DE19943743C2 - Procedure for the identification of binding partners with position-specific arrays - Google Patents

Procedure for the identification of binding partners with position-specific arrays

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Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur massenspektrometrischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positionsspezifischen Arrays, wobei man DOLLAR A auf ein Trägermaterial mittels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionsspezifisches Ligat-Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt, DOLLAR A das auf dem Trägermaterial fixierte positionsspezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Liganden inkubiert, anschließend nicht an das Ligat-Array gebundene Liganden entfernt und DOLLAR A der/die an das Ligat-Array gebundene/n Ligand/en weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert.Described is a method for mass spectrometric identification of binding partners with position-specific arrays, wherein DOLLAR A is used to produce a position-specific ligate array on a carrier material by means of small-volume reaction partners applied in a position-specific manner, wherein at least two successive reactions are carried out step by step, DOLLAR A that on the carrier material fixed position-specific ligate array incubated with a mixture of ligands, then ligands not bound to the ligate array removed and DOLLAR A the ligand (s) bound to the ligate array further characterized by means of mass spectrometry.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mas­ senspektrometrischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positions-spezifischen Arrays.The present invention relates to a method for mas spectrometric identification of binding partners with position-specific arrays.

Mit der fortschreitenden Entschlüsselung des menschlichen Genoms wird es mehr und mehr offensichtlich, daß die Funktion von Genen sowie das Verhalten von Genprodukten sehr schwierig oder in den meisten Fällen unmöglich vor­ herzusagen ist. Aus diesem Grund wird es immer wichtiger, Verfahren zu entwickeln, um die Funktion von Genen zu er­ mitteln. Die Funktion setzt sich dabei im wesentlichen aus dem dynamischen Auftreten und Verschwinden der Pro­ teine und ihre Interaktion mit Liganden zusammen, die in der Mehrzahl ebenfalls Proteine darstellen. Die Regulati­ on der Funktion von Proteinen ist ein extrem komplizier­ ter Prozeß, der auf verschiedenen Ebenen beeinflußt wird, so z. B. durch posttranslationale Modifikationen, ihre Halbwertszeiten, Kompartimentierung, aber auch dynami­ schen Veränderungen der Tertiärstruktur. Die Untersuchung der Funktion und der Interaktionen aller Proteine inner­ halb einer Zelle wird "Proteomics" genannt (Dove A.: Proteomics: translation genomics into products? In: Nature Biotechnology 1999 März, 17, S. 233-236; Hochstrasser D. F.: Proteome in perspective. In: Clin Chem Lab Med 1998 November, 36 (11), S. 825-836), die Gesamtheit aller Proteine einer Zelle wird als "Proteom" bezeichnet. Dieses Forschungsge­ biet wird einen enormen Einfluß auf die Identifizierung von Wirkstoffzielen, Wirkstoffzuschnitt und Wirkstoffent­ deckung haben.With the progressive decryption of the human It is becoming more and more obvious to the genome that the Function of genes and the behavior of gene products very difficult or impossible in most cases is predictable. For this reason, it is becoming increasingly important To develop procedures for the function of genes convey. The function is essentially set from the dynamic appearance and disappearance of the pro teine and their interaction with ligands that are involved in the majority also represent proteins. The regulati The function of proteins is extremely complicated process that is influenced at different levels so z. B. by post-translational modifications, their Half-lives, compartmentalization, but also dynamic changes in the tertiary structure. The investigation the function and interactions of all proteins within Half of a cell is called "Proteomics" (Dove A .: Proteomics: translation genomics into products? In: Nature Biotechnology 1999 March, 17, pp. 233-236; Hochstrasser D. F .: Proteome in perspective. In: Clin Chem Lab Med 1998 November, 36 (11), pp. 825-836), the entirety of all proteins one Cell is called "proteome". This research area offers a huge impact on identification of drug targets, drug cutting and drug discovery to have cover.

Die zur Darstellung des Proteoms einer Zelle derzeit fast ausschließlich verwendete Methode ist die zweidimensiona­ le Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE). Die Protei­ ne werden in der ersten Dimension durch eine isoelektri­ sche Fokussierung getrennt. Eine dazu orthogonal ausgeführte SDS-Elektrophorese bildet die zweite Dimension. Diese Methode ermöglicht heute die Analyse tausender Pro­ teine aus einem zweidimensionalen Gel innerhalb einiger Tage. Inzwischen ist man sich jedoch der Tatsache bewußt, daß es schwierig ist, mehr als 50 bis 60 Prozent eines Proteoms auf einem einzelnen 2D-Gel aufzutrennen, was an den sehr unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften der zellulären Proteine liegt. Des weiteren kommen die meisten zellulären Proteine in sehr geringen Mengen in der Zelle vor.Almost the one used to represent the proteome of a cell the only method used is the two-dimensional le polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE). The Protei ne areoelectri in the first dimension focus separately. An orthogonal one  SDS electrophoresis is the second dimension. This method enables the analysis of thousands of professionals today tones from a two-dimensional gel within some Days. However, people are now aware of the fact that it is difficult to have more than 50 to 60 percent of one What to separate proteomes on a single 2D gel the very different chemical and physical Properties of cellular proteins lies. Furthermore most cellular proteins come in very low levels Quantities in the cell.

Zu einer weiteren Analyse wird das im 2D-Gel aufgetrennte und als Bande oder Spot isolierte Protein vor seiner Elu­ tion aus der Matrix meist proteolytisch verdaut. Dazu muß die Matrix des Gels geschrumpft werden und die Bedingun­ gen im Gel für den Verdau geeignet sein. Der Verdau dau­ ert zudem mehrere Stunden.For a further analysis, the one separated in the 2D gel is separated and protein isolated as a band or spot in front of its elu mostly digested proteolytically from the matrix. To do this the matrix of the gel will shrink and the conditions be suitable for digestion in the gel. The digestion lasts also takes several hours.

Blüggel und Immler (Biospektrum 5/98, S. 39-44) beschrei­ ben im Anschluß an die oben genannten Verfahrensschritte eine weitere Charakterisierung von Peptid Fragmentspek­ tren mittels Massenspektrometrie. Diese nur für die Ana­ lyse eines einzelnen Proteinspots geeignete Methode ist jedoch sehr umständlich und immer noch weit von den für die effektive Analyse geforderten Automatisierungsgraden entfernt.Blüggel and Immler (Biospektrum 5/98, pp. 39-44) describe ben following the above process steps another characterization of peptide fragment spec using mass spectrometry. This only for the Ana lysis of a single protein spot is a suitable method however very cumbersome and still far from that for the effective analysis of the required levels of automation away.

Ein Schlüsselaspekt bei Proteomics und Wirkstoffindung ist die Identifizierung von Signalkaskaden (pathways) in Zusammenhang mit Rezeptor-Ligand-Interaktion-vermittelter Stimulierung von Zellen. Diese Signalkaskaden beinhalten Kaskaden von Protein-Protein-Interaktionen, die lediglich nichtkovalente physikalische Interaktionen von Netzwerk­ proteinen, aber auch Kontakte enzymatischen Typs, wie Phosphorylierung, Dephosphorylierung oder proteolytische Interaktionen sein können. A key aspect of proteomics and drug discovery is the identification of signal cascades (pathways) in Relationship with receptor-ligand interaction-mediated Stimulation of cells. These include signal cascades Cascades of protein-protein interactions that are only noncovalent physical interactions of network proteins, but also contacts of an enzymatic type, such as Phosphorylation, dephosphorylation or proteolytic Interactions can be.  

