DE19945553A1

DE19945553A1 - Detecting Meticillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant Enterococci comprises using a flow-through cytometer and fluorescence readings

Info

Publication number: DE19945553A1
Application number: DE1999145553
Authority: DE
Inventors: Holger Mueller
Original assignee: Holger Mueller
Current assignee: NUDING, SABINE, DR. MED., DE
Priority date: 1999-09-23
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2019-09-24
Also published as: DE19945553B4

Abstract

Detecting Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant Enterococci (VRE) in a flow-through cytometer is new. Detecting Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and vancomycin-resistant Enterococci (VRE) in a flow-through cytometer, comprises: (a) preparing a bacterial suspension; (b) growing of the bacteria in nutrient solution; (c) adding at least one fluorescent-labelled indicator, specific for one of the bacterial species; (d) adding a fluorescent-labelled indicator for damaged cells and an antibiotic to test the resistance; (e) running the suspension through the flow cytometer and radiating each bacteria with a laser; (f) measuring the fluorescence of each bacteria as the laser hits it; and (g) evaluating the total of the single measurements to determine the resistance of the bacteria to the tested antibiotic.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von min destens einer multiresistenten Keimart, insbesondere von MRSA- und VRE-Keimen.The invention relates to a method for the detection of min at least a multi-resistant germ, especially of MRSA and VRE germs.

Multiresistente Keime stellen ein Problem für Kranken häuser, Pflegeheime, Altenheime und dergleichen dar, da Infektionen durch solche Keime nur sehr schwer beherrsch bar sind. Sowohl die erforderlichen Isoliermaßnahmen für die betroffenen Personen als auch die Therapie stellen be trächtliche Kostenfaktoren dar, so daß es von größter Wichtigkeit ist, von solchen multiresistenten Keimen be fallene Personen möglichst schnell zu erkennen. In den USA wurden bei mehr als 30% aller Intensivpatienten, in Österreich bei ca. 18% und in Deutschland bei ca. 3% derartige multiresistente Keime festgestellt. Derartige multiresistente Keime stellen eine heterogene Gruppe unterschiedlicher Spezies dar. Die wichtigsten Vertreter sind MRSA-Keime (Meticillinresistenter Staphylokokkus au reus) und VRE-Keime (Vancomycinresistente Enterokokken). Multi-resistant germs pose a problem for the sick houses, nursing homes, old people's homes and the like Infections from such germs are very difficult to control are cash. Both the necessary insulation measures for the affected persons as well as the therapy order are significant cost factors, making it the greatest It is important to be aware of such multi-resistant germs to recognize fallen people as quickly as possible. In the USA were in more than 30% of all intensive care patients, in Austria around 18% and Germany around 3% such multi-resistant germs were found. Such multi-resistant germs represent a heterogeneous group of different species. The most important representatives are MRSA germs (meticillin-resistant staphylococcus au reus) and VRE germs (vancomycin-resistant enterococci).

