DE19932380A1 - Assay for hydrogen peroxide and hydroperoxides comprises peroxidase-catalyzed reaction with a 4-(alpha-N-alkylhydrazino)-2,1,3-benzoxadiazole - Google Patents
Assay for hydrogen peroxide and hydroperoxides comprises peroxidase-catalyzed reaction with a 4-(alpha-N-alkylhydrazino)-2,1,3-benzoxadiazoleInfo
- Publication number
- DE19932380A1 DE19932380A1 DE1999132380 DE19932380A DE19932380A1 DE 19932380 A1 DE19932380 A1 DE 19932380A1 DE 1999132380 DE1999132380 DE 1999132380 DE 19932380 A DE19932380 A DE 19932380A DE 19932380 A1 DE19932380 A1 DE 19932380A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- hydrogen peroxide
- hydroperoxides
- determination
- reaction
- peroxidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Hydroperoxiden.The invention relates to a method for determining Hydrogen peroxide and hydroperoxides.
Wasserstoffperoxid und Hydroperoxide sind Oxidationsmittel von nahezu ubiquitärer Verbreitung. In der chemischen Industrie werden diese Peroxide für Oxidationsreaktionen eingesetzt, in unserer Atmosphäre spielen sie eine bedeutende Rolle in den Oxidationskreisläufen, und auch in Organismen treten sie in signifikanten Konzentrationen auf (S. Karpinski, H. Reynolds, B. Karpinska, G. Wingsle, G. Creisseu, P. Mullineaux, Science 284 (1999) 654).Hydrogen peroxide and hydroperoxides are oxidizing agents from almost ubiquitous distribution. In the chemical industry these peroxides are used for oxidation reactions in our They play a significant role in the atmosphere Oxidation cycles, and they also occur in organisms significant concentrations on (S. Karpinski, H. Reynolds, B. Karpinska, G. Wingsle, G. Creisseu, P. Mullineaux, Science 284 (1999) 654).
Aus diesen Gründen ist eine quantitative Analytik dieser Peroxide in vielen verschiedenen Anwendungsbereichen dringend geboten. Die enzymatische Bestimmung der Peroxide stellt unter den Analysenverfahren eine besonders attraktive Variante dar, da das Enzym als Biokatalysator eine hohe Selektivität für bestimmte Peroxide gegenüber anderen aufweist. Am weitesten verbreitet ist die Analytik dieser Peroxide unter Verwendung der käuflich erhältlichen Meerrettichperoxidase (Horseradish peroxidase, HR-POD). Diese wird auch in einer bedeutenden Gruppe bioanalytischer Methoden, den Enzym- und Immunoassays als Reagenz eingesetzt. Besonders wichtig sind in diesem Zusammenhang Reaktionen von Oxidasen, die die Reaktion eines Substrates durch Luftsauerstoff katalysieren. Die Menge des hierbei entstehenden Wasserstoffperoxids stellt ein Maß für die Konzentration des Substrates dar. In einer nachgeschalteten Reaktion wird das entstandene Wasserstoffperoxid unter Verwendung der Peroxidase bestimmt. Diese katalysiert die Oxidation einer Vielzahl von Substraten durch Wasserstoffperoxid (L. Casella, A. Marchesini, Biochemistry 33 (1994) 6377) zu gefärbten oder fluoreszierenden Produkten. Als chromogene Peroxidasesubstrate werden unter anderem besonders häufig das o-Phenylendiamin (OPD) (S. Ogiwara, K. Kiuchi, T. Nagatsu, R. Teradaira, I. Nagatsu, K. Fujita, T. Sugimoto, Clinical Chemistry 38 (1992) 1954) das Azinobis- (ethylbenzothiazolin)sulfonat (ABTS) (K.K. Mäkinen, J. Tenovou, Analytical Biochemistry 126 (1982) 100) oder das Tetramethylbenzidin (TMB) (E.S. Bos, et al., Journal of Immunoassay 2 (1981) 187) verwendet, deren Oxidation zu Chromophoren mit Absorptionsmaxima im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums führt. Als fluorogene Peroxidasesubstrate finden dagegen die p-Hydroxyphenylalkansäuren mit Alkylkettenlängen von zwei und drei Kohlenstoffatomen breite Verwendung (G.G. Guilbault, D.N. Kramer, E. Hackley, Analytical Chemistry 39 (1967) 271; G.G. Guilbault, P.J. Brignac, M. Juneau, Analytical Chemistry 40 (1968) 1256; E. Hellpointner, S. Gäb, Nature 337 (1989) 631 und P. Heinmöller, H.