Die im Augenblick vorhandene Methode der Wahl zur Identi­ fizierung von zellulären interagierenden Partnern ist das "two-hybrid" Screeningsystem in Hefe (z. B. Colas und Brent, TIBTECH 1998, 16 S. 355-363). Dieser in vitro An­ satz führt jedoch oftmals zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen.The current method of choice for identi It is the creation of cellular interacting partners "two-hybrid" screening system in yeast (e.g. Colas and Brent, TIBTECH 1998, 16 pp. 355-363). This in vitro An However, sentence often leads to false positive or false negative results.

Die US 5,821,047 beschreibt einen weiteren aktuellen An­ satz zur Identifizierung von zellulären interagierenden Partnern, das sogenannte "phage display". Das Verfahren umfaßt die Fusion eines zu untersuchenden Proteins an die carboxyterminale Domäne des Gen III coat Proteins des fi­ lamentösen Phagen M13. Mit diesem auf der Oberfläche des Phagen M13 präsentierten Fusionsprotein wird dann nach neuen Liganden des zu untersuchenden Proteins gescreent.US 5,821,047 describes another current An set for the identification of cellular interacting Partners, the so-called "phage display". The procedure involves the fusion of a protein to be examined to the carboxy-terminal domain of the gene III coat protein of the fi lamentous phage M13. With this on the surface of the Phage M13 presented fusion protein is then post new ligands of the protein to be examined.

Eine weitere interessante und sich verbreitende Technik ist die Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Biomolekular-Interaktionsanalyse Massenspektrometrie (BIA/MS) (Nelson R. W. und Krone J. R.: Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). In: J Mol Recognit 1999 März-April, 12 (2), S. 77-93). Es bleibt abzuwarten, wie sich dieser Ansatz im Hinblick auf Signifikanz der Daten als auch auf nötige Automatisierung als praktikabel erweisen wird.Another interesting and spreading technique is the surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis Mass spectrometry (BIA / MS) (Nelson R. W. and Krone J. R .: Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA / MS). In: J Mol Recognit 1999 March-April, 12 (2), pp. 77-93). It remains to be seen how this turns out Approach with regard to data significance as well necessary automation will prove to be practicable.

Dazu werden auf Cellulosemembranen mit der sogenannten "Spot-Synthesetechnik" synthetisierte Peptide verwendet, um molekulare Erkennungsereignisse zu untersuchen.This is done on cellulose membranes with the so-called "Spot Synthesis Technique" uses synthesized peptides to investigate molecular recognition events.

Alle oben beschriebenen Verfahren zur Analyse des Pro­ teoms und der Untersuchung im Bereich der Proteomics wei­ sen erhebliche Nachteile auf. Sie sind experimentell auf­ wendig und zeitintensiv und erfassen bei der Analyse nicht alle Proteine einer Zelle auf einmal. Die 2D-PAGE ist zudem für viele Proteine nicht sensitiv genug und für die Proteomics-Analyse ungeeignet, da sie keine Interak­ tionen von Proteinen einer Zelle erfassen kann. All of the methods described above for analyzing the Pro teoms and the investigation in the field of proteomics have significant disadvantages. You're experimenting on agile and time-consuming and capture during analysis not all proteins in a cell at once. The 2D PAGE is also not sensitive enough for many proteins and for the proteomics analysis is unsuitable because it does not cations of proteins in a cell.  

Alle vorgenannten Verfahren und Methoden sind zudem für eine in der Wirkstoff-Entwicklung mehr und mehr gefragte Automatisierung ungeeignet.All of the above methods and methods are also for one more and more in demand in drug development Automation unsuitable.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver­ fahren zur Identifizierung von zellulären interagierenden Partnern für die Proteom-Analyse zur Verfügung zu stel­ len, das eine schnelle, preiswerte und zuverlässige Ana­ lysemethode zur Identifizierung von zellulären interagie­ renden Partnern darstellt und sich ohne große Probleme automatisieren läßt.It is therefore an object of the present invention to provide a ver drive to the identification of cellular interacting Available to partners for proteome analysis len, the fast, inexpensive and reliable Ana lysis method for the identification of cellular interaction partners and without major problems can be automated.

Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst.This object is achieved by the specified in claim 1 Features solved.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur massenspektrome­ trischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positi­ onsspezifischen Arrays, wird auf ein Trägermaterial mit­ tels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionspezifischer Ligat- Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt. Das auf dem Trägermaterial fixierte positions-spezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Liganden inkubiert, anschließend nicht an das Ligat-Array gebundene Liganden entfernt und der/die an das Ligat-Array gebundene/n Ligand/en weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert.In the method according to the invention for mass spectrums trical identification of binding partners with positi onspecific arrays, with a carrier material small volumes applied in a position-specific manner of reaction partners a position-specific ligate Array, making at least two increments consecutive reactions. That on the Carrier material fixed position-specific ligate array incubated with a mixture of ligands, then ligands not bound to the ligate array removed and the ligand (s) bound to the ligate array characterized by mass spectrometry.

Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß die Kom­ bination von Inkubation eines Liganden-Gemisches mit ei­ nem auf einem Träger gebundenen positions-spezifischen Array und anschließender Analyse der gebundenen Proteine mittels Massenspektrometrie die oben genannten Probleme des Standes der Technik vermeidet und eine preiswerte, schnelle, robuste und zuverlässige Methode zur Proteom-Analyse darstellt. Weiterhin kann dieses Verfahren ohne große Probleme vollständig automatisiert werden, so daß eine hoher Probendurchsatz bei geringen Kosten gewährlei­ stet ist.Surprisingly, it was found that the com combination of incubation of a ligand mixture with egg position-specific bound on a carrier Array and subsequent analysis of the bound proteins the above-mentioned problems by means of mass spectrometry of the prior art and an inexpensive, fast, robust and reliable method for proteome analysis  represents. Furthermore, this method can be done without big problems are fully automated so that guarantee a high sample throughput at low costs is steady.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, daß das Ligat-Array ein Peptidarray, Array aus Nucleinsäuren oder anderen organochemischen Verbindungen oder über Fragmentkondensation von Peptiden erhaltenes Proteinarray ist. Es ist insbesondere bevorzugt, daß das Gemisch von Liganden ein Zelllysat, Gemisch von Nucleinsäuren oder Gemisch von anderen organochemischen Verbindungen ist.In the method according to the invention, it is preferred that the ligate array is a peptide array, array of nucleic acids or other organochemical compounds or via Fragment condensation of peptides obtained protein array is. It is particularly preferred that the mixture of Ligands a cell lysate, mixture of nucleic acids or Mixture of other organochemical compounds.

