DE19939730C2

DE19939730C2 - Apparatus for use in electro-eluting macromolecules and a method for electro-eluting macromolecules from gels while minimizing the volume of elution

Info

Publication number: DE19939730C2
Application number: DE1999139730
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Breuer; Robert Hurwitz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-08-21
Filing date: 1999-08-21
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2019-08-22
Also published as: DE19939730A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Verwendung bei der Elektroelution von Makromolekülen, umfassend eine obere Platte 2 mit Löchern 4 und eine Basisplatte 1 mit einer entsprechenden Anzahl von Löchern 3, wobei die Löcher 4 durch eine eingelegte semipermeable Membran 9 beim Zusammenfügen verschließbar sind. DOLLAR A Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Elektroelution von Makromolekülen aus Gelen unter Minimierung des Elutionsvolumens, wobei die Elution der Makromoleküle in ein Elutionsvolumen erfolgt, das kleiner ist als das Volumen des Geldstücks.The invention relates to a device for use in the electroelution of macromolecules, comprising an upper plate 2 with holes 4 and a base plate 1 with a corresponding number of holes 3, the holes 4 being closable by an inserted semipermeable membrane 9 when they are joined together. DOLLAR A Furthermore, the invention relates to a method for electroelution of macromolecules from gels while minimizing the elution volume, the elution of the macromolecules taking place in an elution volume which is smaller than the volume of the coin.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Verwendung bei der Elektroelution von Makromolekülen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Elektroelution von Makromolekülen aus Gelen unter Minimierung des Elutionsvolumens.The invention relates to a device for use in the electroelution of Macromolecules. The invention further relates to a method for electroelution of macromolecules from gels while minimizing the elution volume.

Die Gelelektrophorese von Proteinen in Gelen wird routinemäßig genutzt, um einzelne Komponenten aufgrund ihrer Molekulargewichts- und/oder Ladungsdifferenz aufzutrennen. Die Wiedergewinnung einer spezifischen Proteinkomponente aus dem Gel durch Elektroelution oder Diffusion ist oft mit großen Verlusten verbunden und führt häufig, besonders bei geringen Proteinmengen, zur starken Verdünnung der Probe.Gel electrophoresis of proteins in gels is routinely used to individual components due to their molecular weight and / or To separate charge difference. The recovery of a specific Protein component from the gel by electroelution or diffusion is often included large losses and often leads, especially with small Amounts of protein, for strong sample dilution.

EP Patentschrift Nr. 0361062 beschreibt eine Methode zur gelelektrophoretischen Auftrennung von geladenen oder polarisierten Makromolekülen in einer Trennsäule, die eine gleichzeitige Elektroelution sowie Detektion und Fraktionierung der im Gel aufgetrennten Moleküle ermöglicht. Dieses Verfahren erfordert allerdings ein komplexes System, das eine Elektrophorese- /Elektroelutionsvorrichtung, einen Molekül-Detektor und einen Multielektroden- Fraktionssammler umfaßt.EP Patent No. 0361062 describes a method for gel electrophoretic Separation of charged or polarized macromolecules in one Separation column, the simultaneous electroelution as well as detection and Fractionation of the molecules separated in the gel enables. This method however, requires a complex system that requires electrophoresis / Electroelution device, a molecule detector and a multi-electrode Fraction collector includes.

US Patent Spezifikation Nr. 3956099 beschreibt ein kontinuierliches Verfahren, das die Fraktionierung von Makromolekülen während der elektrophoretischen Auftrennung erlaubt. Diese Methode ist nicht zur Elution von bereits im Gel aufgetrennten Molekülen konzipiert und dient zudem zur präparativen Reinigung von Proteinen.US Patent Specification No. 3956099 describes a continuous process which is the fractionation of macromolecules during electrophoretic Separation allowed. This method is not for the elution of gel already separated molecules designed and also used for preparative cleaning of proteins.

