DE19938520A1 - Process for quality control of the endothelial lining of native blood vessels or in the tissue laboratory of endothelialized, artificial or natural blood vessels and blood vessel valves, cardiac cavities and heart valves - Google Patents
Process for quality control of the endothelial lining of native blood vessels or in the tissue laboratory of endothelialized, artificial or natural blood vessels and blood vessel valves, cardiac cavities and heart valvesInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelauskleidung nativer Blutgefäße oder im Gewebe labor mit einem aufgezüchteten Endothel versehener ("endo thelialisierter") künstlicher oder natürlicher Blutgefäße oder Blutgefäßklappen, Herzhöhlen und Herzklappen für chir urgische Implantationszwecke nach dem Oberbegriff des Pa tentanspruches 1.The invention relates to a method for quality control the endothelial lining of native blood vessels or in the tissue laboratory with a grown endothelium ("endo thelialised ") artificial or natural blood vessels or blood vessel valves, heart sockets and heart valves for chir Urgent implantation purposes according to the generic term of Pa claim 1.
Einhergehend mit der steigenden Lebenserwartung und der Häufigkeit von Herz- und Gefäßerkrankungen spielt der Er satz funktionsuntüchtiger Arterien und Herzklappen in der Chirurgie eine immer größere Rolle. Wenn dies irgendwie möglich ist, wird versucht, patienteneigene bzw. 'autologe' Blutgefäße für solche Zwecke zu rekrutieren, deren Ver pflanzung zwar keine operativen und/oder immunologischen Probleme bereitet, die aber nur begrenzt verfügbar sind. Außerdem kann deren Endothel krankheitshalber bzw. präpara tionsbedingt auch Schäden aufweisen.Along with the increasing life expectancy and the He plays the frequency of heart and vascular diseases set of inoperable arteries and heart valves in the Surgery is playing an increasingly important role. If this somehow is possible, an attempt is made to identify the patient's own or 'autologous' Recruit blood vessels for such purposes, the ver planting no operative and / or immunological Problems arise, but are only available to a limited extent. In addition, their endothelium can be prepared for disease or preparation due to the condition also show damage.
Bei vielen Patienten sind die relativ wenigen, für derarti ge Zwecke prinzipiell überhaupt nur in Frage kommenden Blutgefäße (z. B. die Vena saphena magna, Vena saphena parva oder Arteria mammaria interna) durch Krankheiten (z. B. Va rikosis oder Ateriosklerosis) allerdings oft schon so stark alteriert, daß sie nicht mehr verwendet werden können. Au ßerdem wächst die Zahl der Patienten, die sich nach einer Jahre zurückliegenden ersten Gefäßersatz-Operation plötz lich dringend einer zweiten derartigen Therapie unterziehen müssen, für die aber ein autologer Gefäßersatz dann nicht mehr zur Verfügung steht. In dieser bedrohlichen Situation können bisher nur ein vollkommen prothetischer Gefäßersatz durch flexible Kunststoffprothesen (z. B. aus PTFE) oder kryopräservierte Fremdvenen ("Spendervenen") in Betracht gezogen werden. Leider haben solche Ersatzprodukte jedoch meist wegen rascher Thrombosierung nur eine sehr unbefrie digende Prognose.In many patients, the relatively few are for such In principle, only possible purposes Blood vessels (e.g. the vena saphena magna, vena saphena parva or internal artery) due to diseases (e.g. Va ricosis or atherosclerosis), however, is often so severe altered that they can no longer be used. Au In addition, the number of patients looking after a patient is growing Years ago, the first vascular replacement surgery was sudden urgently undergo a second such therapy need, but not for an autologous vascular replacement more is available. In this threatening situation So far, only a completely prosthetic vascular replacement through flexible plastic prostheses (e.g. made of PTFE) or cryopreserved foreign veins ("donor veins") into consideration to be pulled. Unfortunately, however, such replacement products have mostly because of rapid thrombosis only a very unfree reasonable forecast.