Es werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst aufwendige Aufbereitungsschritte der aufgeschlossenen Zellen vermieden, da in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens alle Proteine einer Zel­ le ohne Reinigung auf einmal analysiert werden können. Die Verwendung von positions-spezifischen Arrays erlaubt zudem eine Standardisierung des Verfahrens. Das für das Verfahren verwendete Trägermaterial für das Peptidarray kann fest oder flexibel sein und besteht bevorzugterweise aus Harzbeads, Polymerpins oder Chipmaterial. Besonders bevorzugt ist es, wenn das verwendete Trägermaterial aus einer Polymermembran besteht, wie zum Beispiel einer Ny­ lon-, Cellulose- oder modifizierten Cellulose oder modi­ fizierten Polypropylenmembran.In the method according to the invention, there are elaborate preparation steps of the unlocked Cells avoided because in a preferred embodiment of the method according to the invention all proteins of a cell le can be analyzed at once without cleaning. The use of position-specific arrays allows furthermore a standardization of the procedure. That for that Process used carrier material for the peptide array can be fixed or flexible and preferably exists made of resin beads, polymer pins or chip material. Especially it is preferred if the carrier material used is made of a polymer membrane, such as a Ny lon, cellulose or modified cellulose or modes polypropylene membrane.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Zelllysat normalerweise ein Vollzelllysat verwendet, es kann jedoch auch ein durch Zentrifugation, Filtration oder andere geeignete Verfahren vorfraktioniertes Voll­ zelllysat verwendet werden. Das Zelllysat kann ein Lysat aus prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen sein, es können auch transformierte oder transgene Zellen verwen­ det werden. To carry out the method according to the invention a whole cell lysate is normally used as the cell lysate, however, it can also be by centrifugation, filtration or other suitable method of pre-fractionated full cell lysate can be used. The cell lysate can be a lysate from prokaryotic or eukaryotic cells, there can also use transformed or transgenic cells be det.  

Besonders bevorzugt ist es, wenn als Zelllysat ein 35S-Methionin-markiertes oder 35S-Cystein-markiertes Lysat verwendet wird.It is particularly preferred if a 35 S-methionine-labeled or 35 S-cysteine-labeled lysate is used as the cell lysate.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das Zelllysat zu­ sammen mit mindestens einem definierten Cofaktor verwen­ det wird. Als Cofaktoren können zum Beispiel Proteine oder Metallionen verwendet werden.Another embodiment of the Ver driving is characterized in that the cell lysate too can be used together with at least one defined cofactor det. Proteins, for example, can be used as cofactors or metal ions can be used.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray ver­ wendeten Peptide zwischen 3 und 30 Aminosäuren lang sind. Bevorzugt sind Peptide zwischen 6 und 15 Aminosäuren Län­ ge, besonders bevorzugt sind Peptide von 13 Aminosäuren Länge. Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Aus­ führungsform, bei der die für das Peptidarray verwendeten Peptide über einen Linker an das Trägermaterial fixiert sind. Dieser Linker kann Protease-sensitiv oder chemisch spaltbar sein.A preferred method according to the invention is also characterized in that the ver for the peptide array peptides used are between 3 and 30 amino acids long. Peptides between 6 and 15 amino acids in length are preferred peptides of 13 amino acids are particularly preferred Length. An off according to the invention is particularly preferred embodiment in which those used for the peptide array Peptides fixed to the carrier material via a linker are. This linker can be protease sensitive or chemical be fissile.

Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Peptidarray ein SPOT-Peptidarray ist.Another preferred method according to the invention is characterized in that the peptide array used is a SPOT peptide array.

Nicht an das Peptidarray gebundenes Protein kann erfin­ dungsgemäß mittels Waschen mit einem Puffer oder durch Fällung entfernt werden.Protein not bound to the peptide array can be invented according to the invention by washing with a buffer or by Precipitation are removed.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e vor der Proteasebehandlung vom Trä­ germaterial gelöst und anschließend einer Gelelektropho­ rese unterzogen wird/werden. One embodiment of the method according to the invention is characterized in that the one or more of the peptide array bound protein (s) before protease treatment germ material dissolved and then a gel electropho rese undergoes.  

Die Charakterisierung der Protease-behandelten Proteine oder der Liganden oder abgespaltenen Liganden erfolgt er­ findungsgemäß mittels Massenspektrometrie, bevorzugt mit­ tels MALDI oder ESI Massenspektrometrie, ganz besonders bevorzugt mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie.The characterization of the protease-treated proteins or the ligands or cleaved ligands it occurs according to the invention by means of mass spectrometry, preferably with MALDI or ESI mass spectrometry, very special preferably using MALDI-TOF mass spectrometry.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Tatsache, daß sich alle Schritte der Proteomics-Analyse vollständig automatisieren lassen.A particular advantage of the method according to the invention is the fact that all the steps of proteomics analysis fully automated.

