DE19911102A1

DE19911102A1 - New cyanine dye comprises barbituric acid or thiobarbituric acid substitutes and reactive groups, which bind carrier substances

Info

Publication number: DE19911102A1
Application number: DE1999111102
Authority: DE
Inventors: Knut Reiner; Steffen Ernst; Heinz Mustroph
Original assignee: Few Chemicals Wolfen GmbH
Current assignee: Few Chemicals Wolfen GmbH
Priority date: 1999-03-12
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2000-09-14

Abstract

Cyanine dyes (I) comprising barbituric acid or thiobarbituric acid substitutes and reactive groups, which bind carrier substances, are new.

Description

Die Erfindung betrifft Cyanin-Farbstoffe für die Anwendung als Fluoreszenzmarker im nahen Infrarot-Bereich um 780 nm (NIR; Near Infrared Region), die stabil und in Wasser löslich sind, eine gute Fluoreszenzquantenausbeute haben und mit einer oder mehreren Reaktivgruppen versehen sind.The invention relates to cyanine dyes for use as Fluorescence markers in the near infrared range around 780 nm (NIR; Near Infrared Region), which are stable and soluble in water, have a good fluorescence quantum yield and with an or several reactive groups are provided.

Es ist allgemein bekannt, daß Fluoreszenzfarbstoffe als Marker auf vielfältige Weise für die Analyse eines Großteils kli nisch, biologisch, biochemisch oder chemisch relevanter Sub stanzen wie z. B. Zellen, Antikörper, Proteine, Hormone, Nucleinsäuren, Kohlehydrate oder Amine und Mercaptane einge setzt werden. Sowohl die entsprechenden Analyse- als auch die Detektionstechniken unterliegen derzeit einer schnellen Ent wicklung. In Kombination mit der leicht detektierbaren, durch Laser induzierten Fluoreszenz (LIF; Laser-Induced Fluo rescence), sind bereits schnelle Analysen in den o. a. Gebieten möglich. Ein wesentliches Ziel dabei ist es, die Nachweisgren ze immer weiter herabzusetzen. Voraussetzung dafür ist eine geringe Untergrundfluoreszenz (Eigenfluoreszenz von Begleit stoffen, Lösungsmittel), Lichtstreuung (Rayleigh-, Tyndall- und Raman-Streuung) und Fluoreszenzlöschung. Besonders bei klinisch und biologisch bedeutenden Anwendungen treten diese Effekte, bedingt durch den kolloidalen Charakter vieler Biomo leküle, verstärkt auf. Gegenüber der Analytik im sichtbaren Spektralbereich, tritt dieser Einfluß im Nahen Infrarot (NIR) nicht oder nur in geringer Form auf. Mit der Entwicklung preiswerter und langwelliger Laserdioden (780 nm) waren für die Nachweistechnologie im NIR die von der technischen Seite notwendigen Voraussetzungen prinzipiell vorhanden. It is well known that fluorescent dyes are used as markers in many ways for the analysis of a large part kli nically, biologically, biochemically or chemically relevant sub punch such as B. cells, antibodies, proteins, hormones, Nucleic acids, carbohydrates or amines and mercaptans are set. Both the corresponding analysis and the Detection techniques are currently subject to rapid development winding. In combination with the easily detectable, through Laser-Induced Fluorescence (LIF; Laser-Induced Fluo rescence), fast analyzes are already in the above Areas possible. One of the main objectives is to determine the to reduce ze more and more. The prerequisite for this is a low background fluorescence (self-fluorescence of accompanying substances, solvents), light scattering (Rayleigh, Tyndall and Raman scattering) and fluorescence quenching. Especially at Clinically and biologically important applications occur Effects due to the colloidal character of many Biomo leküle, reinforced on. Compared to the analytics in the visible Spectral range, this influence occurs in the near infrared (NIR) not or only in a small form. With the development cheaper and longer wave laser diodes (780 nm) were for the detection technology in the NIR that from the technical side necessary prerequisites exist in principle.

Farbstoffe, die im NIR-Bereich absorbieren, sind insbesondere aus der Silberhalogenidphotographie bekannt. Eine der ersten Arbeiten, in der ein NIR-Farbstoff für bioanalytische Anwen dungen eingesetzt wurde, geht zurück auf Sauda et al. ("Anal. Chem." 58 (1986) 2649), die Indocyaningrün (ICG) 1 (λ_max = 785 nm; MeOH) für die Proteinanalyse in Human Serum ver wendeten und damit die Nachweisempfindlichkeit um zwei Größen ordnungen steigern konnten.
Dyes which absorb in the NIR range are known in particular from silver halide photography. One of the first works in which a NIR dye was used for bioanalytical applications goes back to Sauda et al. ("Anal. Chem." 58 (1986) 2649), who used indocyanine green (ICG) 1 (λ _max = 785 nm; MeOH) for protein analysis in human serum and were thus able to increase the detection sensitivity by two orders of magnitude.