-H. Kurth, R. Rabong, W.V. Turner, A. Kettrup, S. Gäb, Analytical Chemiwstry 70 (1998) 1437). Ihre Peroxidase- katalysierte Oxidation durch Peroxide führt zu stark fluoreszierenden Produkten. Unter Verwendung der Fluoreszenzspektroskopie werden deutlich niedrigere Nachweisgrenzen erhalten als unter Verwendung der UV/vis-Spektroskopie für die nicht fluoreszierenden Chromophore. Die Leistungsfähigkeit der gesamten Analysenmethoden ist daher in vielen Fällen von der Nachweisgrenze des abschließenden Verfahrens zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid direkt abhängig.For these reasons there is a quantitative analysis of these peroxides urgently needed in many different areas of application. The enzymatic determination of the peroxides is one of the Analytical methods are a particularly attractive variant because the Enzyme as a biocatalyst has a high selectivity for certain Has peroxides over others. Most widespread the analysis of these peroxides using the commercially available available horseradish peroxidase (Horseradish peroxidase, HR-POD). This is also becoming bioanalytical in a significant group Methods, the enzyme and immunoassays used as a reagent. In this context, reactions from Oxidases, which are the reaction of a substrate by atmospheric oxygen catalyze. The amount of the resulting Hydrogen peroxide is a measure of the concentration of the Substrate represents. In a downstream reaction that hydrogen peroxide formed using the peroxidase certainly. This catalyzes the oxidation of a large number of Substrates by hydrogen peroxide (L. Casella, A. Marchesini, Biochemistry 33 (1994) 6377) to colored or fluorescent Products. As chromogenic peroxidase substrates, among others o-phenylenediamine (OPD) (S. Ogiwara, K. Kiuchi, T. Nagatsu, R. Teradaira, I. Nagatsu, K. Fujita, T. Sugimoto, Clinical Chemistry 38 (1992) 1954) das Azinobis- (ethylbenzothiazoline) sulfonate (ABTS) (K.K. Mäkinen, J. Tenovou, Analytical Biochemistry 126 (1982) 100) or that Tetramethylbenzidine (TMB) (E.S. Bos, et al., Journal of Immunoassay 2 (1981) 187), whose oxidation to chromophores with Absorption maxima in the visible range of the electromagnetic Spectrum leads. On the other hand, as fluorogenic peroxidase substrates the p-hydroxyphenylalkanoic acids with alkyl chain lengths of two and three carbon atoms wide use (G.G. Guilbault, D.N. Kramer, E. Hackley, Analytical Chemistry 39 (1967) 271; G.G. Guilbault, P.J. Brignac, M. Juneau, Analytical Chemistry 40 (1968) 1256; E. Hellpointner, S. Gäb, Nature 337 (1989) 631 and P. Heinmöller, H.-H. Kurth, R. Rabong, W.V. Turner, A. Kettrup, S. Gäb, Analytical Chemiwstry 70 (1998) 1437). Your peroxidase Catalyzed oxidation by peroxides leads to too much fluorescent products. Using the Fluorescence spectroscopy shows significantly lower detection limits obtained as using UV / vis spectroscopy for that non-fluorescent chromophores. The performance of the entire analysis methods is therefore in many cases from the Limit of detection of the final method for determining Hydrogen peroxide directly dependent.
Immunoassays, insbesondere die sogenannten enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) werden zur Bestimmung einer Vielzahl biomedizinisch relevanter Analyten eingesetzt. Die Peroxidase wird hierbei an einen Immunreaktanden chemisch gebunden. Nach erfolgter Immunreaktion wird die Bestimmung des gekoppelten Enzyms unter Verwendung der oben beschriebenen Reaktionen durchgeführt. Aufgrund der hohen enzymatischen Aktivität besitzen diese Analysenverfahren extrem niedrige Nachweisgrenzen.Immunoassays, especially the so-called enzyme-linked Immunosorbent assays (ELISA) are used to determine a wide variety biomedically relevant analytes. The peroxidase will chemically bound to an immune reactant. After done Immune response is taking the determination of the coupled enzyme Performed using the reactions described above. Because of These analytical methods possess high enzymatic activity extremely low detection limits.