Die SPOT-Synthese (R. Frank, Tetrahedron 1992, 48, 9217-9232, DE-OS 40 27 675) ist eine etablierte Methode zur ortsadressierten Synthese von Peptiden und deren Scree­ ning auf Bindung zu Proteinen (A. Kramer, J. Schneider-Mergener, Meth. Mol. Biol. 1998, 87, 25-39, A. Kramer, A. Schuster, U. Reineke, J. Schneider-Mergener, METHODS (Comp. Meth. Enzymol.) 1994, 6, 388-395.). Neben Peptiden sind auf diese Weise auch andere Verbindungsklassen wie z. B. Peptoide (T. Ast, N. Heine, L. Germeroth, J. Schnei­ der-Mergener, H. Wenschuh, Tetrahedron Lett. 1999, 40, 4317-4318) zugänglich.SPOT synthesis (R. Frank, Tetrahedron 1992, 48, 9217-9232, DE-OS 40 27 675) is an established method for site-directed synthesis of peptides and their scree binding to proteins (A. Kramer, J. Schneider-Mergener, Meth. Mol. Biol. 1998, 87, 25-39, A. Kramer, A. Schuster, U. Reineke, J. Schneider-Mergener, METHODS (Comp. Meth. Enzymol.) 1994, 6, 388-395.). In addition to peptides are other connection classes such as z. B. Peptoide (T. Ast, N. Heine, L. Germeroth, J. Schnei der-Mergener, H. Wenschuh, Tetrahedron Lett. 1999, 40, 4317-4318) accessible.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit den unterschied­ lichsten Ligaten anwendbar. Geeignete Ligate, welche sich zu den erfindungsgemäßen positionsspezifischen Ligat-Arrays aufbauen lassen, sind beispielsweise, ohne auf diese beschränkt zu sein, Peptide, β- und γ-Peptide, Pep­ toide, (Oligo-)Harnstoffe, (Oligo-)Thioharnstoffe, (Oligo-)Carbamate, (Oligo-)Carbonate, Triazine, (Oligo-)Sulfonamide, Azatide sowie Glyco-Konjugate der vorgenannten Verbindungen, (Oligo-)Saccharide, PNA (Peptide-Nulceic-Acid), Hydantoine, 2-Piperazone, Isochinoline, Benzodiazepine, pharmakologisch aktive Ver­ bindungen und Wirkstoffe (beispielsweise Antidepressiva, β-Blocker, cardiovascular aktive Verbindungen, Antarrhythmika, Antihistaminika, Tranquilantien, H2-Blocker, Acidose-Therapeutika, Aminoglycosid-Antibiotika, Amoebicide, Anästhetika, Analgetica, Androgene, Antacida, Anthelmintica, Antiallergika, Antiandrogene, Antibiotika, Anticholinergika, Anticoagulantien, Anticonvulsiva, Anti­ dote, Antiemetica, Antifibrinolytika, Antihypertensiva, Antihypertonica, Antihypotonica, Antimalariamittel, An­ timycotica, Antiparkinson-Mittel, Antiphlogistika, Antip­ soriatica, Antipyretica, Antirhematica, Antiscabiasa, An­ tiseborrhoica, Antiseptica, Antitumormittel, Antitussiva, Atemanaleptika, Bronchiolytika, Calciumantagonisten, Car­ diotonica, Cerebrotonica, Chemotherapeutica, Cholesterin­ senker, Cytostatika, Dehydropeptidase-Inhibitoren, Des­ infizentia, Diagnostika, Diuretica, Expektorantien, Fi­ brinolytika, Fungicide, Gestagene, Glucocorticoide, Gona­ dorelin (LH-RH)-Agonisten, Hypnotica, Immunstimulantien, Immunsuppressiva, Keratolytika, β-Lactamase-Inhibitoren, Laxativa, Lebertherapeutika, Lichtschutzmittel, Lipidsen­ ker, LipolyseInhibitoren, Lipotropica, Lokalanästhetika, Malariamittel, Miotica, Muskelrelaxantien, Mydriatica, Neuroleptika, Neurotropica, Ophthalmologika, Parasympa­ thicomimetika, Prostatatherapeutika, Protelytika, Phy­ chotropika, Rhinologika, Röntgenkontrstmittel, Sedativa, Spasmolytika, Spermatocide, Sympathicomimetika, Throm­ bocyten-Aggregationshemmer, Trypsin-Inhibitoren, Tuberku­ lostatika, Ulcustherapeutika, Vasoconstrictoren, Vasodi­ latatoren, Venemittel, Virustatica, Vitamine) oder Natur­ stoffe (beispielsweise Steroide, Terpene, Alkaloide, Fla­ vonoide, Fettsäuren, Lipide, Pheromone, Riechstoffe, An­ tikörper, Hormone, Gifte, Abwehr-, Signal- und Wuchsstof­ fe, Enzyme) und andere als die oben genannten organoche­ mischen Verbindungen.The method according to the invention can be used with a wide variety of ligates. Suitable ligates, which can be built up into the position-specific ligate arrays according to the invention, include, but are not limited to, peptides, β- and γ-peptides, peptides, (oligo) ureas, (oligo) thioureas, ( Oligo-) carbamates, (oligo-) carbonates, triazines, (oligo-) sulfonamides, azatides and glyco-conjugates of the aforementioned compounds, (oligo-) saccharides, PNA (peptide-nucleic acid), hydantoins, 2-piperazones, isoquinolines , Benzodiazepines, pharmacologically active compounds and active ingredients (for example antidepressants, β-blockers, cardiovascular active compounds, antarrhythmics, antihistamines, tranquilizers, H 2 blockers, acidosis therapeutics, aminoglycoside antibiotics, amoebicides, anesthetics, analgesics, androgens, androgenic, androgenic Anthelmintica, antiallergics, antiandrogens, antibiotics, anticholinergics, anticoagulants, anticonvulsants, anti dote, antiemetics, antifibrinolytics, antihypertensives, antihypertonica, antihypotonica, antimalar iamittel, An timycotica, Antiparkinson-Mittel, Antiphlogistika, Antip soriatica, Antipyretica, Antirhematica, Antiscabiasa, An tiseborrhoica, Antiseptica, Antitumormittel, Antitussiva, Breathaleptics, Bronchiolytika, Calciumantagonisten, Car diotonica, Therapeutic agents, Cerotonic agents, Cerebrotonic, Cerebrotonic , Des infizentia, diagnostics, diuretics, expectorants, fi brinolytics, fungicides, gestagens, glucocorticoids, gona dorelin (LH-RH) agonists, hypnotics, immunostimulants, immunosuppressants, keratolytics, β-lactamase inhibitors, laxatives, laxatives, laxatives ker, lipolysis inhibitors, lipotropics, local anesthetics, antimalarials, miotics, muscle relaxants, mydriatics, neuroleptics, neurotropics, ophthalmologics, parasympa thicomimetics, prostate therapeutics, protelytics, phy chotropics, rhinologics, x-ray anticonvulsants, sedative agents, spermatic agents, sedatives, sedatives, sedatives Trypsin inhibitors, tuberculosis drugs, ulcer therapies, vasoconstrictors, vasodilators, venous agents, virustatics, vitamins) or natural substances (e.g. steroids, terpenes, alkaloids, fla vonoids, fatty acids, lipids, pheromones, fragrances, antibodies, hormones, poisons -, Signal- and Wuchsstof fe, enzymes) and other than the above-mentioned organic compounds.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben werden. The invention is illustrated by the following examples to be discribed.  

Dabei zeigt Fig. 1, daß 35S-markierte Proteine an immo­ bilisierte Peptide binden, welche die intrazelluläre EPOR-Domäne repräsentieren. Cellulose-gebundene überlap­ pende Peptide (13mere, 10 Aminosäuren Überlappung), die die gesamte intrazelluläre Domäne des EPOR abdecken (Peptid Nummer 1 repräsentiert Aminosäuren 248-260, Num­ mer 2 Aminosäuren 251-263 usw. für Sequenzinformation siehe Fig. 3), wurden mit Lysaten von EPO stimulierten (A) oder unbehandelten (B) J2E erythroleukämischen Zellen nach Markierung mit 35S-Methionin/Cystein inkubiert. Ge­ bundene Proteine wurden durch Autoradiographie detek­ tiert.Here, FIG. 1 shows that 35 S-labeled proteins bind to immo-stabilized peptides representing the intracellular domain EPOR. Cellulose-bound overlapping peptides (13mers, 10 amino acids overlap) covering the entire intracellular domain of the EPOR (peptide number 1 represents amino acids 248-260, number 2 amino acids 251-263 etc. for sequence information see FIG. 3) incubated with lysates of EPO-stimulated (A) or untreated (B) J2E erythroleukaemic cells after labeling with 35 S-methionine / cysteine. Bound proteins were detected by autoradiography.

Fig. 2 zeigt eine in vitro Translation von cDNA's, die für verschiedene Signalmoleküle kodieren. Die cDNA's wur­ den subkloniert und einer in vitro Translation unter der Verwendung von T7 und T3 Polymerase wie beschrieben un­ terzogen (eine von beiden Reaktionen diente als interne Kontrolle). Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde mit­ tels PAGE getrennt. Radioaktive Proteine wurden durch Au­ toradiographie nach fluorographischer Verstärkung detek­ tiert. Das Molekulargewicht ist auf der rechten Seite an­ gegeben (in kDa). Fig. 2 shows an in vitro translation of cDNAs encoding various signaling molecules. The cDNA's were subcloned and subjected to in vitro translation using T7 and T3 polymerase as described (one of the two reactions served as an internal control). An aliquot of the reaction mixture was separated using PAGE. Radioactive proteins were detected by toradiography after fluorographic amplification. The molecular weight is given on the right side (in kDa).

Fig. 3 zeigt ein Bindungsmuster von JAK2, SHP1 und PLCγ an immobolisierte Peptide der EPOR-Sequenz. (A) Sequenzen von Cellulose-gebundenen überlappenden Peptiden. (B) Ra­ dioaktiv markierte Proteine wurden mit den immobilisier­ ten Peptiden wie beschrieben inkubiert und durch Autora­ diographie sichtbar gemacht. (C) Die Sequenz der gesamten intrazellulären Domäne ist gezeigt und Regionen mit den stärksten radioaktiven Signalen sind für die entsprechen­ den angegebenen Proteine mit Kästen markiert. Fig. 3 shows a weave pattern of JAK2, SHP1 and PLCγ to immobolisierte peptides of the EPOR sequence. (A) Sequences of cellulose-bound overlapping peptides. (B) Radioactive labeled proteins were incubated with the immobilized peptides as described and visualized by autoradiography. (C) The sequence of the entire intracellular domain is shown and regions with the strongest radioactive signals are marked with boxes for the corresponding proteins.

Fig. 4 zeigt ein MALDI Mass Fingerprint des Spots E2 (Thyrosin-Protein-Kinase JAK3). Fig. 4 shows a MALDI mass fingerprint of the spot E2 (tyrosine-protein kinase JAK3).

Fig. 5 zeigt die MS-Fit-Rechnung des Spots E2 aus Fig. 4 dar FIG. 5 shows the MS fit calculation of the spot E2 from FIG. 4

Fig. 6 zeigt die 35S-Aktivität nach Inkubation einer Bi­ bliothek aus 1600 Dipeptoiden mit 35S-Methionin markier­ tem Zell-Lysat. Fig. 6 shows the 35 S activity after incubation of a library of 1600 dipeptoids with 35 S-methionine-labeled cell lysate.

Identifizierung von Bindungspartnern des Erythropoetin-Rezeptors mit positions-spezifischen Peptidarrays und MassenspektrometrieIdentification of binding partners of the erythropoietin receptor with position-specific peptide arrays and Mass spectrometry

Um potentielle intrazellulär interagierende Partner des Erythropoetin Rezeptors (EPOR) zu identifizieren, wurden Zelllysate von Erythropoetin (EPO) stimulierten und nicht-stimulierten Zellen mit Cellulosemembran-gebundenen EPOR-spezifischen Peptidscans inkubiert, der Proteinge­ halt verschiedener ausgewählter Spots einer Gelelektro­ phorese unterzogen und distinkte Banden mittels Massen­ spektrometrie analysiert.In order to identify potential intracellularly interacting partners of the Erythropoietin receptor (EPOR) have been identified Cell lysates from erythropoietin (EPO) stimulated and non-stimulated cells with cellulose membrane-bound Incubated EPOR-specific peptide scans, the protein gene hold various selected spots of a gel electric subjected to phorese and distinct bands by means of masses spectrometry analyzed.

In früheren Experimenten konnte gezeigt werden, daß Inku­ bation eines Sets von an eine Cellulosemembran gebundenen überlappenden Peptiden, die vom cytoplasmatischen Teil des 55 kDa Tumor-Nekrosisfaktor Rezeptor (TNF-R55) stamm­ ten, mit einem 35S-Methionin markierten Jurkat Zelllysat zu einer Bindung von zellulären Proteinen an distinkte Spots des TNF-R Scans führte. Die durch diesen Ansatz hervorgehobenen TNF-R Regionen entsprachen exakt den vor­ her als für die verschiedenen biologischen Funktionen dieses Rezeptors verantwortlich beschriebenen intrazellu­ lären TNF-R Regionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß ein durch das Hefe "two-hybrid" System neu entdecktes Protein FAN spezifisch mit distinkten Spots des TNF-R Scans interagierte, der einer Region entsprach, die für die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase bekannt ist. Die Verwendung der zwei Techniken führte deshalb zu einer relativ schnellen Identifizierung eines neuen an der TNF Signalkaskade beteiligten Proteins. Dennoch war dieser Prozeß relativ arbeitsaufwendig, da eine große Zahl von durch das "two-hybrid" System erhaltenen cDNA Klonen (< 50) auf eine Bindung an eine bestimmte Region des Rezeptors hin zu charakterisieren waren.In previous experiments it could be shown that incubation of a set of overlapping peptides bound to a cellulose membrane, which came from the cytoplasmic part of the 55 kDa tumor necrosis factor receptor (TNF-R55), with a 35 S-methionine-labeled Jurkat cell lysate into one Binding of cellular proteins to distinct spots of the TNF-R scan resulted. The TNF-R regions highlighted by this approach corresponded exactly to the intracellular TNF-R regions previously described as responsible for the various biological functions of this receptor. Furthermore it could be shown that a protein FAN newly discovered by the yeast "two-hybrid" system interacted specifically with distinct spots of the TNF-R scan which corresponded to a region which is known for the activation of the neutral sphingomyelinase. The use of the two techniques therefore led to a relatively quick identification of a new protein involved in the TNF signal cascade. Nevertheless, this process was relatively labor-intensive, since a large number of cDNA clones obtained by the "two-hybrid" system (<50) could be characterized for binding to a specific region of the receptor.

Um einen direkteren Weg zur Identifizierung von intera­ gierenden Partnern in der zellulären Signalkaskade unter Umgehung des Hefe "two-hybrid" Systems zu untersuchen, wurde versucht, Proteine direkt von den Spots zu erhalten und diese sie durch tryptischen Verdau, Massenspektrome­ trie und Datenbankanalyse zu analysieren. Um diesen neuen experimentellen Ansatz zu testen, wurde in diesem Fall ein Cellulosemembran-gebundener von EPO-R stammender Pep­ tidscan synthetisiert, der dann mit EPO-ansprechenden J2E Erythroleukämischen Zelllysaten inkubiert wurde, die mit 35S-Methionin/Cystein markiert waren (siehe Fig. 1). Es konnte eine Bindung an distinkte Rezeptor-spezifische Spots beobachtet werden. Überraschenderweise gab es einen klaren Unterschied in der Bindung bei der Verwendung ei­ nes Lysats einer mit EPO stimulierten J2E Zelle.In order to investigate a more direct way of identifying interacting partners in the cellular signal cascade bypassing the yeast "two-hybrid" system, attempts were made to obtain proteins directly from the spots and to analyze them by tryptic digestion, mass spectrometry and database analysis , To test this new experimental approach, a cellulose membrane-bound EPO-R derived peptide scan was synthesized in this case, which was then incubated with EPO-responsive J2E erythroleukaemic cell lysates labeled with 35 S-methionine / cysteine (see Fig . 1). Binding to distinct receptor-specific spots was observed. Surprisingly, there was a clear difference in binding when using a lysate from an EPO-stimulated J2E cell.