Die in US Patent Spezifikation Nr. 4181594 und EP Patentschrift Nr. 0627954 beschriebenen Verfahren sowie der Blotelutor (hergestellt von Biometra, Göttingen) dienen speziell zur gleichzeitigen Elution aller Komponenten aus eindimensionalen (US Patent 4181594, EP 0627954) bzw. zweidimensionalen Gelen (Blotelutor (Biometra)) in eine Vielzahl von Kammern. Von Nachteil ist, daß die mit Puffer gefüllten Kammern durch trockene Wände, auf denen das Gel aufliegt, voneinander abgetrennt sind. Dies hat einen ungleichmäßigen Transfer zur Folge, der dazu führt, daß eine Komponente in mehreren Kammern bzw. eine Mischung benachbarter Proteinbanden in einer Kammer vorliegt. Diese Methoden sind daher nicht zur Elution einer individuellen Proteinkomponente aus einem im Gel aufgetrennten Proteingemisch geeignet.U.S. Patent Specification No. 4181594 and EP Patent No. 0627954 described method and the blood tutor (manufactured by Biometra, Göttingen) are used specifically for the simultaneous elution of all components one-dimensional (US Patent 4181594, EP 0627954) or two-dimensional Gels (blood tutor (Biometra)) in a variety of chambers. The disadvantage is that the chambers filled with buffer through dry walls on which the gel rests, are separated from each other. This has an uneven transfer result, which leads to a component in several chambers or one Mixture of adjacent protein bands is present in one chamber. These methods are therefore not for the elution of an individual protein component from an im Gel separated protein mixture suitable.

Die Verfahren, die in den US Patent Spezifikationen Nr. 4049534, Nr. 4725348 und Nr. 4747918 beschrieben sind, dienen zur Elektroelution von Proteinen aus Gelstücken, die nur eine Komponente enthalten. Nachteilig ist, daß aufgrund der einheitlich großen Elutionskammern, in denen unterschiedliche Mengen der jeweiligen Makromoleküle aufgefangen werden, diese Verfahren zu einer starken Verdünnung der Probe führen und oft mit großen Verlusten verbunden sind, was die quantitative Anreicherung kleiner Mengen einer Komponente äußerst erschwert.The methods described in U.S. Patent Specifications No. 4049534, No. 4725348 and No. 4747918 are used for the electroelution of proteins Gel pieces that contain only one component. The disadvantage is that due to the uniformly large elution chambers in which different amounts of respective macromolecules are caught, these methods become a strong one Dilution of the sample lead and what are often associated with large losses the quantitative enrichment of small amounts of a component extremely difficult.

Die technische Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, eine Verdünnung bei der Elektroelution von Makromolekülen in das Eluat zu verhindern, beziehungsweise eine Minimierung des Elutionsvolumens bei der Elektroelution kleinster Mengen von Makromolekülen aus Gelstücken zu erreichen.The technical object of the present invention was therefore a To provide an apparatus and a method that make it possible Dilution in the electroelution of macromolecules into the eluate prevent or minimize the elution volume at Electroelution of the smallest quantities of macromolecules from gel pieces to reach.

Die Aufgabe wurde gelöst durch eine Vorrichtung zur Verwendung bei der Elektroelution von Makromolekülen, umfassend
The object was achieved by a device for use in the electroelution of macromolecules, comprising

a) an upper plate 2 with at least one through the thickness of the plate hole 4 , the hole having an upper opening 5 and a lower opening 6 , the upper opening 5 is larger than the second opening 6 , whereby the holes 4 in a larger chamber 18 and a smaller chamber 17 can be divided
b) a base plate 1 with a corresponding number of holes 3 through the thickness of the base plate corresponding to the upper plate 2 , which are arranged below the lower opening 6 of the holes 4 of the upper plate 2 and wherein the lower openings 6 of the holes 4 by a semipermeable membrane 9 inserted between the upper plate 2 and the base plate 1 can be closed when they are joined together.

Bevorzugte Ausführungsformen der Vorrichtung sind aus den Ansprüchen 2 bis 7 zu entnehmen.Preferred embodiments of the device are from claims 2 to 7 refer to.