Aus diesem Grunde wurde versucht, die Thrombogenität von prosthetischen Ersatzprodukten zu verringern. Alle Blutge fäße des Kreislaufsystems sind mit einer konfluenten En dothelschicht ausgekleidet, die mit aktiven und auch regu lierbaren physiologischen Funktionen die Bildung von Blut gerinnseln verhindern. Dazu gehören Blutplättchen (Thrombo zyten) hemmende Funktionen bzw. "antiaggregatorische" Funk tionen ebenso wie gerinnungshemmende bzw. "antikoagulatori sche" Mechanismen. Ein intaktes Endothel kann durch fi brinauflösende bzw. "profibrinolytische" Wirkungen bereits gebildete Gerinnungsthromben (Fibrinthromben) auch noch komplett wieder auflösen. Da diese Komplexität und Anpas sungsfähigkeit antithrombogener Wirkfaktoren durch ein Kunststoffmaterial in gar keiner Weise auch nur annähernd erreicht werden kann, bietet es sich an, vaskuläre En dothelzellen auf der inneren Oberfläche der zu implantie renden Gefäßprothesen anzusiedeln. Nach einer mehrtägigen Kultivationsphase können diese sich teilenden und vermeh renden Zellen schließlich die gesamte Oberfläche abdecken.For this reason, the thrombogenicity of reduce prosthetic replacement products. All blood Vessels of the circulatory system are with a confluent En dothel layer lined with active and also regu The physiological functions that can be formed are the formation of blood Prevent clots. These include platelets (thrombo zyten) inhibiting functions or "anti-aggregatory" radio as well as anticoagulant or "anticoagulant mechanisms ". An intact endothelium can be identified by fi Brin-dissolving or "profibrinolytic" effects already formed coagulation thrombi (fibrin thrombi) also completely dissolve. Because of this complexity and customization ability of antithrombogenic active factors through a Plastic material in no way at all can be achieved, vascular en dothelial cells on the inner surface of the implant vascular prostheses. After a multi-day Cultivation phase, these can divide and increase cells cover the entire surface.
Aus immunulogischen Gründen müssen solche Endothelzellen aus dem Patienten selbst stammen (autologes Endothel). Die Isolierung entsprechender Zellen kann bereits ohne Schwie rigkeit routinemäßig und in ausreichender Menge selbst noch aus relativ kleinen, chirurgisch entnommenen Venen des Pa tienten erfolgen. Im Gewebelabor lassen sich die isolierten Zellen unter sterilen Bedingungen so erheblich vermehren, daß ca. 2 bis 3 Wochen später im Prinzip auch größere Ge fäßprothesen mit ihnen ausgekleidet werden können. Aller dings erhebt sich bei Gefäßprothesen aus künstlichen Mate rialien das besondere Problem, ausgesäte Endothelzellen an den Innenwandungen der Kunststoffrohre zuverlässig dauer haft zu verankern.For immunulogical reasons, such endothelial cells originate from the patient himself (autologous endothelium). The Isolation of appropriate cells can be achieved without difficulty routine and in sufficient quantities itself from relatively small, surgically extracted veins of the Pa patients. The isolated ones can be found in the tissue laboratory Multiply cells under sterile conditions so significantly that about 2 to 3 weeks later in principle also larger ge prostheses can be lined with them. Everything However, vascular prostheses are made from artificial mate rialien the special problem, sown endothelial cells the inner walls of the plastic pipes reliably last firmly anchored.