Die intrazellulären Domänen der Cytokinrezeptoren sind bekannterweise aus strukturellen Modulen für die Bindung von spezifischen zellulären Signalproteinen zusammenge­ setzt. Es wird vermutet, daß die Fähigkeit, mit bestimm­ ten Targets zu interagieren, Kompetenz und Spezifität bei der Regulation der Genexpression bewirkt. Um eine neue Strategie zur Analyse der Interaktionen zwischen zellulä­ ren Proteinen und Peptiden, welche die intrazelluläre Do­ mäne des EPO Rezeptors repräsentieren, zu untersuchen, wurden durch die Spot-Synthese hergestellte Cellulose-gebundene Peptide angewendet. Zelluläre Proteine der Erythroleukämischen EPO-ansprechenden Zellinie J2E wurden in vivo durch die Inkorporation von 35S-Aminosäuren mar­ kiert und wie beschrieben mit den immobilisierten Pepti­ den inkubiert. Fig. 1 zeigt die Bindungsmuster von Zell­ lysaten aus mit EPO stimulierten oder unbehandelten Zel­ len. Es konnten starke Protein/Peptid Interaktionen hauptsächslich mit Peptiden beobachtet werden, die der proximalen Membranregion des EPOR entsprachen. Die Stimu­ lierung mit EPO erhöht offensichtlich die Affinität eini­ ger Proteine zu bestimmten Peptiden, hingegen bleibt die Mehrheit der Interaktionen unverändert.The intracellular domains of the cytokine receptors are known to be composed of structural modules for the binding of specific cellular signal proteins. It is believed that the ability to interact with certain targets causes competence and specificity in the regulation of gene expression. In order to investigate a new strategy for analyzing the interactions between cellular proteins and peptides, which represent the intracellular domain of the EPO receptor, cellulose-bound peptides produced by spot synthesis were used. Cellular proteins of the erythroleukaemic EPO-responsive cell line J2E were marked in vivo by the incorporation of 35 S-amino acids and incubated as described with the immobilized peptides. Fig. 1 shows the binding pattern of cell lysates from EPO stimulated or untreated cells. Strong protein / peptide interactions were observed mainly with peptides that corresponded to the proximal membrane region of the EPOR. EPO stimulation obviously increases the affinity of some proteins for certain peptides, but the majority of the interactions remain unchanged.

Um die Bindungseigenschaften einzelner Proteine zu unter­ suchen, für die bekannt war, daß sie mit dem EPOR intera­ gieren, wurde eine Auswahl von in vitro translatierten Proteinen in demselben System verwendet. Das Vorhanden­ sein und Reinheit von einzelnen radioaktiven Proteinen der erwarteten Größe wurde durch PAGE überprüft (Fig. 2). Nachfolgende Versuche wurden unter der Verwendung von Präparationen durchgeführt, die eine radioaktiv markierte Proteinspezies enthalten um sicherzustellen, daß alle ge­ fundenen Interaktionen spezifisch sind.To investigate the binding properties of individual proteins that were known to interact with the EPOR, a selection of in vitro translated proteins were used in the same system. The presence and purity of individual radioactive proteins of the expected size was checked by PAGE ( Fig. 2). Subsequent experiments were carried out using preparations containing a radiolabelled protein species to ensure that all interactions found were specific.

Das Bindungsmuster von drei Signalmolekülen, die bekann­ termaßen am EPOR-Komplex beteiligt sind, ist in Fig. 3 dargestellt. Die markierten Proteine interagieren spezi­ fisch mit den von EPOR stammenden Peptiden. JAK2 wird als die entscheidende Kinase betrachtet, die EPOR-induzierte Signalaktivitäten vermittelt und für das Fehlen jeglicher intrinsischer Enzymaktivitäten in der intrazellulären Do­ mäne substituiert. JAK2 bindet vornehmlich an die sehr Membran-proximalen Aminosäuren und zusätzlich an Peptide, die einer distalen Region des Rezeptors entsprechen.The binding pattern of three signaling molecules which are known to be involved in the EPOR complex is shown in FIG. 3. The labeled proteins interact specifically with the peptides derived from EPOR. JAK2 is considered the key kinase that mediates EPOR-induced signaling activities and substitutes for the lack of any intrinsic enzyme activity in the intracellular domain. JAK2 binds primarily to the very membrane-proximal amino acids and also to peptides that correspond to a distal region of the receptor.

Die Membran-proximale Bindung stimmt mit den Daten über EPOR-Mutanten überein, die wiederholt gezeigt haben, daß JAK2 mit stark carboxyterminal trunkierten Rezeptorformen Immunopräzipitiert. Zusätzlich beseitigen Mutationen in der Region nahe der Membran die JAK2-Bindung und -Funktion gleichermaßen. Eine zweite Interaktionsstelle wurde in einem mehr distalen Teil des Rezeptors identifi­ ziert. Interessanterweise bindet SHP1, eine Tyrosinphos­ phatase, die bekannterweise funktionell an der EPO-induzierten Signalkaskade beteiligt ist, mit hoher Affi­ nität an dieselben Peptide, die Aminosäuren 386-398 und ebenso an die proximale Membran-Aminosäuresequenz wie für JAK2. Es wurde früher gezeigt, daß die Phosphatase, wel­ che die SH2-Domäne enthält, an das Phosphotyrosin 429 im carboxyterminalen Teil des aktivierten Rezeptors bindet. Die hier vorgelegten Ergebnisse wurden mit unphosphory­ lierten Peptiden erhalten, obwohl eine Phosphorylierung durch eine Kinase, die in dem für die in vitro Translati­ on verwendeten Reticulocytenlysat vorliegen könnte nicht vollständig auszuschließen ist. Das Bindungsmuster zeigt, daß vielleicht zusätzliche Interaktionen unabhängig von einer Phosphorylierung existieren. JAK2 und SHP1 wurden als funktional zusammenhängend beschrieben und interagie­ ren ebenso in in-vitro Experimenten. Wie oben genannt, enthält das für die in vitro Translation verwendete Lysat zusätzliche nichtradioaktive Proteine, die in der Bin­ dungsreaktion stören können. Dies könnte eine Erklärung dafür sein, daß JAK2 an die bevorzugte SHP1 Stelle bindet und umgekehrt. Wenn Bindung von "kaltem" JAK2 und SHP1 an die Peptide annehmen, kann radioaktives Jak2 und SHP1 wechselwirken und dadurch indirekt an die Peptide gebun­ den werden. Die genaue Stelle der Interaktion für PLCγ und den EPOR ist bisher noch nicht beschrieben. Ob PLCγ-Bindung eine Bindung an spezifische Tyrosine innerhalb des EPOR benötigt, bleibt festzustellen. Unsere Daten deuten auf eine Bindungsdomäne in der Nähe des C-Terminus hin, die möglicherweise zu der vorgeschlagenen SH2-Phosphotyrosin Interaktion führt. The membrane-proximal binding matches the data EPOR mutants that have repeatedly shown that  JAK2 with strongly carboxy-terminally truncated receptor forms Immunoprecipitated. Additionally eliminate mutations in the region near the membrane, the JAK2 bond and -Function alike. A second interaction point was identified in a more distal part of the receptor ed. Interestingly, SHP1, a tyrosine phos, binds phatase, which is known to be functionally induced at the EPO Signal cascade is involved with high affi to the same peptides, amino acids 386-398 and the proximal membrane amino acid sequence as well as for JAK2. It has previously been shown that the phosphatase, wel contains the SH2 domain to which phosphotyrosine 429 im carboxy-terminal part of the activated receptor binds. The results presented here were with unphosphory gated peptides, although phosphorylation by a kinase, which is used for the in vitro translati Reticulocyte lysate used could not be present is to be completely excluded. The bond pattern shows that maybe additional interactions regardless of phosphorylation exist. JAK2 and SHP1 were described as functionally coherent and interactive also in in-vitro experiments. As mentioned above, contains the lysate used for in vitro translation additional non-radioactive proteins that are in the bin can interfere with the reaction. This could be an explanation ensure that JAK2 binds to the preferred SHP1 site and vice versa. When binding of "cold" JAK2 and SHP1 accepting the peptides can radioactive Jak2 and SHP1 interact and thereby indirectly bound to the peptides that will. The exact location of the interaction for PLCγ and the EPOR has not yet been described. If PLCγ binding binds to specific tyrosines within of the EPOR remains to be determined. Our dates indicate a binding domain near the C-terminus towards the proposed one SH2-phosphotyrosine interaction leads.  

