DE19927306A1 - New mesenchymal stem cell antigen, used to raise antibodies for e.g. cell characterization and bone marrow typing - Google Patents
New mesenchymal stem cell antigen, used to raise antibodies for e.g. cell characterization and bone marrow typingInfo
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Abstract
Description
Ein GPI-verankertes Antigen auf Zelloberflächen von Fibroblasten und mesenchymalen Stammzellen, seine Verwendung zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern und darauf aufbauende Testkits, die solche Antikörper enthalten.A GPI-anchored antigen on fibroblast and cell surfaces mesenchymal stem cells, its use for obtaining monoclonal Antibodies and test kits based thereon that contain such antibodies.
GPI-verankertes Antigen, dadurch erhältlich, daß man humane dermale Fibroblasten bis zu ihrer vollständigen Konfluenz als Monolayer in Zellkulturflaschen kultiviert, mittels eines etablierten Protokolls mit Trypsin/EDTA von ihrer Unterlage ablöst, mit einem Detergenz inkubiert und mittels Gelchromatographie auftrennt, die Antigen enthaltenden Fraktionen vereinigt und die 30 bis 35 kDa betragenden Fraktionen mit einem aus der Hybridomzelle DSM . . . erhaltenen monoklonalen Antikörpers affinitätschromatographisch abtrennt.GPI-anchored antigen, obtainable by: human dermal fibroblasts to their full confluence as a monolayer in Cell culture bottles cultured using an established protocol with trypsin / EDTA detached from its base, incubated with a detergent and by means of Gel chromatography separates, the fractions containing antigen are combined and the 30 to 35 kDa fractions with a from the hybridoma DSM . . . obtained monoclonal antibody is separated by affinity chromatography.
Die Erfindung betrifft ein Antigen, welches sich auf der Zelloberfläche von humanen Fibroblasten und mesenchymalen Stammzellen befindet und die nach Immunisierung resultierenden Antikörper insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen ein solches Antigen gerichtet sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung als Testkit für die klinische Histologie und Flowzytometrie, insbesondere zur lypisierung von Knochenmarksspenden und zur Identifikation und Selektion von mesenchymalen Stammzellen in Vollblut und Knochenmark.The invention relates to an antigen which is on the cell surface of human Fibroblasts and mesenchymal stem cells are located after immunization resulting antibody, in particular monoclonal antibody, against such Antigen are directed to a process for their preparation and their use as Test kit for clinical histology and flow cytometry, especially for lypization of bone marrow donations and for the identification and selection of mesenchymal Stem cells in whole blood and bone marrow.
Vor über 100 Jahren postulierte COHNHEIM die Existenz mesenchymaler Stammzellen im Blut und Knochenmark, nachdem er experimentell nachweisen konnte, daß fibroblastenähnliche Zellen aus dem Blut in Wunden einwandern und an Bindegewebe adhärieren. Das Wissen über die Natur dieser adhärenten Zellen ist auch heute noch äußerst lückenhaft. In der Folgezeit konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden, daß diese Zellen Proteine der ECM synthetisieren, so z. B. Kollagen Typ I, Kollagen Typ IV, Laminin, Fibronektin und zahlreiche Proteoglykane. Einige dieser Zellen synthetisieren das Faktor VIII-assoziierte Antigen, eine Tatsache die zu der Vermutung Anlaß gab, daß es sich bei diesen Zellen auch um Vorläufer von Endothelzellen handeln könnte. Diese Zellen synthetisieren und sezernieren Zytokine, wie z. B. IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, den Kolonie stimulierenden Faktor-1 (CSF-1), GM-CSF und den Stammzell-Faktor (c-kit Ligand).COHNHEIM postulated the existence of mesenchymal more than 100 years ago Stem cells in the blood and bone marrow after being experimentally proven could see fibroblast-like cells migrate from the blood into wounds and on Adherent connective tissue. The knowledge of the nature of these adherent cells is also still very patchy today. In the period that followed, both on mRNA and are shown at protein level that these cells synthesize ECM proteins, so z. B. Type I collagen, Type IV collagen, laminin, fibronectin and numerous Proteoglycans. Some of these cells synthesize the factor VIII-associated antigen a fact that gave rise to the assumption that these cells are also Could be precursors of endothelial cells. These cells synthesize and secrete cytokines, such as B. IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, the colony stimulating factor-1 (CSF-1), GM-CSF and the stem cell factor (c-kit ligand).
Seit Beginn der 90iger Jahre gelang es durch Vereinzelung dieser adhärenten mesenchymalen Stammzellen und spezieller Klonierungstechniken homogenere Zellpopulationen zu gewinnen. Als ein entscheidender Nachteil diese Arbeiten ist die Tatsache anzusehen, daß alle Arbeitsgruppen nach einem individuellen Protokoll gearbeitet haben, dadurch von ganz unterschiedlichen Ausgangszellpopulationen ausgegangen sind und somit die resultierenden Ergebnisse nur äußerst schlecht vergleichbar waren.Since the beginning of the 90s, these adherent ones have been isolated mesenchymal stem cells and special cloning techniques more homogeneous To win cell populations. A major disadvantage of this work is that Consider the fact that all working groups follow an individual protocol have worked, thus from very different starting cell populations and the resulting results are extremely poor were comparable.