Kryopräservierte, von fremden Personen stammende Blutge fäßprothesen erhalten nach dem Auftauen zumindest noch be trächtliche Restmengen des Spenderendothels, das zur immu nologischen Abstoßung des gesamten Gefäßes führen kann. Erst kürzlich wurde im Hinblick auf die serienmäßige Ver wendung solcher Gefäße ein wichtiger Durchbruch erzielt, in dem es gelungen ist, das Spenderendothel selektiv und scho nend zu entfernen. Die luminale Oberfläche derartiger, "de endothelialisierter", zuvor kryopräservierter und aufgetau ter Gefäße eignet sich hervorragend zur dauerhaften Veran kerung und Auskleidung mit autologem, aus dem therapierten Patienten selbst stammenden Endothelgewebe ("autologes En dothel"). Eine vielversprechende erste Implantation eines solchen Gefäßes in eine Patientin wurde bereits publiziert (Lamm P., Juchem G., Weyrich P., Reichart B.: New alterna tive coronary bypass graft: First clinical experience with an autologous endothelialized cryopreserved allograft. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999, 117 (6), 1217-1219). Ent sprechende logistische Vorkehrungen vorausgesetzt, er scheint auf dieser Basis ein ganz neuer, hervorragend ge eigneter Gefäßersatz für entsprechende Problempatienten in naher Zukunft möglich zu sein.After thawing, cryopreserved blood vessel prostheses originating from other people receive at least considerable residual amounts of the donor endothelium, which can lead to immunological rejection of the entire vessel. Only recently has an important breakthrough been achieved with regard to the serial use of such vessels, in which it has been possible to remove the donor endothelium selectively and gently. The luminal surface of such "de endothelialized", previously cryopreserved and thawed vessels is excellently suitable for permanent anchoring and lining with autologous endothelial tissue originating from the treated patient ("autologous endothelium"). A promising first implantation of such a vessel in a patient has already been published (Lamm P., Juchem G., Weyrich P., Reichart B .: New alternative coronary bypass graft: First clinical experience with an autologous endothelialized cryopreserved allograft. J. Thorac Cardiovasc. Surg. 1999, 117 ( 6 ), 1217-1219). Appropriate logistical precautions provided that on this basis a completely new, excellently suited vascular replacement for corresponding problem patients seems to be possible in the near future.
Ein Problem besteht jedoch bis heute in der unbefriedigen den Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung der ausge wählten Ersatzprodukte. Dieses Argument gilt sowohl im Hin blick auf eventuell noch zur Verfügung stehendes autologes Gefäßmaterial, als auch für natürliche und artifizielle, endothelialisierte oder nicht endothelialisierte Blutgefä ße, Herzklappen, und Herzhöhlen unmittelbar vor ihrer Im plantation. Derzeit kann lediglich eine Überprüfung von endständig abgeschnittenen Segmenten bzw. Gewebeproben der zur Implantation vorgesehenen Ersatzmaterialien vorgenommen werden, wobei die Auswertung durch die übliche rasterelek tronenmikroskopische Inspektion erst ein bis zwei Tage spä ter erfolgen kann. Auf die wirkliche Intaktheit der dann bereits transplantierten Protheseteile kann also lediglich indirekt zurückgeschlossen werden.One problem, however, is still unsatisfactory the quality control of the endothelial coating chose replacement products. This argument applies both in the Hin look at autologes that may still be available Vascular material, as well as for natural and artificial, endothelialized or non-endothelialized blood vessels eats, heart valves, and cardiac cavities immediately before their im plantation. Currently, only a review of terminally cut off segments or tissue samples of the replacement materials intended for implantation be, the evaluation by the usual rasterelek Tron microscopic inspection only one or two days late ter can be done. On the real intactness of the then already transplanted prosthesis parts can only be indirectly inferred.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Qualitätskontrolle der Endothelbeschichtung der oben bezeichneten Gefäß- oder Herzteile in ihrem gesam ten Ausmaß zu schaffen, durch das eine schnelle und über zeugende Dokumentation der Funktionalität ihrer Endothelbe schichtung selbst noch am Tage der chirurgischen Implanta tion möglich wird.The object of the present invention is a Process for quality control of the endothelium coating of the above-mentioned vascular or cardiac parts in their entirety to create the extent by which a fast and over convincing documentation of the functionality of your endothelium stratification even on the day of the surgical implant tion is possible.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.This task is accomplished by a method with the characteristics of claim 1 solved.