Um den oben beschriebenen Ansatz weiter zu vertiefen, wurde untersucht, ob es möglich ist, Proteine zu identi­ fizieren, die an Peptide gebunden sind, welche von der Rezeptorsequenz stammen. Dazu wurden Peptide verwendet, die eine starke Interaktion mit zellulären Proteinen zeigten, mit Zelllysaten inkubiert und die Proteine nach ausgiebigem Waschen wie beschrieben eluiert. Nach Tren­ nung auf Acrylamid wurden diese Proteine gefärbt, in-Gel enzymatisch verdaut, die Fragmente isoliert und einer Massenspektrometrie unterzogen. Die Reinheit und Menge der in den Gelbanden vorhandenen Proteine war für absolut ausreichend, um die aus den Peptidspots erhaltene Pro­ teinspezies über Peptid Mass Fingerprints zu identifizie­ ren. Einige dieser Proteine sind für Funktionen in Zusam­ menhang mit EPOR nicht beschrieben. Zum Beispiel wurde die Janus Kinase JAK3, von der bekannt ist, daß sie an IL-2,4,7,9,15 Signalkaskaden beteiligt ist, als ein Bin­ departner von Peptiden aus der EPOR-Sequenz identifiziert (Fig. 4 und Fig. 5). Weitere Untersuchungen über die funktionelle Relevanz der identifizierten Proteine fol­ gen.In order to further deepen the approach described above, it was examined whether it is possible to identify proteins which are bound to peptides which originate from the receptor sequence. For this purpose, peptides were used which showed a strong interaction with cellular proteins, incubated with cell lysates and, after extensive washing, the proteins eluted as described. After separation on acrylamide, these proteins were stained, digested enzymatically in-gel, the fragments isolated and subjected to mass spectrometry. The purity and amount of the proteins present in the gel bands was absolutely sufficient to identify the protein species obtained from the peptide spots via peptide mass fingerprints. Some of these proteins have not been described for functions in connection with EPOR. For example, the Janus kinase JAK3, which is known to be involved in IL-2,4,7,9,15 signal cascades, has been identified as a bin separator of peptides from the EPOR sequence (FIGS . 4 and 6) . 5). Further studies on the functional relevance of the identified proteins follow.

In-Gel-VerdauIn-gel digestion

Ein von Shevchenko et al. (1) verwendetes und leicht mo­ difiertes In-Gel-Verdau Verfahren wurde angewendet. Die Proteinspots wurden ausgeschnitten, mit 50% Acetonitril in 25 mM Ammoniumbicarbonat, durch Dehydrierung in Aceto­ nitril geschrumpft und in einer Vakuumzentrifuge getrock­ net.A by Shevchenko et al. (1) used and slightly mo Differentiated in-gel digestion procedure was used. The Protein spots were cut out with 50% acetonitrile in 25 mM ammonium bicarbonate, by dehydration in Aceto nitrile shrunk and dried in a vacuum centrifuge net.

Die Gelstücke wurden 10 µl 5 mM Ammoniumbicarbonat mit 300 ng Trypsin aufgequollen. Nach 60 min, wurde 5 µl 5 mM Ammoniumbicarbonat hinzugefügt, um die Gelstücke während des tryptischen Verdaus feucht zu halten (37°C, über Nacht). Um die Peptide zu extrahieren, wurden 15 µl 0,5% Trifluoressigsäure (TFA) in Acetonitril hinzugefügt und die Proben für 5 min beschallt. Die Peptide wurden direkt aus der abgetrennten Flüssigkeit mittels MALDI Massenspe­ trometrie analysiert.The gel pieces were 10 µl of 5 mM ammonium bicarbonate 300 ng of trypsin swollen. After 60 min, 5 ul 5 mM Ammonium bicarbonate added to the gel pieces during keep the tryptic digestion moist (37 ° C, above Night). In order to extract the peptides, 15 µl 0.5%  Trifluoroacetic acid (TFA) added in acetonitrile and the samples are sonicated for 5 min. The peptides were direct from the separated liquid using MALDI mass sp trometry analyzed.

MALDI Massenspetrometrie und DatenbanksucheMALDI mass spectrometry and database search

Die massenspektrometrischen Messungen wurden auf einer Voyager-DE STR BioSpectrometrie Workstation MALDI-TOF Massenspektrometer (Perseptive Biosystems, Inc.) durchge­ führt. 2 µl der Analyselösung wurde mit 2 µl alpha-Cyano- 4-hydroxyzimtsäure (4-HCCA) Matrixlösung, bestehend aus 10 mg Matrix in 1 ml 0,3% TFA in Acetonitril-Wasser (1 : 1, v/v) gelöst, gemischt. Von der erhaltenen Mischung wurde 1 µl auf die Probenplatte aufgebracht. Die Proben wurden bei Raumtemperatur (24°C) luftgetrocknet. Alle Messungen wurden im Reflektionsmodus bei einer Beschleunigungsspan­ nung von 20 kV, 70% Gitterspannung und einer Verzögerung von 200 ns durchgeführt. Jedes erhaltene Spektrum war das Mittel aus 256 Laserbeschüssen. Die Massenspektren wurden unter der Verwendung bekannter Trypsinfragmente als in­ terne Standards kalibriert. Die bestimmten Peptidmassen wurden mit theoretischen Massen von Proteinen aus der NCBInr. 11.09.98 Datenbank unter der Verwendung des Such­ programms MS-FIT verglichen (http://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/msfit.htm).The mass spectrometric measurements were carried out on a Voyager-DE STR BioSpectrometry workstation MALDI-TOF Mass spectrometer (Perseptive Biosystems, Inc.) leads. 2 µl of the analysis solution was mixed with 2 µl alpha-cyano 4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA) matrix solution consisting of 10 mg matrix in 1 ml 0.3% TFA in acetonitrile water (1: 1, v / v) dissolved, mixed. From the mixture obtained 1 µl applied to the sample plate. The samples were air dried at room temperature (24 ° C). All measurements were in reflection mode at an acceleration chip voltage of 20 kV, 70% grid voltage and a delay performed by 200 ns. Every spectrum received was that Average of 256 laser shots. The mass spectra were using known trypsin fragments as in internal standards calibrated. The specific peptide masses were made with theoretical masses of proteins from the NCBInr. 09/11/98 Database using the search programs MS-FIT compared (Http://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/msfit.htm).