Weiterhin wird die technische Aufgabe mittels eines Verfahrens zur Elektroelution . von Makromolekülen aus Gelen unter Minimierung des Elutionsvolumens gelöst, umfassend die folgenden Schritte:
Einlegen einer semipermeablen Membran 9 zwischen einer oberen Platte 2 und einer Basisplatte 1, wobei die unteren Öffnungen 6 der Löcher 4 abgedichtet werden;
Füllen der geschlossenen Löcher 4 mit einem Elutionspuffer;
Einlegen eines Gelstückes enthaltend Makromoleküle in die größere Kammer 18 der oberen Platte 2;
Elution der Makromoleküle aus dem Gelstück in den Elutionspuffer durch Anlegen einer Spannungsdifferenz über die Löcher 4, wobei die Elution der Makromoleküle in ein Elutionsvolumen erfolgt, das kleiner ist als das Volumen des Gelstückes. Furthermore, the technical task is carried out using an electroelution method. of macromolecules from gels while minimizing the elution volume, comprising the following steps:
Inserting a semipermeable membrane 9 between an upper plate 2 and a base plate 1 , the lower openings 6 of the holes 4 being sealed;
Filling the closed holes 4 with an elution buffer;
Inserting a piece of gel containing macromolecules into the larger chamber 18 of the upper plate 2 ;
Elution of the macromolecules from the gel piece in the elution buffer by applying a voltage difference across the holes 4 , the elution of the macromolecules taking place in an elution volume which is smaller than the volume of the gel piece.

Weitere bevorzugte Verfahren können aus den Ansprüchen 13 und 14 entnommen werden.Further preferred methods can be found in claims 13 and 14 be removed.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung lassen sich kleinste Proteinmengen aus Gelstücken in minimale Volumina eluieren. Dies wird dadurch erreicht, daß sich durch den trichterförmigen Aufbau der Löcher 4 der oberen Platte die zu eluierenden Makromoleküle in Richtung des kleineren Bereiches des Loches (der kleineren Kammer 17) bewegen und letztlich in einem Volumen aufgefangen werden, das kleiner ist als das Volumen des Gelstückes.With the device according to the invention, the smallest amounts of protein can be eluted from gel pieces in minimal volumes. This is achieved in that the macromolecules to be eluted move in the direction of the smaller area of the hole (the smaller chamber 17 ) through the funnel-shaped structure of the holes 4 of the upper plate and are ultimately collected in a volume which is smaller than the volume of the gel piece.

Weiterhin ermöglicht die Vielzahl der in der oberen Platte vorgesehen unterschiedlich großen Kammern eine an die jeweilige Proteinmenge angepaßte Elution in minimale Elutionsvolumina. Dabei wird eine spezifische Komponente eines Proteingemisches nach gelelektrophoretischer Auftrennung in eine der jeweiligen Proteinmenge angepaßte Kammergröße eluiert.Furthermore, the variety of those provided in the top plate allows chambers of different sizes adapted to the respective amount of protein Elution in minimal elution volumes. This involves a specific component of a protein mixture after gel electrophoretic separation into one of the adapted chamber size eluted each protein amount.

Weiterhin ist vorteilhaft, daß die separate Vorrichtung zur Durchführung dieses Elektroelutionsverfahrens kostengünstig ist. Zudem kann die Vorrichtung als Zusatzgerät zu konventionellen Semidry-Blottern dienen.It is also advantageous that the separate device for performing this Electroelution process is inexpensive. In addition, the device as Serve additional device to conventional Semidry blotters.

Mit der Vorrichtung können sehr effizient Proteine aus normalen Gelstücken (0,5 bis 1 mm dick) sowie auch aus dicken Gelen (3 bis 4 mm dick) eluiert werden. Das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.Proteins from normal gel pieces (0.5 up to 1 mm thick) and also from thick gels (3 to 4 mm thick). The method and the device according to the invention are as follows explained in more detail using an exemplary embodiment.

Die beigefügten Abbildungen zeigen:The attached pictures show:

Fig. 1 eine schematische Übersicht der vielkammerigen, separaten Elutionsvorrichtung. Fig. 1 is a schematic overview of the multi-chamber, separate elution device.

Fig. 2 den Einbau der Vorrichtung in einen herkömmlichen Semidry-Blotter. Fig. 2 shows the installation of the device in a conventional Semidry blotter.

Fig. 3 das SDS-PAGE eines Proteingemisches und einer Komponente nach Elektroelution. Fig. 3 shows the SDS-PAGE of a protein mixture and a component by electroelution.

Eine bevorzugte Ausführungsform soll nachfolgend beispielhaft erläutert werden:A preferred embodiment will be explained below by way of example:

example

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß Fig. 1 setzt sich aus einer Basisplatte 1 mit einer Anzahl von Löchern 3 sowie einer oberen Platte 2 mit einer entsprechenden Anzahl von Löchern 4, die unterhalb und gegebenenfalls oberhalb der Platte von herausragenden Stegen 7, 8 umgeben sind, zusammen. Beide Platten, Basisplatte und obere Platte werden aus detergenzresistentem Material wie z. B. Plexiglas oder PVC zugeschnitten und die Aussparungen für die Löcher, Hohlräume bzw. die Kammern durch Fräsen eingefügt. Zwischen beiden Platten befindet sich eine semipermeable Membran 9, wie z. B. eine Dialysemembran. Die in der oberen Platte 2 nebeneinanderliegenden, in benachbarten parallelen Reihen angeordneten Kammern 4 unterschiedlicher Größe weisen einen trichterförmigen Querschnitt auf und bestehen aus einer oberen Öffnung 5, einer unteren Öffnung 6, wobei die untere Öffnung kleiner ist, als die obere Öffnung 5. Weiterhin sind aus der Plattenebene herausragende Stege 7, 8 um die oberen und unteren Öffnungen 5, 6 angeordnet.The apparatus according to Fig. 1 consists of a base plate 1 having a number of holes 3 and a top plate 2 with a corresponding number of holes 4, below, and optionally above the plate of outstanding ribs 7, are surrounded 8, together. Both plates, base plate and top plate are made of detergent resistant material such as. B. cut plexiglass or PVC and inserted the recesses for the holes, cavities or chambers by milling. Between the two plates there is a semipermeable membrane 9 , such as. B. a dialysis membrane. The chambers 4 of different sizes lying side by side in the upper plate 2 and arranged in adjacent parallel rows have a funnel-shaped cross section and consist of an upper opening 5 , a lower opening 6 , the lower opening being smaller than the upper opening 5 . Furthermore, webs 7 , 8 projecting from the plate plane are arranged around the upper and lower openings 5 , 6 .

Die Vorrichtung stellt eine separate Einheit dar, die als Zusatzgerät zu herkömmlichen Semidry-Blottern dient. Das Einbringen der Vorrichtung in den Semidry-Blotter ist in Fig. 2 dargestellt. Als Vorbereitung zur Elektroelution werden die im Gel aufgetrennten Proteine angefärbt (mit Coomassie-Blue-Farbstoff), die gewünschte Komponente mittels beiliegender Schablone ausgestanzt und die Gelstücke für ca. 15 Minuten im Elutionspuffer äquilibriert. Zwischen beide Platten der Vorrichtung wird eine semipermeable Membran 9 entsprechender Größe so eingelegt, daß sie die Anzahl von Kammern abschließt, die zur Elektroelution genutzt werden. Das kann eine, mehrere oder alle Kammern betreffen. Die aus der Platte herausragenden Stege 8 um die unteren Öffnungen 6 der Löcher 4, die deckungsgleich in die Löcher 3 der Basisplatte 1 passen, werden von diesen so umschlossen, daß die zwischen beiden Platten befindliche semipermeable Membran 9 die untere Öffnung 6 der Löcher paßgenau abdichten, wenn beide Platten fest miteinander verbunden werden. Die abgedichteten Kammern werden mit Puffer gefüllt und die Gelstücke in die dafür vorgesehene Vertiefung bzw. größere Kammer 18 des Löcher 4 eingelegt. Die Vorrichtung wird nun (wie beim Blotting-Verfahren) zwischen zwei Lagen mit Puffer getränkem Filterpapier 14 zwischen beide Elektroden 15, 16 eines herkömmlichen Semidry-Blotters eingespannt und eine Spannung von ca. 12 Volt angelegt. Während der Elution wandern die Proteine aus den Gelstücken in den mit Puffer gefüllten Auffangbehälter 17 der Kammern. Die Zeit für eine komplette Elution variiert mit der Gelmatrix und der Dicke des Gels, liegt aber im Durchschnitt zwischen 30 und 60 Minuten. Anschließend werden die Eluate mittels einer Pipette aus den Auffangbehältern 17 der Kammern abgesaugt.The device represents a separate unit that serves as an additional device to conventional Semidry blotters. The introduction of the device into the Semidry blotter is shown in FIG. 2. In preparation for electroelution, the proteins separated in the gel are stained (with Coomassie Blue dye), the desired component is punched out using the template provided and the gel pieces are equilibrated in the elution buffer for approx. 15 minutes. A semipermeable membrane 9 of appropriate size is inserted between the two plates of the device so that it closes the number of chambers that are used for electroelution. This can affect one, several or all chambers. The webs 8 protruding from the plate around the lower openings 6 of the holes 4 , which fit congruently into the holes 3 of the base plate 1 , are enclosed by them in such a way that the semipermeable membrane 9 located between the two plates seals the lower opening 6 of the holes with a precise fit when both plates are firmly connected. The sealed chambers are filled with buffer and the gel pieces are inserted into the recess or larger chamber 18 of the holes 4 provided for this purpose. The device is now (as in the blotting process) clamped between two layers of filter paper 14 soaked in buffer between both electrodes 15 , 16 of a conventional Semidry blotter and a voltage of approximately 12 volts is applied. During the elution, the proteins migrate from the gel pieces into the buffer container 17 of the chambers filled with buffer. The time for a complete elution varies with the gel matrix and the thickness of the gel, but is on average between 30 and 60 minutes. The eluates are then sucked out of the collecting containers 17 of the chambers by means of a pipette.

Das Foto in Fig. 3 zeigt die Elektroelution einer Komponente aus einem komplexen Proteingemisch. COS-Zell-Extrakte wurden mittels einer 10%igen SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und das Gel mit Coomassie-Blue-Farbstoff angefärbt. Die gewünschte Proteinkomponente wurde aus dem Gel ausgeschnitten und aus dem Gelstück mit der Elutionsvorrichtung eluiert. Der Zellextrakt (Spur 2) und die eluierte Komponente 10 (Spur 3) wurden durch SDS- Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung analysiert. Wie die Ergebnisse zeigen, bietet das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung mehrere Vorteile: zum einen werden im Gel aufgetrennte Proteine auf einfache Weise mit hohen Ausbeuten aus Gelstücken eluiert und in minimalen, der Proteinmenge angepaßten Elutionsvolumina aufgefangen, wodurch eine Verdünnung der Probe weitgehend herabgesetzt wird. Zudem dient die separate Einheit als Zusatzgerät zu herkömmlichen Semidry-Blottern, die zur Grundausstattung eines jeden Labors gehören, und ist daher kostengünstig in der Anschaffung. Der Eluter kann eine routinemäßige Proteinreinigung, besonders, wenn nur geringe Mengen der zu untersuchenden Komponente zur Verfügung stehen bzw. benötigt werden (wie z. B. zur Sequenzierung oder für das MALDI-Verfahren), wesentlich erleichtern. The photo in Fig. 3 shows the electroelution of a component from a complex protein mixture. COS cell extracts were separated by means of a 10% SDS gel electrophoresis and the gel was stained with Coomassie Blue dye. The desired protein component was cut out of the gel and eluted from the gel piece with the elution device. The cell extract (lane 2 ) and the eluted component 10 (lane 3 ) were analyzed by SDS gel electrophoresis and Coomassie staining. As the results show, the method and the device of the invention offer several advantages: on the one hand, proteins separated in the gel are easily eluted from gel pieces with high yields and collected in minimal elution volumes adapted to the amount of protein, which largely reduces the dilution of the sample , In addition, the separate unit serves as an additional device for conventional Semidry blotters, which are part of the basic equipment of every laboratory, and is therefore inexpensive to purchase. The Eluter can make routine protein purification considerably easier, especially if only small amounts of the component to be examined are available or required (such as for sequencing or for the MALDI method).