Dieser Farbstoff hat jedoch die folgenden Nachteile. Er kann nur durch physikalische Effekte an die Probe gebunden werden (nicht-kovalente Bindung), was während der chromatographischen Separation der Probe zu einer teilweisen Abtrennung des Farb stoffes führt. Trotz dieses schwerwiegenden Problems waren da mit die Vorteile von NIR-Fluoreszenzmarkern eindrucksvoll de monstriert. Es folgten Arbeiten, um NIR-Fluoreszenzmarker mit Reaktivgruppen für den Bereich um 780 nm zu synthetisieren.However, this dye has the following disadvantages. He can are only bound to the sample by physical effects (non-covalent bond) what happens during the chromatographic Separation of the sample to a partial separation of the color substance leads. Despite this serious problem, there were with the advantages of NIR fluorescence markers protested. This was followed by work on using NIR fluorescent markers To synthesize reactive groups for the range around 780 nm.

Als Reaktionspartner stehen bei Antikörpern, Proteinen, Hormo nen, Nucleinsäuren, und anderen Biomolekülen u. a. Mercapto- (-SH), Amino- (-NH₂), Hydroxy- (-OH) und Aldehydgruppen (-CHO) zur Verfügung. Einer der ersten Ansätze in der Synthese von Cyaninfarbstoffen mit Reaktivgruppen bestand in der Verwendung von Iodacetamidogruppen gemäß dem Farbstoff 2 [Ernst et al. ("Cytometry" 10 (1989) 3)]. Diese Gruppe war prinzipiell ge eignet, weist aber noch viele Einschränkungen auf. So reagiert sie nur mit Mercaptogruppen und nicht mit Amino- oder Hydroxy gruppen. Das ist ein wichtiger Nachteil, da z. B. viele Protei ne keine genügende Anzahl von Mercaptogruppen aufweisen und andere Biomoleküle keine haben. Hinzu kommt als zweiter Nach teil, daß Mercaptogruppen (-SH HS-) in Gegenwart von Sauer stoff leicht zu Disulfiden (-S-S-) oxidieren und von daher un ter Lufteinfluß für kovalente Bindungen an den Fluoreszenzmar ker nicht mehr oder nur in geringem Umfang zur Verfügung ste hen.
The reaction partners for antibodies, proteins, hormones, nucleic acids and other biomolecules include mercapto (-SH), amino (-NH ₂ ), hydroxy (-OH) and aldehyde groups (-CHO). One of the first approaches in the synthesis of cyanine dyes with reactive groups consisted in the use of iodoacetamido groups according to dye 2 [Ernst et al. ("Cytometry" 10 (1989) 3)]. In principle, this group was suitable, but still has many limitations. It only reacts with mercapto groups and not with amino or hydroxyl groups. This is an important disadvantage because e.g. B. many Protei ne do not have a sufficient number of mercapto groups and other biomolecules do not have. In addition, there is a second after part that mercapto groups (-SH HS-) easily oxidize to disulfides (-SS-) in the presence of oxygen and therefore no longer or only to a small extent for covalent bonds to the fluorescent markers under the influence of air To be available.

Mit n = 3 erhält man Absorptionsmaxima um 760 nm. Abgesehen von den Einschränkungen bei der Verwendung von Iodacetamido gruppen, sind Farbstoffe mit n = 3 nicht sehr stabil und auf grund ihrer relativ geringen Wasserlöslichkeit neigen sie in wässrigen Systemen zur Bildung von Farbstoffaggregaten (Er scheinen der kürzerwelligen Dimeren- oder H-Bande), die we sentlich schlechter fluoreszieren. Die Tendenz, Farbstoffag gregate zu bilden, korreliert auch mit der Tendenz zu unspezi fischen nicht-kovalenten Bindungen des Farbstoffes an das Bio molekül. Aus diesen drei Gründen sind Farbstoffe der Struktur 2 wenig geeignet.With n = 3, absorption maxima around 760 nm are obtained of the restrictions on the use of iodoacetamido groups, dyes with n = 3 are not very stable and on due to their relatively low solubility in water, they tend to be in aqueous systems for the formation of dye aggregates (Er seem of the shorter-wave dimer or H-band), which we fluoresce much worse. The tendency to dye day Forming gregate also correlates with the tendency to unspezi fish non-covalent bonds of the dye to the bio molecule. For these three reasons, dyes are of structure 2 not very suitable.

In Proteinen oder anderen Biomolekülen sind gegenüber den Mer captogruppen sehr viele Aminogruppen enthalten und können als Alternative zu den Mercaptogruppen herangezogen werden. Ein entscheidender Schritt gelang mit der Synthese von Farbstof fen mit Methylencarboxygruppen durch Southwick et al. ("Cyto metry" 11 (1990) 418), die man z. B. durch Umsetzung mit N- Hydroxysuccinimid (NHS) in ihre N-Succinimidester 3 umwandeln kann, die dann wiederum sehr gut mit Aminogruppen reagieren.
Compared to the mercapto groups, proteins or other biomolecules contain very many amino groups and can be used as an alternative to the mercapto groups. A decisive step was achieved with the synthesis of dyes with methylene carboxy groups by Southwick et al. ("Cyto metry" 11 (1990) 418), which can be found e.g. B. by reaction with N-hydroxysuccinimide (NHS) can convert into their N-succinimide esters 3, which in turn react very well with amino groups.