Bestimmung von Bindungspartnern einer Peptoid-BibliothekDetermination of binding partners in a peptoid library

Eine Bibliothek aus 1600 Dipeptoiden (Membrangröße: 9 cm × 9 cm) der allgemeinen Formel I
A library of 1600 dipeptoids (membrane size: 9 cm × 9 cm) of the general formula I

worin R1 und R2 für beliebige Reste stehen,
wurde mit einem 35S-Methionin markiertem Zell-Lysat inku­ biert. Die Positionen A, B und C, stellen dabei die fol­ gen Verbindungen dar:where R 1 and R 2 represent any radicals,
was incubated with a 35 S-methionine labeled cell lysate. Positions A, B and C represent the following connections:

Dipeptoid A Dipeptoid A

Dipeptoid B Dipeptoid B

Dipeptoid C Dipeptoid C

Claims (27)

1. Verfahren zur massenspektrometrischen Charakterisie­ rung bzw. Identifizierung von Bindungspartnern mit positionsspezifischen Arrays, wobei man
auf einem Trägermaterial mittels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionspezifisches Ligat-Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt,
das auf dem Trägermaterial fixierte positions­ spezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Ligan­ den inkubiert,
anschließend nicht an das Ligat-Array gebundene Li­ ganden entfernt und
den/die an das Ligat-Array gebundenen Liganden weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert bzw. i­ dentifiziert.1. Method for mass spectrometric characterization or identification of binding partners with position-specific arrays, where one
a position-specific ligate array is produced on a carrier material by means of position-specific applied small volumes of reaction partners, wherein at least two successive reactions are carried out step by step,
incubate the position-specific ligate array fixed on the carrier material with a mixture of ligand,
subsequently removed ligands not bound to the ligate array and
further characterized or diagnosed the ligand (s) bound to the ligate array by means of mass spectrometry. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ligat-Array ein Peptidarray, Array aus Nuc­ leinsäuren oder anderen organochemischen Verbindungen oder über Fragmentkondensation von Peptiden erhalte­ nes Proteinarray ist.2. The method according to claim 1, characterized in that that the ligate array is a peptide array, array from Nuc linseed acids or other organochemical compounds or via fragment condensation of peptides protein array. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch von Liganden ein Zelllysat, Gemisch von Nucleinsäuren oder Gemisch von anderen organoche­ mischen Verbindungen ist.3. The method according to claim 1, characterized in that the mixture of ligands is a cell lysate, mixture of nucleic acids or a mixture of other organoche mix connections is. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der auf dem Trägermaterial hergestellte Ligatarray ein Peptidarray ist,
das auf das Trägermaterial fixierte positions­ spezifische Peptidarray mit einem Zelllysat inkubiert,
anschließend nicht an das Peptidarray gebundenes Pro­ tein entfernt und
das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e nach Proteasebehandlung mittels Massenspektrometrie cha­ rakterisiert bzw. identifiziert wird.4. The method according to claim 1, characterized in that the ligate array produced on the carrier material is a peptide array,
incubate the position-specific peptide array fixed on the carrier material with a cell lysate,
then protein not bound to the peptide array is removed and
the protein (s) bound to the peptide array is characterized or identified after protease treatment by means of mass spectrometry. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial fest oder flexibel ist.5. The method according to claim 1, characterized in that the carrier material used is firm or flexible is. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus Harzbeads, Po­ lymerpins oder Chipmaterial besteht.6. The method according to claim 5, characterized in that the carrier material used from resin beads, Po lymerpins or chip material. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus einer Polymer­ membran besteht.7. The method according to claim 5, characterized in that that the carrier material used is made of a polymer membrane exists. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus einer Nylon-, Cellulose-, modifizierten Cellulose- oder modifizier­ ten Polypropylenmembran besteht.8. The method according to claim 7, characterized in that that the backing material used is made of a nylon, Cellulose, modified cellulose or modified polypropylene membrane. 9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein Vollzelllysat verwendet.9. The method according to claim 3, characterized in that a whole cell lysate is used as the cell lysate. 10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein durch Zentrifugation oder Filtration vorfraktioniertes Vollzelllysat verwendet.10. The method according to claim 3, characterized in that as a cell lysate by centrifugation or Filtration uses pre-fractionated whole cell lysate. 11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Zelllysat ein Lysat aus proka­ ryontischen oder eukaryontischen Zellen verwendet. 11. The method according to claim 9 or 10, characterized shows that a lysate from proka ryontic or eukaryotic cells.   12. verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein Lysat aus transformierten Zellen verwendet.12. The method according to any one of claims 9 to 11, characterized characterized in that a cell lysate is a lysate transformed cells used. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein 35S-Methionin- oder 35S-Cystein-markiertes Lysat verwen­ det.13. The method according to any one of claims 9 to 12, characterized in that a 35 S-methionine or 35 S-cysteine-labeled lysate is used as the cell lysate. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zelllysat zusammen mit mindestens einem definierten Cofaktor verwendet.14. The method according to any one of claims 9 to 13, characterized characterized in that the cell lysate together with used at least one defined cofactor. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Cofaktoren Proteine oder Metallionen verwen­ det.15. The method according to claim 14, characterized in that cofactors use proteins or metal ions det. 16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide zwi­ schen 3 und 30 Aminosäuren lang sind.16. The method according to claim 2, characterized in that the peptides used for the peptide array between are 3 and 30 amino acids long. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide zwi­ schen 6 und 15 Aminosäuren lang sind.17. The method according to claim 16, characterized in that that the peptides used for the peptide array between are 6 and 15 amino acids long. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide 13 Aminosäuren lang sind.18. The method according to claim 17, characterized in that that the peptides used for the peptide array 13 Amino acids are long. 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Ligat-Array verwendeten Ligate über einen Linker an das Trägermaterial fixiert sind.19. The method according to claim 1, characterized in that the ligates used for the ligate array are about a linker is fixed to the carrier material. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker Protease-sensitiv ist. 20. The method according to claim 19, characterized in that the linker is protease sensitive.   21. Verfahren nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, daß der Linker chemisch spaltbar ist.21. The method according to claim 19, characterized in that the linker is chemically cleavable. 22. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Peptidarray ein SPOT-Peptidarray ist.22. The method according to claim 2, characterized in that the peptide array used is a SPOT peptide array is. 23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Charakterisierung bzw. Identifizie­ rung der Liganden mittels MALDI oder ESI Mas­ senspektrometrie erfolgt.23. The method according to claim 1, characterized in that that further characterization or identification ligands using MALDI or ESI Mas spectrometry is carried out. 24. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht an das Peptidarray gebundene Protein mittels Waschen mit einem Puffer entfernt.24. The method according to claim 4, characterized in that that the protein not bound to the peptide array removed by washing with a buffer. 25. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht an das Peptidarray gebundene Protein durch Fällung entfernt.25. The method according to claim 4, characterized in that the protein not bound to the peptide array removed by precipitation. 26. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e vor der Proteasebehandlung vom Trägermaterial löst und anschließend einer Gelelektrophorese unter­ zieht.26. The method according to claim 4, characterized in that that the protein (s) bound to the peptide array before the protease treatment of the carrier material dissolves and then a gel electrophoresis draws. 27. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Charakterisierung bzw. Identifizierung der Protease-behandelten Proteine mittels MALDI oder ESI Massenspektrometrie erfolgt.27. The method according to claim 4, characterized in that that the characterization or identification of the Protease-treated proteins using MALDI or ESI Mass spectrometry takes place.
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