In den Enzym- und Immunoassays können neben der HR-POD auch verwandte Enzyme (beispielsweise Microperoxidasen, Chloroperoxidase, (L. Casella, A. Marchesini, Biochemistry 33 (1994) 6377; K.K. Mäkinen, J. Tenovou, Analytical Biochemistry 126 (1982) 100)) oder biomimetische Enzyme, z. B. Porphyrinkomplexe, (Q. Chen, D. Ci, Q. Zhu, H. Zheng, J. Xu, Anal. Chim. Acta 381 (1999) 175) eingesetzt werden. Diese Katalysatoren zeichnen sich durch unterschiedliche Aktivitäten und Selektivitäten aus. Kopplungen mit Oxidase katalysierten Reaktionen, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid verlaufen, sind ebenfalls möglich.In addition to HR-POD, enzyme and immunoassays can also related enzymes (e.g. microperoxidases, Chloroperoxidase, (L. Casella, A. Marchesini, Biochemistry 33 (1994) 6377; K.K. Mäkinen, J. Tenovou, Analytical Biochemistry 126 (1982) 100)) or biomimetic enzymes, e.g. B. Porphyrin Complexes, (Q. Chen, D. Ci, Q. Zhu, H. Zheng, J. Xu, Anal. Chim. Acta 381 (1999) 175) can be used. These catalysts are characterized by different activities and selectivities. Couplings with Oxidase catalyzed reactions that release Hydrogen peroxide are also possible.
2,1,3-Benzooxadiazolderivate (Benzofurazanderivate) sind in der analytischen Chemie bisher vor allem in Form des 4-Chloro-7-nitro- 2,1,3-benzooxadiazols (NBD-chlorid, NBD-Cl) oder seines 4-Fluor-Analogons (NBD-F) bekannt geworden, welche sich mit Nucleophilen unter Ausbildung fluoreszierender Produkte umsetzen (z. B. H.-J. Klimisch, L. Stadler, Journal of Chromatography 90 (1974) 141; P.B. Ghosh, M.W. Whitehouse, Biochem. J. 108 (1968) 155 und K. Imai, Y. Watanabe, Analytica Chimica Acta 130 (1981) 377). Auch die entsprechenden 4-Halogen-7-aminosulfonylderivate (ABD-X mit X = Cl oder F), 4-Halogen-7-dimethylaminosulfonylderivate (DBD-X) und 4-Halogeno-7-sulfonsäurederivate (SBD-X) sind für ähnliche Zwecke eingesetzt worden (z. B. T. Toyo'oka, T. Suzuki, Y. Saito, S. Uzu, K. Imai, Analyst 114 (1989) 413).2,1,3-benzooxadiazole derivatives (benzofurazane derivatives) are in the analytical chemistry so far mainly in the form of 4-chloro-7-nitro 2,1,3-benzooxadiazole (NBD chloride, NBD-Cl) or its 4-fluoro analogue (NBD-F), which deals with nucleophiles with the formation of fluorescent products (e.g. H.-J. Klimisch, L. Stadler, Journal of Chromatography 90 (1974) 141; P.B. Ghosh, M.W. Whitehouse, Biochem. J. 108 (1968) 155 and K. Imai, Y. Watanabe, Analytica Chimica Acta 130 (1981) 377). Also the corresponding 4-halogen-7-aminosulfonyl derivatives (ABD-X with X = Cl or F), 4-halogen-7-dimethylaminosulfonylderivate (DBD-X) and 4-Halogeno-7-sulfonic acid derivatives (SBD-X) are for similar purposes have been used (e.g. T. Toyo'oka, T. Suzuki, Y. Saito, S. Uzu, K. Imai, Analyst 114 (1989) 413).
