ ren. Über direkte Klonierungen oder über homologe Rekombinationen kann das ursprüngliche Fiber-Gen (des Serotyp 5 Vektors) oder Teile davon aus dem Vektor entfernt und durch Teile oder komplette Fiber-Gene anderer Serotypen ersetzt wer­ den. Aus dem in dieser Weise veränderten Virusgenom können Viren produziert werden, deren veränderte Hämagglutinationsneigung menschlichen Erythrozyten gegenüber anschließend in in vitro Untersuchungen bestimmt wird.The exact location of the fiber gene is known. It is possible to use fiber genes from others ren, non-agglutinating adenoviruses [subgenus A, B, C except serotype 5, E, F] with Isolate with the help of a PCR reaction or a restriction digest of the virus genome Ren. This can be done by direct cloning or homologous recombinations original fiber gene (of the serotype 5 vector) or parts thereof from the vector removed and replaced by parts or complete fiber genes of other serotypes the. Viruses can be produced from the virus genome modified in this way whose altered tendency to hemagglutinate human erythrocytes versus subsequently determined in in vitro tests.

Ein Virus, das eine verringerte bzw. keine Häamagglutinatiosnneigung mehr zeigt, dessen Gentransferleistung aber durch die vorgenommen Veränderungen weitge­ hend unbeeinflusst gut ist, würde ein geringeres medizinisches Risiko in sich tra­ gen schwere hämatologische Veränderungen beim Menschen auszulösen. A virus that shows a reduced or no tendency to hemagglutination, but its gene transfer performance is largely due to the changes made While unaffected is good, there would be less medical risk to trigger severe haematological changes in humans.  

Austausch der Fiber-Gene zwischen Adenovirus Serotyp 2 und 5Exchange of the fiber genes between adenovirus serotype 2 and 5

Fig. 1 zeigt ein Ausgangskonstrukt A, z. B. einen Adenovirus Serotyp 2 (bestehend aus 35937 Basenpaaren). In einem ersten Schritt wird das Fiber-Gen Ad2 (31030 bp - 32778 bp) aus dem Genom eines Spenderadenovirus (A) über eine PCR amplifiziert und anschließend wird findet eine Insertion des PCR-Produktes in ein Hilfsplasmid B statt. Das Hilfsplasmid enthält Sequenzabschnitte aus dem Empfän­ gerplasmid pJM17, die das Ad5 Fiber-Gen (Serotyp 5) flankieren. Fig. 1 shows an initial construct A, z. B. an adenovirus serotype 2 (consisting of 35937 base pairs). In a first step, the fiber gene Ad2 (31030 bp - 32778 bp) from the genome of a donor adenovirus (A) is amplified by means of a PCR and then the PCR product is inserted into an auxiliary plasmid B. The auxiliary plasmid contains sequence sections from the recipient plasmid pJM17, which flank the Ad5 fiber gene (serotype 5).

In einem zweiten Schritt wird das Ad2 Fiber-Gens über homologe Rekombination des Hilfsplasmides B mit dem pJM17 -Plasmides an den Ort des Ad5-Fiber-Gen insertiert. Das beispielhaft gewählte pJM17 Plasmid trägt das komplette Serotyp 5 Genom und dient als Ausgangskonstrukt zur Herstellung rekombinanter Adenoviren. In a second step, the Ad2 fiber gene is made via homologous recombination of the auxiliary plasmid B with the pJM17 plasmid at the site of the Ad5 fiber gene inserted. The pJM17 plasmid chosen as an example carries the complete serotype 5 Genome and serves as the starting construct for the production of recombinant adenoviruses.  

LiteraturlisteBibliography

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Claims (10)

1. Verfahren zur Verringerung der Wechselwirkung rekombinanter Adenoviren mit zellulären Bestandteilen des humanen Blutes, insbesondere zur Verwen­ dung in der humanen Gentherapie, gekennzeichnet durch das Einführen von wenigstens einer gezielten Mutation in Basensequenzen des Fiber-Gens von Adenoviren abgeleiteten Vektoren humanen oder nicht-humanen Ursprungs oder in virale oder nicht-virale Helferkonstrukte zur Herstellung solcher Vek­ toren.1. A method for reducing the interaction of recombinant adenoviruses with cellular components of human blood, in particular for use in human gene therapy, characterized by the introduction of at least one targeted mutation in base sequences of the fiber gene of adenovirus-derived vectors of human or non-human origin or in viral or non-viral helper constructs for the production of such vectors. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verwendung von Serotyp-5- Adenoviren bevorzugt ist.2. The method of claim 1, wherein the use of serotype 5- Adenovirus is preferred. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch den teilweisen oder kompletten Austausch oder das zusätzliche Einbringen von Fiber- Genen aus Nicht-Serotyp 5 Adenoviren in von Adenovirus Serotyp 5 abgelei­ tete Vektoren humanen oder nicht-humanen Ursprungs oder Helferkonstruk­ te zur Herstellung solcher Vektoren.3. The method according to claim 1 or 2, characterized by the partial or complete exchange or the additional introduction of fiber Genes from non-serotype 5 adenoviruses derived from adenovirus serotype 5 vectors of human or non-human origin or helper construct te for the production of such vectors. 4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Mutationen um Insertio­ nen und/oder Deletionen handelt.4. The method of claim 1, wherein the mutations are Insertio nen and / or deletions. 5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den zellulären Bestandteilen des Blutes um Erythrozyten handelt.5. The method of claim 1, wherein it is the cellular components of the blood is erythrocytes. 6. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche unter Verwendung von Adenovirus-Vektoren, die von anderen Adenoviren abgelei­ tet werden. 6. The method according to at least one of the preceding claims Use of adenovirus vectors that differ from other adenoviruses be tested.   7. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in den nach Entfernung von Steuerungselementen aus dem Virus entstande­ nen Raum therapeutische Transgene eingesetzt werden.7. The method according to at least one of the preceding claims, wherein in after the removal of control elements from the virus therapeutic transgenes can be used. 8. Verfahren zur Herstellung von spezifischen Verpackungslinien, die Fiber- Gene oder Teile davon komplementieren können und zur Produktion von adenoviralen Vektoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 verwendet werden.8. Process for the production of specific packaging lines, the fiber Genes or parts of them can complement and produce adenoviral vectors according to claims 1 to 7 are used. 9. Verwendung von adenoviralen Vektoren nach den Ansprüchen 1 bis 8 in der ex-vivo Gentherapie.9. Use of adenoviral vectors according to claims 1 to 8 in the ex vivo gene therapy. 10. Verwendung von adenoviralen Vektoren nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung von pharmazeutisch wirksamen Produkten in der ex-vivo Gen­ therapie.10. Use of adenoviral vectors according to claims 1 to 8 for Manufacture of pharmaceutically active products in the ex vivo gene therapy.
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EP0978566A2 (en) * 1998-07-08 2000-02-09 Introgene B.V. Chimaeric adenoviruses

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