Weiterhin ist heute noch sehr wenig über die molekularen Mechanismen, die zur Differenzierung in die unterschiedlichen mesenchymalen Zelltypen führen bekannt. Es ist unklar, ob die fraglich einheitliche Population der mesenchymalen Stammzellen zunächst einen gemeinsamen Weg der Differenzierung durchlaufen, um sich dann erst in einen speziellen Phänotyp (Chondroblast, Fibroblast, Osteoblast) zu differenzieren, oder ob schon präformierte Vorläuferzellen für diese einzelnen Phänotypen existieren.Furthermore, very little is still known about the molecular mechanisms involved in Differentiation into the different mesenchymal cell types is known to result. It is unclear whether the questionable uniform population of the mesenchymal stem cells first go through a common path of differentiation and only then differentiate into a special phenotype (chondroblast, fibroblast, osteoblast), or whether preformed progenitor cells exist for these individual phenotypes.
In den letzten Jahren sind verstärkte Anstrengungen unternommen worden, die Pluripotenz dieser mesenchymalen Stammzellen für therapeutische Zwecke zu nutzen. So wurden diese Zellen nach der klassischen Adhärenztechnik aus autologem Knochenmark gewonnen, die Zellen über mehrere Verdopplungszeiten passagiert und diese Zellen dann in Gelenke des gleichen Patienten mit degenerativer Arthritis injiziert. Entsprechende Heilungsversuche wurden erfolgreich bei Patienten mit schlecht heilenden Frakturen unternommen. Theoretischer Hintergrund dieser Versuche war die Vorstellung, daß die pluripotenten Stammzellen am Ort ihres natürlichen regulativen Umfeldes die für sie adäquaten Differenzierungssignale bekommen und dann den gewünschten mesenchymalen Phänotyp ausbilden.Increased efforts have been made in recent years to: To use pluripotency of these mesenchymal stem cells for therapeutic purposes. So these cells became autologous using the classic adherence technique Bone marrow is obtained, the cells passaged over several doubling times and these cells then in joints of the same patient with degenerative arthritis injected. Appropriate healing attempts have been successful in patients with badly healing fractures. Theoretical background to this Experiments was the idea that the pluripotent stem cells at the place of their natural regulatory environment, the adequate differentiation signals for them and then develop the desired mesenchymal phenotype.
Neuere Beobachtungen zeigten weiterhin, daß es häufig bei Knochenmarktransplantationen trotz guter Übereinstimmung an MHC-Antigenen zwischen Spender und Empfänger zu Intoleranz- bzw. Abstoßungsreaktionen kommt, wenn im übertragenen Knochenmark ein relativ hoher Anteil (< 5%) an solchen adhärenten mesenchymalen Stammzellen nachweisbar war.Recent observations also showed that it was common Bone marrow transplants despite good agreement with MHC antigens intolerance or rejection reactions occur between donor and recipient, if there is a relatively high proportion (<5%) of such in the transferred bone marrow adherent mesenchymal stem cells was detectable.
Eine möglichst hohe Übereinstimmung von MHC-Antigenen des Spenders und des Empfängers stellt eine notwendige Voraussetzung für die Akzeptanz von Zell- bzw. Gewebespenden durch den Empfänger dar. Neben diesen MHC-Antigenen sind im Laufe der letzten Jahre eine Reihe von sog. Minorantigenen bekannt geworden, bei deren Inkombatibilität (Nichtübereinstimmung) zwischen Spender und Empfänger es auch bei sehr guter Übereinstimmung in den MHC-Merkmalen zu einer Abstoßungs- bzw. Unverträglichkeitsreaktion kommen kann. Es besteht deshalb heute das Ziel, neben einer weitgehenden Übereinstimmung in den MHC-Antigenen auch eine Übereinstimmung in den teilweise noch unbekannten Minorantigenen anzustreben. Es ist deshalb notwendig, solche relevanten Zelloberflächenstrukturen auf ausgewählten Zellen zu erkennen und mittels einfacher Methoden, insbesondere mittels spezifischer monoklonaler Antikörper, nachzuweisen und gegebenenfalls diese Zellen über eine Magnetseparation zu entfernen.As close a match as possible of the donor's and the donor's MHC antigens Recipient is a necessary prerequisite for the acceptance of cell or Tissue donations by the recipient. In addition to these MHC antigens A number of so-called minor antigens have become known over the past few years their incompatibility (mismatch) between donor and recipient even with very good agreement in the MHC characteristics to a rejection or intolerance reaction can occur. So today the goal is in addition to a broad agreement in the MHC antigens also one To strive for agreement in the partly still unknown minor antigens. It is therefore necessary to identify such relevant cell surface structures to recognize selected cells and using simple methods, in particular by means of specific monoclonal antibodies, and if necessary to detect them Remove cells using magnetic separation.
Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein Zelloberflächenantigen (MS-Antigen) bereitzustellen, welches von mesenchymale Stammzellen exprimiert wird und dadurch deren zweifelsfreie Erkennung und Elimination aus Zellgemischen erlaubt.The aim of the invention is therefore to provide a cell surface antigen (MS antigen) to provide which is expressed by mesenchymal stem cells and thereby allows their unequivocal detection and elimination from cell mixtures.
Die Erfindung hat weiterhin zum Ziel, Antikörper bereitzustellen, die mit humanen mesenchymalen Stammzellen reagieren und gleichzeitig hämatopoetische Stammzellen diskriminieren.The invention further aims to provide antibodies which are compatible with human mesenchymal stem cells react and at the same time hematopoietic stem cells discriminate.