Als Hydrazinreagenzien zur Bestimmung von Carbonylverbindungen wurden die 4-Hydrazinoverbindungen NBDH, DBDH und ABDH beschrieben (z. B. S. Uzu, S. Kanda, K. Imai, K. Nakashima, S. Akiyama, Analyst 115 (1990) 1477), während für die Analytik von Carbonsäuren das 4-Piperazinylderivat und das 4-Aminoethylaminoderivat bekannt sind (z. B. T. Toyo'oka, M. Ishibashi, Y. Takeda, K. Nakashima, S. Akiyama, S. Uzu, K. Imai, Journal of Chromatography 588 (1991) 61 und P. Prados, T. Fukushima, T. Santa, H. Homma, M. Tsunoda, S. Al- Kindi, S. Mori, H. Yokosu, K. Imai, Analytica Chimica Acta 344 (1997) 227).As hydrazine reagents for the determination of carbonyl compounds the 4-hydrazino compounds NBDH, DBDH and ABDH have been described (e.g. S. Uzu, S. Kanda, K. Imai, K. Nakashima, S. Akiyama, Analyst 115 (1990) 1477), while for the analysis of carboxylic acids 4-piperazinyl derivative and the 4-aminoethylamino derivative are known (e.g. T. Toyo'oka, M. Ishibashi, Y. Takeda, K. Nakashima, S. Akiyama, S. Uzu, K. Imai, Journal of Chromatography 588 (1991) 61 and P. Prados, T. Fukushima, T. Santa, H. Homma, M. Tsunoda, S. Al- Kindi, S. Mori, H. Yokosu, K. Imai, Analytica Chimica Acta 344 (1997) 227).
Als N-alkylierte Verbindung wurde kürzlich das 4-α-N-Methyl hydrazino-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol (MNBDH) beschrieben (A. Büldt, U. Karst, DE 198 00 537.7), welches mit Aldehyden und Ketonen zu den entsprechenden Hydrazonen abreagiert, die flüssigchromatographisch getrennt und UV/vis-spektroskopisch detektiert werden (A. Büldt, U. Karst, Analytical Chemistry 71 (1999) 1893). Sowohl das Hydrazinreagenz als auch seine Derivate sind nichtfluoreszierend. Das Reagenz kann sowohl in Verbindung mit der Aktivprobenahme, als auch unter Verwendung diffusionskontrollierter Passivsammler (A. Büldt, R. Lindahl, J.-O. Levin, U. Karst, J. Environ. Monit. 1 (1999) 39) eingesetzt werden. Bemerkenswert ist die Reaktion von MNBDH mit Stickstoffdioxid und Ozon zu nur einem einzigen Reaktionsprodukt, dem 4-α-N-Methylamino- 7-nitro-2,1,3-benzooxadiazol (MNBDA), welches sich durch eine intensive Fluoreszenz auszeichnet. Die Reaktion mit Nitrit im sauren Medium unter Entstehung desselben Reaktionsproduktes kann zur fluoreszenzspektroskopischen Bestimmung von Nitrit eingesetzt werden (A. Büldt, U. Karst, Analytical Chemistry, im Druck). Eine Reaktion mit Peroxiden ist bisher nicht bekannt.4-α-N-methyl was recently used as the N-alkylated compound hydrazino-7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (MNBDH) (A. Büldt, U. Karst, DE 198 00 537.7), which with aldehydes and Ketones reacted to the corresponding hydrazone, which separated by liquid chromatography and UV / vis-spectroscopic can be detected (A. Büldt, U. Karst, Analytical Chemistry 71 (1999) 1893). Both the hydrazine reagent and its derivatives are non-fluorescent. The reagent can be used in conjunction with the active sampling, as well as using diffusion-controlled passive collector (A. Büldt, R. Lindahl, J.-O. Levin, U. Karst, J. Environ. Mon. 1 (1999) 39) can be used. The reaction of MNBDH with nitrogen dioxide and is remarkable Ozone to only one reaction product, the 4-α-N-methylamino 7-nitro-2,1,3-benzooxadiazole (MNBDA), which is characterized by a characterized by intense fluorescence. The reaction with nitrite in acidic medium with the formation of the same reaction product used for the fluorescence spectroscopic determination of nitrite (A. Büldt, U. Karst, Analytical Chemistry, in press). A Reaction with peroxides is not yet known.
Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß MNDBH durch Wasserstoffperoxid und Alkylhydroperoxide in Gegenwart von Peroxidase als Katalysator rasch ebenfalls unter Entstehung des MNBDA oxidiert wird. Das intensiv fluoreszierende MNBDA kann unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers oder eines Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreaders quantifiziert werden. Im Vergleich zu den bekannten p-Hydroxyalkylcarbonsäuren zeichnet sich das MNBDH als Peroxidasesubstrat durch wesentliche technische Vorteile aus: Die Anregung findet bei etwa 470 nm statt, während die Emission bei etwa 550 nm gemessen wird. Damit sind Anregung und Emission des MNBDA im Vergleich zu den Oxidationsprodukten der Hydroxyphenylcarbonsäuren um mehr als 100 nm rotverschoben, was eine deutlich bessere Selektivität bedingt. Es zeigte sich, daß die dem MNBDH ähnlichen Substanzen MDBDH (mit einer Dimethylaminosulfonyl- anstelle einer Nitrofunktion in 7-Position) und MABDH (mit einer Aminosulfonyl- anstelle einer Nitrofunktion in 7-Position) ähnlich positive Eigenschaften aufweisen.Surprisingly, however, it was found that MNDBH by Hydrogen peroxide and alkyl hydroperoxides in the presence of Peroxidase as a catalyst also rapidly with the formation of MNBDA is oxidized. The intensely fluorescent MNBDA can be found under Use a fluorescence spectrometer or a Microtiter plate fluorescence readers can be quantified. in the Compared to the known p-hydroxyalkyl carboxylic acids stands out the MNBDH as a peroxidase substrate through essential technical Advantages from: The excitation takes place at about 470 nm, while the Emission is measured at around 550 nm. With that are suggestion and Emission of the MNBDA compared to the oxidation products of the Hydroxyphenylcarboxylic acids are red-shifted by more than 100 nm, which is a significantly better selectivity. It turned out that the MNBDH-like substances MDBDH (with a dimethylaminosulfonyl instead of a nitro function in 7-position) and MABDH (with a Aminosulfonyl- instead of a nitrofunction in the 7-position) similar have positive properties.
Eine Untersuchung der durch die neuen Peroxidasesubstrate erreichbaren Nachweisgrenzen für Wasserstoffperoxid und Hydroperoxide belegt, daß MNBDH, MDBDH und MABDH wesentlich bessere Resultate als die typischerweise verwendeten Hydroxyphenylcarbonsäuren ergeben. Damit steht eine Gruppe neuer Peroxidasesubstrate zur Verfügung, die bezüglich Selektivität und Nachweisgrenzen eine gute Alternative zu den Hydroxyphenylcarbonsäuren darstellt.An investigation of the new peroxidase substrates achievable detection limits for hydrogen peroxide and Hydroperoxides prove that MNBDH, MDBDH and MABDH are much better Results than those typically used Hydroxyphenylcarboxylic acids result. With it stands a group of new ones Peroxidasesubstrate available for selectivity and Detection limits are a good alternative to Hydroxyphenylcarboxylic acids represents.
Erfindungsgemäß werden die in Lösung oder in der Gasphase zu bestimmenden Peroxide mit einer der Substanzen MNBDH, MDBDH oder MABDH und einer Peroxidase in Kontakt gebracht. Die Probenahme kann unter Verwendung von Lösungen der Reagenzien für die Bestimmung der Peroxide in Lösung erfolgen. Als Probenahmetechnik für die Analytik der Peroxide in der Gasphase können die literaturbekannten Probenahmesysteme, beispielsweise mit Lösungen der Reagenzien gefüllte Waschflaschen oder Denudersysteme eingesetzt werden.According to the invention, they are in solution or in the gas phase determining peroxides with one of the substances MNBDH, MDBDH or MABDH and a peroxidase contacted. Sampling can using solutions of the reagents for the determination of the Peroxides are made in solution. As a sampling technique for analytics the peroxides in the gas phase can be known from the literature Sampling systems, for example with solutions of the reagents filled wash bottles or denuder systems can be used.
Im folgenden soll der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand von Beispielen erläutert werden:The use of the method according to the invention is intended below are explained using examples:
Es werden folgende Lösungen angesetzt:
Lösung 1:
2,5 mg MNBDH werden in 25 ml Acetonitril gelöst.The following solutions are used:
Solution 1:
2.5 mg of MNBDH are dissolved in 25 ml of acetonitrile.
Lösung 2:
2,5 mg HR-POD werden in 10 ml Phosphat-Puffer (pH 5,8; 0,01 M)
gelöst.Solution 2:
2.5 mg HR-POD are dissolved in 10 ml phosphate buffer (pH 5.8; 0.01 M).
Reagenzlösung:
1,4 ml Lösung 1 werden mit 10 ml Lösung 2 vermischt.Reagent solution:
1.4 ml of solution 1 are mixed with 10 ml of solution 2.
Auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten ("wells") werden in einer Kavität 200 µl einer 0,01-10 µM H2O2-Lösung, die eine Standardlösung oder eine Probenlösung sein kann, und 60 µl Reagenzlösung zusammengegeben. Um eine gute Durchmischung zu gewährleisten, wird die Mikrotiterplatte für 1 Minute in einem Rüttler geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit zehn Minuten wird die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 460 nm und einer Emissionswellenlänge von 545 nm vermessen. Mit Wasserstoff peroxidlösungen bekannten Gehalts wird eine Kalibrationsgerade erstellt. Anhand dieser wird der Gehalt unbekannter Proben ermittelt.200 .mu.l of a 0.01-10 .mu.m H 2 O 2 solution, which can be a standard solution or a sample solution, and 60 .mu.l of reagent solution are combined in a cavity on a microtiter plate with 96 wells. To ensure thorough mixing, the microtiter plate is shaken in a shaker for 1 minute. After a reaction time of ten minutes, the fluorescence is measured with an excitation wavelength of 460 nm and an emission wavelength of 545 nm. A calibration line is established with hydrogen peroxide solutions of known content. The content of unknown samples is determined on the basis of this.
Realprobenuntersuchung:
Eine US-amerikanische Mundspüllösung der Marke Mentadent ("Dual
Action Mouthwash With Baking Soda & Peroxide") von der Firma
Chesebourgh Pond's USA Co. wird 1 : 100.000 verdünnt und entsprechend
der obigen Vorschrift behandelt. Der Gehalt in der Mundspüllösung
wird zu 0,73% +/- 0,05% Wasserstoffperoxid bestimmt.Real sample examination:
A US mouthwash solution of the brand Mentadent ("Dual Action Mouthwash With Baking Soda &Peroxide") from Chesebourgh Pond's USA Co. is diluted 1: 100,000 and treated in accordance with the above regulation. The content in the mouthwash solution is determined to be 0.73% +/- 0.05% hydrogen peroxide.
Lösungen:
Die Lösungen 1 und 2 sowie die Reagenzlösung sind denen aus
Beispiel 1 identisch.Solutions:
Solutions 1 and 2 and the reagent solution are identical to those from Example 1.
Glucoseoxidase-(GOD-)Lösung:
15 mg GOD auf 10 ml Phosphat-Puffer (pH 5,8; 0,01 M).Glucose oxidase (GOD) solution:
15 mg GOD on 10 ml phosphate buffer (pH 5.8; 0.01 M).
Auf einer Mikrotiterplatte werden in einer Kavität 100 µl einer 0,1-10 µM Glucose-Lösung mit 50 µl der GOD-Lösung versetzt und gut durchmischt. Die so vorbereitete Mikrotiterplatte wird 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 40 µl der der Reagenzlösung zupipettiert und die Lösungen werden erneut durchmischt. Nach 10 Minuten Reaktionszeit wird die Fluoreszenz wie in Beispiel 1 angegeben ausgelesen. Mit Glucoselösungen bekannten Gehalts wird eine Kalibrationsgerade erstellt. Anhand dieser wird der Gehalt unbekannter Proben ermittelt.On a microtiter plate, 100 µl of a 0.1-10 µM glucose solution mixed with 50 µl of the GOD solution and good mixed up. The prepared microtiter plate is 15 minutes incubated for long at 37 ° C. Then 40 µl of the Pipette in the reagent solution and the solutions are again mixed up. After a reaction time of 10 minutes, the fluorescence becomes like read out specified in Example 1. Known with glucose solutions A calibration line is created. Based on this the content of unknown samples is determined.