Der klinisch besonders bestechende Vorteil des erfindungs gemäßen Verfahrens besteht darin, daß ein spezifischer Nachweis der morphologischen und funktionellen Intaktheit der Endotheloberfläche der jeweils vorbereiteten Prothesen (s. oben!) schon kurz vor der Implantation in einen Patien ten getroffen werden kann. Dadurch werden möglicherweise schwerwiegende Komplikationen für den Patienten vermieden, die darin bestehen könnten, daß vorgesehene Ersatzprodukte mit einem unvollständigen Endothel transplantiert werden. Im Bedarfsfall muß die Kultivationsphase noch länger ausge dehnt werden, bis die relevante Oberfläche der Prothesen vollständig mit dem Patientenendothel bedeckt ist. So er gibt sich in jedem Fall die Möglichkeit, kryopräservierte Spendergefäße optimal zu nutzen. Auch im Hinblick auf durch Krankheit, Alter oder iatrogene Intervention vorgeschädigte autologe Gefäße sind ähnliche Überlegungen wichtig. Durch Einbringung solcher Gefäße in eine geeignete Endotheliali sierungsapparatur (DE-PS 199 18 558.1 A1) kann die Endothe lauskleidung noch vervollständigt und dann auf der Grundla ge der hiermit zum Patent angemeldeten Methodik qualitäts mäßig auch überprüft werden.The clinically particularly impressive advantage of the invention according to the method is that a specific Evidence of morphological and functional integrity the endothelial surface of the prepared prosthesis (see above!) shortly before implantation in a patient ten can be taken. This may be avoid serious complications for the patient, which could consist of the proposed replacement products be transplanted with an incomplete endothelium. If necessary, the cultivation phase must last longer be stretched until the relevant surface of the prosthesis is completely covered with the patient endothelium. So he in any case there is the possibility of cryopreserved Optimal use of donor vessels. Also with regard to Illness, old age or iatrogenic intervention pre-injured Similar considerations are important for autologous vessels. By Insertion of such vessels in a suitable endothelial sierungsapparatur (DE-PS 199 18 558.1 A1) can the Endothe lausbildung still completed and then on the bas the methodology for which a patent has been applied for be checked moderately.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.Advantageous embodiments of the invention are shown in the Sub-claims emerge.
Im folgenden werden die Erfindungen und deren Ausgestaltun gen im Zusammenhang mit der Figur näher erläutert. Die Fi gur zeigt als exemplarisches Beispiel eine Gefäßprothese, die nur teilweise mit patienteneigenen Endothelzellen be schichtet wurde.In the following, the inventions and their configuration gene explained in connection with the figure. The Fi gur shows a vascular prosthesis as an example, which only partially with patient's own endothelial cells was stratified.
Im Gewebelabor werden aus einer kleinen, chirurgisch ent nommenen Vene des Patienten stammende Endothelzellen iso liert und so erheblich vermehrt, daß mit ihnen auch größere Gefäßprothesen 1 ausgekleidet werden können. Eine speziell entwickelte Beschichtungseinrichtung zur Auskleidung von Gefäßprothesen mit Endothelzellen ist in der Patentanmel dung DP 199 18 558.1 erläutert. Nach dem Aussäen der En dothelzellen und dem Anhaften derselben auf der Innenwan dung 2 der Gefäßprothese 1 vermehren sich die anhaftenden Endothelzellen 3 in einem geeigneten Kulturmedium derart, daß sie schließlich eine konfluente Endothelzellenschicht an der Innenwandung 2 der Gefäßprothese 1 bilden. Dabei wird Kulturmedium in der in DE-PS 199 18 558.1 A1 erläuter ten Weise über dicht mit den Enden der Gefäßprothese 1 ver bundene Kanülen (nicht dargestellt) durch das Gefäßlumen perfundiert.In the tissue laboratory, endothelial cells originating from a small, surgically removed vein of the patient are isolated and increased so considerably that larger vascular prostheses 1 can also be lined with them. A specially developed coating device for lining vascular prostheses with endothelial cells is explained in patent application DP 199 18 558.1. After sowing the endothelial cells and adhering them to the inner wall 2 of the vascular prosthesis 1 , the adhering endothelial cells 3 multiply in a suitable culture medium such that they finally form a confluent endothelial cell layer on the inner wall 2 of the vascular prosthesis 1 . Culture medium is perfused in the manner described in DE-PS 199 18 558.1 A1 by way of cannulas connected to the ends of the vascular prosthesis 1 (not shown) through the vessel lumen.
