DE19937512B4 - Method and apparatus for rapid genome sequencing by linearization or separation of the DNA - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie und Genomik. Zwei prinzipiell verschiedene Sequenzierungsverfahren werden heute praktisch ausnahmslos angewendet. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung ist eine schneellere und billigere Sequenzierung von Genome zu erreichen. Die Sequenzierung eines pro- oder eukaryotischen z. B. eines menschlichen Chromosoms soll z. B. innerhalb eines Monats oder einer Woche gelingen und möglichst automatisch ablaufen. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung wird dadurch gelöst, dass eine gereinigte genomische DNA-Sequenz oder eine ungereinigte DNA-Sequenz eines, in einem Gemisch von Proteasen zersetzten Anaphase, Telophase, G1-Phase bzw. Mitose oder Interphase-Chromosoms auf einer langen Platte (LP), auf einem Lineal oder auf bzw. entlang eines langen Stabs geradlinig gelegt bzw. linearisiert und dann mit solchen Verfahrn wie z. B. Laser-Scanning-Mikroskopie z. B. unter schwachen UV-Bestrahlung (260-280 nm oder 200-250 nm), welche von der DNA absolbiert wird, Raster-Tunnel-Mikroskopie, Elektronen-Mikroskopie (EM), NMR- oder eine andere spektroskopische Analyse, CD (Circular Dichroism)) oder mit einem anderen Verfahren sequenziert wird.The invention relates to the field of molecular biology and genomics. Two principally different sequencing methods are used virtually invariably today. DOLLAR A The object of the invention is to achieve a faster and cheaper sequencing of genomes. The sequencing of a pro- or eukaryotic z. B. a human chromosome z. B. succeed within a month or a week and run as automatically as possible. DOLLAR A The object of the invention is achieved by a purified genomic DNA sequence or an unpurified DNA sequence of anaphase, telophase, G1-phase or mitosis or interphase chromosome decomposed in a mixture of proteases on a long plate ( LP), linearized on a ruler or on or along a long bar and then with such procedures such. B. laser scanning microscopy z. B. under weak UV irradiation (260-280 nm or 200-250 nm), which is absolubilized by the DNA, scanning tunneling microscopy, electron microscopy (EM), NMR or other spectroscopic analysis, CD (Circular Dichroism)) or sequenced by another method.
Description
Die Erfindung betrifft den Bereich der Molekularbiologie und Genomik. Zwei prinzipiell verschiedene Sequenzierungsverfahren werden heute praktisch ausnahmslos angewendet.The The invention relates to the field of molecular biology and genomics. Two fundamentally different sequencing methods are used today practically invariably applied.
Das erste Verfahren beruht auf einer basenspezifischen chemischen Spaltung am Ende radioaktiv markierter DNA-Fragmente (Maxam-Gilbert-Methode). In 4 verschiedenen Reaktionsansätzen werden die DNA Fragmente an den 4 Basen partiell basenspezifisch modifiziert. Danach wird die modifizierte Base von der Desoxyribose entfernt und die Phosphodiesterbindung an dieser Stelle im DNA-Rückgrat hydrolysiert. Die entstandenen Fragmente werden dann auf sehr dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach der Größe getrennt. Nach Autoradiographie sind nur die Fragmente sichtbar, die noch ein intaktes Ende besitzen, da die DNA nur dort radioaktiv markiert wurde.The The first method is based on a base-specific chemical cleavage at the end of radioactively labeled DNA fragments (Maxam-Gilbert method). In 4 different reactions the DNA fragments on the 4 bases become partially base-specific modified. Thereafter, the modified base of the deoxyribose removed and the phosphodiester bond hydrolyzed at this point in the DNA backbone. The resulting fragments are then on very thin polyacrylamide gels separated in the electric field according to size. After autoradiography only the fragments are visible, which are still one possess intact end, since the DNA is only radioactively labeled there has been.