Das erfindungsgemäße MS-Antigen ist dadurch erhältlich, daß man an Kollagen Typ I beschichtete Zellkulturgefäße adhärierende spindelförmige Zellen aus peripherem Blut bzw. aus Knochenmark gewinnt, bis zu ihrer Konfluenz in einer Monolayerschicht kultiviert, mit Trypsin/EDTA ablöst, mit einem Detergenz, vorzugsweise mit 2% Natrium-Deoxycholat/Triton X-100 behandelt und entweder über eine Wheat-Germ-Lektin-Affinitätschromatographie mit anschließender DEAE- Ionenaustauschchromatographie reinigt, oder mittels einer Immunäffinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern, die mit der Hybridoma-Zellinie DSM . . . gewonnen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform hat es sich als zweckmäßig erwiesen, den Natrium- Deoxycholat/Triton X-100 Proteinextrakt zuerst mittels gelchromatographischen Verfahren an Sepharose 4B oder Sephadex G-200 aufzutrennen. Dabei werden die das Antigen enthaltenen Fraktionen, insbesondere der Bereich zwischen 25 kDa bis 65 kDa mit den zuvor benannten monoklonalen Antikörpern in Kontakt gebracht und so auf an sich bekannte Weise biochemisch rein isoliert.The MS antigen according to the invention can be obtained by using type collagen I coated cell culture vessels adhering spindle-shaped cells from peripheral Blood or from bone marrow, until their confluence in one Monolayer layer cultured, detached with trypsin / EDTA, with a detergent, preferably treated with 2% sodium deoxycholate / Triton X-100 and either via a wheat germ lectin affinity chromatography with subsequent DEAE Ion exchange chromatography cleans, or by means of a Immunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies using the Hybridoma cell line DSM. . . be won. In a preferred one Embodiment has proven to be expedient, the sodium Deoxycholate / Triton X-100 protein extract first by means of gel chromatography Process on Sepharose 4B or Sephadex G-200. The will Fractions contained antigen, in particular the range between 25 kDa and 65 kDa brought into contact with the aforementioned monoclonal antibodies and thus isolated in a manner known per se, biochemically pure.
Für das enzymatische Ablösen der in Kultur gezüchteten adhärenten Zellen wird vorzugsweise eine 0,01 bis 0,1 Gew.-% Trypsinlösung verwendet. Zweckmäßigerweise enthält die zum Ablösen der adhärenten Zellen verwendete Lösung zusätzlich 0,001 bis 0,1 Gew.-% EDTA. Zum Solubilisieren des in der Membran verankerten Antigens wird zweckmäßigerweise ein Detergenz verwendet, welches gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein nichtionogenes Tensid, wie beispielsweise Triton®X-100 und 0,1 bis 2% Natrium-Deoxycholat, ist. Unerwünschte Membrananteile, die von der Membran mit dem gewünschten Antigen mit abgelöst werden, können zweckmäßigerweise mittels Gelchromatographie entfernt werden. Hierzu können beliebige dem Fachmann bekannte Chromatographieverfahren verwendet werden. Erfindungsgemäß hat es sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, als Trägermaterial Sepharose 4B zu verwenden. Mit einer solchen chromatographischen Auftrennung lassen sich ohne weiteres diejenigen Fraktionen abtrennen, die das in Frage kommende ca. 32 kDa große Antigen bzw. das ca. 64 kDa große dimere Antigen enthalten. Das Antigen wird dann vorzugsweise mittels einer Wheat-Germ-Lektin- Affinitätschromatographie weiter aufgereinigt, wobei das gebundene Antigen mit N- Acetylglucosamin abgelöst wird. Mittels DEAE-Ionenaustauschchromatographie läßt sich sowohl das abgelöste Antigen (ca. 60%), als auch das nicht gebundene Antigen (ca. 40%) der Wheat-Germ-Lektin-Affinitätschromatographie weiter aufreinigen. Besonders reine Antigenpräparate lassen sich dadurch erhalten, daß man das solubilisierte erfindungsgemäße Antigen mit einem monoklonalen Antikörper reagieren läßt, der aus der Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM . . . erhältlich ist. Dabei ist es sowohl möglich, das Antigen mittels einem immobilisierten, auf eine Matrix aufgebrachten Antikörper selektiv aus einem Proteingemisch "herauszufischen", wie z. B. durch Auftragen der Proteinlösung auf eine Chromatographiesäule, als auch das Antigen durch Zugabe des Antikörpers aus der Lösung auszufällen (Immunpräzipitation).For the enzymatic detachment of the adherent cells grown in culture preferably a 0.01 to 0.1% by weight trypsin solution is used. Conveniently the solution used to detach the adherent cells contains an additional 0.001 up to 0.1% by weight EDTA. For solubilizing the antigen anchored in the membrane a detergent is advantageously used, which according to a preferred Embodiment a nonionic surfactant, such as Triton®X-100 and 0.1 to 2% sodium deoxycholate. Undesired membrane parts, which from the Membrane with the desired antigen can also be detached expediently be removed by means of gel chromatography. You can do this any chromatography method known to the person skilled in the art can be used. According to the invention, however, it has proven to be expedient as a carrier material Sepharose 4B to use. With such a chromatographic separation can be easily separated those fractions that the in question contain approximately 32 kDa antigen or the approximately 64 kDa dimeric antigen. The Antigen is then preferably obtained using a wheat germ lectin Affinity chromatography further purified, the bound antigen with N- Acetylglucosamine is replaced. Using DEAE ion exchange chromatography both the detached antigen (approx. 60%) and the unbound antigen Purify (about 40%) Wheat Germ Lectin Affinity Chromatography. Particularly pure antigen preparations can be obtained by solubilized antigen according to the invention with a monoclonal antibody can react, from the hybridoma cell line with the accession number DSM. . . is available. It is possible to use an immobilized, Antibodies applied to a matrix selectively from a protein mixture "fish out" such. B. by applying the protein solution to a Chromatography column, as well as the antigen by adding the antibody from the Precipitate solution (immunoprecipitation).
In einem besonders bevorzugten Verfahren wird das erfindungsgemäße Zelloberflächenantigen mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers isoliert, der aus o. g. Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM . . . erhältlich ist. Hierbei werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an Ziege-anti-Maus- Antikörper gebunden, die an Magnetpartikel (Dynabeads M-450; Fa. DYNAL, Oslo, Norwegen) kovalent gekoppelt sind. Hierzu wird das Antigen enthaltende proteingemisch wie zuvor beschrieben präpariert. Zur Isolierung wird das Proteingemisch bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit dem Antikörper- Magnetpartikel-Komplex inkubiert und dann an einem Magneten immobilisiert (Magnetseparation). Alle durch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper nicht spezifisch gebundenen Proteinverunreinigungen werden durch mehrmaliges Waschen mit PBS eliminiert. Das gebundene Antigen wird mittels eines kommerziellen Elutionspuffers (Mab Trap GII; Fa. Pharmacia, Schweden) vom an den Magnetpartikeln gebundenen Antikörper eluiert und anschließend neutralisiert. Das so über Magnetseparation gewonnene Antigen zeigt im Westernblot eine einheitliche Proteinhauptbande bei ca. 32 kDa und eine Minorbande bei ca. 63 kDa, die das dimere Antigen repräsentiert. Diese Proteinbanden entsprechen dem erfindungsgemäßen Zelloberflächenantigen auf mesenchymalen Stammzellen gegen welches die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gerichtet sind.In a particularly preferred method, the invention Cell surface antigen isolated with the help of the monoclonal antibody, which is derived from the above. Hybridoma cell line with the accession number DSM. . . is available. Here the monoclonal antibodies according to the invention are used on goat anti-mouse Antibodies bound to magnetic particles (Dynabeads M-450; DYNAL, Oslo, Norway) are covalently coupled. For this purpose, the antigen prepared as a protein mixture as described above. For isolation, it becomes Protein mixture at room temperature with gentle shaking with the antibody Magnetic particle complex incubated and then immobilized on a magnet (Magnetic separation). All by the monoclonal antibody according to the invention Protein impurities that are not specifically bound are caused by repeated Washing with PBS eliminated. The bound antigen is obtained using a commercial Elution buffers (Mab Trap GII; Pharmacia, Sweden) from to Antibody bound magnetic particles eluted and then neutralized. That so Antigen obtained by magnetic separation shows a uniform one in the Western blot Main protein band at approx. 32 kDa and a minor band at approx. 63 kDa, which is the dimer Antigen represents. These protein bands correspond to those of the invention Cell surface antigen on mesenchymal stem cells against which the monoclonal antibodies according to the invention are directed.
Die Erfindung betrifft auch monoklonale Antikörper, die mit der erfindungsgemäßen Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM . . . erhältlich sind.The invention also relates to monoclonal antibodies with the invention Hybridoma cell line with the accession number DSM. . . are available.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper bindet sich an humane mesenchymale Stammzellen, humane Fibroblasten sowie von ihnen abgeleitete Differenzierungsstadien und an einige Nervenzellen des menschlichen Gehirns. Er diskriminiert sämtliche später aufgeführten relevanten Zelltypen. Auf diese Weise ist es möglich, mesenchymale Stammzellen und von ihnen abgeleiteten Differenzierungsstadien, hierbei insbesondere Fibroblasten, immunhistologisch nachzuweisen.The monoclonal antibody according to the invention binds to human mesenchymal Stem cells, human fibroblasts and those derived from them Stages of differentiation and to some nerve cells of the human brain. He discriminates against all relevant cell types listed later. That way it is possible to derive and derive mesenchymal stem cells Differentiation stages, especially fibroblasts, immunohistologically to prove.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antigens zur Herstellung von mesenchymalen Stammzell-Antikörpern, und zwar sowohl von monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern, auf an sich bekannte Weise. Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird derart vorgegangen, daß man mittels dem Fachmann bekannten Methoden mit einem Antigengemisch immunisiert, das dadurch erhältlich ist, daß man kultivierte humane mesenchymale Stammzellen durch Trypsin/EDTA von ihren Kulturgefäßen ablöst und die dadurch erhaltene Zellsuspension dreimal mit PBS serumfrei wäscht. Die dadurch erhaltene Zellsuspension wixd mit einem Detergenz, und zwar vorzugsweise mit einem nichtionischen Detergenz, wie Triton® X-100/Natrium-Deoxycholat inkubiert, um die relevanten Membranproteine zu solubilisieren. Nach Zentrifugation wird das Zellpelett verworfen und der Überstand, in dem sich neben anderen Antigenen auch das erfindungsgemäße Antigen befindet, über eine Gelfiltrationschromatographie aufgetrennt. Im weiteren wird mittels einer Affinitätschromatographie an Wheat- Germ-Lektin das erfindungsgemäße Antigen weiter aufgereinigt und über eine DEAE- Ionenaustauschchromatographie biochemisch rein dargestellt. Mit dem so gereinigten Antigen werden in einer für den Fachmann bekannten Art und Weise Balb-c-Mäuse immunisiert. Ausgehend von dieser beschriebenen Primärimmunisierung mit oben beschriebenem Antigen wird in einer bekannten Methode nach KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256 (1975) 495-497; Naturwissenschaften 77 (1990); Natur 349 (1991) 293-299) eine Zellfusion mit den Antikörper produzierenden Mauslymphozyten, wie beispielsweise einer Zellinie X63-Ag 8.653, durchgeführt. Eine der dadurch erhaltenen Hybridoma-Zellinien produziert die erfindungsgemäßen Antikörper gegen ein Zelloberflächenantigen mesenchymaler Stammzellen.The invention also relates to the use of the antigen according to the invention for Generation of mesenchymal stem cell antibodies, both from monoclonal as well as polyclonal antibodies, in a manner known per se. At An embodiment of the invention is carried out in such a way that immunized methods known to those skilled in the art with an antigen mixture which is obtainable by culturing human mesenchymal stem cells Trypsin / EDTA detaches from their culture vessels and the resulting Wash cell suspension three times with PBS serum-free. The thus obtained Cell suspension wixd with a detergent, preferably with one nonionic detergent such as Triton® X-100 / sodium deoxycholate to solubilize the relevant membrane proteins. After centrifugation Cell pellet discarded and the supernatant, which contains other antigens as well the antigen according to the invention is located by gel filtration chromatography separated. Furthermore, an affinity chromatography on wheat Germ-lectin further purified the antigen according to the invention and via a DEAE Ion exchange chromatography shown biochemically pure. With the so cleaned Antigens are Balb-c mice in a manner known to those skilled in the art immunized. Based on this primary immunization described above Antigen described is in a known method according to KÖHLER and MILSTEIN (Nature 256 (1975) 495-497; Natural Sciences 77 (1990); Nature 349 (1991) 293-299) a cell fusion with the antibody-producing Mouse lymphocytes, such as a cell line X63-Ag 8.653, performed. A of the hybridoma cell lines thus obtained produces the invention Antibodies against a cell surface antigen of mesenchymal stem cells.
Derartige Antikörper reagieren mit den oben erwähnten humanen mesenchymalen Stammzellen und Fibroblasten als deren Differenzierungsstadium sowohl in Kultur als auch in humanen histologischen Schnitten von beispielsweise Haut, Hirn, Placenta, Niere, Nabelschnur, Herz, Muskulatur, Pankreas etc. Mittels Durchflußzytometrie konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an humane mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark und an humane Fibroblasten unabhängig von deren Gewebeherkunft binden. Auf die gleiche Weise wurde nachgewiesen, daß diese Antikörper nicht an Zellen des normalen Vollblutes wie z. B. Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten binden. CD 34+ angereicherte hämatopoetische Stammzellen werden bis zu 25% positiv durch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper markiert, ein Befund der darauf hinweist, daß es sich bei diesen positiven Zellen um mesenchymale Stammzellen bzw. deren Differenzierungszustände handelt. Mit der flowzytometrischen Analyse konnte weiterhin nachgewiesen werden, daß der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper keine in vitro kultivierten mikro- und makrovaskulären Endothelzellen, Keratinozyten, Chondrozyten und glatte bzw. quergestreifte Muskelzellen erkennt.Such antibodies react with the above-mentioned human mesenchymal stem cells and fibroblasts as their differentiation stage both in culture and in human histological sections of, for example, skin, brain, placenta, kidney, umbilical cord, heart, muscles, pancreas etc. By means of flow cytometry it could be shown that bind the monoclonal antibodies according to the invention to human mesenchymal stem cells from the bone marrow and to human fibroblasts regardless of their tissue origin. In the same way it was demonstrated that these antibodies do not appear on normal whole blood cells such as e.g. B. bind lymphocytes, granulocytes, monocytes and platelets. CD 34 + enriched hematopoietic stem cells are marked up to 25% positively by the monoclonal antibody according to the invention, a finding which indicates that these positive cells are mesenchymal stem cells or their differentiation states. With the flow cytometric analysis it was also possible to demonstrate that the monoclonal antibody according to the invention does not recognize any in vitro cultivated micro- and macrovascular endothelial cells, keratinocytes, chondrocytes and smooth or striated muscle cells.
Mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper ist es neben der Erkennung von mesenchymalen Stammzellen auch möglich, Fibroblasten bzw. Fibroblasten- Subpopulationen in Kultur zu charakterisieren und sie zweifelsfrei von anderen morphologisch ähnlichen Zelltypen zu unterscheiden. Damit kann in der pathologischen Histologie der vermutete mesenchymale Ursprung bestimmter Tumoren eindeutig belegt werden und gegebenenfalls kann die Expression des korrespondierenden Antigens als Prognosemarker bei solchen Tumoren Verwendung finden. Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann weiterhin für embryologische Fragestellungen zum Nachweis der mesenchymalen Abstammung von Zellen und Gewebe im Verlauf der Embryogenese und Organogenese genutzt werden.With the monoclonal antibody according to the invention, it is next to the recognition of mesenchymal stem cells also possible, fibroblasts or fibroblasts Characterize subpopulations in culture and make them beyond doubt by others distinguish morphologically similar cell types. So that in the pathological histology of the suspected mesenchymal origin of certain Tumors are clearly documented and, if necessary, the expression of the Corresponding antigen as a prognostic marker for such tumors Find. The monoclonal antibody according to the invention can also be used for embryological questions to prove the mesenchymal lineage of Cells and tissues are used in the course of embryogenesis and organogenesis.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper eignet sich auch zur Charakterisierung des zellulären Ursprungs von Bindegewebszellen im Verlaufe der Wundheilung und kann darüber hinaus genutzt werden, um Ursachen von schlecht bzw. nichtheilenden Wunden aufzudecken. Es existieren experimentelle Hinweise, daß Fibroblasten der Wundumgebung von chronischen nichtheilenden Wunden in ihren synthetischen und proliferativen Parametern viel schlechter sind als entsprechende potente Fibroblasten aus normaler Haut. Diese Wundfibroblasten exprimieren auch erheblich weniger des erfindungsgemäßen Zelloberflächenantigens. Es ist denkbar, daß von Patienten mit nichtheilenden Wunden mit Hilfe des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers potente mesenchymale Stammzellen aus Knochenmarkpunktaten bzw. aus angereichertem Vollblut gewonnen werden und als autologes Zelltransplantat in die nichtheilenden Wunden eingebracht werden. Diese Stammzellen differenzieren nun in natürlicher Umgebung zu hochpotenten Fibroblasten und bewerkstelligen den vormals unmöglichen Wundverschluß.The monoclonal antibody according to the invention is also suitable for characterization the cellular origin of connective tissue cells in the course of wound healing and can also be used to identify causes of poor or non-healing Uncover wounds. There is experimental evidence that fibroblasts of the Wound environment of chronic non-healing wounds in their synthetic and proliferative parameters are much worse than corresponding potent fibroblasts from normal skin. These wound fibroblasts also express significantly less of the cell surface antigen according to the invention. It is conceivable that of patients with non-healing wounds with the help of the monoclonal antibody according to the invention potent mesenchymal stem cells from bone marrow punctates or from enriched whole blood can be obtained and as an autologous cell transplant in the non-healing wounds. These stem cells now differentiate in a natural environment to highly potent fibroblasts and manage the previously impossible wound closure.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung des korrespondierenden Antigens auf mesenchymalen Stammzellen, welches durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannt wird.The invention also relates to a method for obtaining the corresponding Antigen on mesenchymal stem cells, which by the invention monoclonal antibody is recognized.
Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher erläutert werden.The invention is illustrated by the following examples.
Humane mesenchymale Stammzellen wurden mittels Magnetseparation mit Hilfe des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers aus angereichertem Vollblut gewonnen und bis zu ihrer Konfluenz in einer Zellmonolayerschicht kultiviert. Die adhärenten Zellen wurden dann mit einer 0,05%igen Trypsin-/0,02%igen EDTA-Lösung abgelöst und suspendiert. Nach dreimaligen Waschen der so suspendierten Stammzellen mit eiskaltem PBS wurde jeweils bei 4°C und 900 UpM zentrifugiert. Das resultierende Zellpelett wurde mit 0,5% Triton® X-100 und bis zu 2% Natrium-Deoxycholat und 1 mmol Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) in PBS-Puffer unter leichtem Schütteln auf Eis für ca. 30 Minuten inkubiert. Die Zellkonzentration betrug ca. 107 Zellen pro 100 ml Puffer. Im Anschluß daran wurde nochmals bei 4°C und 20.000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert, um die durch das Detergenz herausgelösten Membranproteine von dem restlichen Zellpelett zu trennen. Der Überstand wurde auf einer Sepharose 4B-Säule chromatographiert, die Fraktionen mit einem Molekulargewicht zwischen 25 kDa und 90 kDa gepoolt und einer Wheat-Germ-Lektin-Affinitätschromatographie unterzogen. Mit den antigenhaltigen Fraktionen wurden im Anschluß eine DEAE- Ionenaustauschchromatographie durchgeführt. Die antigenhaltigen Fraktionen wurden gepoolt und das Protein über eine 70%ige Ammoniumsulfatfällung konzentriert. Das so angereicherte Antigen wurde auf einem SDS-Gel (Sammelgel 5%, Trenngel 10%) mittels Elektrophorese aufgetrennt. Nach einem Elektroblotting (Laufpuffer ohne SDS zuzügl. 20% Methanol) auf Nitrozellulose wurden noch freie Bindungsstellen auf der Membran mit 5% Magermilchpulver bei 37°C für 2 Stunden blockiert. Das Antigen läßt sich auf dem so behandelten Filter durch Inkubation über Nacht bei 4°C mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in einer Sandwich-Technik mit einem Ziege-anti-Maus-POD-markierten Antikörper mittels der bekannten Farbreaktion durch DAB plus H2O2 (10 mg/10 ml PBS + 50 µl 30%iges H2O2) als eine einheitliche Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 32 kDa nachweisen. Unter nichtreduzierenden Elektrophoresebedingungen ändert sich weder Laufverhalten noch das Molekulargewicht des Antigens.Human mesenchymal stem cells were obtained from enriched whole blood by means of magnetic separation with the aid of the monoclonal antibody according to the invention and cultured to their confluence in a cell monolayer layer. The adherent cells were then detached with a 0.05% trypsin / 0.02% EDTA solution and suspended. After washing the stem cells suspended in this way with ice-cold PBS, centrifugation was carried out at 4 ° C. and 900 rpm. The resulting cell pellet was incubated with 0.5% Triton® X-100 and up to 2% sodium deoxycholate and 1 mmol phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) in PBS buffer with gentle shaking on ice for about 30 minutes. The cell concentration was approximately 10 7 cells per 100 ml of buffer. The mixture was then centrifuged again at 4 ° C. and 20,000 rpm for 10 minutes in order to separate the membrane proteins released by the detergent from the remaining cell pellet. The supernatant was chromatographed on a Sepharose 4B column, the fractions with a molecular weight between 25 kDa and 90 kDa were pooled and subjected to Wheat Germ lectin affinity chromatography. DEAE ion exchange chromatography was then carried out on the antigen-containing fractions. The antigen-containing fractions were pooled and the protein concentrated over a 70% ammonium sulfate precipitation. The antigen so enriched was separated on an SDS gel (stacking gel 5%, separating gel 10%) by means of electrophoresis. After electroblotting (running buffer without SDS plus 20% methanol) on nitrocellulose, free binding sites on the membrane were blocked with 5% skim milk powder at 37 ° C. for 2 hours. The antigen can be on the filter treated in this way by incubation overnight at 4 ° C. with the monoclonal antibody according to the invention in a sandwich technique with a goat anti-mouse POD-labeled antibody by means of the known color reaction by DAB plus H 2 O 2 (10 mg / 10 ml PBS + 50 µl 30% H 2 O 2 ) as a uniform protein band with a molecular weight of approx. 32 kDa. Under non-reducing electrophoresis conditions, neither the running behavior nor the molecular weight of the antigen change.
Mit dem wie oben erfindungsgemäß beschriebenen monoklonalen Antikörper wurden die folgenden Versuche durchgeführt:With the monoclonal antibody as described above according to the invention carried out the following experiments:
Flowzytometrie kultivierter humaner mesenchymaler Stammzellen; wie oben beschrieben, wurden humane mesenchymale Stammzellen aus Vollblut isoliert und in einer Monolayerkultur kultiviert. Es wurden 105 Zellen mit 20 µl des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers (DSM . . .) bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Es konnte nachgewiesen werden, daß sich der Antikörper an alle kultivierten mesenchymalen Stammzellen bindet. Die Fluoreszenzintensität der gebundenen Antikörper ist mit der von anti- CD 44 (HCAM) auf Fibroblasten vergleichbar.Flow cytometry of cultured human mesenchymal stem cells; As described above, human mesenchymal stem cells were isolated from whole blood and cultured in a monolayer culture. 10 5 cells with 20 μl of the monoclonal antibody (DSM...) According to the invention were at 4 ° C. for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. It could be demonstrated that the antibody binds to all cultured mesenchymal stem cells. The fluorescence intensity of the bound antibodies is comparable to that of anti-CD 44 (HCAM) on fibroblasts.
Flowzytometrie kultivierter humaner dermaler Fibroblasten; kultivierte humane dermale Fibroblasten (105 Zellen) wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper (DSM . . .) bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Es wurde gefunden, daß der Antikörper alle Fibroblasten markiert. Werden statt Fibroblasten dermalen Ursprungs Fibroblasten aus anderen menschlichen Geweben (Herz, Leber, Nabelschnur, Plazenta etc.) eingesetzt, dann ergeben sich sowohl im Ausmaß der Bindung als auch in der Intensität keine signifikanten Unterschiede zu den dermalen Fibroblasten. Fibroblasten anderer Spezies (Kaninchen, Maus, Ratte, Rind etc.) reagieren nicht mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper.Flow cytometry of cultured human dermal fibroblasts; cultured human dermal fibroblasts (10 5 cells) were treated with 50 μl of the monoclonal antibody (DSM...) according to the invention at 4 ° C. for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. The antibody was found to label all fibroblasts. If fibroblasts from other human tissues (heart, liver, umbilical cord, placenta, etc.) are used instead of fibroblasts of dermal origin, there are no significant differences to the dermal fibroblasts either in the extent of the binding or in the intensity. Fibroblasts of other species (rabbits, mice, rats, cattle, etc.) do not react with the monoclonal antibody according to the invention.
Flowzytometrie kultivierter humaner Keratinozyten; Humane Keratinozyten (105 Zellen) wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.Flow cytometry of cultured human keratinocytes; Human keratinocytes (10 5 cells) with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was labeled by the antibodies.
Flowzytometrie kultivierter humaner makrovaskulärer Endothelzellen; 105 Endothelzellen wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.Flow cytometry of cultured human macrovascular endothelial cells; 10 5 endothelial cells were with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was marked by the antibody.
Flowzytometrie kultivierter humaner mikrovaskulärer Endothelzellen; 105 Endothelzellen wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.Flow cytometry of cultured human microvascular endothelial cells; 10 5 endothelial cells were with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was marked by the antibody.
Flowzytometrie humaner Chondrozyten; 105 Chondrozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.Flow cytometry of human chondrocytes; 10 5 chondrocytes were treated with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was marked by the antibody.
Flowzytometrie humaner Granulozyten; 105 Granulozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.Flow cytometry of human granulocytes; 10 5 granulocytes were with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was marked by the antibody.
Flowzytometrie humaner Lymphozyten; 105 Lymphozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.Flow cytometry of human lymphocytes; 10 5 lymphocytes were with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was marked by the antibody.
Flowzytometrie humaner Monozyten; 105 Monozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.Flow cytometry of human monocytes; 10 5 monocytes were with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was marked by the antibody.
Flowzytometrie humaner Thrombozyten; 105 Thrombozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.Flow cytometry of human platelets; 10 5 platelets were with 50 ul of the antibody of the invention at 4 ° C for 45 min. incubated and then analyzed by flow cytometry. None of the cells used was marked by the antibody.
Immunhistologie humaner Haut (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Haut wurden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Cavpinteria, CA, USA) mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im histologischen Schnitt färbten sich nur die Fibroblasten der Dermis und des subkutanen Bindegewebes an. Komponenten der Epidermis und der nicht bindegewebigen Hautanhangsgebilde wie Haarfollikel, Talgdrüsen, Schweißdrüsen färbten sich nicht an. Gleichfalls negativ erschienen die Endothelzellen der Blutgefäße der Haut.Immunohistology of human skin (avidin-biotin technique); Cryostat sections from human skin were according to a known protocol (LSAB kit, Fa. DAKO, Cavpinteria, CA, USA) with 100 ul of the antibody according to the invention Incubated at 4 ° C for 12 hours. In the histological section only those stained Fibroblasts of the dermis and subcutaneous connective tissue. Components of the Epidermis and the non-connective tissue attachments such as hair follicles, Sebaceous glands, sweat glands did not stain. The also appeared negative Endothelial cells of the blood vessels of the skin.
Immunhistologie humaner Tonsille (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Tonsille wurden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im histologischen Schnitt färbten sich nur die Fibroblasten des Bindegewebes der Gefäße und der Kapsel an, während die Follikel gänzlich negativ waren.Human tonsil immunohistology (avidin-biotin technique); Cryostat sections from human tonsil were according to a known protocol (LSAB kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) with 100 ul of the antibody according to the invention Incubated at 4 ° C for 12 hours. In the histological section only those stained Fibroblasts of the connective tissue of the vessels and capsule during the Follicles were completely negative.
Immunhistologie humaner Niere (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Niere wurden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im Nierenschnitt erscheinen das Parenchym und die Tubuluszellen weitgehend negativ, bis auf einige proximale Tubuli, an die sich der Antikörper teilweise bindet. Die Glomeruli sind in ihrem Gefäßkonvolut deutlich granulär positiv, ein Befund der nahelegt, daß möglicherweise die Mesangiumzellen, die mesenchymalen Ursprungs sind, das vom Antikörper erkannte Antigen exprimieren.Human kidney immunohistology (avidin-biotin technique); Cryostat sections from human kidney were according to a known protocol (LSAB kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) with 100 ul of the antibody according to the invention Incubated at 4 ° C for 12 hours. The parenchyma and the. Appear in the kidney section Tubular cells largely negative, with the exception of a few proximal tubules to which the Antibody partially binds. The glomeruli are clear in their vascular bundle granularly positive, a finding that suggests that the mesangial cells, the mesenchymal origin is the antigen recognized by the antibody express.
Immunhistologie humaner Plazenta (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Plazenta wurden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Der Antikörper markiert intensiv alle Fibroblasten des Mesenchyms. Die Endothelzellen des angeschnittenen Gefäßes der Plazenta werden durch den Antikörper nicht erkannt. Alle epithelialen Strukturen wie Amnionepithel, Zytotrophoblasten und Synzytiotrophoblasten werden gleichfalls nicht durch diesen Antikörper markiert.Immunohistology of human placenta (avidin-biotin technique); Cryostat sections from human placenta were developed according to a known protocol (LSAB kit, DAKO, Carpinteria, CA, USA) with 100 ul of the antibody according to the invention incubated at 4 ° C for 12 hours. The antibody intensely marks all of them Fibroblasts of the mesenchyme. The endothelial cells of the incised vessel the placenta is not recognized by the antibody. All epithelial Structures such as amniotic epithelium, cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts are also not marked by this antibody.
Immunhistologie humaner Plazenta (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Plazenta wurden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Der Antikörper reagiert nicht mit den Zellen des Leberparenchyms. Es werden ausschließlich die Fibroblasten des Leberbindegewebes und des perivaskulären Bindegewebes angefärbt. Das Epithel der Gallenblasenwand und die unter der Lamina propria liegende glatte Muskulatur wird nicht markiert. Die Fibroblasten des Bindegewebes der Lamina propria und des lockeren Bindegewebsgerüstes zwischen den Muskelbündeln wird durch den Antikörper deutlich angefärbt.Immunohistology of human placenta (avidin-biotin technique); Cryostat sections from human placenta were developed according to a known protocol (LSAB kit, DAKO, Carpinteria, CA, USA) with 100 ul of the antibody according to the invention incubated at 4 ° C for 12 hours. The antibody does not react with the cells of the Liver parenchyma. Only the fibroblasts of the Liver connective tissue and the perivascular connective tissue stained. The epithelium the gallbladder wall and the smooth muscles under the lamina propria is not marked. The fibroblasts of the connective tissue of the lamina propria and The loose connective tissue structure between the muscle bundles is replaced by the Antibody stained clearly.
Immunhistologie humaner Schilddrüse (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Schilddrüse wurden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Das einschichtige Follikelepithel des Schilddrüsenfollikels wird durch den Antikörper nicht angefärbt. Es werden ausschließlich die Fibroblasten des perifollikulären Bindegewebes markiert.Human thyroid immunohistology (avidin-biotin technique); Cryostat sections from human thyroid gland were tested according to a known protocol (LSAB kit, DAKO, Carpinteria, CA, USA) with 100 ul of the antibody according to the invention incubated at 4 ° C for 12 hours. The single layer follicular epithelium of the Thyroid follicle is not stained by the antibody. It will only the fibroblasts of the perifollicular connective tissue are marked.
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|---|---|---|---|
| DE1999127306 DE19927306A1 (en) | 1999-06-15 | 1999-06-15 | New mesenchymal stem cell antigen, used to raise antibodies for e.g. cell characterization and bone marrow typing |
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ID=7911332
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012087241A1 (en) * | 2010-12-20 | 2012-06-28 | Agency For Science, Technology And Research | Method of purifying exosomes |
| CN114878817A (en) * | 2022-06-01 | 2022-08-09 | 武汉宏韧生物医药股份有限公司 | Method for detecting anti-mesenchymal stem cell antibody in serum based on flow cytometry |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992022584A1 (en) * | 1991-06-18 | 1992-12-23 | Caplan Arnold I | Monoclonal antibodies specific for marrow-derived mesenchymal cells |
-
1999
- 1999-06-15 DE DE1999127306 patent/DE19927306A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO1992022584A1 (en) * | 1991-06-18 | 1992-12-23 | Caplan Arnold I | Monoclonal antibodies specific for marrow-derived mesenchymal cells |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN114878817A (en) * | 2022-06-01 | 2022-08-09 | 武汉宏韧生物医药股份有限公司 | Method for detecting anti-mesenchymal stem cell antibody in serum based on flow cytometry |
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