Der Zielsetzung einer zuverlässigen und aussagekräftigen Qualitätskontrolle zur kompletten und funktionell aktiven Endothelialisierung von Gefäßprpthesen folgend, führten die folgenden Überlegungen zur Erfindung.The objective of a reliable and meaningful Quality control for complete and functionally active Following endothelialization of vascular prostheses, the following considerations for the invention.
Endothelzellen 3 zeichnen sich physiologischerweise durch diverse antithrombotische Aktivitäten aus, durch die im in takten Blutkreislauf auch die Bildung von Fibrinthromben äußerst wirksam verhindert wird. Beispielsweise besteht ei ne besonders hervortretende, für die Zwecke der vorliegen den Erfindung bevorzugt einsetzbare Spezialität des En dothels bzw. der Endothelzellen 3 in allen Blutgefäßen des Körpers in der Aktivierung von Protein C, das ständig durch die Leber in das Blutplasma eingespeist wird. Die Zellen tieferer Schichten der Blutgefäßwand (z. B. Gefäßmuskelzel len und Perizyten) können Protein C nicht aktivieren. Ande rerseits zeichnen sich diese Zellen aber durch bestimmte prothrombogene Eigenschaften, z. B. eine besonders hohe Kon zentration an Gewebefaktor aus, dem heute eine entscheiden de Auslöserrolle bei der Entstehung intravasaler Fibrin thromben zugemessen wird. Diese prothrombogene Aktivität läßt sich an hochgereinigten gesunden arteriellen oder ve nösen Endothelzellen tierischen und menschlichen Ursprungs nicht nachweisen.Endothelial cells 3 are physiologically characterized by various antithrombotic activities, which also extremely effectively prevent the formation of fibrin thrombi in the intact blood circulation. For example, there is a particularly prominent specialty of the endothelium or endothelial cells 3 , which can preferably be used for the purposes of the present invention, in all blood vessels of the body in the activation of protein C, which is constantly fed into the blood plasma by the liver. The cells of deeper layers of the blood vessel wall (e.g. vascular muscle cells and pericytes) cannot activate Protein C. On the other hand, these cells are characterized by certain prothrombogenic properties, e.g. B. a particularly high concentration of tissue factor, which is deemed to play a crucial role in the development of intravascular fibrin thrombi. This prothrombogenic activity cannot be demonstrated in highly purified healthy arterial or venous endothelial cells of animal and human origin.
In der Figur symbolisieren durchgehende Pfeile, wie die En dothelzellen 3 Protein C aktivieren. Die punktierten Pfei le deuten dagegen an, daß die Zellen 4 der tieferen Blutge fäßwand Gewebefaktor entfalten. Je größer also diejenige Fläche der Innenwandung 2 der Gefäßprothese 1 ist, die nicht von Endothelzellen 3 bewachsen ist, desto größer ist die Menge des Gewebefaktors, der im Kontakt mit einer in die Gefäßprothese 1 gefüllten Inkubationslösung 5 steht.Solid arrows in the figure symbolize how the endothelial cells 3 activate protein C. The dotted arrows indicate, however, that the cells 4 of the deeper blood vessel wall tissue factor develop. The larger the area of the inner wall 2 of the vascular prosthesis 1 that is not covered by endothelial cells 3 , the greater the amount of tissue factor that is in contact with an incubation solution 5 filled in the vascular prosthesis 1 .