Das war schon ein wesentlicher Vorteil der Farbstoffe 3 gegen über denen mit der Struktur 2. Die Probleme der Stabilität wa ren damit jedoch noch nicht gelöst. That was already a major advantage of the dyes 3 against above those with the structure 2. The problems of stability wa However, this does not solve the problem.

Die Farbstoffaggregation und die unspezifische nicht-kovalente Bindung der Farbstoffe an die Probe in wässrigen Medien, kann durch eine bessere Wasserlöslichkeit des Farbstoffes verhin dert werden. Bereits aus der Photographie ist bekannt, daß Arylsulfogruppen gegenüber N-Alkylsulfogruppen zu einer deut lichen Verbesserung der Wasserlöslichkeit eines Farbstoffes führen. Entsprechende Fluoreszenzmarker wurden erstmals von Mujumdar et al. ("Bioconjugate Chem." 4 (1993) 105) beschrie ben.
The dye aggregation and the unspecific, non-covalent binding of the dyes to the sample in aqueous media can be prevented by improving the water solubility of the dye. It is already known from photography that aryl sulfo groups lead to a significant improvement in the water solubility of a dye compared to N-alkyl sulfo groups. Corresponding fluorescence markers were first used by Mujumdar et al. ("Bioconjugate Chem." 4 (1993) 105).

Die Farbstoffe 4 werden unter der Marke Cy™ von der Firma Amersham Life Science Inc. vertrieben (siehe auch http://www.amersham.com/life/cydye). Mit Cy3™ (4; n = 1) hat man Farbstoffe mit einem Absorptionsmaximum um 560 nm, mit Cy5™ (4; n = 2) mit einem Absorptionsmaximum um 660 nm. Für die Laserdiode mit einer Emission um 780 nm ist aus der Cy™- Reihe Cy7™ verfügbar (4; n = 3), das ein Absorptionsmaximum um 760 nm aufweist. Mit diesem Farbstoff werden die Probleme, die aus der Wasserlöslichkeit resultieren, umgangen. Als gravie render Nachteil bleibt, daß der Farbstoff Cy7™ für viele An wendungen nicht ausreichend stabil ist.The dyes 4 are sold under the brand name Cy ™ by the company Amersham Life Science Inc. (see also http://www.amersham.com/life/cydye). With Cy3 ™ (4; n = 1) has one dyes with an absorption maximum around 560 nm, with Cy5 ™ (4; n = 2) with an absorption maximum around 660 nm. For the laser diode with an emission around 780 nm is from the Cy ™ - Cy7 ™ series available (4; n = 3), which has an absorption maximum around 760 nm. With this dye the problems that result from the water solubility, bypassed. As gravie render disadvantage remains that the dye Cy7 ™ for many An turns is not sufficiently stable.

Neben den Succinimidestern als Reaktivgruppe für Aminogruppen wird schon seit längerer Zeit auch der Weg über die Isothiocy anatgruppe verfolgt [Mujumdar et al. ("Cytometry" 10 (1989) 11)].
In addition to the succinimide esters as a reactive group for amino groups, the route via the isothiocyanate group has also been pursued for a long time [Mujumdar et al. ("Cytometry" 10 (1989) 11)].

Ähnlich wie bei den Farbstoffen 2, 3 und 4 ist es auch mit Farbstoff 5 (n = 3) möglich, Farbstoffe mit einem Absorptions maximum um 760 nm zu erhalten. Neben den bereits bei den Farb stoffen 2 und 3 diskutierten Problemen der Wasserlöslichkeit und Stabilität, kommt hier ein weiterer Nachteil hinzu: die Reaktion der Isothiocyanatgruppe mit der Aminogruppe führt zu nicht sehr stabilen Thioharnstoffderivaten.Similar to dyes 2, 3 and 4 it is also with Dye 5 (n = 3) possible, dyes with an absorption maximum to get 760 nm. In addition to those already in the color substances 2 and 3 discussed problems of water solubility and stability, there is another disadvantage here: the Reaction of the isothiocyanate group with the amino group leads to not very stable thiourea derivatives.

Die Farbstoffe 3, 4 und 5 können prinzipiell auch zur DNA- Sequenzanalyse verwendet werden. Allerdings muß man dazu in einem zusätzlichen Schritt am 5'-Hydroxy-Ende des syntheti schen Oligonucleotids (Sequenzierprimer, Primer) oder an den Nucleotiden über einen sog. Amino-Linker R-(CH₂)_n-NH₂ (R = Re aktivgruppe, die mit der OH-Gruppe reagiert; -(CH₂)_n- Spacer) eine Aminogruppe einführen, die wiederum mit dem NHS-Ester der Carboxygruppe des Farbstoffes reagiert und so den Farbstoff am Oligonucleotid fixiert [Yu et al. ("Nuc. Acids Res." 20 (1992) 83)]. Das Konjugat zwischen Farbstoff und Oligonucleotid, ver bunden über den Amino-Linker, wird dann isoliert und gerei nigt. Die Gesamtzeit zur Markierung z. B. eines Oligonucleotids aus 20 Basen beträgt nach dieser Methode ca. 2 Tage.The dyes 3, 4 and 5 can in principle also be used for DNA sequence analysis. However, you have to do this in an additional step at the 5'-hydroxy end of the synthetic oligonucleotide (sequencing primer, primer) or on the nucleotides via a so-called. Amino linker R- (CH ₂ ) _n -NH ₂ (R = Re active group , which reacts with the OH group; - (CH ₂ ) _n - spacer) introduce an amino group, which in turn reacts with the NHS ester of the carboxy group of the dye and thus fixes the dye on the oligonucleotide [Yu et al. ("Nuc. Acids Res." 20 (1992) 83)]. The conjugate between dye and oligonucleotide, connected via the amino linker, is then isolated and purified. The total time to mark z. B. an oligonucleotide of 20 bases takes about 2 days by this method.

Ein wesentlicher Fortschritt wurde durch Verwendung von N- Hydroxypropylgruppen am Farbstoff erreicht. Die Hydroxygruppe wird mittels der phosphitylierenden Verbindung Bis-(N,N-di- isopropyl)-β -cyanoethyl-phosphordiamidit in das Bis-(N,N-di- isopropyl)-β-cyanoethyl-phosphoramidit umgewandelt (US-A 5 556 959), das direkt mit dem 5'-Hydroxy-Ende des Oligonucleotids reagiert. Damit reduzieren sich die Reaktionsschritte, die Ausbeute an markiertem Produkt ist größer, die Reinigung ein facher und die benötigte Zeit verringert sich von 2 Tagen auf 5 Stunden.A significant advance was made through the use of N- Reached hydroxypropyl groups on the dye. The hydroxy group the phosphitylating compound bis- (N, N-di- isopropyl) -β -cyanoethyl-phosphorodiamidite into the bis- (N, N-di- isopropyl) -β-cyanoethyl-phosphoramidite converted (US-A 5 556 959), that directly to the 5'-hydroxy end of the oligonucleotide reacted. This reduces the reaction steps that Yield of labeled product is greater, the purification one times and the time required is reduced from 2 days to 5 hours.

Allerdings wurden nur die Synthese von Tri- und Pentamethincy aninen mit dieser Reaktivgruppe beschrieben, letztere mit ei nem Absorptionsmaximum um 645 nm und keine Heptamethincyanine.However, only the synthesis of tri- and pentamethincy were made anines described with this reactive group, the latter with ei nem absorption maximum around 645 nm and no heptamethine cyanines.

Generell weisen Cyaninfarbstoffe mit größer werdender Länge der Polymethinkette eine fallende Stabilität auf. Es gab eini ge Versuche, das Problem der Stabilität durch den Einbau von Ringsystemen in die Polymethinkette zu lösen.In general, cyanine dyes show with increasing length the polymethine chain shows a decreasing stability. There were some ge attempts to solve the problem of stability by installing To solve ring systems in the polymethine chain.

Literaturbekannt für die Synthese von stabilisierten Cyanin farbstoffen ist die Verwendung von 2-Chlor-1,3-dialdehyden, 6 und 7, die durch Vilsmeier-Synthese aus Cylcopentanon und Cy clohexanon zugänglich sind.
Known in the literature for the synthesis of stabilized cyanine dyes is the use of 2-chloro-1,3-dialdehydes, 6 and 7, which are accessible by Vilsmeier synthesis from Cylcopentanone and Cy clohexanone.

Allerdings ist das Chloratom in der Polymethinkette des Farb stoffes reaktiv, so daß entsprechende Farbstoffe zwar vom Farbstoffgrundkörper her stabiler als offenkettige Cyanine sind, doch durch die leichte nucleophile Substitution des Chloratoms ein weiteres Stabilitätsproblem hinzu kommt.However, the chlorine atom is in the polymethine chain of the color substance reactive, so that corresponding dyes from Dye base is more stable than open-chain cyanines are, but due to the easy nucleophilic substitution of the Chlorine atom adds another stability problem.

Zur Umgehung dieses Problems wurden Farbstoffe mit einem imi niumsubstituierten Ring in der Polymethinkette synthetisiert (US-A 5 453 505) wie z. B. 8.
To circumvent this problem, dyes with an imi niumsubstituierten ring in the polymethine chain were synthesized (US-A 5 453 505) such. B. 8.

Das Iminium-Kation erhöht die Stabilität des Farbstoffes ge genüber Licht im Vergleich zum Chlor-Farbstoff und führt zu einer gewissen Wasserlöslichkeit und damit zur Verringerung der Aggregatbildung. The iminium cation increases the stability of the dye compared to light compared to chlorine dye and leads to a certain water solubility and thus a reduction the aggregate formation.

Einen anderen Versuch, das Farbstoffstabilitätsproblem zu lö sen, stellen Farbstoffe der Struktur 9 [Strekowski et al. ("J. Org. Chem." 57 (1992) 4578)] dar. Damit werden Absorptionsma xima von 768 nm (X = O) und 795 nm (X = S) erreicht. Mit X = O wird dieser Farbstoff von LI-COR Inc. unter IRD 40™ angeboten (http://www. licor.com/bio).
Another attempt to solve the dye stability problem are dyes of structure 9 [Strekowski et al. ("J. Org. Chem." 57 (1992) 4578)]. This achieves absorption maxima of 768 nm (X = O) and 795 nm (X = S). With X = O, this dye is offered by LI-COR Inc. under IRD 40 ™ (http: // www. Licor.com/bio).

Mit diesen Farbstoffen sind jedoch zwei neue Stabilitätspro bleme gegenüber Cy7™ verbunden. Das erste liegt in der Stabi lität der Bindung X. Mit X = S erhält man einen Farbstoff, der sehr leicht hydrolysiert [Shealy et al. ("Anal. Chem." 67 (1995) 247)]; etwas stabiler ist die Etherbindung X = O, aber immer noch ziemlich hydrolyseempfindlich. Das zweite, bereits oben erwähnte, Stabilitätsproblem resultiert aus der als Reak tivgruppe verwendeten Isothiocyanatgruppe, deren Reaktionspro dukt mit Aminogruppen ebenfalls hydrolyseempfindlich ist. Das Problem der Etherspaltung wird auch nicht durch die Farb stoffe 10a und 10b, gelöst, die unter IRD 41™ bzw. IRD 800™ angeboten werden (http://www. licor.com/bio).
However, there are two new stability problems associated with Cy7 ™ with these dyes. The first lies in the stability of the bond X. With X = S, a dye is obtained which hydrolyzes very easily [Shealy et al. ("Anal. Chem." 67 (1995) 247)]; the ether bond X = O is somewhat more stable, but still quite sensitive to hydrolysis. The second, already mentioned above, stability problem results from the isothiocyanate group used as a reactive group, whose reaction product with amino groups is also sensitive to hydrolysis. The problem of ether cleavage is also not solved by the dyes 10a and 10b, which are offered under IRD 41 ™ and IRD 800 ™ (http: // www. Licor.com/bio).

Zusammenfassend ist somit festzustellen, daß zwar für eine Be zugswellenlänge von 780 nm (z. B. einer Laserdiode) mit Cy7™, IRD 40™, IRD 41™ und IRD 800™ Farbstoffe verfügbar sind, die se aber nicht alle Anforderungen an die Stabilität erfüllen und geringe Fluoreszenzquantenausbeuten aufweisen.In summary, it can therefore be stated that although a Be pull wavelength of 780 nm (e.g. a laser diode) with Cy7 ™, IRD 40 ™, IRD 41 ™ and IRD 800 ™ dyes are available that However, they do not meet all stability requirements and have low fluorescence quantum yields.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, neue Farbstoffe anzugeben, die die oben genannten Nachteile nicht aufweisen und die ins besondere stabil und in Wasser löslich sind, eine gute Fluo reszenzquantenausbeute haben, eine oder mehrere Reaktivgruppen aufweisen, und für die Anwendung als Fluoreszenzmarker im na hen Infrarot-Bereich um 780 nm geeignet sind.It is the object of the invention to provide new dyes, which do not have the disadvantages mentioned above and which ins are particularly stable and soluble in water, a good fluo have rescence quantum yield, one or more reactive groups have, and for use as a fluorescent marker in the na The infrared range around 780 nm are suitable.

Diese Aufgabe wird durch Cyanin-Farbstoffe mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Verwendungen erfindungsgemäßer Cyanin-Farbstoffe ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.This task is done by cyanine dyes with the characteristics solved according to claim 1. Advantageous embodiments and Uses of the cyanine dyes according to the invention arise from the dependent claims.

Die Grundidee der Erfindung besteht darin, durch die Einfüh rung neuer Substituenten, die Nachteile, insbesondere die ge ringe Stabilität und Fluoreszenzquantenausbeute, der herkömm lichen Farbstoffe zu beseitigen.The basic idea of the invention is through the introduction tion of new substituents, the disadvantages, especially the ge ring stability and fluorescence quantum yield, the conventional Eliminate colorants.

Die Absorption der Cyaninfarbstoffe wird wesentlich bestimmt durch die Anzahl der Methingruppen, die die Polymethinkette bilden. Mit zunehmender Anzahl der Methingruppen wird die Ab sorption bathochrom verschoben. Heptamethinfarbstoffe (7 Me thingruppen bilden die Polymethinkette) haben ein Absorptions maximum um 740 nm. Dieses Absorptionsmaximum reicht nicht aus, damit solche Farbstoffe durch Laserdioden mit einer Emissions wellenlänge um 780 nm zur Fluoreszenz angeregt werden können. Werden zur Farbstoffsynthese anstelle des Glutacondialdehyds die beiden cyclischen Dialdehyde 6 und 7 verwendet, erhält man Farbstoffe mit einem Absorptionsmaximum zwischen 780 und 800 nm, die die Anforderung an die Absorption bereits erfüllen.The absorption of the cyanine dyes is essentially determined by the number of methine groups making up the polymethine chain form. As the number of methine groups increases, the Ab sorption shifted bathochromically. Heptamethine dyes (7 Me thingruppen form the polymethine chain) have an absorption maximum around 740 nm. This absorption maximum is not sufficient thus such dyes by laser diodes with an emission wavelength around 780 nm can be excited to fluorescence. Used for dye synthesis instead of glutacondialdehyde the two cyclic dialdehydes 6 and 7 used are obtained Dyes with an absorption maximum between 780 and 800 nm that already meet the absorption requirement.

Allerdings tauscht das Chloratom in diesen Farbstoffen relativ leicht gegen Nucleophile aus, so daß diese Farbstoffe nicht als Fluoreszenzmarker verwendet werden können. Wie bereits oben ausgeführt, löst man dieses Problem auch nicht durch den Austausch des Chloratoms gegen Phenol oder Thiophenol.However, the chlorine atom in these dyes changes relatively easily against nucleophiles, so these dyes do not can be used as fluorescent markers. As already mentioned above, this problem is also not solved by the Exchange of the chlorine atom for phenol or thiophenol.

Erfindungsgemäß wird die o. a. Aufgabe durch den Austausch des Chlors gegen Barbitursäuren bzw. Thiobarbitursäuren gelöst. Solche Farbstoffe sind wesentlich beständiger gegen nucleophi len Austausch. Ferner zeigen sie vorteilhafterweise die ge wünschte Absorption mit Maxima oberhalb 760 nm, insbesondere zwischen 780 und 820 nm und eine effektive Fluoreszenz.According to the invention the o. A. Task by exchanging the Chlorine dissolved against barbituric acids or thiobarbituric acids. Such dyes are much more resistant to nucleophi len exchange. They also advantageously show the ge desired absorption with maxima above 760 nm, in particular between 780 and 820 nm and an effective fluorescence.

Durch die Substitution, die zu einer Innersalzbildung führt, wird die Fluoreszenzquantenausbeute der Farbstoffe gegenüber den entsprechenden Farbstoffen mit dem Chloratom in Wasser et wa verdoppelt. Die Wasserlöslichkeit kann beliebig durch Sub stitution mit Sulfonsäuregruppen erhöht werden. Through the substitution, which leads to an internal salt formation, is compared to the fluorescence quantum yield of the dyes the corresponding dyes with the chlorine atom in water et wa doubled. The water solubility can be arbitrarily determined by sub stitution can be increased with sulfonic acid groups.

In jedem Farbstoff können zwei oder eine reaktive Gruppe sein, vorzugsweise die N-Hydroxysuccinimid-Ester der Alkylcarboxy gruppe oder das Bis-(N,N-di-isopropyl)-β-cyanoethyl phosphoramidit der Alkylhydroxygruppe, die zur kovalenten Bin dung an die zu markierende Komponente führen.In each dye there can be two or one reactive group preferably the N-hydroxysuccinimide esters of alkyl carboxy group or the bis (N, N-di-isopropyl) -β-cyanoethyl phosphoramidite of the alkyl hydroxy group, which leads to the covalent bond lead to the component to be marked.

Embodiments example 1

Zum Vergleich der Hydrolyseempfindlichkeit erfindungsgemäßer Farbstoffe (c) mit herkömmlichen Farbstoffen (a, b) wurden 0,01%ige gepufferte wäßrige Lösungen mit pH = 10,5 der Mo dellfarbstoffe a-c hergestellt und bei 23°C in einem abge dunkelten Gefäß aufbewahrt. In Abhängigkeit von der Lagerzeit wurde die Extinktion gemessen. Vom Logarithmus der normali sierten Extinktion [ln (E/E0)] und der Lagerzeit wurde eine Korrelation durchgeführt und daraus die Halbwertszeit des Farbstoffes t_1/2 berechnet (Tab. 1). Die Zeit t_1/2 dient als Maß für die Hydrolyseempfindlichkeit des Farbstoffes.
To compare the sensitivity to hydrolysis of dyes (c) according to the invention with conventional dyes (a, b) 0.01% buffered aqueous solutions with pH = 10.5 of the Mo dell dyes ac were prepared and stored at 23 ° C in a darkened vessel. The extinction was measured as a function of the storage time. A correlation was carried out from the logarithm of the normalized extinction [In (E / E0)] and the storage time, and from this the half-life of the dye t _{1/2 was} calculated (Tab. 1). The time t _1/2 serves as a measure of the sensitivity of the dye to hydrolysis.

Tab. 1 Halbwertzeiten der Hydrolyse der Farbstoffe a-c in gepufferter wäßriger Lösung mit pH = 10,5
Tab. 1 Half-lives of the hydrolysis of the dyes ac in buffered aqueous solution with pH = 10.5

Farbstoffdye t_1/2 [h]t _1/2 [h] aa 22 bb 1313th cc 5656

Das in Tab. 1 zusammengestellte Ergebnis zeigt die hervorra gende Hydrolysebeständigkeit und damit Stabilität des erfin dungsgemäßen Farbstoffs.The result compiled in Tab. 1 shows the excellent low hydrolysis resistance and thus stability of the inven the dye according to the invention.

Beispiel 2 Example 2

5-[2,5-Bis-[2-(1-carboxypentyl-3,3-dimethyl-5-sulfo-1,3- dihydro-indol-2-yliden)-ethyliden]-cyclopentyliden]-1,3- dimethyl-pyrimidin-2,4,6-trion, Dinatriumsalz 5- [2,5-bis- [2- (1-carboxypentyl-3,3-dimethyl-5-sulfo-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) -ethylidene] -cyclopentylidene] -1,3- dimethyl-pyrimidine-2,4,6-trione, disodium salt

A) sodium salt of 3- (5-carboxypentyl) -1,1,2-trimethyl-5- sulfoindolium bromide

2,61 g Natriumsalz des 1,1,2-Trimethyl-5-sulfoindolenin und 2,1 g 6-Bromhexansäure werden in Substanz 2 h bei einer Badtemperatur von 110°C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Nach beendeter Reaktion wird der ölige Rückstand mehrmals mit Aceton versetzt, bis ein pulvriger Feststoff zurückbleibt.2.61 g of the sodium salt of 1,1,2-trimethyl-5-sulfoindolenine and 2.1 g of 6-bromohexanoic acid are in substance for 2 h at a Brought to reaction bath temperature of 110 ° C with stirring. After the reaction has ended, the oily residue is several times with Acetone is added until a powdery solid remains.

B) 1-carboxypentyl-2- [2- [2-chloro-3 - [(1-carboxypentyl-1,3- dihydro-3,3-dimethyl-5-sulfo-2H-indol-2-ylidene) ethylidene] - 1-cyclopenten-1-yl] ethenyl] -3,3-dimethyl-5-sulfo-3H- indolium hydroxide, inner salt, sodium salt

2,28 g Quartärsalz aus A) und 0,47 g 2-Chlor-3-dimethylamino methylencyclopent-1-encarbaldehyd werden in 15 ml Ethanol in Gegenwart von je 1,5 ml Acetanhydrid und Triethylamin 20 Minu ten am Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird mit Ethylacetat gefällt. (λ = 809 nm)2.28 g of the quaternary salt from A) and 0.47 g of 2-chloro-3-dimethylamino methylenecyclopent-1-ene carbaldehyde are dissolved in 15 ml of ethanol in Presence of 1.5 ml each of acetic anhydride and triethylamine for 20 minutes th refluxed. After cooling to room temperature precipitated with ethyl acetate. (λ = 809 nm)

C) 5- [2,5-bis- [2- (1-carboxypentyl-3,3-dimethyl-5-sulfo-1,3- dihydro-indol-2-ylidene) ethylidene] cyclopentylidene] -1,3- dimethyl-pyrimidine-2,4,6-trione, disodium salt

2,13 g des Farbstoffs aus B) werden in 10 ml DMF gelöst, dazu gibt man schnell eine Suspension aus 0,04 g Natriumhydrid und 1,3-Dimethylbarbitursäure in DMF. Nach 10 minütiger Reaktions zeit wird filtriert und der Farbstoff durch Etherzusatz zur Fällung gebracht. (λ = 789 nm)2.13 g of the dye from B) are dissolved in 10 ml of DMF, in addition are quickly a suspension of 0.04 g of sodium hydride and 1,3-dimethylbarbituric acid in DMF. After 10 minutes of reaction time is filtered and the dye by adding ether Brought precipitation. (λ = 789 nm)

Beispiel 3 Example 3

5-[2-[2-(3-(6-Hydroxyhexyl)-1,1-dimethyl-1,3-dihydro benzo[e]indol-2-yliden)-ethyliden]-6-[2-(3,3-dimethyl-1-(4- sulfobutyl)-1,3-dihydro-indol-2-yliden)-ethyliden]- cyclohexyliden]-1,3-dimethyl-pyrimidin-2,4,6-trion, Natrium salz 5- [2- [2- (3- (6-Hydroxyhexyl) -1,1-dimethyl-1,3-dihydrobenzo [e] indol-2-ylidene) ethylidene] -6- [2- (3, 3-dimethyl-1- (4-sulfobutyl) -1,3-dihydro-indol-2-ylidene) -ethylidene] - cyclohexylidene] -1,3-dimethyl-pyrimidine-2,4,6-trione, sodium salt

A) 2- [2- [2-chloro-3- [2- (1,3-dihydro-3- (6-hydroxyhexyl) -1,1- dimethyl-2H-benzo [e] -indol-2-ylidene) -ethylidene] -1- cyclohexen-1-yl] ethenyl] -3, 3-dimethyl-1- (4-sulfobutyl) -3H- indolium hydroxide, inner salt

4,37 g 1,1,2-Trimethyl-3-(6-hydroxyhexyl)-1H- benzo[e]indoliumjodid und 1,72 g Chlor-3-hydroxymethylen cyclohex-1-encarbaldehyd werden in 150 ml eines Gemisches aus 1-Butanol und Benzen (7 : 3) am Wasserabscheider erhitzt, bis kein Wasser mehr übergeht (ca. 4 h). Nach Abkühlen auf Raum temperatur wird von unlöslichen Rückständen filtriert. Danach gibt man 2,95 g 2,3,3-Trimethyl-1-(4-sulfobutyl)-3H-indolium- Innersalz zu und erhitzt weitere 20 h am Rückfluß. Nach been deter Reaktion wird eingeengt und der Rückstand über Kieselgel säulenchromatographisch gereinigt (λ = 803 nm).4.37 g 1,1,2-trimethyl-3- (6-hydroxyhexyl) -1H- benzo [e] indolium iodide and 1.72 g chloro-3-hydroxymethylene cyclohex-1-ene carbaldehyde are made in 150 ml of a mixture 1-butanol and benzene (7: 3) heated on a water separator until no more water passes over (approx. 4 h). After cooling to room temperature is filtered from insoluble residues. Thereafter are given 2.95 g of 2,3,3-trimethyl-1- (4-sulfobutyl) -3H-indolium- Internal salt is added and the mixture is refluxed for a further 20 h. After been Deter reaction is concentrated and the residue over silica gel Purified by column chromatography (λ = 803 nm).

B) 5- (2- [2- (3,3-dimethyl-1- (4-sulfobutyl) -1,3-dihydro-indole-2- ylidene) -ethylidene] -6- [2- [1- (6-hydroxyhexyl) -3,3-dimethyl octahydro-indol-2-ylidene] -ethylidene] -cyclohexylidene) -1,3- dimethyl-pyrimidine-2,4,6-trione

1,85 g des Farbstoffes aus A) werden in 15 ml DMF gelöst. Dazu gibt man eine Suspension aus 0,3 g 1,3-Dimethylbarbitursäure und 0,045 g Natriumhydrid in DMF. Es wird 8 Stunden bei Raum temperatur unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Nach beende ter Reaktion wird der Farbstoff durch Zugabe von Diethylether ausgefällt (λ = 779 nm).1.85 g of the dye from A) are dissolved in 15 ml of DMF. In addition a suspension of 0.3 g of 1,3-dimethylbarbituric acid is added and 0.045 g sodium hydride in DMF. It will be 8 hours at room temperature stirred with exclusion of moisture. After finish The reaction is the dye by adding diethyl ether precipitated (λ = 779 nm).

Example 4

Der folgende Farbstoff wurde nach den in Beispiel 2 angeführ ten Methoden unter Einsatz der entsprechenden Zwischenprodukte erhalten.
The following dye was obtained by the methods listed in Example 2 using the appropriate intermediates.

Example 5

Claims

1. Cyanine dye, characterized by a barbituric acid or thiobarbituric acid substituent and reactive groups which are designed to bind to carrier substances.

2. cyanine dye according to claim 1, characterized by the general structure
with:
n = 2.3;
R ¹ , R ² = identically or differently hydrogen or alkyl having 1 to 8 carbon atoms
R ³ , R ⁴ = hydrogen, HO ₂ S, NaO ₃ S, KO ₃ S or the four CH groups required to complete a benzene ring;
R ⁵ , R ⁶ = hydrogen, HO ₃ S, NaO ₃ S, KO ₃ S or the four CH groups necessary to complete a benzene ring;
R ⁷ , R ⁸ = identical or different alkyl with 1 to 4 carbon atoms, sulfoalkyl with 3 or 4 carbon atoms, (CH ₂ ) _m CH ₂ OH, (CH ₂ ) _m COOH with m = 3-6, the N-hydroxysuccinimide -Ester of the carboxy group and the bis (N, N-di-isopropyl) -β-cyanoethyl-phosphoramidite of the Hy droxygruppe;
X = O, S.

3. cyanine dye according to claim 1 or 2, characterized in that
R ⁷ , R ⁸ = identical or different, the N-hydroxysuccinimide ester of the carboxy group (CH ₂ ) _m COOH with m = 3-6 and the bis (N, N-di-isopropyl) -β-cyanoethyl phosphoramidite the Hydroxy group (CH) _m CH ₂ OH with m = 3-6
mean.

4. Use of a dye according to claim 1 or 2 as Fluorescent markers in the near infrared range.