Das zweite, heute wesentlich verbreitetere Verfahren basiert auf der enzymatischen Neusynthese der zu sequenzierenden DNA in Gegenwart nukleotidspezifischer Inhibitoren (Sanger-Methode). Ausgehend von einem kurzen Oligonukleotid (Primer) wird in 4 getrennten Ansätzen an der zu sequenzierenden DNA ein DNA-Strang neusynthetisiert. Gleichzeitig wird die neusynthetisierte DNA unter Einbau von 32P-dATP radioaktiv markiert. Jedem Ansatz wird jedoch neben den für die DNA-Synthese notwendigen Substraten (dNTPs) einer von 4 nukleotidspezifischen Inhibitoren zugesetzt. Hierbei handelt es sich um Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs), denen nicht nur die 2'-OH-Gruppe, sondern auch die 3'-OH-Gruppe der Desoxyribose fehlt. Didesoxynukleosidtriphosphate werden ebenso wie Desoxynukleosidtriphosphate von der DNA-Polymerase als Substrate verwendet. Werden sie jedoch statt eines Desoxynukleosidtriphosphats statistisch in die DNA eingebaut, so kann an dieser Stelle die DNA-Kette nicht mehr verlängert werden, da ja die 3'-OH-Gruppe fehlt. In jedem der 4 Reaktionsansätze befindet sich also eine Population von DNA-Molekülen, die zum einen alle radioaktiv markiert sind, die zum anderen alle in Form des Primers ein identisches 5'-Ende tragen, und die sich schließlich aber in der Länge bis zum jeweils basenspezifischen 3'-Ende hin unterscheiden. Diese Fragmente werden wiederum auf dünnen Polyacrylamidgelen im elektrischen Feld nach Größe getrennt und durch Autoradiographie dargestellt.The second method, which is much more common today, is based on the enzymatic re-synthesis of the DNA to be sequenced in the presence of nucleotide-specific inhibitors (Sanger method). Starting from a short oligonucleotide (primer), a DNA strand is re-synthesized in 4 separate batches on the DNA to be sequenced. At the same time, the newly synthesized DNA is radiolabeled by incorporation of 32 P-dATP. However, each batch is added to one of 4 nucleotide-specific inhibitors in addition to the substrates (dNTPs) required for DNA synthesis. These are dideoxynucleoside triphosphates (ddNTPs), which lack not only the 2'-OH group but also the 3'-OH group of deoxyribose. Dideoxynucleoside triphosphates, as well as deoxynucleoside triphosphates, are used as substrates by the DNA polymerase. However, if they are randomly incorporated into the DNA instead of a deoxynucleoside triphosphate, then at this point the DNA chain can no longer be extended, since the 3'-OH group is missing. In each of the 4 reaction approaches, therefore, there is a population of DNA molecules that are all radiolabeled on the one hand, on the other hand all in the form of the primer have an identical 5 'end, and finally but in length to each distinguish base-specific 3 'end. These fragments are again size-separated on thin polyacrylamide gels in the electric field and displayed by autoradiography.
Der Hauptnachteil dieser Sequenzanalysen besteht im großen Zeit- und Finanzaufwand. Vom Beginn des Projektes bis zu dem Punkt, wo ein Genom komplett sequenziert wird, können Jahre und sogar Jahrzehnte vergehen, z.B. wurde das "Human Genome Projekt" im Jahre 1973 begonnen und wird voraussichtlich im 2003 beendet.Of the The main disadvantage of these sequence analyzes is the long-term and financial expenses. From the beginning of the project to the point where A genome completely sequenced can take years and even decades pass, e.g. became the "Human Genome Project "im Started in 1973 and is expected to finish in 2003.
Die
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Die Aufgabe der Erfindung ist, eine schnellere und billigere Sequenzierung von Genomen zu erreichen. Die Sequenzierung eines pro- oder eukaryontischen Genoms bzw. menschlicher Chromosomen soll z.B. innerhalb eines Monats oder einer Woche gelingen und möglichst automatisch ablaufen.The The object of the invention is a faster and cheaper sequencing of genomes. The sequencing of a pro- or eukaryotic Genome or human chromosomes should e.g. within a month or a week succeed and possible run automatically.
Die Aufgabe der Erfindung wird, dadurch gelöst, dass ein gereinigtes genomisches DNA-Molekül oder ein ungereinigtes DNA-Molekül eines, in einem Gemisch von Proteasen zersetztes Anaphase-, Telophase-, G1-Phase- bzw. Mitose- oder Interphase-Chromosom auf einer langen Platte (LP), auf einem Lineal oder auf bzw. entlang eines langen Stabs geradlinig gelegt bzw. linearisiert oder auseinander gezogen und dann mit solchen Verfahren wie z.B. Laser-Scanning-Mikroskopie z.B. unter schwacher UV-Bestrahlung (260–280 nm oder 200–250 nm), welche von der DNA absorbiert wird, Raster-Tunnel-Mikroskopie, Elektronen-Mikroskopie (EM), NMR- oder anderen spektroskopischen Analysen, CD (Circular Dichroism) oder mit einem anderen physikalisch-optischen Verfahren sequenziert wird.The The object of the invention is achieved in that a purified genomic DNA molecule or a unpurified DNA molecule anaphase, telophase, decomposed in a mixture of proteases, G1-phase or mitosis or interphase chromosome on a long Plate (LP), on a ruler or on or along a long Stabs laid straight or linearized or pulled apart and then with such methods as e.g. Laser scanning microscopy e.g. under low UV irradiation (260-280 nm or 200-250 nm), which is absorbed by the DNA, scanning tunneling microscopy, electron microscopy (EM), NMR or other spectroscopic analyzes, CD (Circular Dichroism) or with another physico-optical method is sequenced.
Vorbereitungpreparation
a) Reinigung der genomischen, z.B. chromosomalen DNA-Molekülea) purification of the genomic, e.g. chromosomal DNA molecules
Ein DNA-Molekül in Form eines aus dem Zellkern isolierten Chromosoms, aus dem Plasma einer isolierten Organelle, oder eine virale oder eine bakterielle DNA oder DNA anderer Herkunft wird durch Abbau chromosomaler Proteine bzw. Organellen-Proteine von den Proteinen getrennt und dann z.B. durch Zentrifugation gereinigt.A DNA molecule in the form of a nucleus isolated chromosome, from the plasma of an isolated organelle, or a viral or a Bacterial DNA or DNA of other origin is separated by degradation of chromosomal proteins or organelle proteins from the proteins and then purified, for example by centrifugation.
Um einen Abbau chromosomaler Proteine zu erreichen, wird mindestens ein Chromosom mit einem Gemisch von Proteasen inkubiert. Das Gemisch von Proteasen enthält z.B. Chymotrypsin, Streptomyces griseus-Protease (Pronase), Aspergillus oryzae-Protease, Subtilisin, Elastase, Pepsin, Papain, Bromealin u.a. Proteasen und Dithiothreitol, welches Disulfidbrücken in Proteine reduziert.Around to achieve a degradation of chromosomal proteins, at least a chromosome is incubated with a mixture of proteases. The mixture of Contains proteases e.g. Chymotrypsin, Streptomyces griseus protease (pronase), Aspergillus oryzae protease, subtilisin, elastase, pepsin, papain, bromealin et al Proteases and dithiothreitol, which disulfide bridges in Reduced proteins.
Durch diese Protease werden die chromosomalen Proteine zersetzt, wobei das DNA-Molekül nicht angegriffen und freigesetzt wird. Das DNA-Molekül wird z.B. durch Zentrifugation z.B. im Cäsiumchlorid Gradient oder Gelelektrophorese gereinigt.By this protease decomposes the chromosomal proteins, wherein the DNA molecule is not attacked and released. The DNA molecule is e.g. by centrifugation e.g. in cesium chloride Gradient or gel electrophoresis cleaned.
b) Präparation des gereinigten DNA-Molekülsb) Preparation of the purified DNA molecule
Für die Sequenzierung ist eine Immobilisierung der beiden Enden des genomischen DNA-Moleküls an bestimmte Substrate notwendig. Diese Substrate können z.B. viereckig oder kreisförmig sein, wobei eine Seite bzw. Oberfläche z.B. eines Vierecks oder Kreises mit einem Glasstab verbunden ist und an der anderen Oberfläche ein kurzes synthetisches DNA-Molekül, wie z.B. ein Poly(G/C)n-Molekül immobilisiert ist. Die viereckigen Substrate können sich entlang einer langen Platte (LP) bzw. auf der Oberfläche der LP oder über eine Nut in der LP bewegen. Die kreisförmigen Substrate können sich auch entlang der LP bzw. über oder in der Nut in der LP bewegen. Das kurze synthetische DNA-Molekül kann z.B. in einem DNA-Synthetisierer hergestellt werden und entweder durch ein Sauerstoffatom oder z.B. durch Polylysin-Polyhistidin-Fusionspeptide, die auf einer Nickel-haltigen Oberfläche befestigt sind, an die Substrate immobilisiert werden. Die LP weist mindestens eine Vertiefung auf, die entweder klein oder wie ein Reagenzglas sein kann. Die lange Platte (LP) besteht z.B. aus Glas, Silizium oder einem Metall wie z.B. Gold oder Kupfer. Die LP kann fest oder elastisch bzw. biegsam sein. Die Oberfläche der LP kann gut bzw. präzise oder nicht gut geschliffen sein. Auf der LP können sich ein, zwei oder mehrere Substrate bewegen, die sich über dem Niveau der Vertiefung und der Nut befinden. Die beiden freien Enden der an zwei Substrate immobilisierten synthetischen DNA-Moleküle befinden sich in der Vertiefung, aber sind relativ weit voneinander entfernt, um die Ligation zwischen diesen freien Enden zu verhindern. Die Immobilisierung des genomischen oder chromosomalen DNA-Moleküls wird durch die Ligation eines oder beider Enden dieses genomischen DNA- Moleküls mit den freien Enden der kurzen synthetischen DNA-Moleküle z.B. Poly(G/C)n, die jeweils mit einem Ende am beweglichen Substrat immobilisiert sind, in der Vertiefung der LP und unter Zugabe von DNA-Ligasen und ATP erreicht.For sequencing is an immobilization of the two ends of the genomic DNA molecule to certain Substrates necessary. These substrates may e.g. be square or circular, where a page or surface e.g. a rectangle or circle is connected to a glass rod and on the other surface a short synthetic DNA molecule, e.g. immobilized a poly (G / C) n molecule is. The quadrangular substrates can along a long plate (LP) or on the surface of the LP or over move a groove in the LP. The circular substrates can become also along the LP or over or move in the groove in the LP. The short synthetic DNA molecule may e.g. in a DNA synthesizer and either by a Oxygen atom or e.g. by polylysine-polyhistidine fusion peptides, which are mounted on a nickel-containing surface to which Substrates are immobilized. The LP has at least one depression which can be either small or as a test tube. The long disk (LP) consists e.g. made of glass, silicon or a metal such as. Gold or copper. The LP can be fixed or elastic or be flexible. The surface the LP can be good or precise or not honed well. On the LP can be one, two or more Move substrates that are over the level of the depression and the groove. The two free Ends of the immobilized on two substrates synthetic DNA molecules are located yourself in the depression, but are relatively far apart, to prevent the ligation between these free ends. The Immobilization of the genomic or chromosomal DNA molecule becomes by the ligation of one or both ends of this genomic DNA molecule with the free ends of the short synthetic DNA molecules e.g. Poly (G / C) n, respectively are immobilized at one end to the movable substrate, in the Deepening of the LP and achieved with the addition of DNA ligases and ATP.
c) Ligation der beiden Enden der gereinigten oder ungereinigten genomischen oder chromosomalen DNA-Moleküle mit den freien Enden der synthetischen DNA-Moleküle der Substratec) Ligation of the two Terminals of the purified or unpurified genomic or chromosomal DNA molecules with the free ends of the synthetic DNA molecules of the substrates
Das gereinigte genomische z.B. chromosomale DNA-Molekül wird in die Vertiefung in der oder auf der Oberfläche der langen Platte (LP) oder ihrer Nut gelegt. Danach gibt man einen Gemisch mit DNA-Ligasen z.B. T4-Ligasen und ATP in diese Vertiefung, damit die beiden Enden des gereinigten genomischen DNA-Moleküls mit den beiden freien Enden der synthetischen DNA-Moleküle wie z.B. Poly(G/C)n des Substrats ligiert werden. In der Vertiefung kann auch ein G1-Phase- bzw. ein Interphase oder ein Mitose-Chromatin gelegt werden. In diesem Fall gibt zuerst man einen Gemisch mit Proteasen wie z.B. Chymotrypsin, Streptomyces griseus-Protease, Aspergillus oryzae-Protease, Subtilisin, Elastase, Pepsin, Papain u.a. Proteasen, damit die chromosomalen Proteine ohne Beeinträchtigung der DNA zersetzt werden, und danach einen Gemisch mit T4-Ligasen, ATP und Inhibitoren der Proteasen in die Vertiefung auf der LP.The purified genomic e.g. chromosomal DNA molecule is in the depression in or on the surface of the long plate (LP) or her groove. Thereafter, a mixture with DNA ligases e.g. T4 ligases and ATP in this well, so the two ends of the purified genomic DNA molecule with the two free ends the synthetic DNA molecules such as. Poly (G / C) n of the substrate are ligated. In the depression may also be a G1-phase or an interphase or a mitotic chromatin be placed. In this case, you first give a mixture Proteases, e.g. Chymotrypsin, Streptomyces griseus protease, Aspergillus oryzae protease, subtilisin, elastase, pepsin, papain et al Proteases to allow the chromosomal proteins without impairment DNA and then a mixture with T4 ligases, ATP and inhibitors of proteases in the well on the LP.
Man kann mehrere miteinander ligierte Chromosomen oder chromosomale DNA-Moleküle in die Vertiefung auf der LP einführen, damit die Sequenzierung des gesamten Genoms ununterbrochen verlaufen kann.you can be several mutually ligated chromosomes or chromosomal DNA molecules Insert into the well on the LP to allow sequencing of the entire genome can be uninterrupted.
Für die Ligation der Chromosomen nimmt man z.B. G1-Phase-Chromosomen und behandelt ihre Telomer-Abschnitte, so dass die Telomer-Bereiche frei werden. Danach mischt man diese Chromosomen, deren Telomer-Abschnitte frei sind, mit DNA-Ligasen und ATP. Dabei werden die Telomer-Abschnitte verschiedener Chromosomen miteinander ligiert. Man führt diese ligierten Chromosomen in ein Gemisch von Proteasen ein, wonach die chromosomalen Proteine ohne Beeinträchtigung der DNA zersetzt werden und die DNA-Moleküle freigelegt bzw. entschraubt werden.For the ligation the chromosomes are taken e.g. G1-phase chromosomes and treated their Telomere sections so that the telomere areas become free. After that mix these chromosomes, whose telomere sections are free, with DNA ligases and ATP. Thereby the telomere sections become different Chromosomes ligated together. One introduces these ligated chromosomes in a mixture of proteases, after which the chromosomal proteins without impairment The DNA are decomposed and the DNA molecules uncovered or unscrewed become.
Linearisierung oder Auseinanderziehenlinearization or pulling apart
Nach der Ligation der beiden Enden der gereinigten oder ungereinigten genomischen bzw. chromosomalen DNA-Moleküle mit den freien Enden der kurzen synthetischen DNA-Moleküle z.B. (G/C)n, die jeweils mit einem Ende an die beweglichen Substrate immobilisiert sind, werden diese Substrate auf der langen Platte (LP) in entgegengesetzten Richtungen langsam bewegt. Das freigelegte DNA-Molekül wird auseinander gezogen. Dabei wird dieses DNA-Molekül auf der Oberfläche der Nut der LP gestreckt oder geradlinig gelegt bzw. linearisiert.To the ligation of the two ends of the purified or unpurified genomic or chromosomal DNA molecules with the free ends of the short synthetic DNA molecules e.g. (G / C) n, which are each immobilized at one end to the movable substrates, These substrates are opposed on the long plate (LP) Directions slowly moved. The exposed DNA molecule will diverge drawn. This DNA molecule is on the surface of the Groove of the LP stretched or rectilinear or linearized.
Sequenzierungsequencing
Nach der Linearisierung der genomischen oder chromosomalen DNA-Moleküle auf der langen Platte (LP) wird ein DNA-Molekül mit Verfahren wie z.B. Laser-Scanning, Elektronen- oder Raster-Tunnel-Mikroskopie, NMR- oder anderen spektroskopischen Analysen oder anderen physikalisch-optischen Verfahren sequenziert werden.To the linearization of genomic or chromosomal DNA molecules on the long plate (LP) is a DNA molecule with methods such. Laser scanning, Electron or Scanning tunneling microscopy, NMR or other spectroscopic analyzes or other physico-optical methods.