Die Erfindung zielt nun darauf, daß anti- bzw. prothrombo gene Aktivitäten der in der Gefäßprothese 1 aufgezüchteten Zellen 3 der Endothelschicht bzw. der Zellen 4 der Ge fäßwand hochspezifisch zu erfassen und zu quantifizieren. Beispielsweise aus Protein C in Gegenwart von Thrombin an der Endotheloberfläche in einer entsprechend zusammenge setzten Inkubationslösung gebildetes aktives Protein C (PCA) kann nach der Entnahme der Inkubationslösung aus dem Lumen der Gefäßprothese 1 mit einem spezifischen, für pho tometrische Tests kommerziell erhältlichen Substrat inku biert werden. Die dabei proportional zur PCA-Menge gebilde te Produktmenge wird standardmäßig mit Hilfe optischer Meß geräte registriert. Im Prinzip analog verläuft der gegebe nenfalls zusätzlich vorzunehmende Nachweis von Gewebefaktor an der Innenwandund 2. In diesem Fall wird die Gefäßprothe se 1 mit einer die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden physiologischen Salzlösung inkubiert (z. B. das kommerziell erhältliche Präparat Fa. "Beriplex" der Cen teon, Marburg). Im Kontakt mit eventuell noch nicht vom ge züchteten Endothel abgedeckten Wandbereichen und dem dort befindlichen Gewebefaktor würde Faktor X zu Faktor Xa umge wandelt. Nach der Entnahme dieser Salzlösung und Zusatz der Gerinnungsfaktoren Va bzw. II kann dann in vitro unter re produzierbaren Inkubationsbedingungen Thrombin gebildet werden, das ein gleichzeitig vorhandenes spezifisches Sub strat hydrolisieren kann. Das dabei gebildete Produkt kann wieder online mit einem optischen Meßverfahren registriert werden.The invention now aims to detect and quantify anti- or prothrombo gene activities of the cells 3 of the endothelial layer or cells 4 of the ge vascular wall grown in the vascular prosthesis 1 in a highly specific manner. For example, active protein C (PCA) formed from protein C in the presence of thrombin on the endothelium surface in a correspondingly composed incubation solution can be incubated after removing the incubation solution from the lumen of the vascular prosthesis 1 with a specific substrate commercially available for photometric tests . The amount of product formed in proportion to the amount of PCA is registered as standard with the aid of optical measuring devices. In principle, analogous to where appropriate in addition to be carried out proceeds detection of tissue factor on the inner wall and the second In this case, the vascular prosthesis 1 is incubated with a physiological salt solution containing the coagulation factors II, VII, IX and X (eg the commercially available preparation "Beriplex" from Cen teon, Marburg). In contact with wall areas that may not yet be covered by the grown endothelium and the tissue factor located there, factor X would be converted to factor Xa. After removal of this salt solution and addition of coagulation factors Va or II, thrombin can then be formed in vitro under reproducible incubation conditions, which can hydrolyze a specific substrate present at the same time. The product formed in this way can be registered online again using an optical measuring method.
Bei allen im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Kontakt mit der Innenwandung 2 der Gefäßprothese 1 zu bringenden Gerinnungsfaktoren bzw. deren Lösungen handelt es sich um klinisch geprüfte Präparate, die sämtliche Auflagen des Arzneimittelrechts erfüllen.All coagulation factors or their solutions to be brought into contact with the inner wall 2 of the vascular prosthesis 1 in the context of the present invention are clinically tested preparations which meet all requirements of pharmaceutical law.
Ein weiterer Vorteil des beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es sich auch mehrfach im Ver lauf der Endotheliasierungsprozedur anwenden läßt. Zwi schenzeitlich kann die Gefäßprothese wieder mit frischem Nährmedium gefüllt und die Kultivation des Endothels fort gesetzt werden. Auf diese Weise läßt sich der Endothelia sierungsprozeß im zeitlichen Verlauf genau verfolgen.Another advantage of the described invention The procedure is that it is also several times in Ver course of the endothelialization procedure can be applied. Two In time, the vascular prosthesis can be replaced with fresh Culture medium filled and the cultivation of the endothelium continued be set. In this way, the endothelia Follow the development process closely over time.
Erfindungsgemäß lassen sich alle notwendigen Testlösungen und Inkubationsprozesse problemlos unter vollkommen steri len Bedingungen durchführen. Darüber hinaus liegt ein be sonderer Vorteil auch in der Schnelligkeit des hier be schriebenen Qualitätskontrollverfahrens.According to the invention, all the necessary test solutions can be used and incubation processes without problems under completely steri conditions. In addition, there is a be special advantage also in the speed of the be here written quality control procedure.
Schließlich handelt es sich bei allen in Rahmen des be schriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens benötigten Fakto ren bzw. Substanzen um klinisch bereits verfügbare in ande ren Zusammenhängen schon eingesetzte Produkte, die relativ kostengünstig zu beziehen sind.After all, all are within the framework of the be Factor described method required ren or substances around clinically already available in other Connections already used products that are relative are available inexpensively.
Zusammenfassend werden durch die vorliegende Erfindung die folgenden Vorteile erreicht.In summary, the present invention achieved the following advantages.
- 1. Der Qualitätsnachweis bezieht sich bei der vorliegenden Erfindung auf möglichst wenige, aus Objektivitätsgründen heraus aber hochselektive Merkmale entweder der vollkom menen Endothel-denudierten oder der vollkommen mit vita len Endothelzellen überzogenen Prothesenwand.1. The proof of quality refers to this Invention on as few as possible, for reasons of objectivity out but highly selective features of either the complete the endothelium-denuded or the one with complete vita len endothelial cell-covered prosthesis wall.
- 2. Die gesamte Endothelwand der zu implantierenden Prothese wird einbezogen.2. The entire endothelial wall of the prosthesis to be implanted is involved.
- 3. Das erfindungsgemäße Verfahren erfaßt weniger passive (z. B. rein anatomische) Merkmale als vielmehr funktio nelle Merkmale. Diese belegen den Grad der erreichten Antithrombogenität der Endothelfläche der zu implantie renden Gefäßprothese.3. The method according to the invention detects less passive (e.g. purely anatomical) features rather than function nelle features. These show the degree of achievement Antithrombogenicity of the endothelial surface of the implant vascular prosthesis.
- 4. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf wissenschaft lich akzeptierten und zweifelsfrei dokumentierten Meßme thoden.4. The method according to the invention is based on science Measurements accepted and documented without a doubt methods.
- 5. Bei dem vorliegenden Verfahren werden vorteilhafterweise nur Chemikalien verwendet, gegen die keine arzneimittel rechtlichen Bedenken bestehen.5. In the present method, advantageously only chemicals are used against which no drugs are used there are legal concerns.
- 6. Die Qualitätskontrolle läßt sich nach dem erfindungsge mäßen Verfahren schon an der noch nicht implantierten Prothese vollziehen und gibt Aufschluß über den erreich ten Konfluenzzustand der noch wachsenden Endothelzellen. 6. The quality control can be according to the fiction procedures already on the not yet implanted Perform prosthesis and provide information about the achieved th confluence state of the still growing endothelial cells.
- 7. Das erfindungsgemäße Verfahren ist wiederholt und stets unter strikt sterilen Bedingungen durchführbar.7. The process according to the invention is repeated and always feasible under strictly sterile conditions.
- 8. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht schnelle Er gebnisse und gibt einen direkten Aufschluß über die Qua lität der anschließend sofort transplantierten Gefäßpro these.8. The method according to the invention enables rapid er results and provides direct information about the Qua lity of the immediately transplanted vascular pro thesis.
- 9. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr kostengünstig.9. The method according to the invention is very inexpensive.
- 10. Neben endothelialisierten Gefäßprothesen läßt sich das beschriebene Verfahren auch zur Qualitätsüberprüfung der Endothelialisierung von Herzklappen und Herzhöhlen ein setzen.10. In addition to endothelialized vascular prostheses, this can be done described method also for quality control of the Endothelialization of heart valves and cardiac cavities put.
- 11. Schließlich eignet sich das hier beschriebene Verfahren auch zur Selektierung von für den autologen Gefäßersatz vor.11. Finally, the procedure described here is suitable also for the selection of for autologous vascular replacement in front.
Nach Abschluß der Protein C-Aktivierungsstudien wurde die selben Venensegmente mit Albumin/PBS-Lösung gründlich gewa schen und dann mit 37°C warmer Beriplex-Lösung gefüllt (eine Stammlösung von Beriplex P/N 500 [Centeon, Marburg] in 13 ml Aqua ad iniectabilia, davon ein 500 µl Aliquot 1 : 25 mit SL verdünnt, ausreichend für 5 Standard-Venensegmente), und bei 37°C inkubiert. Nach definierten Zeitintervallen wurden 100 µl-Aliquots abgenommen und in Mikrotiterplatten sofort mit 37°C warmer Stop-Lösung (wässrige Lösung von 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 120 mM NaCl, 2,7 mM KCl, eingestellt auf pH 10,0) vermischt. Nach Zugabe von Substrat für akti vierten Faktor Xa ("S-2222", Chromogenix) bis zur Endkon zentration 1,5 mM, wurde die photometrische Messreihe bei 37°C begonnen. Dazu wurde alle 30 sec die Extinktionszunah me bei 405 nm über einen Zeitraum von 15 min gemessen. Als Referenz diente verdünnte Beriplexlösung, die zuvor im selben Verhältnis mit reiner Deoxycholatlösung (0,025%ig in SL) und Stop-Lösung vermischt worden war.After completing the protein C activation studies, the same vein segments were washed thoroughly with albumin / PBS solution and then filled with 37 ° C warm Beriplex solution (a stock solution of Beriplex P / N 500 [Centeon, Marburg] in 13 ml Aqua ad iniectabilia, of which a 500 µl aliquot diluted 1:25 with SL, sufficient for 5 standard vein segments), and incubated at 37 ° C. After defined time intervals, 100 µl aliquots were taken and immediately in microtiter plates with 37 ° C warm stop solution (aqueous solution of 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 120 mM NaCl, 2.7 mM KCl, adjusted to pH 10.0) mixed. After addition of substrate for acti fourth factor Xa ( "S-2222", Chromogenix) to the final concentration 1, 5 mM, the photometric measurement series at 37 ° C was begun. For this purpose, the extinction increase at 405 nm was measured every 30 seconds over a period of 15 minutes. Diluted beriplex solution, which had previously been mixed in the same ratio with pure deoxycholate solution (0.025% in SL) and stop solution, served as reference.
In der Zwischenzeit der Gewebefaktor-Photometrie (s. o.) wurden die nun schon mehrfach untersuchten Ohrvenen mit Al bumin/PBS-Lösung gespült und dann dem in der Literatur be schriebenen Verfahren von E. Jaffe folgend durch 30 minüti ge Kollagenase-Inkubation bei 37°C von Endothel befreit. Danach wurden die Gefäße kräftig mit PBS durchspült, wobei immer wieder auch Luftblasen in den Perfusionsstrom inkor poriert wurden.Meanwhile tissue factor photometry (see above) the ear veins, which have now been examined several times, were treated with Al bumin / PBS solution and then be in the literature following procedures by E. Jaffe by 30 minutes Collagenase incubation at 37 ° C freed of endothelium. The vessels were then rinsed vigorously with PBS, whereby air bubbles in the perfusion stream again and again have been pored.
In den so de-endothelialisierten Gefäße wurden anschließend alle oben beschriebenen Inkubationsreihen zum Nachweis von aktivem Protein C bzw. freigelegtem Gewebefaktor unter sonst völlig analogen Bedingungen durchgeführt.In the so-endothelialized vessels were subsequently all incubation series described above for the detection of active protein C or exposed tissue factor under otherwise completely analogous conditions performed.
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