LIST OF REFERENCE NUMBERS

11

Basisplatte
baseplate

22

obere Platte
top plate

33

Löcher in der Basisplatte
Holes in the base plate

44

Löcher in der oberen Platte
Holes in the top plate

55

obere Öffnung
upper opening

66

untere Öffnung
lower opening

77

Stege um obere Öffnung
Bridges around top opening

88th

Stege um untere Öffnung
Bridges around lower opening

99

semipermeable Membran
semipermeable membrane

1414

Filterpapier
filter paper

1515

Elektrode
electrode

1616

Elektrode
electrode

1717

kleinere Kammer
smaller chamber

1818

größere Kammer
larger chamber

Claims

1. A device for use in electroelution of macromolecules comprising

a) an upper plate ( 2 ) with at least one through the thickness of the plate leading hole ( 4 ), the hole having an upper opening ( 5 ) and a lower opening ( 6 ), wherein the upper opening ( 5 ) is larger than the lower opening ( 6 ), whereby the holes ( 4 ) are divided into a larger chamber ( 18 ) and a smaller chamber ( 17 )
b) a base plate (1) with one of the upper plate (2) corresponding number of leading through the thickness of base plate holes (3) of the upper plate (2) are arranged below the lower opening (6) of the holes (4) and the lower openings ( 6 ) of the holes ( 4 ) can be closed by a semipermeable membrane ( 9 ) inserted between the upper plate ( 2 ) and the base plate ( 1 ).

2. Device according to claim 1, characterized in that webs ( 8 ) projecting from the plate plane are arranged around the lower openings ( 6 ) and the webs ( 8 ) fit into the holes ( 3 ) of the base plate together with a semipermeable membrane ( 9 ) can be introduced.

3. Device according to claim 1 or 2, characterized in that the holes of the upper plate ( 2 ) have a funnel-shaped cross section.

4. Device according to claims 1 to 3, characterized in that around the upper openings ( 5 ) of the holes ( 4 ) projecting webs ( 7 ) are arranged.

5. Device according to claims 1 to 4, characterized in that the holes ( 4 , 3 ) are elongated along the plane of the plate.

6. Device according to claims 1 to 5, characterized in that the upper plate ( 2 ) and the base plate ( 1 ) have holes ( 4 , 3 ) with different dimensions and the holes are arranged side by side in adjacent rows.

7. Device according to claims 1 to 6, characterized in that two electrodes ( 15 , 16 ) are arranged for applying a voltage difference.

8. Semidry blotter containing the device according to claims 1 to 7.

9. Use of a template for punching out and adapting gel pieces to the dimensions of the larger chamber ( 18 ) of the holes ( 4 ) of the device according to claims 1 to 7.

10. Use according to claim 9, characterized in that a template comprising interchangeable attachments of different sizes is used, which are precisely adapted to the dimensions of the larger chambers ( 18 ) of the holes ( 4 ).

11. Kit containing a Semidry blotter according to claim 8 and stencils Punching out and fitting gel pieces.

12. A method for electroelution of macromolecules from gels while minimizing the elution volume using the device according to claims 1 to 7, comprising the following steps:

- Inserting a semipermeable membrane ( 9 ) between an upper plate ( 2 ) and a base plate ( 1 ), the lower openings ( 6 ) of the holes ( 4 ) being sealed.
- Fill the closed holes ( 4 ) with an elution buffer.
- Inserting a piece of gel containing macromolecules into the larger chamber ( 18 ) of the upper plate ( 2 ).
- Elution of the macromolecules from the gel piece in the elution buffer by applying a voltage difference across the holes ( 4 ), the elution of the macromolecules taking place in an elution volume which is smaller than the volume of the gel piece.

13. The method according to claim 12, characterized in that a variable number of holes ( 4 ) is used to carry out the electroelution.

14. The method according to claim 12 or 13, characterized in that the Macromolecules are selected from the group of proteins, peptides, nucleic acids.