Das linearisierte DNA-Molekül kann durch mehrere Sequenzierer und auch mit verschiedenen Fragmenten sequenziert werden. Dieser Vorgang wird hier als eine "multiparallele Sequenzierung" (MS) bezeichnet. Um die Sequenzierung relativ zu vereinfachen, kann man die Oberfläche der LP bzw. der Nute mit einem Gemisch von Helicasen, wie z.B. 3'-5' E. coli Rep Helicase, und ATP beschichten, damit die linearisierte doppelsträngige oder dsDNA in zwei komplementäre einzelsträngige ssDNA-Moleküle geteilt wird. Man kann die ganze LP oder nur die Vertiefung erhitzen, damit alle Wasserstoffbrücken und DNA-DNA-Interaktionen gelöst werden.The linearized DNA molecule can through multiple sequencers and also with different fragments be sequenced. This process is referred to herein as "multi-parallel sequencing" (MS). To simplify the sequencing relatively, one can see the surface of the LP or groove with a mixture of helicases, e.g. 3'-5 'E. coli Rep Helicase, and ATP coat so that the linearized double-stranded or dsDNA in two complementary single ssDNA molecules is shared. You can heat the whole LP or just the deepening, so that all hydrogen bonds and DNA-DNA interactions solved become.
In
der
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der
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der
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den
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Ligationsstellen
In
der
In
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In
der
Somit können z.B. drei oder mehrere chromosomale DNA-Moleküle auf einer LP linearisiert und sequenziert werden.Consequently can e.g. linearized three or more chromosomal DNA molecules on a LP and be sequenced.
Ein
Anaphase-, Telophase-, G1-Phase- bzw. Mitose- oder Interphase-Chromosom
Die
lange Platte (LP)
Das
Molekül
Die
synthetischen Moleküle
Das
Substrat
Das
Substrat
Nach
der Linearisierung des genomischen oder chromosomalen DNA-Moleküls
Die
LP2 in der
Die
Erhitzung erfolgt aber nach der Ligation eines der beiden Enden
des Moleküls
In
der
- 11
- Sequenzierer, z.B. Sonde eines Raster-tunnel-Mikroskops oder einsequencer, e.g. Probe a raster tunnel microscope or a
- Spektroskopspectroscope
- 22
- Lange Platte (LP)Long Plate (LP)
- 33
- Vertiefungdeepening
- 44
- (kurze) synthetische DNA-Moleküle(Short) synthetic DNA molecules
- 55
- Nut auf der LP2groove on the LP2
- 66
-
eckiges
Substrat ohne Glasstab
16 angular substrate without glass rod16 - 77
- ein genomisches oder chromosomales DNA-Molekülone genomic or chromosomal DNA molecule
- 88th
-
Ligationsstelle
zwischen dem Molekül
4 und dem Molekül7 Ligation site between the molecule4 and the molecule7 - 99
- ReagenzglasTest tube
- 1010
- ein Interphase-, z.B. G1-Phase, oder Mitose-Chromosom oder Anaphase-one Interphase, e.g. G1 phase, or mitosis chromosome or anaphase
- Chromatinchromatin
- 1111
- Gemisch mit Proteasenmixture with proteases
- 1212
- Gemisch mit DNA-Ligasen und ATPmixture with DNA ligases and ATP
- 1313
-
Deckel
des Substrats
6 Cover of the substrate6 - 1414
- Polyhistidin-Polylysin-Fusionspeptid-SchichtPolyhistidine fusion peptide-polylysine-layer
- 1515
-
Ni-NTA-Schicht
16 GlasstabNi-NTA-layer16 glass rod - 1717
- Substrat des Glasstabssubstratum of the glass rod
- 1818
- Erhitzerheaters
- 1919
-
Verbindungsfaser
zwischen den Glasstab
16 und der Rolle18 Connecting fiber between the glass rod16 and the role18 - 2020
- Pipettepipette
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