DE19914817A1

DE19914817A1 - New DNA for the multiple peptide resistance factor of Staphylococcus, useful for identifying agents that increase bacterial sensitivity to antimicrobial peptides

Info

Publication number: DE19914817A1
Application number: DE19914817A
Authority: DE
Inventors: Friedrich Goetz; Andreas Peschel
Original assignee: Petry Genmedics Dr GmbH
Current assignee: Petry Genmedics Dr GmbH
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2000-10-05

Abstract

DNA sequences (I) for the mprF (multiple peptide resistance factor) gene of Staphylococcus aureus and S. xylosus, both about 3.6 kb, and their fragments. Independent claims are also included for the following: (1) a DNA sequence (Ia) that hybridizes to (I) or their fragments under stringent conditions; (2) a DNA sequence (Ib) that encodes any of two proteins (II) each with a sequence of about 1000 amino acids (given in the specification); (3) a DNA sequence (III) derived from (I), (Ia) or (Ib) but differing by at least one mutation, particularly an insertion or deletion and preferably in a coding region; (4) the gene products (IIa) derived from (I), (Ia), (Ib) or (III); (5) (II) and their fragments; (6) a vector containing at least part of any of the new DNAs; (7) an organism in which expression of the mprF gene is altered; (8) an agent (A) that directly and/or indirectly modifies, preferably reduces, expression of the mprF gene and/or biological activity of the MprF protein; (9) a pharmaceutical composition containing at least one (A) and preferably at least one carrier; and (10) methods for producing (A).

Description

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen des mprF-Gens aus Staphylokokken. Weiterhin betrifft die Erfindung Wirkstoffe, die für die Behandlung bakterieller Infektionserkrankungen geeignet sind.The invention relates to DNA sequences of the mprF gene Staphylococci. The invention further relates to active ingredients, those for the treatment of bacterial infectious diseases are suitable.

Bakterielle Infektionserkrankungen in Form der sog. Noso komialinfektionen stellen im Krankenhausalltag ein schwer wiegendes Problem dar. Es handelt sich hierbei um Infektio nen, die häufig durch banale Erreger verursacht werden, deren Übertragung gleichzeitig mit der Behandlung und Pflege er folgt. Durch Infektionen mit diesen sog. Hospitalkeimen wer den zahlreiche Todesfälle verursacht.Bacterial infectious diseases in the form of the so-called noso Commercial infections are difficult in everyday hospital life weighing problem. This is infection that are often caused by banal pathogens Transfer simultaneously with treatment and care follows. Through infections with these so-called hospital germs causing numerous deaths.

Die klinischen Manifestationen von Nosokomialinfektionen sind sehr vielfältig. Neben Pilzen, Salmonellen, enteropathogenen Kolibakterien und Clostridien spielen Gram-positive Bakteri en, wie beispielsweise Staphylokokken oder Streptokokken, hierbei eine große Rolle. Unter den Staphylokokken hat Staphylococcus aureus die größte pathogene und damit medizi nische Bedeutung. Staphylococcus aureus-Stämme kommen bei Menschen und Tieren vor und sind beispielsweise die Erreger von abszedierenden Entzündungen sowie von Herzentzündungen und Sepsis. Infolge der oft vorhandenen multiplen Antibioti karesistenzen dieser Keime ist eine effektive Behandlung solcher Infektionen häufig nicht möglich.The clinical manifestations of nosocomial infections are very diverse. In addition to mushrooms, salmonella, enteropathogenic Colibacteria and clostridia play Gram-positive bacteria such as staphylococci or streptococci, a major role here. Has among the staphylococci Staphylococcus aureus the largest pathogenic and therefore medicinal African meaning. Staphylococcus aureus strains come along Humans and animals in front and are, for example, the pathogen of abscessing inflammation as well as of heart inflammation and sepsis. As a result of the often existing multiple antibiotics Resistance to these germs is an effective treatment such infections are often not possible.

Bei der Abwehr von mikrobiellen Infektionen durch das Immun system sind antimikrobielle Peptide ein entscheidender Fak tor. Diese Peptide werden deshalb als "host defense"-Peptide bezeichnet. Diese Peptide werden von Zellen des Organismus, insbesondere von Blutzellen und Epithelzellen, gebildet, und wirken wachstumshemmend auf die mikrobiellen Erreger. Bei spiele für solche antimikrobiellen Peptide sind die Defen sine, die sich beim Menschen in den Granula von Phagozyten (Freßzellen), auf Epithelien und auf der Haut nachweisen lassen. Protegrine wurden in Leukozyten des Schweins, Maga inine auf der Haut von Amphibien und Tachyplesine in den Haemozyten des Pfeilschwanzkrebses gefunden. Die meisten Host defense-Peptide besitzen kationische und amphiphile Eigenschaften und eine Wirkungsweise, die auf der Ausbildung von Poren in der Cytoplasmamembran von sensitiven Mikroorga nismen beruht.In the defense against microbial infections by the immune system system, antimicrobial peptides are a crucial factor goal. These peptides are therefore called "host defense" peptides designated. These peptides are made by cells of the organism, especially formed by blood cells and epithelial cells, and have a growth-inhibiting effect on the microbial pathogens. At games for such antimicrobial peptides are the defens sine, which is found in humans in the granules of phagocytes (Eating cells), on epithelia and on the skin to let. Protegrins were found in swine leukocytes, Maga inine on the skin of amphibians and tachyplesine in the Haemocytes of horseshoe crab found. Most Host defense peptides are cationic and amphiphilic Characteristics and an mode of action based on training of pores in the cytoplasmic membrane of sensitive microorganisms nisms.

Auch von verschiedenen Bakterien werden Peptide mit ver gleichbarer Aktivität und Struktur gebildet. Diese Peptide dienen dazu, dem Produzenten einen ökologischen Vorteil gegen konkurrierende Mikroorganismen zu verschaffen. Zu diesen Pep tiden zählen die Lanthionin-haltigen Peptide (Lantibiotika) wie Nisin, Gallidermin oder Epidermin und unmodifizierte Pep tide wie Lactococcin A oder Pediocin PA-1. Weitere Vertreter von bakteriellen antimikrobiellen Peptiden sind Gramicidine, welche von Bacillus brevis gebildet werden, sowie Polymyxine, beispielsweise Polymyxin B, die nicht-ribosomal synthetisiert werden. Beispiele für verschiedene antimikrobielle Peptide sind in Fig. 1 dargestellt.Peptides with comparable activity and structure are also formed by different bacteria. These peptides serve to give the producer an ecological advantage against competing microorganisms. These peptides include the lanthionine-containing peptides (lantibiotics) such as nisin, gallidermin or epidermin and unmodified peptides such as lactococcin A or pediocin PA-1. Other representatives of bacterial antimicrobial peptides are gramicidins, which are formed by Bacillus brevis, and polymyxins, for example polymyxin B, which are synthesized non-ribosomally. Examples of different antimicrobial peptides are shown in FIG. 1.

Einige Bakterien erweisen sich als resistent gegenüber derar tigen antimikrobiellen Peptiden. Dies führt dazu, daß das Im munsystem die eingedrungenen Bakterien schwerer abwehren kann und sich die Infektion manifestieren kann. Als wichtige pathogene Bakterien mit einer solchen Resistenz gegen Host defense-Peptide sind hier neben diversen Gram-negativen Bak terien die Gram-positiven Bakterien Staphylococcus aureus und verschiedene Streptokokken-Arten zu nennen. Insbesondere Staphylococcus aureus besitzt eine hohe derartige Resistenz.Some bacteria are resistant to derar antimicrobial peptides. This means that the Im munsystem is more difficult to ward off the invading bacteria and the infection can manifest itself. As important pathogenic bacteria with such resistance to host Defense peptides are here in addition to various gram-negative bak the gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and to name different types of streptococci. In particular Staphylococcus aureus is highly resistant.

Bisher konnten die Gene von Gram-positiven Bakterien, die an der Resistenz gegen Host defense-Peptide beteiligt sind, nicht identifiziert werden. Diese Gene bzw. deren Genpro dukte stellen jedoch einen sehr wichtigen Pathogenitätsfaktor dar.So far, the genes of Gram-positive bacteria have been identified resistance to host defense peptides are involved, cannot be identified. These genes or their genpro However, products represent a very important pathogenicity factor represents.

Da bis zum heutigen Zeitpunkt häufig das schwerwiegende Pro blem auftritt, daß eine bakterielle Infektion aufgrund von multiplen Antibiotikaresistenzen des Erregers nicht in den Griff zu bekommen ist, besteht das Bedürfnis, neue effektive antimikrobielle Wirkstoffe zu entwickeln.To date, this is often the serious pro blem occurs that a bacterial infection due to multiple antibiotic resistance of the pathogen not in the To get a grip, there is a need to find new effective ones to develop antimicrobial agents.

Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, neue Strategien zum Auffinden effektiver Wirkstoffe zu erarbeiten und hiervon ausgehend die entsprechenden Wirkstoffe zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wird gelöst durch die neuen Strategien, die auf den Ergebnissen basieren, die durch die Bereitstel lung der in den Ansprüchen 1 bis 7 beanspruchten neuen DNA- Sequenzen gewonnen wurden. Die von diesen DNA-Sequenzen abge leiteten Genprodukte bzw. Peptide/Proteine sind in den An sprüchen 8 bis 10 beansprucht. Ein Vektor, der entsprechende DNA-Sequenzen enthält, ist in den Ansprüchen 11 und 12 be schrieben. Die Ansprüche 13 bis 15 betreffen Organismen, die durch molekularbiologische Arbeiten mit den beanspruchten DNA-Sequenzen zu gewinnen sind. Die Ansprüche 16 bis 22 be treffen Wirkstoffe, Verwendung dieser Wirkstoffe und entspre chende pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiten geeignet sind. Die Verfahren zum Auffinden der erfindungsgemäßen Wirkstoffe sind in den Ansprüchen 23 bis 25 dargestellt. Der Wortlaut sämtli cher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt die ser Beschreibung gemacht.The invention therefore has as its object new strategies to find effective agents and from there based on the corresponding active ingredients put. The task is solved by the new strategies, based on the results provided by the development of the new DNA claimed in claims 1 to 7 Sequences were obtained. The abge from these DNA sequences Directed gene products or peptides / proteins are in the An claims 8 to 10 claims. A vector, the corresponding one Containing DNA sequences is in claims 11 and 12 be wrote. Claims 13 to 15 relate to organisms that through molecular biological work with the claimed DNA sequences can be obtained. The claims 16 to 22 be meet active ingredients, use of these active ingredients and correspond Pharmaceutical compositions used for treatment of bacterial infectious diseases are suitable. The Are methods for finding the active compounds according to the invention presented in claims 23 to 25. The wording of all The claims are hereby incorporated by reference made this description.

Die Erfindung umfaßt das überraschende Ergebnis, daß das vom mprF-Gen kodierte Protein für die Resistenz von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Peptiden zumindest mitverantwort lich ist. Dies eröffnet eine völlig neue Möglichkeit, Wirk stoffe zu entwickeln, die für eine Bekämpfung von pathogenen Bakterien wirksam eingesetzt werden können. Die mprF-Gene bzw. MprF-Proteine können zum Beispiel zum Design von anti mikrobiellen Peptiden genutzt werden, für die Staphylokokken nicht resistent sind. Weiterhin können die MprF-Proteine für die Suche nach Substanzen eingesetzt werden, die die MprF- Proteine blockieren und somit die Sensitivität der Erreger gegenüber körpereigenen antimikrobiellen Substanzen erhöhen.The invention includes the surprising result that the mprF gene encoded protein for bacterial resistance at least partly responsible for antimicrobial peptides is. This opens up a completely new way of knowing to develop substances for the fight against pathogenic Bacteria can be used effectively. The mprF genes or MprF proteins can be used, for example, to design anti microbial peptides are used for the staphylococci are not resistant. Furthermore, the MprF proteins for the search for substances are used that the MprF Proteins block and thus the sensitivity of the pathogen compared to the body's own antimicrobial substances.

Das Gen mprF wurde in Staphylococcus aureus und in dem nicht- pathogenen Bakterium Staphylococcus xylosus identifiziert und sequenziert (Fig. 2 und Fig. 3). Die Abkürzung mprF be zieht sich auf eine Definition der Erfinder als multiple peptide resistance factor. Das Gen liegt in beiden Organismen als vermutlich separate Transkriptionseinheit mit nachfolgen dem Terminator vor. Ein offenes Leseraster (orf 1) liegt im 5'-Bereich der Sequenz. Dieses offene Leseraster weist Ähn lichkeiten zu hypothetischen Membranproteinen auf, wobei das 5'-Ende fehlt. Das mprF-Gen kodiert für ein relativ großes Protein mit diversen potentiellen Transmembranbereichen am Amino-Terminus und einem hydrophilen Carboxy-Terminus. Die Fig. 4B zeigt ein Hydrophobizitätsprofil des Proteins MprF aus S. aureus nach Kyte & Doolittle (Kyte, J., Doolittle, R. F. (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132).The gene was identified in mprF Staphylococcus aureus and in the non-pathogenic bacterium Staphylococcus xylosus and sequenced (Fig. 2 and Fig. 3). The abbreviation mprF refers to a definition by the inventors as a multiple peptide resistance factor. The gene is present in both organisms as a presumably separate transcription unit with a successor to the terminator. An open reading frame (orf 1) lies in the 5 'area of the sequence. This open reading frame shows similarities to hypothetical membrane proteins, with the 5 'end missing. The mprF gene codes for a relatively large protein with various potential transmembrane regions at the amino terminus and a hydrophilic carboxy terminus. FIG. 4B shows a hydrophobicity profile of the protein from S. aureus MPrf by Kyte & Doolittle (Kyte, J., Doolittle, RF (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132).

Neben den Sequenzen der mprF-Gene umfaßt die Erfindung DNA- Sequenzen, die mit diesen Sequenzen oder Fragmenten davon unter für den Fachmann leicht zu ermittelnden stringenten Bedingungen hybridisieren sowie DNA-Sequenzen, die abgesehen von der Degeneration des genetischen Codes mit diesen Sequen zen hybridisieren, wobei sich die Degeneration des geneti schen Codes auf die dritte Position jedes Basentripletts bezieht, welches für die vom Triplett kodierte Aminosäure in der Regel eine untergeordnete Rolle spielt.In addition to the sequences of the mprF genes, the invention includes DNA Sequences that match these sequences or fragments thereof among those that are easy to determine for the expert Hybridize conditions as well as DNA sequences that apart from the degeneration of the genetic code with these sequences hybridize zen, whereby the degeneration of the geneti codes to the third position of each base triplet relates, which for the amino acid encoded by the triplet in usually plays a subordinate role.

Weiterhin werden von der Erfindung DNA-Sequenzen des mprF- Gens umfaßt, die mindestens eine Mutation tragen. Vorzugs weise wird durch diese Mutation, die beispielsweise eine Insertion oder eine Deletion sein kann, das Gen inaktiviert. Hierfür kann die Mutation in dem kodierenden Bereich des Gens liegen, oder die Mutation betrifft ein regulatorisches Ele ment des mprF-Gens, wie beispielsweise Transkriptions- oder Translationssignale. Auch eine Insertion oder Deletion im nicht-kodierenden Bereich, bevorzugt im 5'-Bereich, kann zu einer verminderten Expression und damit zu einer zumindest teilweisen Inaktivierung des Gens genutzt werden. Weiterhin kann das mprF-Gen auch überexprimiert werden. Dies wird vor zugsweise dadurch erreicht, daß ein entsprechend starker Pro moter dem Gen vorgeschaltet wird, oder dadurch, daß die Ko pienzahl des Gens erhöht wird.Furthermore, DNA sequences of the mprF- Includes genes that carry at least one mutation. Preferential is wise by this mutation, for example a Insertion or deletion may inactivate the gene. The mutation in the coding region of the gene can do this , or the mutation affects a regulatory el ment of the mprF gene, such as transcription or Translation signals. An insertion or deletion in the non-coding area, preferably in the 5 'area, can be too a reduced expression and thus at least one partial inactivation of the gene can be used. Farther the mprF gene can also be overexpressed. This will be done before preferably achieved in that a correspondingly strong pro moter upstream of the gene, or in that the Ko gene number is increased.

Fig. 4A zeigt im oberen Teil beispielhaft eine Insertions mutation durch das Transposon Tn917. Transposons sind DNA- Abschnitte, die an beliebiger Stelle des Genoms integrieren können. Durch die Integration des Transposons entsteht eine Mutation, die in der Regel dazu führt, daß das betroffene Gen nicht mehr korrekt abgelesen werden kann. Daher können Trans posons zur Erzeugung von Mutanten eingesetzt werden. In die sem Fall hat das Transposon Tn917 im hinteren Bereich des kodierenden Abschnittes des mprF-Gens von S. xylosus inte griert. Weiterhin zeigt Fig. 4A im unteren Bereich das für den Austausch des mprF-Gens von Staphylococcus aureus gegen eine Erythromycin-Resistenzkassette (erm) verwendete Plasmid pBT mhrF. Bei diesem Plasmid pBT mprF entsprechen die die Erythromycin-Resistenzkassette umgebenden Bereiche den Berei chen, die im Genom von Staphylococcus aureus den kodierenden Bereich des mprF-Gens flankieren. Nach dem Einbringen des Plasmids pBT mprF in Staphylococcus aureus lagern sich daher diese sich entsprechenden Abschnitte aneinander und der da zwischenliegende Bereich wird ausgetauscht (homologe Rekombi nation. Der für das MprF-Protein kodierende Abschnitt wird also gegen die Erythromycin-Resistenzkassette ausgetauscht. Durch diese beiden Mutationsstrategien wurden die mprF-Gene in Staphylococcus xylosus und in Staphylococcus aureus in aktiviert. Fig. 4A shows in the upper part of an example of an insertional mutation by the transposon Tn917. Transposons are sections of DNA that can integrate anywhere in the genome. The integration of the transposon creates a mutation, which usually means that the affected gene can no longer be read correctly. Therefore, trans posons can be used to generate mutants. In this case, the transposon Tn917 has integrated in the rear of the coding section of the mprF gene from S. xylosus. Furthermore, FIG. 4A shows in the lower region the plasmid pBT mhrF used for the replacement of the mprF gene from Staphylococcus aureus with an erythromycin resistance cassette (erm). In this plasmid pBT mprF, the areas surrounding the erythromycin resistance cassette correspond to the areas flanking the coding area of the mprF gene in the genome of Staphylococcus aureus. After the plasmid pBT mprF has been introduced into Staphylococcus aureus, these corresponding sections are attached to one another and the area in between is exchanged (homologous recombination). The section coding for the MprF protein is therefore exchanged for the erythromycin resistance cassette Mutation strategies have activated the mprF genes in Staphylococcus xylosus and in Staphylococcus aureus in.

Weiterhin werden von der Erfindung die Genprodukte, die von den mprF-Sequenzen, den mutierten Sequenzen oder jeweils Fragmenten davon kodiert werden, umfaßt. Unter Genprodukt sind hier neben den Aminosäure (AS)-Sequenzen auch RNA-Mole küle zu verstehen. Die AS-Sequenzen, zumindest diejenigen, die von einer korrekten und vollständigen mprF-DNA-Sequenz abgeleitet sind, zeichnen sich dadurch aus, daß sie die Sequenz eines Proteins bilden, welches dem Bakterium, aus welchem das Protein stammt, eine Resistenz gegenüber anti mikrobiellen Peptiden vermittelt. Hierbei handelt es sich insbesondere um kationische antimikrobielle Peptide, die beispielsweise von menschlichen oder tierischen Zellen oder auch von Bakterien gebildet sein können.Furthermore, the gene products from the mprF sequences, the mutated sequences or in each case Fragments thereof are encoded. Under gene product there are also RNA moles in addition to the amino acid (AS) sequences to understand coolness. The AS sequences, at least those that of a correct and complete mprF DNA sequence are characterized in that they are the Form a sequence of a protein that the bacterium which the protein comes from, resistance to anti microbial peptides mediated. This is it especially cationic antimicrobial peptides that for example of human or animal cells or can also be formed by bacteria.

Außerdem werden von der Erfindung Vektoren, die entsprechende DNA-Sequenzen aufweisen, und Organismen, die durch Einsatz entsprechender Vektoren verändert wurden, mit umfaßt. Bei den Organismen handelt es sich vorzugsweise um bakterielle Mikro organismen. Diese Organismen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Expression des mprF-Gens verändert sind. Hierbei kann es sich vorzugsweise um eine Überexpression oder um eine Inaktivierung des Gens handeln. In diesem Zusammenhang sei auf die. Ausführungsformen in den Beispielen 1 und 2 verwie sen. Die Analyse von mprF-Mutanten zeigte, daß diese Organis men sensitiv für diverse kationische Peptide waren, was die Rolle des MprF-Proteins bei der Resistenz gegen antimikrobi elle Peptide verdeutlicht. Der durch mprF vermittelte Resi stenzlevel war bei den verschiedenen getesteten Peptiden unterschiedlich, was auf eine Spezifität des Systems hin deutet.In addition, the invention vectors, the corresponding DNA sequences, and organisms by use corresponding vectors were changed, includes. Both Organisms are preferably bacterial microorganisms organisms. These organisms are characterized in that they are changed in the expression of the mprF gene. Here can preferably be an overexpression or a Act inactivation of the gene. In this context on the. Embodiments in Examples 1 and 2 refer sen. Analysis of mprF mutants showed that these organ were sensitive to various cationic peptides, what the Role of MprF protein in antimicrobial resistance All peptides clarified. Resi mediated by mprF Stenlevel was on the various peptides tested different, which indicates a specificity of the system points.

Im Vergleich mit den Mutanten wurde in Anwesenheit eines intakten mprF-Gens weniger Gallidermin von der Zelle gebun den. Gallidermin ist ein von Bakterien gebildetes antimikro bielles Peptid und zählt zu den Lantibiotika. Die Funktion des MprF-Proteins beruht somit vermutlich auf einer Abstoßung der antimikrobiellen Peptide durch die resistente Bakterien zelle.In comparison with the mutants, the presence of a intact mprF gene less gallidermin bound from the cell the. Gallidermin is an antimicro made by bacteria biological peptide and is one of the lantibiotics. The function of the MprF protein is presumably based on rejection of the antimicrobial peptides by the resistant bacteria cell.

Diese Ergebnisse machen deutlich, daß das MprF-Protein für die Resistenz von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Pep tiden verantwortlich ist. Erfindungsgemäß werden daher Wirk stoffe entwickelt, die die Wirkung des MprF-Proteins beein flussen. Dies kann zum einen dadurch geschehen, daß die Ex pression des mprF-Gens durch geeignete Faktoren beeinflußt, bevorzugt vermindert wird. Weiterhin kann auch die biologi sche Aktivität des MprF-Proteins direkt oder auch indirekt durch entsprechende Hemmstoffe beeinflußt werden.These results make it clear that the MprF protein for the resistance of bacteria to antimicrobial pep is responsible. According to the invention are therefore effective developed substances that affect the effect of the MprF protein rivers. On the one hand, this can happen because the ex pression of the mprF gene is influenced by suitable factors, is preferably reduced. Furthermore, the biologi cal activity of the MprF protein directly or indirectly be influenced by appropriate inhibitors.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe zeichnen sich dadurch aus, daß sie die Empfindlichkeit der anzugreifenden Mikroorganis men, wobei es sich insbesondere um Gram-positive Bakterien handelt, gegenüber antimikrobiellen Substanzen erhöhen. Dies führt dazu, daß die zu bekämpfenden Bakterien gegenüber Host defense-Peptiden des Immunsystems und/oder anderen antimikro biellen Substanzen empfindlich werden und deshalb angreifbar sind.The active compounds according to the invention are notable for that the sensitivity of the microorganism to be attacked men, in particular Gram-positive bacteria acts against antimicrobial substances. This causes the bacteria to be controlled against host defense peptides of the immune system and / or other antimicro biological substances become sensitive and therefore vulnerable are.

Bei betroffenen Patienten können daher nach Behandlung mit den erfindungsgemäßen Wirkstoffen die pathogenen Bakterien durch körpereigene Abwehrmechanismen eliminiert werden, oder die Bakterien werden durch von außen zu applizierende anti mikrobielle Substanzen angegriffen.In affected patients, therefore, after treatment with the active substances according to the invention the pathogenic bacteria are eliminated by the body's own defense mechanisms, or the bacteria are anti-applied from the outside attacked microbial substances.

Bei dem erfindungsgemäßen Wirkstoff handelt es sich vor zugsweise um ein Peptid oder um ein Protein. Die Wirkstoffe können auch aus Naturstoffbibliotheken, Peptidbibliotheken, Phage-Display-Bibliotheken o. ä. stammen.The active ingredient according to the invention is pre- preferably a peptide or a protein. The active ingredients can also from natural product libraries, peptide libraries, Phage display libraries or similar.

Die Erfindung umfaßt die Verwendung der oben beschriebenen Wirkstoffe zur Behandlung von Krankheiten, die mit bakteriel len Infektionen in Zusammenhang stehen. Als besonders wichti ger Bereich solcher Erkrankungen seien hier die Nosokomialin fektionen erwähnt. Außerdem sind pharmazeutische Zusammenset zungen erfaßt, die mindestens einen der erwähnten Wirkstoffe beinhalten, sowie solche pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Behandlung von Krankheiten, die mit bakteriellen Infektionen in Zusammenhang stehen, vorgesehen sind. Weiter hin wird ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, die mit bakteriellen Infektionen in Zusammenhang stehen, umfaßt, bei welchem die erfindungsgemäßen Wirkstoffe verabreicht werden.The invention includes the use of those described above Active substances for the treatment of diseases with bacteriel infections. As particularly important The area of such diseases here is the nosocomialin fections mentioned. In addition, pharmaceutical compositions tongues recorded the at least one of the active ingredients mentioned contain, as well as such pharmaceutical compositions, those for the treatment of diseases with bacterial Infections are related. Next hin is a method of treating diseases that associated with bacterial infections, in which the active substances according to the invention are administered become.

Verschiedene erfindungsgemäße Verfahren können zur Suche eines Wirkstoffes eingesetzt werden, welcher mindestens eines der oben beschriebenen Merkmale aufweist. Um die Effektivität eines zu testenden Wirkstoffes bestimmen zu können, kann die Sensitivität/Empfindlichkeit der zu bekämpfenden Mikroorga nismen gegenüber antimikrobiellen Substanzen bestimmt werden. Ein derartiges Verfahren umfaßt eine Behandlung der Mikroor ganismen, beispielsweise Gram-positive Bakterien, mit einer antimikrobiellen Substanz, gegenüber der die zu bekämpfenden Mikroorganismen resistent sind. Wichtig ist hierbei, daß die antimikrobielle Substanz bevorzugt in einer sublethalen Dosis eingesetzt wird, d. h. in einer Konzentration, bei welcher die Resistenzmechanismen der zu bekämpfenden Mikroorganismen noch greifen. Anschließend oder zeitgleich werden die Mikroorga nismen mit mindestens einem zu testenden Wirkstoff inkubiert. Durch die Behandlung mit einem effektiven Wirkstoff wird die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber der antimikro biellen Substanz heraufgesetzt, so daß die Mikroorganismen von den antimikrobiellen Substanzen, gegenüber denen sie zu nächst resistent waren, angegriffen werden. Dies ist durch eine Bestimmung von Wachstums- und/oder Überlebensraten der Mikroorganismen meßbar.Various methods according to the invention can be searched an active ingredient can be used, which at least one of the features described above. To be effective of being able to determine an active substance to be tested can Sensitivity / sensitivity of the microorganism to be controlled nisms against antimicrobial substances can be determined. One such method involves treatment of the microor organisms, for example Gram-positive bacteria, with a antimicrobial substance against which to be controlled Microorganisms are resistant. It is important that the antimicrobial substance preferred in a sublethal dose is used, d. H. in a concentration at which the Mechanisms of resistance of the microorganisms to be controlled still to grab. Subsequently or at the same time, the Mikroorga incubated with at least one drug to be tested. By treating with an effective ingredient, the Sensitivity of the microorganisms to the antimicro biological substance so that the microorganisms of the antimicrobial substances to which they are exposed were next resistant to be attacked. This is through a determination of growth and / or survival rates of the Microorganisms measurable.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Suche eines effektiven Wirkstoffes gegen Mikroorganismen nutzt mprF- Genprodukte als Maß für die Effektivität des potentiellen Wirkstoffes, da, wie oben beschrieben, die Expression des mprF-Gens mit der Resistenz gegenüber antimikrobiellen Sub stanzen korreliert. Hierbei werden die Mikroorganismen mit mindestens einer antimikrobiellen Substanz behandelt, wobei die Substanz bevorzugt in einer sublethalen Dosis eingesetzt wird. Anschließend oder zeitgleich werden die Bakterien mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff behandelt. Das Ausmaß der mprF-Expression kann beispielsweise durch Northern-Blots (zur Bestimmung der RNA) oder durch Western-Blots (zur Be stimmung des MprF-Proteins) gemessen werden.Another inventive method for searching a effective active ingredient against microorganisms uses mprF- Gene products as a measure of the effectiveness of the potential Active ingredient since, as described above, the expression of mprF gene with resistance to antimicrobial sub punch correlated. Here, the microorganisms with treated at least one antimicrobial substance, wherein the substance is preferably used in a sublethal dose becomes. Afterwards or at the same time the bacteria become with treated at least one potential active ingredient. The extent mprF expression can be, for example, by Northern blots (for determining the RNA) or by Western blots (for loading mood of the MprF protein) can be measured.

Schließlich kann ein Verfahren zur Wirkstoffsuche eingesetzt werden, welches die Abstoßung von antimikrobiellen Substan zen durch die zu bekämpfenden Bakterien als Maß für die Wir kung des potentiellen Wirkstoffs nutzt. Da die resistenzver mittelnde Wirkung des MprF-Proteins vermutlich auf einer sol chen Abstoßungsfunktion beruht, wie unter Beispiel II näher ausgeführt wird, ist dies eine sehr geeignete Methode, um die Effektivität eines erfindungsgemäßen Wirkstoffs zu überprü fen. Nach Behandlung der zu bekämpfenden Mikroorganismen mit mindestens einer antimikrobiellen Substanz in bevorzugt sub lethaler Dosis und einer Inkubation mit mindestens einem potentiellen Wirkstoff, wird ein Aliquot des Mediums abgenom men und hierin die von den Mikroorganismen nicht gebundenen antimikrobiellen Substanzen bestimmt. Hierfür kommen ver schiedene Methoden in Frage, die dem Fachmann bekannt sind. Der Nachweis der antimikrobiellen Substanzen kann beispiels weise durch Markierung der Substanzen mit radioaktiven Iso topen oder mit Fluoreszenzgruppen, durch Einsatz spezifi scher Antiseren und/oder mit Hilfe der HPLC (high performance liquid chromatography) geführt werden.Finally, a method for searching for active substances can be used which is the rejection of antimicrobial substances zen by the bacteria to be controlled as a measure of the we of the potential active ingredient. Since the resistance average effect of the MprF protein presumably on a sol Chen rejection function is based, as in Example II in more detail is a very suitable way to do that To check the effectiveness of an active ingredient according to the invention fen. After treatment of the microorganisms to be controlled with at least one antimicrobial substance in preferably sub lethal dose and incubation with at least one potential active ingredient, an aliquot of the medium is removed and here those not bound by the microorganisms antimicrobial substances determined. For this come ver different methods in question, which are known to the expert. The detection of the antimicrobial substances can for example by labeling the substances with radioactive iso topen or with fluorescent groups, by using specifi antisera and / or with the help of HPLC (high performance liquid chromatography).

Um einen potentiellen Wirkstoff zu entwickeln, der vorzugs weise in einem der oben beschriebenen Verfahren getestet werden kann, ist es sinnvoll, von dem MprF-Protein als Modell auszugehen. Beispielsweise unter Einsatz von Computer-Model ling-Methoden wird, zunächst theoretisch, ein Wirkstoff ent wickelt, der mit dem natürlichen MprF-Protein um einen Wech selwirkungspartner, beispielsweise ein Substrat, konkurriert, der aber nicht die biologische Funktion des natürlichen Pro teins erfüllt. Ein solcher Wirkstoff kann in effektiver Weise die biologische Aktivität des MprF-Proteins vermindern oder sogar vollständig hemmen.To develop a potential active ingredient, the preferred tested in one of the methods described above it makes sense to use the MprF protein as a model going out. For example, using a computer model ling methods is, initially theoretically, an active ingredient wraps around a change with the natural MprF protein interaction partner, for example a substrate, competes, but not the biological function of the natural pro teins fulfilled. Such an active ingredient can be effective reduce the biological activity of the MprF protein or even inhibit completely.

Eine andere Möglichkeit des Wirkstoff-Designs ist, das MprF- Protein als Angriffspunkt für den zu entwickelnden Wirkstoff einzusetzen. Vorteilhafterweise unter Einsatz von Computer gestützten Modellen wird eine Substanz entwickelt, die mit dem natürlichen Protein wechselwirkt und dieses hemmt. Der auf Grundlage dieser theoretischen Design-Überlegungen ent wickelte potentielle Wirkstoff kann anschließend in einem der oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren auf seine Wirksamkeit hin getestet werden. Another possibility of drug design is that MprF Protein as a target for the active ingredient to be developed to use. Advantageously using a computer based models, a substance is developed that with interacts with the natural protein and inhibits it. The based on these theoretical design considerations wrapped potential drug can then be in one of the above-mentioned method according to the invention Effectiveness tested.

Weiterhin können die zu testenden Wirkstoffe als Testsubstan zen aus Naturstoffbibliotheken, Peptidbibliotheken, Phage display-Bibliotheken oder ähnlichem stammen.Furthermore, the active substances to be tested can be used as test substances zen from natural product libraries, peptide libraries, phage display libraries or the like.

Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Figuren und der nachfolgenden Beschrei bung von Beispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.The described features and other features of the invention result from the figures and the following description Practice of examples in connection with the subclaims. The individual features can be used individually or individually to be realized in combination with each other.

Die Figuren zeigen:The figures show:

Fig. 1 schematische Struktur verschiedener antimikro bieller Peptide (Stand der Technik), Fig. 1 shows a schematic structure of various anti-microbial peptides (prior art),

Fig. 2 DNA-Sequenz des mprF-Gens von Staphylococcus aureus Sa113, Fig. 2 DNA sequence of the mprF gene of Staphylococcus aureus SA113,

Fig. 3 DNA-Sequenz des mprF-Gens von Staphylococcus xylosus C2a, Fig. 3 DNA sequence of the gene of Staphylococcus xylosus mprF-C2a,

Fig. 4 Struktur und Inaktivierung der mprF-Gene von Staphylococcus aureus und Staphylococcus xylosus (A) sowie das Hydrophobizitätsprofil der abgeleiteten Proteinsequenz (B), Fig. 4 structure and inactivation of mprF genes of Staphylococcus aureus and Staphylococcus xylosus (A) and the hydrophobicity profile of the deduced protein sequence (B),

Fig. 5 AS-Sequenzen und Funktionen der vom mprF-Gen von Staphylococcus aureus kodierten Peptide/Proteine, Fig. 5 AA sequences and functions of the mprF gene of Staphylococcus aureus encoded peptides / proteins

Fig. 6 AS-Sequenzen und Funktionen der vom mprF-Gen von Staphylococcus xylosus kodierten Pepti de/Proteine, Fig. 6 AA sequences and functions of the gene of Staphylococcus xylosus mprF-coded Pepti de / proteins

Fig. 7 tabellarische Darstellung der Aktivität von antimikrobiellen Peptiden gegen Wildtyp und Mutanten von Staphylococcus aureus und Staphy lococcus xylosus, Fig. 7 tabular representation of the activity of antimicrobial peptides against wild type and mutants of Staphylococcus aureus and Staphy lococcus xylosus,

Fig. 8 grafische Darstellung von Gallidermin im Überstand nach Bindung dieses Peptids durch Staphylococcus aureus und Staphylococcus xylosus (Wildtyp und Mutanten) und Figure 8 is graphical representation. Of gallidermin in the supernatant after binding of this peptide by Staphylococcus aureus and Staphylococcus xylosus (wild type and mutants) and

Fig. 9 Vergleich der Carboxy-terminalen Bereiche des MprF-Proteins aus Staphylococcus aureus (Sa) und Staphylococcus xylosus (Sx) mit ähnlichen Proteinen aus Bacillus subtilis (Bs), Agrobac terium tumefaciens (At), Mycobacterium tuber culosis (Mt), Mycobacterium leprae (MI) und Streptomyces coelicolor (Sc). Fig. 9 Comparison of the carboxy-terminal regions of the MprF protein from Staphylococcus aureus (Sa) and Staphylococcus xylosus (Sx) with similar proteins from Bacillus subtilis (Bs), Agrobac terium tumefaciens (At), Mycobacterium tuber culosis (Mt), Mycobacterium leprae (MI) and Streptomyces coelicolor (Sc).

Von den in Fig. 1 gezeigten antimikrobiellen Peptiden des Standes der Technik besitzen Defensin HNP-1 und Protegrin 5 eine durch Disulfidbrücken stabilisierte β-Faltblattstruktur. Gallidermin und Nisin enthalten Thioether-Aminosäuren und werden der Gruppe der Lantibiotika zugerechnet. Die Magainin II-Variante und Melittin sind unmodifizierte, lineare Pep tide. Gramicidin S und D enthalten D-Aminosäuren. In dieser Figur sind positiv geladene Aminosäuren schwarz, negativ geladene Aminosäuren grau gezeichnet. Hierbei wurden auch die Ladungen der terminalen Amino- bzw. Carboxylgruppen berück sichtigt. Das Carboxy-terminale Lysin von Nisin beispiels weise wurde nicht schwarz gezeichnet, da sich die Ladung der Seitenkette mit der Ladung der Carboxylgruppe am ∝-C-Atom aufhebt. Ungewöhnliche Aminosäuren, die in dieser Figur ge zeigt sind, sind Lan, Lanthionin; Mla, Methyllanthionin; Dhb, Dehydrobutyrin; Avc, S-Aminovinylcystein; Dha, Dehydro alanin; O, Ornithin. Of the prior art antimicrobial peptides shown in Fig. 1, Defensin HNP-1 and Protegrin 5 have a β-sheet structure stabilized by disulfide bridges. Gallidermin and nisin contain thioether amino acids and are assigned to the group of lantibiotics. The Magainin II variant and Melittin are unmodified, linear peptides. Gramicidin S and D contain D-amino acids. In this figure, positively charged amino acids are drawn in black, negatively charged amino acids in gray. The charges of the terminal amino or carboxyl groups were also taken into account. The carboxy-terminal lysine of nisin, for example, was not drawn in black because the charge on the side chain is canceled with the charge on the carboxyl group on the ∝-C atom. Unusual amino acids shown in this figure are Lan, Lanthionin; Mla, methyl lanthionine; Dhb, dehydrobutyrin; Avc, S-aminovinylcysteine; Dha, dehydro alanine; O, ornithine.

In Fig. 4 ist im oberen Teil die Struktur des mprF-Gens dar gestellt. Im Carboxy-terminalen Bereich (links) befindet sich ein offenes Leseraster (orf 1), welches Ähnlichkeiten zu hy pothetischen Membranproteinen zeigt. Der für das MprF-Protein kodierende Bereich ist durch einen schraffierten Pfeil ange deutet. Weiterhin sind die Mutationsstrategien, auf welche sich die Beispiele beziehen, in dieser Abbildung dargestellt. Die Position der Insertion durch das Transposon Tn917 in das mprF-Gen von Staphylococcus xylosus (XG2) ist im oberen Teil von (A) dargestellt. Im unteren Teil von (A) ist gezeigt, wie das mprF-Gen von Staphylococcus aureus durch homologe Rekom bination unter Verwendung des Plasmides pBT mprF gegen eine Erythrcmycin-Resistenzkassette (erm) ausgetauscht ist. T: Transkriptionsterminator. Teil (B) der Figur zeigt ein Hydro phobizitätsprofil des linearen MprF-Proteins aus Staphylococ cus aureus nach Kyte & Doolittle.In Fig. 4, the structure of the mprF gene is shown in the upper part. In the carboxy-terminal area (left) there is an open reading frame (orf 1), which shows similarities to hypothetical membrane proteins. The area coding for the MprF protein is indicated by a hatched arrow. Furthermore, the mutation strategies to which the examples refer are shown in this figure. The position of the insertion by the transposon Tn917 into the mprF gene from Staphylococcus xylosus (XG2) is shown in the upper part of (A). In the lower part of (A) it is shown how the mprF gene from Staphylococcus aureus is exchanged for an erythrcmycin resistance cassette (erm) by homologous recombination using the plasmid pBT mprF. T: transcription terminator. Part (B) of the figure shows a hydrophobicity profile of the linear MprF protein from Staphylococ cus aureus according to Kyte & Doolittle.

Die Positionsangaben der Fig. 5 und 6 beziehen sich auf die jeweiligen DNA-Sequenzen des mprF-Gens (Fig. 2 und 3).The position data of Fig. 5 and 6 relate to the respective DNA sequences of the mprF gene (Fig. 2 and 3).

Examples 1. Methods

S. aureus Sa113 (Iordanescu, S. und Surdeanu, M. (1976) J. Gen. Micorbiol. 96, 277-281), S. xylosus C2a (Brückner, R. (1997) FEMS Micorbiol. Lett. 151, 1-8) und E. coli DH5∝ (Ausubel, F. M. Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. und Struhl, K. (1990) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N. Y.) wurden in BM-Medium kultiviert (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% Glucose), solange nichts anderes angegeben ist.S. aureus Sa113 (Iordanescu, S. and Surdeanu, M. (1976) J. Gen. Micorbiol. 96, 277-281), S. xylosus C2a (Brückner, R. (1997) FEMS Micorbiol. Lett. 151, 1 -8) and E. coli DH5∝ (Ausubel, FM Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA and Struhl, K. (1990) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY) were cultured in BM medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.1% K ₂ HPO ₄ , 0.1% glucose) as long as nothing else is specified.

Das Phasmid pTV1ts, welches für die Transposon-Mutagenese eingesetzt wird, enthält ein Temperatur-sensitives Replikon, ein Chloramphenicol-Resistenzgen und das Transposon Tn917, welches eine Erythromycin-Resistenz vermittelt (Youngman, P., Poth, H., Green, B., York, K., Olmedo, G. und Smith, K. (1989) in Regulation of procaryotic development (Smith, I., Slepecky, R. A. und Setlow, P., eds), Seiten 65-87, American Society for Microbiology, Washington, DC). Um eine Sammlung von Mutanten herzustellen, wurde S. xylosus (pTV1ts) über Nacht bei 30°C in BM-Medium kultiviert, welches 5 µg Ery thromycin/ml und 20 µg Chloramphenicol/ml enthielt. Die Kultur wurde anschließend 100-fach mit BM-Medium verdünnt, welches 2,5 µg Erythromycin/ml enthielt, und für 14 Stunden bei 42°C inkubiert, um Transposon-Insertionsmutanten zu selektionieren. Diese Kultur wurde ein weiteres Mal in der gleichen Weise verdünnt und für weitere 14 Stunden bei 42°C kultiviert. Aliquots der Bakteriensuspension wurden auf BM- Agarplatten, welche 2,5 µg Erythromycin/ml enthielten, ausgestrichen und bei 37°C inkubiert. Mutanten-Klone (4000) wurden auf BM-Agarplatten, welche 3 µg Gallidermin/ml ent hielten, transferiert und hinsichtlich verschlechtertem Wachstum auf Gallidermin ausgewählt.The phasmid pTV1ts, which is used for transposon mutagenesis contains a temperature-sensitive replicon, a chloramphenicol resistance gene and the transposon Tn917, which mediates erythromycin resistance (Youngman, P., Poth, H., Green, B., York, K., Olmedo, G. and Smith, K. (1989) in Regulation of procaryotic development (Smith, I., Slepecky, R.A. and Setlow, P., eds), pages 65-87, American Society for Microbiology, Washington, DC). To a collection of mutants, S. xylosus (pTV1ts) was developed Cultivated overnight at 30 ° C in BM medium containing 5 µg Ery Thromycin / ml and 20 µg chloramphenicol / ml contained. The Culture was then diluted 100-fold with BM medium, which contained 2.5 µg erythromycin / ml, and for 14 hours incubated at 42 ° C to generate transposon insertion mutants select. This culture was once again in the diluted in the same way and for a further 14 hours at 42 ° C. cultured. Aliquots of the bacterial suspension were placed on BM Agar plates containing 2.5 µg erythromycin / ml streaked and incubated at 37 ° C. Mutant clones (4000) were on BM agar plates containing 3 µg gallidermin / ml held, transferred, and deteriorated Growth selected on Gallidermin.

DNA wurde durch Zyklus-Sequenzierung (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. und Struhl, K. (1990) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N. Y.) in einem DNA- Sequenzierungsgerät 4000 L (LI-COR Inc., Lincoln, Neb., USA) sequenziert, wobei das Thermosequenasefluoreszenz-markierte Zyklus-Sequenzierungskit (Amersham, Little Chalfont, UK) verwendet wurde.DNA was isolated by cycle sequencing (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (1990) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N.Y.) in a DNA 4000 L sequencer (LI-COR Inc., Lincoln, Neb., USA) sequenced, the thermosequenase fluorescent labeled Cycle sequencing kit (Amersham, Little Chalfont, UK) was used.

Um Aminosäuresequenzähnlichkeits-Analysen durchzuführen, wurde das Programm BLAST 2.0 verwendet. Multiple Sequenzver gleiche wurden unter Einsatz des Higgins-Sharp-Algorithmus des Programmes MacDNASIS Pro (Hitachi Software Engineering, San Bruno, Calif., USA) durchgeführt. To perform amino acid sequence similarity analysis, the BLAST 2.0 program was used. Multiple sequence ver same were done using the Higgins-Sharp algorithm the MacDNASIS Pro program (Hitachi Software Engineering, San Bruno, Calif., USA).

Für die in vitro-Rekombination von DNA wurden Standard- Methoden und -Vektoren benutzt (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. und Struhl, K. (1990) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, N. Y.). Um das mprF-Gen von S. aureus Sa113 durch ein Erythromycin-Resistenzgen zu ersetzen, wurden DNA-Fragmente von 885 bp und 1042 bp, welche das mprF-Gen flankieren, durch PCR amplifiziert und in das Temperatursensitive Plasmid pBT2 (BrUckner, R. (1997) FEMS Microbxol. Lett. 151, 1-8) kloniert, wobei die Restriktions- Stellen, die in Fig. 4 gezeigt sind, durch Veränderung der Primer-Sequenz eingeführt worden waren. Ein PstI-XbaI-Frag ment von 1,45 kbp, welches das Erythromycin-Resistenzgen ermB von Tn551 kodiert, wurde zwischen die PCR-Fragmente (Fig. 4) inseriert, nachdem die DNA-Sequenz bestätigt wurde. Das resultierende Plasmid pBTΔmprFl wurde in S. aureus Sa113 durch Elektroporation transformiert (Augustin, J. und Götz, F. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66, 203-208). Durch Inkuba tion bei 42°C und nachfolgender Suche nach Erythromycin- resistenten Klonen ohne die Plasmid-kodierte Chloramphe nicol-Resistenz wurde die Mutante AG2, welche das ermB-Gen anstatt des mprF-Gens enthält, identifiziert. Die korrekte Integration von ermB wurde durch direkte Sequenzierung der DNA verifiziert.Standard methods and vectors were used for the in vitro recombination of DNA (Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA and Struhl, K. (1990) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY). In order to replace the mprF gene of S. aureus Sa113 with an erythromycin resistance gene, DNA fragments of 885 bp and 1042 bp, which flank the mprF gene, were amplified by PCR and inserted into the temperature-sensitive plasmid pBT2 (BrUckner, R. (1997) FEMS Microbxol. Lett. 151, 1-8), the restriction sites shown in FIG. 4 having been introduced by changing the primer sequence. A 1.45 kbp PstI-XbaI fragment encoding the Tn551 erythromycin resistance gene ermB was inserted between the PCR fragments ( Fig. 4) after the DNA sequence was confirmed. The resulting plasmid pBTΔmprFl was transformed into S. aureus Sa113 by electroporation (Augustin, J. and Götz, F. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66, 203-208). The mutant AG2, which contains the ermB gene instead of the mprF gene, was identified by incubation at 42 ° C. and subsequent search for erythromycin-resistant clones without the plasmid-encoded chloramphenicol resistance. The correct integration of ermB was verified by direct sequencing of the DNA.

Das Plasmid pRBmprF wurde durch Ligation eines 3281 bp PCR- Fragmentes, welches das mprF-Gen von S. xylosus C2a umfaßte, zusammen mit 359 bp aufwärts von dem Startcodon mit der mut maßlichen Promotor-Region und 400 bp abwärts des Stopcodons mit der Terminator-Struktur in die SmaI-Schnittstelle von pUC18 konstruiert. Nach der Sequenz-Analyse wurde das Frag ment aus dem resultierenden Plasmid isoliert, in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pRB473 (Brückner, R. (1992) Gene 122, 187-192) kloniert und in S. xylosus C2a XG2 und S. aureus Sa113 AG2 durch Elektroporation eingebracht. The plasmid pRBmprF was isolated by ligation of a 3281 bp PCR Fragment comprising the S. xylosus C2a mprF gene, along with 359 bp up from the start codon with the mut dimensional promoter region and 400 bp down the stop codon with the terminator structure in the SmaI interface from pUC18 constructed. After the sequence analysis, the question ment isolated from the resulting plasmid into the multiple Cloning site of the vector pRB473 (Brückner, R. (1992) Gene 122, 187-192) cloned and in S. xylosus C2a XG2 and S. aureus Sa113 AG2 introduced by electroporation.

Um das Plasmid pTXmprF zu konstruieren, wurde ein 2927 bp PCR-Fragment, welches das mprF-Gen aus S. xylosus kodiert, in den Expressionsvektor pTX15 über die Schnittstellen BamHI und MluI kloniert, um eine transkriptionelle Fusion mit dem Plas mid-kodierten xylA-Promotor zu produzieren (Peschel A., Ottenwälder, B. und Götz, F. (1996) FEMS Microbiol. Lett. 137, 279-284). Die für die PCR verwendeten Primer wurden modifiziert, um eine BamHI-Schnittstelle 34 bp aufwärts von dem mprF-Startcodon und eine MluI-Schnittstelle 370 bp ab wärts von dem Stopcodon einzuführen. Das Ligations-Gemisch wurde in den Klonierungswirt S. carnosus TM300 durch Proto plasten-Transformation eingebracht (Götz, F. und Schumacher B. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 40, 285-288). Der resultie rende Plasmid-Vektor wurde durch Sequenzierung des Inserts überprüft und anschließend in S. xylosus C2a und S. aureus Sa113 durch Elektroporation transferiert. Der xylA-Promotor wird durch den Plasmid-kodierten Repressor XylR unterdrückt. Eine Aktivierung kann durch den Zusatz von 0,5% Xylose im Kulturmedium erreicht werden. Das Plasmid pTX16, ein Abkömm ling von pTX15 (Peschel, A., Ottenwälder B. und Götz, F. (1996) FEMS Microbiol. Lett. 137, 279-284), wurde als negati ve Kontrolle für die mprF-Expressionsstudien verwendet.To construct the plasmid pTXmprF, a 2927 bp PCR fragment encoding the mprF gene from S. xylosus in the expression vector pTX15 via the interfaces BamHI and MluI cloned for a transcriptional fusion with the plas to produce a mid-coded xylA promoter (Peschel A., Ottenwälder, B. and Götz, F. (1996) FEMS Microbiol. Lett. 137, 279-284). The primers used for the PCR were modified to a BamHI interface 34 bp up from the mprF start codon and an MluI interface 370 bp to introduce from the stop codon. The ligation mix was in the cloning host S. carnosus TM300 by Proto plastic transformation introduced (Götz, F. and Schumacher B. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 40, 285-288). The result The plasmid vector was generated by sequencing the insert checked and then in S. xylosus C2a and S. aureus Sa113 transferred by electroporation. The xylA promoter is suppressed by the plasmid-encoded repressor XylR. Activation can be achieved by adding 0.5% xylose in the Culture medium can be achieved. The plasmid pTX16, a derivative ling of pTX15 (Peschel, A., Ottenwälder B. and Götz, F. (1996) FEMS Microbiol. Lett. 137, 279-284), was considered negati ve used control for the mprF expression studies.

Das antimikrobielle Peptid Defensin HNP1-3 wurde aus humanen peripheren Blut-Neutrophilen wie beschrieben isoliert (Har wig, S. S. L., Ganz, L. und Lehrer, R. I. (1994) Methods En zymol. 236, 160-172). Die Defensin-Peptide wurden aus den Granula der Granulocyten durch Extraktion mit 5% Essigsäure angereichert und durch RP-HPLC (reversed phase high perfor mance liquid chromatography) gereinigt. Das Produkt bestand aus den drei Defensin-Varianten HNP1, HNP2 und HNP3, welche nur in der ersten Aminosäure unterschiedlich sind.The antimicrobial peptide Defensin HNP1-3 was derived from human peripheral blood neutrophils isolated as described (Har wig, S. S. L., Ganz, L. and Lehrer, R. I. (1994) Methods En zymol. 236, 160-172). The defensin peptides were derived from the Granules of granulocytes by extraction with 5% acetic acid enriched and by RP-HPLC (reversed phase high perfor mance liquid chromatography). The product passed from the three defensin variants HNP1, HNP2 and HNP3, which are only different in the first amino acid.

Die Protegrine 3 und 5 wurden als Peptidamide synthetisiert, einer Faltungs-Prozedur unterzogen, um die korrekten Disul fidbrücken und β-Faltblattstrukturen zu erzielen, und ab schließend durch RP-HPLC gereinigt (Peschel, A., Otto, M., Jack, R. W., Kalbacher, H., Jung, G. und Götz, F. (1999) J. Biol. Chem. 274, 8405-8410).Protegrins 3 and 5 were synthesized as peptide amides, subjected to a folding procedure to ensure the correct disposition to achieve fid bridges and β-sheet structures, and off finally cleaned by RP-HPLC (Peschel, A., Otto, M., Jack, R. W., Kalbacher, H., Jung, G. and Götz, F. (1999) J. Biol. Chem. 274, 8405-8410).

Um die Sensitivität von Bakterien gegenüber antimikrobiellen Substanzen zu bestimmen, wurde die minimale inhibitorische Konzentration verschiedener derartiger Substanzen bestimmt. In einem seriellen Verdünnungstest wurde LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl), welches ansteigende Konzentrationen der antimikrobiellen Peptide enthielt, mit 1/100 Volumen Vorkultur beimpft. Die antimikrobiellen Peptide waren Gallidermin (Dr. Karl Thomae GmbH, Biberach, Deutsch land), Nisin, synthetisches (A8, 13, 18)-Magainin II Amid, Melittin, Gramicidin S und Gramicidin D (alle von Sigma, St. Louis, MO., USA) sowie die oben erwähnten Defensine und Pro tegrine. Die Kulturen wurden bis zum Erreichen der statio nären Phase kultiviert. Die Trübung der Kulturen wurde bei 590 nm beobachtet. Da die Aktivität von humanen Defensinen sehr empfindlich gegenüber Salzkonzentrationen ist (Harwig, S. S. L., Ganz, L. und Lehrer, R. I. (1994) Methods Enzymol. 236, 160-172), wurde das LB-Medium ohne NaCl und mit nur der Hälfte der Trypton- und Hefeextrakt-Menge eingesetzt. Die getesteten Stämme zeigten in diesem Medium ausreichendes Wachstum.The sensitivity of bacteria to antimicrobial Determining substances became the minimal inhibitory Concentration of various such substances determined. In a serial dilution test, LB medium (1% Trypton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl), which is increasing Contained concentrations of the antimicrobial peptides with Inoculates 1/100 volume pre-culture. The antimicrobial peptides were gallidermin (Dr. Karl Thomae GmbH, Biberach, German land), nisin, synthetic (A8, 13, 18) -magainin II amide, Melittin, Gramicidin S and Gramicidin D (all from Sigma, St. Louis, MO., USA) and the defensins and pro mentioned above tegrine. The cultures were until the statio cultivated nary phase. The turbidity of the cultures was reduced 590 nm observed. Because the activity of human defensins is very sensitive to salt concentrations (Harwig, S. S. L., Ganz, L. and Lehrer, R. I. (1994) Methods Enzymol. 236, 160-172), the LB medium was without NaCl and with only the Half of the trypton and yeast extract amount used. The tested strains showed sufficient in this medium Growth.

Um die Interaktion von Gallidermin mit Bakterienzellen zu untersuchen, wurden die Bakterien bis zur stationären Phase im BM-Nedium kultiviert und durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit Natrium-Phosphatpuffer (50 mM, pH 7) gewaschen und bis zu einer finalen optischen Dichte bei 578 nm von 4 in dem gleichen Puffer resuspendiert, welcher 5 µg Gallidermin/ml (S. aureus) oder 25 µg Gallidermin/ml (S. xylosus) enthielt. Nach 20 Minuten Inkubation bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt. Der Gehalt an Gallidermin im Überstand wurde durch RP-HPLC-Analyse bestimmt, wobei ein linearer Gradient von 30-60% Acetoni tril in 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) über 20 Säulenvolumen in einer Spherisorp ODS2-Säule eingesetzt wurde (Grom Analy tik, Herrenberg, Deutschland).To increase the interaction of gallidermine with bacterial cells investigate, the bacteria were up to the stationary phase cultivated in the BM medium and harvested by centrifugation. The cells were washed twice with sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7) and washed to a final optical density Resuspended 578 nm of 4 in the same buffer containing 5 µg Gallidermin / ml (S. aureus) or 25 µg Gallidermin / ml (S. xylosus) contained. After 20 minutes of incubation at 37 ° C the cells were removed by centrifugation. The salary of gallidermine in the supernatant was determined by RP-HPLC analysis determined, with a linear gradient of 30-60% Acetoni tril in 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) over 20 column volumes was used in a Spherisorp ODS2 column (Grom Analy tik, Herrenberg, Germany).

2 results Example I mprF affects the sensitivity to cationic antimicro biological peptides

Durch Vergleich der minimalen Hemmkonzentrationen von diver sen Peptiden gegenüber Wildtyp- und mprF-Mutantenstämmen wurde der durch mprF vermittelte Resistenzfaktor als Quotient aus der minimalen Hemmkonzentration der jeweiligen Substanz beim Wildtyp und der minimalen Hemmkonzentration bei der Mutante (mprF::erm bzw. mprF::Tn917) bestimmt (Fig. 7). Der höchste Resistenzfaktor trat bei Defensin HNP1-3 aus humanen neutrophilen Granulozyten, Protegrinen aus Leukozyten des Schweins, Nisin aus Lactococcus lactis und Gallidermin aus Staphylococcus gallinarum auf. Diese relativ großen Peptide besitzen eine starre Struktur, die durch Disulfidbrücken oder Thioetherbrücken stabilisiert wird (Fig. 1). Ein vergleichs weise geringer Resistenzfaktor wurde für die linearen, rela tiv flexiblen Peptide Magainin II von der Haut des Krallen frosches und Melittin aus dem Bienengift ermittelt. Keine Resistenz wurde gegen das kleine, ringförmige Gramicidin S und das lineare, aber neutrale Gramicidin D (beide aus Bacil lus brevis) beobachtet.By comparing the minimum inhibitory concentrations of various peptides against wild-type and mprF mutant strains, the resistance factor mediated by mprF was calculated as the quotient of the minimum inhibitory concentration of the respective substance in the wild-type and the minimum inhibitory concentration in the mutant (mprF :: erm or mprF :: Tn917) determined ( Fig. 7). The highest resistance factor was found for defensin HNP1-3 from human neutrophil granulocytes, protegrins from pig leukocytes, nisin from Lactococcus lactis and gallidermine from Staphylococcus gallinarum. These relatively large peptides have a rigid structure which is stabilized by disulfide bridges or thioether bridges ( FIG. 1). A comparatively low resistance factor was determined for the linear, relatively flexible peptides Magainin II from the skin of the clawed frog and melittin from the bee venom. No resistance was observed against the small, ring-shaped gramicidin S and the linear but neutral gramicidin D (both from Bacilus brevis).

Um den Einfluß des mprF-Gens auf die Resistenz gegenüber antimikrobiellen Peptiden durch einen weiteren Versuch zu belegen, wurden die Mutanten, bei denen das mprF-Gen ausge schaltet war (mprF::erm bzw. mprF::Tn917), mit dem Plasmid pRBmprF, welches das mprF-Gen enthält, transformiert (mprF::erm (pRBmprF) bzw. mprF::Tn917 (pRBmprF)). Diese sog. Komplementation der mprF-Mutanten führte zu einem normalen, oder zumindest gegenüber der Mutante erhöhten Resistenzlevel für Peptide, gegen die die Mutanten sensitiv waren (Fig. 7).In order to demonstrate the influence of the mprF gene on the resistance to antimicrobial peptides by a further experiment, the mutants in which the mprF gene was switched off (mprF :: erm or mprF :: Tn917) were used with the plasmid pRBmprF , which contains the mprF gene, transformed (mprF :: erm (pRBmprF) or mprF :: Tn917 (pRBmprF)). This so-called complementation of the mprF mutants led to a normal, or at least increased resistance level for the peptides against which the mutants were sensitive ( FIG. 7).

Example II mprF-bearing bacteria bind less cationisobes Galli dermin

Wildtyp-, Mutanten- und komplementierte Mutantenzellen wurden mit Gallidermin inkubiert und der Gehalt an ungebundenem Gallidermin im Überstand nach dem Entfernen der Zellen durch HPLC bestimmt. Fig. 8 zeigt das Ergebnis dieses Versuches. Der Wildtyp ist schwarz, die mprF-Mutante weiß und die mit Plasmid pTXmprF komplementierte Mutante grau dargestellt. In pTXmprF befindet sich das mprF-Gen von Staphylococcus xylosus unter Kontrolle des Xylose-induzierten xylA-Promo tors. Zur Expression von mprF wurde dem Kulturmedium deshalb 0,5% Xylose zugesetzt. Wildtyp, mprF-Mutante und mit Plasmid pTXmprE komplementierte Mutante wurden mit Gallidermin inku biert und die Menge an ungebundenem Protein im Kulturüber stand bestimmt. Es zeigte sich, daß in Anwesenheit eines intakten mprF-Gens (Wildtyp oder komplementierte Mutante) wesentlich mehr Gallidermin im Überstand zu finden war als bei den mprF-Mutanten. Die Funktion von MprF dürfte somit nicht auf proteolytischen Abbau, sondern auf einer Abstoßung der antimikrobiellen Peptide durch die Zelle beruhen. Die offensichtliche Spezifität von MprF für bestimmte Peptide deutet auf eine "multiple drug"-Transporter-ähnliche Funk tionsweise hin.Wild-type, mutant and complemented mutant cells were incubated with gallidermin and the content of unbound gallidermin in the supernatant after removal of the cells was determined by HPLC. Fig. 8 shows the result of this experiment. The wild type is black, the mprF mutant is white and the mutant complemented with plasmid pTXmprF is shown in gray. In pTXmprF, the Staphylococcus xylosus mprF gene is under the control of the xylose-induced xylA promoter. To express mprF, 0.5% xylose was therefore added to the culture medium. Wild type, mprF mutant and mutant complemented with plasmid pTXmprE were incubated with gallidermine and the amount of unbound protein in the culture supernatant was determined. It was found that in the presence of an intact mprF gene (wild-type or complemented mutant), significantly more gallidermine was found in the supernatant than in the mprF mutants. The function of MprF should therefore not be based on proteolytic degradation, but rather on rejection of the antimicrobial peptides by the cell. The apparent specificity of MprF for certain peptides indicates a "multiple drug" transporter-like mode of operation.

Example III MprF homologous proteins are found in many bacteria

In den bekannten kompletten oder noch unvollständigen Genom sequenzen von diversen Bakterien befinden sich viele Gene mit unbekannter Funktion. Bei fünf Bakterienarten wurden unter diesen uncharakterisierten Genen Ähnlichkeiten zum Gen mprF gefunden. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen aller ähnli chen (homologen) Gene hatten vergleichbare Hydrophobizitäts profile. Eine Sequenzähnlichkeit bestand vor allem im Car boxy-terminalen hydrophilen Bereich, wie aus Fig. 9 zu ent nehmen ist. Die konservierten Aminosäuren, d. h. die Amino säuren, die bei mehreren der untersuchten Proteine an ent sprechender Position funktionell ähnlich sind (wobei die funktionelle Ähnlichkeit wie in verbreiteten Datenverar beitungsprogrammen, z. B. BLAST 2.0, definiert ist), sind hervorgehoben. Die folgenden Ähnlichkeitsgrade, d. h. der prozentuale Anteil an funktionell ähnlichen Aminosäuren an entsprechenden Positionen, wurden für die Carboxy-Termini der verschiedenen Spezies zum MprF-Protein von Staphylococcus aureus ermittelt: Bacillus subtilis, 63%; Agrobacterium tumefaciens, 58%; Streptomyces coelicolor, 44%; Mycobacte rium tuberculosis, 42%; Mycobacterium leprae, 40%. Die Ähnlichkeit zwischen den MprF-Proteinen der beiden Staphylo kokken-Spezies betrug im Carboxy-Terminus 83%. Es kann davon ausgegangen werden, daß die homologen Gene in den verschiede nen Bakterienarten ebenfalls Resistenz gegen Host defense- Peptide und/oder bakterielle antimikrobielle Substanzen ver mitteln. There are many genes with unknown function in the known complete or incomplete genome sequences of various bacteria. Similarities to the mprF gene were found among these uncharacterized genes in five types of bacteria. The deduced amino acid sequences of all similar (homologous) genes had comparable hydrophobicity profiles. Sequence similarity existed above all in the car boxy-terminal hydrophilic region, as can be seen in FIG. 9. The conserved amino acids, ie the amino acids, which are functionally similar in several of the proteins investigated at a corresponding position (the functional similarity as defined in common data processing programs, e.g. BLAST 2.0) being highlighted. The following degrees of similarity, ie the percentage of functionally similar amino acids at corresponding positions, were determined for the carboxy termini of the different species to the MprF protein from Staphylococcus aureus: Bacillus subtilis, 63%; Agrobacterium tumefaciens, 58%; Streptomyces coelicolor, 44%; Mycobacte rium tuberculosis, 42%; Mycobacterium leprae, 40%. The similarity between the MprF proteins of the two staphylococcal species was 83% in the carboxy terminus. It can be assumed that the homologous genes in the various types of bacteria also impart resistance to host defense peptides and / or bacterial antimicrobial substances.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. DNA sequence of the mprF gene from Staphylococcus aureus according to FIG. 2 or fragments thereof.

2. DNA sequence of the mprF gene from Staphylococcus xylosus according to FIG. 3 or fragments thereof.

3. DNA sequence, characterized in that it hybridizes under stringent conditions with the DNA sequence according to FIG. 2 or with the DNA sequence according to FIG. 3 or fragments thereof.

4. DNA sequence, characterized in that it codes for a hrotein with the amino acid sequences given in FIG. 5 or FIG. 6.

5. DNA sequence according to one of the preceding claims, since characterized in that they have at least one mutation, in particular an insertion or deletion, where preferably a mutation in a coding Ab cut of the sequence is present.

6. DNA sequence according to claim 5, characterized in that the MprF protein encoded by the sequence in its bio logical function changed, in particular deactivated, is.

7. DNA sequence according to one of the preceding claims, since characterized in that the ko from the DNA sequence MprF protein resistance to antimicrobial len peptides, especially cationic antimicrobial Peptides.

8. Gene product derived from a DNA sequence according to a the preceding claims.

9. Peptide / protein with one of the amino acid sequences or fragments indicated in FIG. 5 or 6.

10. peptide / protein according to claim 9, characterized in that there is resistance to antimicrobial peptides, especially cationic antimicrobial peptides, mediated.

11. Vector, characterized in that it has at least one Part of a DNA sequence according to one of claims 1 to 7, in particular according to claim 5 or 6.

12. Vector according to claim 11, characterized in that the Vector for influencing biological activity of proteins can be used, the resistance to antimicrobial peptides, especially cationic antimicrobial peptides.

13. organism, in particular bacterial microorganism, characterized in that it is in the expression of the mprF gene is changed.

14. Organism according to claim 13, characterized in that the mprF gene is overexpressed.

15. Organism according to claim 13, characterized in that the expression of the mprF gene is reduced, in particular which is switched off.

16. Active ingredient, the expression of the mprF gene and / or the biological activity of the MprF protein directly and / or indirectly influenced, preferably reduced.

17. Active ingredient according to claim 16, characterized in that the active ingredient the sensitivity of microorganisms affected by antimicrobial substances preferably increased.

18. Active ingredient according to claim 17, characterized in that the microorganisms are bacteria, especially grief positive bacteria.

19. Active ingredient according to claim 17 or 18, characterized in net that the antimicrobial substances cationic antimicrobial peptides, especially host defense peptides and / or bacterial antimicrobial Peptides.

20. Active ingredient according to one of claims 16 to 19, characterized characterized in that the active ingredient is a peptide or Pro tein is.

21. Pharmaceutical composition, characterized in that they have at least one active ingredient with at least one of the features according to at least one of claims 16 to 20 in an effective amount and preferably at least least contains a pharmaceutical carrier.

22. Use of at least one active ingredient after at least one of claims 16 to 20 or pharmaceutical A composition according to claim 21 for the treatment of Diseases associated with bacterial infections stand menhang.

23. A method for providing an active ingredient with at least one of the features according to at least one of claims 16 to 20, characterized in that the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances is determined as a measure of the effect of the potential active ingredient, comprising

a) treatment of microorganisms with at least one antimicrobial substance,
b) an incubation with at least one potential active ingredient and
c) the determination of growth and / or survival rates of the microorganisms.

24. A method for providing an active ingredient with at least one of the features according to at least one of claims 16 to 20, characterized in that an mprF gene product is determined as a measure of the effect of the potential active ingredient, comprising

a) treatment of microorganisms with at least one antimicrobial substance,
b) an incubation with at least one potential active ingredient and
c) determining the amount of an mprF gene product.

25. A method for providing an active ingredient with at least one of the features according to at least one of claims 16 to 20, characterized in that the rejection of antimicrobial substances, for example antimicrobial peptides, by the microorganisms as a measure of the effect of the potential active ingredient is determined comprehensively

a) treatment of microorganisms with at least one antimicrobial substance,
b) an incubation with at least one potential active ingredient and
c) the determination of at least one antimicrobial substance in the medium.