Die bisher eingesetzten Verfahren zum Nachweis von multi resistenten Keimen sind sehr zeitaufwendig, umständlich und personalintensiv. Zunächst werden über einen Zeitraum von 12-24 Stunden Kulturen mit dem Ziel, sichtbare Einzelkolonien bis in sichtbare Größenordnungen zu züchten, angelegt. Anschließend erfolgt ein mikrobio logischer und/oder chemischer Nachweis der Art der Keime sowie ein Resistenztest, beispielsweise mit geeigneten Antibiotikum-Testplättchen. Der erforderliche große Auf wand und die lange Testphase erlauben eine entsprechende Überprüfung von Personen nur bei dringendem Verdacht auf eine entsprechende Infektion. Mit dem angegebenen (Zeit-) Aufwand können zwar prinzipiell große Serien bearbeitet werden, jedoch bedeutet dies für die jeweiligen Patienten, daß die strengen und kostenintensiven Isoliermaßnahmen entsprechend aufrechterhalten werden müssen.The previously used methods for the detection of multi resistant germs are very time consuming, cumbersome and labor intensive. First, over a period of time from 12-24 hours of cultures aiming to be visible Single colonies up to visible orders of magnitude breed, laid out. This is followed by a microbiology logical and / or chemical proof of the type of germs and a resistance test, for example with suitable ones Antibiotic test plate. The required big up wall and the long test phase allow a corresponding Checking people only when there is an urgent suspicion of a corresponding infection. With the specified (time) In principle, large series can be processed but this means for each patient that the strict and costly isolation measures must be maintained accordingly.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Testsystem zu schaffen, mit dem schneller und einfacher multiresistente Keime nachgewiesen werden können, die Per sonen, insbesondere Patienten, besiedelt oder infiziert haben.An object of the present invention is to provide a To create test system with the faster and easier multi-resistant germs can be detected, the Per people, especially patients, populated or infected to have.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. This object is achieved by the method with solved the features of claim 1.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können derartige multiresistente Keime innerhalb weniger Stunden nachge wiesen werden, da dieses Verfahren zum Nachweis wesentlich weniger Keime und damit weniger Vermehrungszyklen benötigt. Der Nachweis selbst erfolgt dann nahezu vollauto matisch mit einem Durchflußzytometer, das geringere An forderungen an die Ausbildung der den Test durchführenden Fachkräfte stellt. Das Durchflußzytometer erlaubt dabei schnelle und exakte Messungen, so daß insgesamt ein brei terer Kreis von Personen solchen Tests unterzogen werden kann oder sogar Reihenuntersuchungen bei realisierbarem Aufwand möglich werden.With the method according to the invention, such multiresistant germs within a few hours be pointed out because this procedure is essential for detection fewer germs and therefore fewer propagation cycles are required. The proof itself is then carried out almost fully automatically matically with a flow cytometer, the lower An requirements for the training of those performing the test Specialists. The flow cytometer allows quick and exact measurements, so that a whole porridge such a group of people can or even screening examinations at realizable Effort will be possible.

Durch die in den Unteransprüchen aufgeführten Maßnahmen sind vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen des im Anspruch 1 angegebenen Verfahrens möglich.By the measures listed in the subclaims are advantageous developments and improvements of method specified in claim 1 possible.

Als Indikator für die jeweils gesuchte Keimart eignen sich mit dem Oberflächenantigen dieser gesuchten Keimart ver bindende Antikörper, vorzugsweise PerCP-gekoppelte und/oder PE(Phycoerytrin)-gekoppelte Antikörper, die im Durchflußzytometer rot fluoreszieren, und/oder fluorezein gekoppelte (FITC[Fluorezein-iso-thiocyanat]) Antikörper. Alternativ hierzu kann als Indikator auch ein als Reaktant mit den Oberflächenenzymen der gesuchten Keimart wirkendes Substrat verwendet werden, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist.Suitable indicators for the type of germ in question ver with the surface antigen of this type of germ sought binding antibodies, preferably PerCP-coupled and / or PE (Phycoerytrin) -coupled antibodies, which in the Flow cytometers fluoresce red, and / or fluorescein coupled (FITC [fluorescein isothiocyanate]) antibodies. As an alternative, an as can also be used as an indicator Reactant with the surface enzymes of the type of germ sought acting substrate can be used with a Fluorescent dye is coupled.

Als Schlüsselantibiotikum eignet sich vor allem das Peni zillinderivat Oxacillin, insbesondere zum Nachweis von re sistenten MRSA-Keimen, oder Vancomycin, insbesondere zum Nachweis von resistenten VRE-Keimen.The peni is particularly suitable as a key antibiotic zillinderivat Oxacillin, especially for the detection of re resistant MRSA germs, or vancomycin, especially for Detection of resistant VRE germs.

Als Farbstoff zur Prüfung der Resistenz in Verbindung mit dem Schlüsselantibiotikum eignet sich vor allem ein mem branpotentialsensitiver Farbstoff, insbesondere ein Oxonol- Farbstoff (DiBAC3) oder ein Carbocyanin-Farbstoff (DiOC3), der im Durchflußzytometer grün fluoresziert, so daß die keimartspezifische Fluoreszenz deutlich von der resistenz abhängigen Fluoreszenz bei der Messung unterschieden werden kann.As a dye for testing resistance in connection with the key antibiotic is particularly suitable for a mem industry-sensitive dye, especially an oxonol Dye (DiBAC3) or a carbocyanine dye (DiOC3), which fluoresces green in the flow cytometer, so that the Germ specific fluorescence clearly of the resistance dependent fluorescence when measuring can be.

Der die Keime enthaltende Probenstrom wird in vorteil hafter Weise hydrodynamisch fokussiert, bevor er den vom Laserstrahl bestrahlten Meßpunkt passiert, so daß die Keime den Meßpunkt im wesentlichen einzeln passieren und somit individuelle Messungen an den Keimen vorgenommen werden können.The sample stream containing the germs is advantageous hydrodynamically focused before the Laser beam irradiated measuring point passes, so that the Germs essentially pass the measuring point individually and thus individual measurements were made on the germs can be.

Die verschiedenen Fluoreszenzstrahlungen (z. B. rot und grün) werden mittels eines optischen Detektionssystems bei jedem Meßvorgang quantifiziert, insbesondere durch Er fassung der Strahlungsamplituden oder Strahlungsintensitäten. Zur elektronischen Ausblendung von wesentlich von der ge suchten Keimart abweichenden Keimen wird das ein Maß für die Zellgröße bildende Vorwärtsstreulicht des Laserstrahls und/oder das ein Maß für den Zellinhalt bildende Seit wärtsstreulicht des Laserstrahls erfaßt, wobei Fluores zenzmessungen an dem jeweils vom Laserstrahl erfaßten Keim nur dann durchgeführt und/oder ausgewertet werden, wenn dieser Keim durch die Streulichterfassung als im gesuchten Toleranzbereich liegend erkannt wird. Hierdurch können exaktere Messungen durch Ausblenden von unerwünschten Messungen und Rauschsignalen erreicht werden.The different fluorescent radiations (e.g. red and green) are detected using an optical detection system quantified each measurement, in particular by Er Detection of radiation amplitudes or radiation intensities. For electronic suppression of essential ge If germs are searched for deviating germs, this becomes a measure of forward scattered light of the laser beam forming the cell size and / or the side forming a measure of the cell content Scattered light of the laser beam, with fluorescence zenz measurements on the germ detected by the laser beam can only be carried out and / or evaluated if this germ by the scattered light detection than in the sought Tolerance range lying is recognized. This can more precise measurements by hiding unwanted ones Measurements and noise signals can be achieved.

Zur Auswertung werden bei jedem Meßvorgang die erfaßten Fluoreszenzwerte in eine zwei- oder mehrdimensionale Ta belle eingetragen, wobei Schwellenwerte für die Unterschei dungskriterien Indikation und Resistenz vorgegeben werden. Auch dies dient zur Ausblendung von unerwünschten Signalen und Grundrauschen.For the evaluation, the recorded ones are recorded with every measuring process Fluorescence values in a two- or multi-dimensional Ta belle entered, with thresholds for the difference Indication and resistance can be specified. This also serves to suppress unwanted signals and noise floor.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Zuhilfenahme der Zeich nungen erläutert. Es zeigen:The method according to the invention is described below of exemplary embodiments with the aid of the drawing explained. Show it:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Durchfluß zytometers und Fig. 1 is a schematic representation of a flow cytometer and

Fig. 2 ein Auswertediagramm zum Nachweis des Vor handenseins oder Nichtvorhandenseins der ge suchten multiresistenten Keimart. Fig. 2 is an evaluation diagram to demonstrate the presence or absence of the sought-after multi-resistant germ type.

Zum Nachweis einer vermuteten multiresistenten Keimart, beispielsweise von MRSA- oder VRE-Keimen, wird zunächst, im Falle MRSA, in üblicher Weise ein Abstrich aus Körper höhlen (vorzugsweise Nase, Rachen), Wunden und Hautarealen hergestellt, bzw., im Falle VRE, Urin, Stuhl, Sekrete und Anal-Abstriche hergestellt. Aber auch Reinkulturen nach Anzüchtung aus allen üblichen Untersuchungsmaterialien können verwendet werden. Für die Analyse werden nicht kon ventionelle Wattetupfer verwendet, sondern das Material wird mit sterilen Einmal-Ösen abgestrichen und in die Nährbouillon verbracht. Der Grund liegt in einer Mini mierung des Rauschsignals, da sich von Watte Kleinst partikel ablösen. Danach werden die in der Suspension enthaltenen Keime in einer Nährlösung während einer Zeitdauer von ca. 2-3 Stunden je nach Keim vervielfacht. Eine stärkere Vervielfachung ist beim beschriebenen Verfahren im Gegensatz zum herkömmlichen Nachweisverfahren nicht erforderlich.To detect a suspected multi-resistant type of germ, for example from MRSA or VRE germs, is first in the case of MRSA, a body smear in the usual way caves (preferably nose, throat), wounds and skin areas manufactured, or, in the case of AER, urine, stool, secretions and Anal smears made. But also after pure cultures Cultivation from all common test materials can be used. For the analysis no conventional cotton swabs are used, but the material is wiped off with sterile disposable eyelets and into the Nutrient broth spent. The reason is a mini mation of the noise signal, since tiny amounts of cotton detach particles. After that, the in the suspension germs contained in a nutrient solution during a Duration of approx. 2-3 hours multiplied depending on the germ. A greater multiplication is in the described In contrast to the conventional detection method not mandatory.

Nun wird der Suspension ein mit einem fluoreszierenden Farbstoff versetzter Indikator für die jeweils gesuchte Keimart zugegeben, der sich spezifisch an diese Keimart anlagert oder ankoppelt. Beispielsweise weisen MRSA-Keime als Oberflächenantigen das Protein A auf, während VRE- Keime das Oberflächenantigen Lancefieldgruppe D enthalten. Der Suspension werden daher spezifische Antikörper zu gefügt, die sich mit diesen Antigenen zu Komplexen ver binden. Diese Antikörper werden mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt, beispielsweise werden PerCP- und/oder PE(Phyco erytrin)-konjugierte Antikörper verwendet. Liegt die gesuchte Keimart in der Suspension vor, so lagern sich die spezifischen Antikörper an die Antigene und damit an die Keime an, so daß sich Farbstoffkonzentrationen an diesen Keimen bilden. PerCP- und/oder PE-Konjugate fluoreszieren dabei rot. Weiterhin können beispielsweise auch fluore zeingekoppelte (FITC[Fluorezein-iso-thiocyanat]) Antikörper verwendet werden, die grün fluoreszieren. Liegen die ge suchten bzw. vermuteten Keime in der Nährlösung nicht vor, so erfolgt keine Anlagerung und damit keine Farbstoff konzentration.Now the suspension becomes one with a fluorescent one Dye-offset indicator for the one you are looking for Germ type added, which is specific to this type of germ attaches or couples. For example, MRSA have germs protein A as surface antigen, while VRE- Germs containing the surface antigen Lancefieldgruppe D. Specific antibodies are therefore added to the suspension added, which combine with these antigens to form complexes tie. These antibodies are used with fluorescent dyes coupled, for example PerCP and / or PE (Phyco erytrin) conjugated antibody. Is that searched for germ type in the suspension, so the specific antibodies to the antigens and thus to the Germs so that dye concentrations on them Germinate. PerCP and / or PE conjugates fluoresce thereby red. Fluores can also be used, for example Zinc-coupled (FITC [Fluorezein-Iso-thiocyanat]) antibodies used that fluoresce green. Are the ge did not search for or suspect germs in the nutrient solution, so there is no accumulation and therefore no dye concentration.

Anstelle eines Nachweises eines bestimmten Keims über Antikörper und Antigene können auch mit Fluoreszenzfarb stoffen gekoppelte Substrate, z. B. Fibrinogen, verwendet werden, die sich beispielsweise an den Oberflächenenzymen der gesuchten Keimart anlagern. Auch in diesem Falle kann somit an diesen Keimen eine Farbstoffkonzentration erzielt werden, die mit dem noch zu beschreibenden Durchfluß zytometer nachgewiesen werden kann. Ein Substrat kann auch zusammen mit einem Antikörper verwendet werden, um die Spezifität des Nachweises zu erhöhen.Instead of proof of a particular germ about Antibodies and antigens can also be fluorescent substances coupled substrates, e.g. B. fibrinogen used that, for example, on the surface enzymes of the type of germ sought. In this case too thus achieved a dye concentration on these germs be with the flow rate to be described cytometer can be detected. A substrate can too used together with an antibody to control the To increase the specificity of the detection.

Nach dem Zufügen des Indikators wird der Suspension ein Schlüsselantibiotikum zugefügt, das den Keim als multi resistent definiert, wenn er dadurch nicht angegriffen bzw. geschädigt wird. Bei MRSA-Keimen wird beispielsweise das Penizillinderivat Oxacillin und bei VRE-Keimen Vanco mycin als Schlüsselantibiotikum verwendet. Als Farbstoff wird beispielsweise ein membranpotentialsensitiver Farb stoff, wie der Oxonol-Farbstoff DiBAC3, verwendet. DiBAC3 wird von intakten Zellen nicht aufgenommen. Nur bei durch das Schlüsselantibiotikum geschädigten Zellen kann nach Depolarisation des Membranpotentials der Farbstoff in die geschädigten Zellen eindringen. Der Anteil der infolge dieses Farbstoffs fluoreszierenden Zellen einer Population entspricht somit der Menge der geschädigten Zellen. Bei Resistenz bleiben die Zellen bzw. Keime intakt, so daß der Farbstoff nicht eindringen kann. Oxonol-Farbstoffe bzw. Oxonole fluoreszieren grün.After adding the indicator, the suspension becomes a Key antibiotic added that the germ as multi defined as resistant if it does not attack it or is damaged. With MRSA germs, for example the penicillin derivative oxacillin and Vanco for VRE germs mycin used as a key antibiotic. As a dye becomes, for example, a membrane potential sensitive color substance, such as the oxonol dye DiBAC3. DiBAC3 is not absorbed by intact cells. Only with through the key antibiotic can damage damaged cells Depolarization of the membrane potential of the dye in the penetrate damaged cells. The proportion of as a result this dye fluorescent cells of a population corresponds to the amount of damaged cells. At Resistance, the cells or germs remain intact, so that the Dye cannot penetrate. Oxonol dyes or Oxonols fluoresce green.

Anstelle des Oxonol-Farbstoffs DiBAC3 kann beispielsweise auch ein Carbocyanin-Farbstoff, wie DiOC3, zum Nachweis der Resistenz verwendet werden. Die Wirkungsweise ist dabei im wesentlichen umgekehrt. DiOC3 wird in intakten Zellen akkumuliert, die dann grün bzw. gelb-grün fluores zieren. Nach einer Depolarisation bzw. Schädigung der Zellen durch das Schlüsselantibiotikum bei fehlender Re sistenz verläßt der Farbstoff diese wieder, und die Fluo reszenz nimmt ab. Eine nachgewiesene Fluoreszenz ist daher bei diesem Farbstoff ein Indiz für einen resistenten bzw. multiresistenten Keim.Instead of the oxonol dye DiBAC3, for example also a carbocyanine dye, such as DiOC3, for detection of resistance can be used. The mode of action is essentially the reverse. DiOC3 is intact Cells accumulate, which then green or yellow-green fluores adorn. After depolarization or damage to the Cells by the key antibiotic in the absence of Re the dye leaves it again, and the fluo resence decreases. A proven fluorescence is therefore with this dye an indication of a resistant or multi-resistant germ.

Zum Prüfen der so veränderten Suspension auf eine oder mehrere multiresistente Keimarten, im einfachsten Falle eine, wird nun ein an sich bekanntes Durchflußzytometer mit mindestens zwei Fluoreszenzen verwendet. Solche Durch flußzytometer werden beispielsweise von den Firmen Beckman- Coulter, Becton Dickinson (FACSCalibur-Durchflußzytometer) und Ortho-Instruments angeboten und vertrieben. Nach einer Einwirkungsdauer von beispielsweise 10 Minuten bis zu einer Stunde, je nach Farbstoff und verwendetem Indikator, wird die Suspension in das Zytometer eingegeben, und die Messung kann beginnen. Über eine Leitung 10 werden gemäß Fig. 1 die Keime in der Suspension einer Fokussierkammer 11 zugeführt. Über eine zweite, seitlich einmündende Lei tung 12 wird kontinuierlich Trägerflüssigkeit zugeführt, die den Probenstrom mit den Keimen erfaßt und beschleu nigt. Diese sogenannte hydrodynamische Fokussierung ge währleistet, daß die Zellen in einem nachfolgenden Meßrohr 13 einen Meßpunkt 14 einzeln passieren und dadurch einzeln überprüft werden können. Der Meßpunkt 14 wird von einem Laserstrahl 15 bestrahlt, der somit die jeweils passie renden Keime trifft und gegebenenfalls zur Fluoreszenz anregt. Hierfür wird beispielsweise ein Argon-Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm verwendet.To test the suspension thus modified for one or more multi-resistant types of germs, in the simplest case one, a flow cytometer known per se with at least two fluorescences is now used. Such flow cytometers are offered and sold, for example, by Beckman-Coulter, Becton Dickinson (FACSCalibur flow cytometer) and Ortho-Instruments. After an exposure time of, for example, 10 minutes to one hour, depending on the dye and the indicator used, the suspension is introduced into the cytometer and the measurement can begin. Via a line 10 FIG 1, the nuclei are fed in the suspension of a focusing chamber 11 according to.. Via a second, laterally leading Lei device 12 carrier liquid is continuously fed, which detects and accelerates the sample stream with the germs. This so-called hydrodynamic focusing ensures that the cells in a subsequent measuring tube 13 pass a measuring point 14 individually and can thus be checked individually. The measuring point 14 is irradiated by a laser beam 15 , which thus hits the germs that pass each and possibly stimulates fluorescence. For example, an argon laser with a wavelength of 488 nm is used for this.

Bei jeder so angeregten Zelle wird nun geprüft, ob rote und/oder grüne Fluoreszenzstrahlung auftritt. Diese Fluoreszenzstrahlungen werden mittels eines optischen De tektionssystems erfaßt, das beispielsweise aus zwei Fluo reszensstrahlungs-Sensoren 16, 17 besteht. Die Meßergeb nisse werden in einem Diagramm gemäß Fig. 2 aufgezeichnet. Dabei geben die beiden gestrichelten Linien Schwellenwerte für die beiden Fluoreszenzstrahlungen Fl 1 (grün) und Fl 2 (rot) vor, die empirisch bestimmt werden und darunter liegende Werte als Rauschen oder für die Erkennung als zu geringe Intensität erkennen. Nur Strahlungsintensitäten bzw. -amplituden oberhalb dieser Schwellenwerte werden zur Keimerkennung verwendet. Dies bedeutet, bei einer wesent lichen Ansammlung von Meßpunkten im Bereich 1 liegen multiresistente Keime der gesuchten Art vor, da die fehlende grüne Fluoreszenzstrahlung (z. B. bei Verwendung des Farbstoffs DiBAC3), die Resistenz erkennen läßt, während die vorhandene rote Fluoreszenzstrahlung die gesuchte Keimart anzeigt. Wird eine wesentliche Konzen tration im Bereich 2 festgestellt, so bedeutet dies, daß zwar die gesuchte Keimart vorliegt, diese jedoch nicht re sistent gegenüber dem Antibiotikum war. Der Bereich 4 de finiert Keime, die weder resistent sind, noch der ge suchten Keimart angehören. Schließlich definiert der Be reich 3 Keime, die zwar resistent sind, jedoch nicht der gesuchten Keimart zuzuordnen sind. Der Nachweis einer bestimmten multiresistenten Keimart ist daher nur dann erbracht, wenn sich eine wesentliche Konzentration im Bereich 1 darstellt.For each cell excited in this way, it is now checked whether red and / or green fluorescent radiation occurs. This fluorescence radiation is detected by means of an optical detection system which, for example, consists of two fluorescence radiation sensors 16 , 17 . The measurement results are recorded in a diagram according to FIG. 2. The two dashed lines specify threshold values for the two fluorescent radiations Fl 1 (green) and Fl 2 (red), which are determined empirically and recognize values below that as noise or for the detection as too low an intensity. Only radiation intensities or amplitudes above these threshold values are used for germ detection. This means that when there is a substantial accumulation of measuring points in area 1, multi-resistant germs of the type sought are present, since the lack of green fluorescent radiation (for example when using the dye DiBAC3) reveals the resistance, while the existing red fluorescent radiation indicates the sought-after one Germ type indicates. If a significant concentration is determined in area 2, this means that the type of germ sought is present, but this was not resistant to the antibiotic. Area 4 defines germs that are neither resistant nor belonging to the type of germ sought. Finally, the area defines 3 germs that are resistant but cannot be assigned to the type of germ sought. The proof of a certain multidrug-resistant type of germ is therefore only provided if there is a significant concentration in area 1.

Wird zum Nachweis der Resistenz beispielsweise der Farb stoff DiOC3 verwendet, so zeigt eine festgestellte grüne Fluoreszenzstrahlung bei einem Meßvorgang eine Resistenz an. Der Nachweis einer bestimmten multiresistenten Keimart ist daher bei diesem Farbstoff dann erbracht, wenn sich eine wesentliche Konzentration im Bereich 2 darstellt.Used to demonstrate resistance, for example, color DiOC3 fabric used shows a green Fluorescence radiation during a measuring process a resistance on. The detection of a certain multi-resistant germ type is therefore provided with this dye when represents a significant concentration in area 2.

Trifft der Laserstrahl 15 auf eine Zelle bzw. einen Keim, so treten neben der für die eigentliche Messung benötigten Fluoreszenzstrahlung noch ein Vorwärtsstreulicht im Be reich 3 bis 100 und ein Seitwärtsstreulicht auf. Der Winkel des Vorwärtsstreulichts ist ein Maß für die Zell größe, kleinere Zellen streuen weniger Licht. Das Seit wärtsstreulicht, das im Bereich eines rechten Winkels zum einfallenden Lichtstrahl anteilsmäßig geringer auftritt, ist ein Maß für die Granularität bzw. den Zellinhalt. If the laser beam 15 strikes a cell or a germ, then in addition to the fluorescence radiation required for the actual measurement, a forward scattered light in the range 3 to 100 and a side scattered light occur. The angle of the forward scattered light is a measure of the cell size, smaller cells scatter less light. The side scattered light, which occurs proportionally less in the area of a right angle to the incident light beam, is a measure of the granularity or the cell content.

Dieser Effekt kann und wird bei den bekannten Durchfluß zytometern als Meßfilter eingesetzt. Bei jedem Meßvorgang einer Zelle im Meßpunkt 14 werden das Vorwärtsstreulicht und das Seitwärtsstreulicht bestimmt. Dadurch kann fest gestellt werden, ob die betreffende Zelle bezüglich ihrer Zellgröße und ihres Zellinhalts ungefähr der gesuchten Zelle entspricht. Nur in diesem Fall wird dann die Fluo reszenzstrahlung für die Messung ausgewertet. Festge stellte, in ihrer Größe oder ihrem Zellinhalt stark ab weichende Zellen werden für die Messung ausgeblendet, so daß insgesamt exaktere Meßergebnisse erhalten werden.This effect can and is used in the known flow cytometers as a measuring filter. The forward scattered light and the side scattered light are determined each time a cell is measured at measuring point 14 . This makes it possible to determine whether the cell in question approximately corresponds to the cell in question in terms of its cell size and cell content. Only in this case is the fluorescence radiation evaluated for the measurement. Festge noted, in size or cell content from strongly deviating cells are hidden for the measurement, so that overall more accurate measurement results are obtained.

Ein weiteres Mittel zur Verbesserung der Meßergebnisse besteht noch darin, daß spezifische Nährlösungen bei der Vorbereitung und Vermehrung verwendet werden, die speziell die Vermehrung der gesuchten Keime fördern und die Ver mehrung anderer Keime verlangsamen oder unterbinden.Another means of improving the measurement results is that specific nutrient solutions in the Preparation and propagation are used specifically promote the multiplication of the germs sought and Ver slow down or prevent the spread of other germs.

Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die An wendung der beschriebenen Stoffe beschränkt, sondern es können prinzipiell Indikatoren verwendet werden, die sich speziell an einer, nämlich der gesuchten Keimart anlagern, wobei ein fluoreszierender Farbstoff an diesem Indikator angelagert sein kann oder separat vorliegt und sich dann anlagert, wenn die gesuchte Keimart vorliegt. Weiterhin können auch verschiedene Schlüsselantibiotika zur Prüfung der Resistenz verwendet werden, wobei auch unterschied liche Mechanismen möglich sind, die bei vorhandener oder nicht vorhandener Resistenz die Anlagerung eines fluores zierenden Farbstoffs ermöglichen oder verhindern.The invention is of course not on the An limited use of the substances described, but it In principle, indicators can be used that are attach specifically to one, namely the type of germ sought, being a fluorescent dye on this indicator can be attached or present separately and then accumulates when the type of germ sought is present. Farther can also use various key antibiotics for testing of resistance can be used, whereby also differ Mechanisms are possible that exist with existing or non-existent resistance the addition of a fluores allow or prevent decorative dye.

In weiterer Ausbildung der Erfindung können statt zwei auch drei oder mehr Kriterien gleichzeitig untersucht werden, wobei eine entsprechende Zahl unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluoreszenzeffekte ausgewertet werden muß. Beispielsweise kann auch ein gleichzeitiger Nachweis verschiedener multiresistenter Keimarten durch einen Meßvorgang erfolgen, wozu eine entsprechende Zahl unterschiedlicher Fluoreszenzstrahlungen ausgewertet werden muß.In a further embodiment of the invention, instead of two also examined three or more criteria at the same time be a corresponding number of different Fluorescent dyes or fluorescence effects evaluated must become. For example, a simultaneous Detection of various multi-resistant types of germ by a measuring process, for which a corresponding number different fluorescent radiation can be evaluated got to.

Claims

1. Method for the detection of at least one multi-resistant germ type, in particular MRSA and VRE germs, using a flow cytometer, which has the following method steps:

1. 1.1 preparation of a germ suspension,
2. 1.2 multiplication of the germs in a nutrient solution,
3. 1.3 adding at least one indicator mixed with a fluorescent dye for the type of germ in question which specifically attaches or couples to this type of germ,
4. 1.4 adding a fluorescent other dye serving as an indicator of damaged cells and a key antibiotic to test resistance,
5. 1.5 passing the suspension thus formed through the flow cytometer and irradiating the largely isolated germs successively with a laser beam,
6. 1.6 Measuring each of the fluorescent radiation associated with the dyes when the laser beam strikes a germ to be checked and
7. 1.7 Evaluation of the large number of individual measurements at least as to whether and / or how many are proportionally or numerically lower, in which the particular type of germ sought was found in connection with a resistance to the antibiotic.

2. The method according to claim 1, characterized in that that as an indicator with the surface antigens of Antibodies connecting the desired germ type are used.

3. The method according to claim 2, characterized in that that PerCP-coupled and / or PE (Phycoerytrin) -coupled Antibodies that fluoresce red and / or fluorezein coupled (FITC [fluorescein isothiocyanate]) antibodies, that fluoresce green can be used.

4. The method according to claim 1, characterized in that as an indicator as a reactant with the surfaces enzyme of the desired type of germ used substrate which is coupled with a fluorescent dye.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that as the key antibiotic Penicillin derivative oxacillin, especially for MRSA germs, or vancomycin, in particular for VRE germs.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that as a dye for testing the Resistance associated with the key antibiotic Membrane potential sensitive dye, especially a Oxonol dye (DiBAC3) or a carbocyanine dye (DiOC3) is used.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the sample stream containing the germs is hydrodynamically focused before it passes the measuring point ( 14 ) irradiated by the laser beam ( 15 ), so that the germs pass the measuring point essentially individually.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the different fluorescence radiations are quantified by means of an optical detection system ( 16 , 18 ) during each measurement process, in particular by detecting the radiation amplitudes or radiation intensities.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for electronic blanking of those which differ significantly from the type of germ sought Germinate the forward-forming measure of cell size scattered light from the laser beam and / or a measure of that Lateral scattered light of the laser beam forming cell contents is detected, with fluorescence measurements on each germs detected by the laser beam only then carried out and / or evaluated if this germ by the Scattered light detection as in the searched tolerance range is recognized lying down.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that for evaluation with each measurement process the recorded fluorescence values into a two or three multidimensional table are entered, whereby Thresholds for the differentiation criteria indication and resistance are given.