Realprobenuntersuchung:
Ein Karottensaftgetränk der Firma albi GmbH & Co. wird 1 : 10.000
verdünnt und entsprechend der obigen Vorschrift behandelt. Bezogen
auf die unverdünnte Probe wird der Glucosegehalt zu 110 +/- 8 mM
bestimmt.Real sample examination:
A carrot juice drink from albi GmbH & Co. is diluted 1: 10,000 and treated according to the above instructions. Based on the undiluted sample, the glucose content is determined to be 110 +/- 8 mM.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1999132380 DE19932380A1 (en) | 1999-07-13 | 1999-07-13 | Assay for hydrogen peroxide and hydroperoxides comprises peroxidase-catalyzed reaction with a 4-(alpha-N-alkylhydrazino)-2,1,3-benzoxadiazole |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1999132380 DE19932380A1 (en) | 1999-07-13 | 1999-07-13 | Assay for hydrogen peroxide and hydroperoxides comprises peroxidase-catalyzed reaction with a 4-(alpha-N-alkylhydrazino)-2,1,3-benzoxadiazole |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19932380A1 true DE19932380A1 (en) | 2000-02-17 |
Family
ID=7914401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1999132380 Withdrawn DE19932380A1 (en) | 1999-07-13 | 1999-07-13 | Assay for hydrogen peroxide and hydroperoxides comprises peroxidase-catalyzed reaction with a 4-(alpha-N-alkylhydrazino)-2,1,3-benzoxadiazole |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19932380A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6635439B2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-10-21 | Ethicon, Inc. | Hydrogen peroxide indicator employing enzyme and dye |
| CN101921836A (en) * | 2010-05-27 | 2010-12-22 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Preparation of kit and method for rapidly detecting carotene components in foods and beverages |
-
1999
- 1999-07-13 DE DE1999132380 patent/DE19932380A1/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6635439B2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-10-21 | Ethicon, Inc. | Hydrogen peroxide indicator employing enzyme and dye |
| CN101921836A (en) * | 2010-05-27 | 2010-12-22 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | Preparation of kit and method for rapidly detecting carotene components in foods and beverages |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Hematin as a peroxidase substitute in hydrogen peroxide determinations | |
| Spector et al. | p-Hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens: evidence for an oxygenated flavin intermediate | |
| CN107328748B (en) | Detection method for determining bisulfite in sample and application | |
| DE3826922A1 (en) | PROCESS FOR THE COLOR-RIMETRIC DETERMINATION OF AN ANALYTE BY ENZYMATIC OXIDATION | |
| DE60314990T2 (en) | METHOD FOR QUANTITATING GLYCOSYLATED PROTEIN USING A REDOX REACTION AND A QUANTIFICATION KIT | |
| JPH0354304B2 (en) | ||
| Chen et al. | Application of iron-tetrasulfonatophthalocyanine as a new mimetic peroxidase in the determination of hydrogen peroxide with p-hydroxyphenylpropionic acid as a substrate | |
| US5206150A (en) | Composition of, method of producing and method of using a stabilized formulation for assaying peroxidase activity | |
| Zhu et al. | Application of thiamine as a fluorogenic substrate in the determination of hydrogen peroxide based on the catalytic effect of hemin | |
| Kamio et al. | The chemistry of escapin: identification and quantification of the components in the complex mixture generated by an L‐amino acid oxidase in the defensive secretion of the sea snail Aplysia californica | |
| Rao et al. | The role of iron in prostaglandin synthesis: Ferrous iron mediated oxidation of arachidonic acid | |
| Elnemma | Spectrophotometric determination of hydrogen peroxide by a hydroquinone-aniline system catalyzed by molybdate | |
| Xu et al. | Fluorescence determination of hydrogen peroxide using hemoglobin as a mimetic enzyme of peroxidase | |
| US4202938A (en) | Procedure for the quantitative determination of hydrogen peroxide concentration in aqueous solutions | |
| EP0068438B1 (en) | Means and method for the detection of hydrogen peroxide | |
| DE19932380A1 (en) | Assay for hydrogen peroxide and hydroperoxides comprises peroxidase-catalyzed reaction with a 4-(alpha-N-alkylhydrazino)-2,1,3-benzoxadiazole | |
| Ma et al. | Synthesis of a novel chemiluminescent reagent for the determination of hydrogen peroxide in snow waters | |
| US4629696A (en) | Process for the selective production of reduced oxygen species | |
| DE2264847A1 (en) | METHOD AND REAGENT FOR DETERMINATION OF CHOLESTEROL | |
| DE2906732C2 (en) | Method and reagent for the determination of peroxidase | |
| Iwaoka et al. | Chemiluminescent assay of lipid peroxide in plasma using cytochrome c heme peptide | |
| EP0742437B1 (en) | A method of inhibiting the activity of the reducing substances in oxidative chromogenic analysis | |
| CH643883A5 (en) | COMPOSITION FOR DETERMINATION OF URIC ACID. | |
| DE69827595D1 (en) | METHODS AND REAGENTS FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF ASCORBIC ACID | |
| JPH06217799A (en) | Method of measuring substance |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OAV | Applicant agreed to the publication of the unexamined application as to paragraph 31 lit. 2 z1 | ||
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8122 | Nonbinding interest in granting licenses declared | ||
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |