DE19860801A1

DE19860801A1 - Recombinant growth factor with the biological activity of a G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)

Info

Publication number: DE19860801A1
Application number: DE1998160801
Authority: DE
Inventors: Johannes Fischer; Peter Wernet; Gerd Gellissen; Ulrike Weydemann; Volker Jenzelewski; Michael Piontek; Alexander W Strasser
Original assignee: Rhein Biotech GmbH
Current assignee: Dynavax GmbH
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2000-07-06
Also published as: WO2000040727A3; AU2103800A; AR016050A1; WO2000040727A2

Abstract

The invention relates to growth factors with granulocyte colony stimulating activity and to nucleic acid molecules which comprise a sequence coding for said growth factor. The invention also relates to a method for producing the inventive growth factor, to pharmaceutical compositions which comprise the inventive proteins or nucleic acids and to the therapeutical utilisation thereof. The growth factors have cytokine effects of different degrees and can stimulate the maturation of blood cells. The inventive molecules are particularly useful for treating diseases and wounds which are related to a blood cell deficiency such as cancer, leukemia, severe burns and opportunistic infections and after bone marrow transplantations.

Description

Die Erfindung betrifft einen Wachstumsfaktor mit Granulozyten Kolonie-stimulierender Aktivität sowie ein Nukleinsäuremolekül, das eine für diesen Wachstumsfaktor kodieren de Sequenz umfaßt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors, pharmazeutische Zusammen setzungen, welche die erfindungsgemäßen Proteine oder Nukleinsäuren umfassen, und ihre therapeutische Verwendung.The invention relates to a growth factor with granulocyte-stimulating colony Activity as well as a nucleic acid molecule that encode one for this growth factor de sequence includes. Furthermore, the present invention relates to a method for Preparation of the growth factor according to the invention, pharmaceutical composition settlements comprising the proteins or nucleic acids according to the invention, and their therapeutic use.

Cytokine sind an der Reifung von Blutzellen beteiligt, indem sie die Reifung von Stamm zellen zu voll differenzierten Blutzellen stimulieren. Einer dieser Faktoren, der G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) wird in aktivierten Monozyten, Makrophagen und anderen Zellinien synthetisiert. Das Protein tritt in zwei verschiedenen natürlichen Formen mit einer Größe von 177 und 174 Aminosäuren auf (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986). Beide Proteine sind das Resultat der Expression eines einzigen Gens. Das Gen enthält fünf Exons und vier Intronsequenzen. Am 5'-Ende des zweiten Introns be finden sich zwei 9 Bp voneinander entfernte Spleiß-Donorsequenzen, die ein alternatives Spleißen ermöglichen. Die beiden natürlichen Proteinformen werden durch Translation der durch dieses alternative Spleißen des Primärtranskriptes entstandenen mRNAs er zeugt. Die längere Form unterscheidet sich von der kürzeren durch Einschub von 3 Ami nosäuren (Val-Ser-Glu) zwischen den Positionen 35 und 36. Beide Formen entstehen aus einer um 30 Aminosäuren längeren Vorstufe. Die relative Masse der kürzeren Form wurde mit 18,671 Da bestimmt (Nagata et al., 1986). Sie wird als Hauptsyntheseprodukt beschrieben, das eine zwanzigfach höhere Aktivität in bestimmten biologischen Tests aufweist als das längere Nebenprodukt (Nagata, 1989).Cytokines are involved in the maturation of blood cells by the maturation of stem stimulate cells to fully differentiated blood cells. One of these factors, the G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) is activated in monocytes, macrophages and other cell lines are synthesized. The protein occurs in two different natural ways Forms with a size of 177 and 174 amino acids (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986). Both proteins are the result of expression of a single gene. The Gen contains five exons and four intron sequences. At the 5 'end of the second intron be there are two splice donor sequences 9 bp apart, an alternative Allow splicing. The two natural forms of protein are translated the mRNAs resulting from this alternative splicing of the primary transcript testifies. The longer form differs from the shorter one by inserting 3 Ami noacids (Val-Ser-Glu) between positions 35 and 36. Both forms arise from a precursor that is 30 amino acids longer. The relative mass of the shorter form was found to be 18.671 Da (Nagata et al., 1986). It is considered the main synthetic product described a 20-fold higher activity in certain biological tests exhibits than the longer by-product (Nagata, 1989).

Das natürliche Protein enthält zwei Disulfidbrücken zwischen den Aminosäurepaaren Cys36 und Cys42 sowie Cys64 und Cys74. Der natürliche G-CSF enthält eine O-Glyko sylierung an Thr133. Die Glykosylierung hat keinen Einfluß auf die Aktivität und die Sta bilität des Proteins, wie Untersuchungen mit dem in Bakterien hergestellten Produkt und ein Vergleich mit natürlichen Isolaten belegen. Eine Beeinflussung der biologischen Ak tivität durch Veränderung N-terminaler Sequenzen des Cytokins ist nicht bekannt. Nach Kuga et al. behalten N-terminal um bis zu 11 Aminosäurereste verkürzte G-CSF Molekü le die volle biologische Aktivität, wohingegen z. B. C-terminale Verkürzungen der Grund sequenz die Aktivität herabsetzen bzw. variieren (Kuga et al., 1989).The natural protein contains two disulfide bridges between the amino acid pairs Cys36 and Cys42 as well as Cys64 and Cys74. The natural G-CSF contains an O-Glyko sylation to Thr133. Glycosylation has no effect on activity and sta stability of the protein, such as tests with the product produced in bacteria and a comparison with natural isolates shows. An influence on the biological Ak activity by changing N-terminal sequences of the cytokine is not known. To Kuga et al. retain G-CSF molecule truncated by up to 11 amino acid residues at the N-terminal le the full biological activity, whereas z. B. C-terminal shortening the reason sequence reduce or vary the activity (Kuga et al., 1989).

G-CSF ist in der Lage, die Population neutrophiler Granulozyten in kurzer Zeit in vivo und ex vivo substantiell zu vergrößern. Das Protein ist daher eine Substanz mit vielfälti gen therapeutischen Applikationsmöglichkeiten. So kann G-CSF in der Krebsbehand lung eingesetzt werden, wenn die Zellen des Immunsystems z. B. durch eine Chemothe rapie zerstört wurden. Darüber hinaus kann G-CSF in der Knochenmarktransplantation, bei schwerwiegenden Verbrennungen, bei Leukämie oder bei opportunistischen Infektio nen aufgrund von Immundefizienzen eingesetzt werden (US-Patent 5,399,345). Zudem wird G-CSF zur Mobilisierung von Blutstammzellen aus dem Knochenmark oder einem anderen Stammzellreservoir in das periphere Blut eingesetzt. Mit G-CSF können Zellen der myeloischen Zellreihe zum klinischen Einsatz ex vivo expandiert werden.G-CSF is able to rapidly isolate the neutrophil granulocyte population in vivo and to enlarge substantially ex vivo. The protein is therefore a substance with diversity therapeutic application options. This is how G-CSF can be used in cancer treatment lung are used when the cells of the immune system z. B. by a chemothe therapy were destroyed. In addition, G-CSF can be used in bone marrow transplantation, for severe burns, leukemia or opportunistic infection due to immune deficiencies (US Patent 5,399,345). In addition G-CSF is used to mobilize blood stem cells from the bone marrow or a another stem cell reservoir inserted into the peripheral blood. With G-CSF, cells can the myeloid cell series can be expanded ex vivo for clinical use.

Aufgrund der Vielzahl an verschiedenen Anwendungsgebieten für den Wachstumsfaktor G-CSF besteht daher ein Bedürfnis nach Varianten dieses Wachstumsfaktors, die sich durch eine höhere oder geringere biologische Aktivität als der natürliche G-CSF Wachs tumsfaktor auszeichnen, so daß je nach angestrebter Verwendung eine Variante des G- CSF Wachstumsfaktors mit geeigneter Aktivität eingesetzt werden kann. Der Terminus "Variante" bzw. "G-CSF-Variante" soll dabei Aminosäure- und Nukleinsäuremoleküle mit einer gegenüber der jeweiligen ursprünglichen Sequenz, z. B. der Humansequenz, ver änderten Aminosäure- bzw. Nukleinsäureabfolge beschreiben.Because of the multitude of different areas of application for the growth factor G-CSF therefore has a need for variants of this growth factor that are due to a higher or lower biological activity than the natural G-CSF wax feature factor, so that depending on the intended use, a variant of the G- CSF growth factor with appropriate activity can be used. The term "Variant" or "G-CSF variant" is intended to include amino acid and nucleic acid molecules one compared to the respective original sequence, e.g. B. the human sequence, ver describe changed amino acid or nucleic acid sequence.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, rekombinante Varianten eines Pro teins mit der Aktivität des G-CSF Wachstumsfaktors zur Verfügung zu stellen, wobei jede dieser Varianten eine höhere oder geringere biologische Aktivität aufweisen soll als der natürliche G-CSF Wachstumsfaktor.It is therefore an object of the present invention to provide recombinant variants of a pro to provide one with the activity of the G-CSF growth factor, each of these variants should have a higher or lower biological activity than that natural G-CSF growth factor.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch einen rekombinanten Wachstumsfaktor ge löst, der ein Säuger-G-CSF oder ein dazu homologes Protein mit der biologischen Aktivi tät eines G-CSFs ist, und dem die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren des reifen G-CSF Proteins fehlen. According to the invention, this object is achieved by a recombinant growth factor which triggers a mammalian G-CSF or a homologous protein with the biological activi activity of a G-CSF and the first two N-terminal amino acids of the mature one G-CSF proteins are missing.

Unter "homologen Proteinen" sind solche Proteine zu verstehen, die eine Homologie von mindestens 60% zu einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäu resequenzen besitzen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Homologie 70 oder 80%, besonders bevorzugt 90 oder 95%. Am stärksten bevorzugt ist eine Homo logie von 98 oder 99%. Die Homologie wird dabei berechnet wie in Pearson und Lip man, 1988, dargestellt."Homologous proteins" are understood to mean those proteins which have a homology of at least 60% to one of the amino acids shown in SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4 possess sequences. In preferred embodiments, the homology is 70 or 80%, particularly preferably 90 or 95%. Homo is most preferred logic of 98 or 99%. The homology is calculated as in Pearson and Lip one, 1988.

Der in der vorliegenden Erfindung beschriebene Wachstumsfaktor weist einen gegen über dem natürlichen G-CSF-Protein um zwei Aminosäuren verkürzten N-Terminus auf und besitzt vollkommen unerwartet eine deutlich höhere biologische Aktivität als der na türliche G-CSF-Wachstumsfaktor. Der Begriff "biologische Aktivität" des G-CSF Wachs tumsfaktors bezieht sich dabei auf die Fähigkeit, die Proliferation von Blutstammzellen zu stimulieren (Kuga et al., 1989). Diese können durch die Stimulation mit G-CSF und ande ren Faktoren zu Granulozyten expandiert und differenziert werden. Diese Differenzierung korreliert mit der Synthese des an der Zelloberfläche von myeloischen Vorläuferzellen lokalisierten CD34-Proteins. Daher eignet sich der Nachweis des CD34 Proteins als Maßstab für die Proliferationsfähigkeit der stimulierten Zellen.The growth factor described in the present invention contradicts one N-terminus shortened by two amino acids over the natural G-CSF protein and completely unexpectedly has a significantly higher biological activity than the na natural G-CSF growth factor. The term "biological activity" of the G-CSF wax Factor factor refers to the ability to proliferate blood stem cells stimulate (Kuga et al., 1989). These can be stimulated with G-CSF and others factors to granulocytes are expanded and differentiated. This differentiation correlates with the synthesis of on the cell surface of myeloid progenitor cells localized CD34 protein. The detection of the CD34 protein is therefore suitable as Standard for the proliferation ability of the stimulated cells.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Wachstumsfaktor ein reifer humaner, um die ersten beiden N-terminalen Aminosäuren verkürzter Wachstums faktor.In a preferred embodiment, the growth factor according to the invention is a mature human growth shortened by the first two N-terminal amino acids factor.

Wie oben erwähnt, umfaßt der natürliche humane G-CSF Wachstumsfaktor zwei leicht unterschiedliche Aminosäuresequenzen. Dieser Unterschied ist für die erfindungsgemä ße, N-terminal verkürzte Ausführungsform ebenfalls beobachtet worden. Dabei hat die kürzere Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Wachstumsfaktors in ihrer reifen Form 172 Aminosäuren, die längere Form enthält eine Insertion von drei Aminosäuren zwischen den Positionen 33 und 34. Für die Numerierung wird dabei die Aminosäure +3 des reifen Proteins als neue Aminosäure +1 zugrundegelegt. Beide Moleküle, sowohl das 172 als auch das 175 Aminosäuren umfassende Molekül, weisen einen identischen N-Terminus mit der N-terminalen Sequenz Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser auf, im Gegensatz zum N-Terminus der natürlichen Sequenz, die Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser lautet. Die Aminosäuresequenz kann dabei im Vergleich zu den natürlichen Proteinen weiter verändert werden, z. B. ein N-terminales Methionin enthalten; erfindungsgemäß fehlen jedoch stets die beiden Aminosäuren Thr/Pro am N-Terminus.As mentioned above, the natural human G-CSF growth factor comprises two easily different amino acid sequences. This difference is for the invention ß, N-terminal shortened embodiment was also observed. The shorter amino acid sequence of the growth factor according to the invention in its mature Form 172 amino acids, the longer form contains an insertion of three amino acids between positions 33 and 34. The amino acid +3 of the mature protein as a new amino acid +1. Both molecules, both the 172 and 175 amino acid molecules have an identical one N-terminus with the N-terminal sequence Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser, in contrast to the N-terminus of the natural sequence, which is Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser. The amino acid sequence can continue compared to the natural proteins be changed, e.g. B. contain an N-terminal methionine; according to the invention are missing however, always the two amino acids Thr / Pro at the N-terminus.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße rekombi nante Wachstumsfaktor ein N-terminales Methionin. Abhängig vom ausgewählten Wirtsorganismus, in dem der Wachstumsfaktor exprimiert wird, können spezifische Pro teasen das N-terminale Methionin, welches durch Translation des Initiationskodons ent steht, bei allen oder einem Teil der exprimierten Moleküle abspalten. Durch Einführung eines weiteren für Methionin kodierenden Codons in 3'-Position vom Initiationscodon kann jedoch ein reifes Protein erhalten werden, das auch nach der Prozessierung des N- Terminus ein N-terminales Methionin enthält.In a further preferred embodiment, the recombi according to the invention contains nante growth factor an N-terminal methionine. Depending on the selected one Host organism in which the growth factor is expressed can specific Pro tease the N-terminal methionine, which ent by translation of the initiation codon stands, split off at all or a part of the expressed molecules. By introduction of a further codon coding for methionine in the 3'-position of the initiation codon However, a mature protein can be obtained that can also be processed after the N- Terminus contains an N-terminal methionine.

Weiterhin umfaßt der rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungs form die in SEQ ID NR:1 ("174 (-2 AS) Variante"), SEQ ID NR: 2 ("177 (-2 AS) Variante"), SEQ ID NR:3 ("Met-174 (-2 AS) Variante") oder SEQ ID NR:4 ("Met-177 (-2 AS) Varian te") dargestellte Aminosäuresequenz oder eine davon abgeleitete Sequenz. Die abgelei tete Sequenz unterscheidet sich durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäu reaustausch in einer oder mehreren Positionen von einer der in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 4 gezeigten Sequenzen. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sich die abgeleitete Sequenz in 1 bis 5 Aminosäureresten von einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR: 4 gezeigten Sequenzen durch eine der erwähnten Mutationen unterscheidet; überaus be vorzugt ist es, wenn sich eine abgeleitete Sequenz in lediglich einem Aminosäurerest von einer der vorstehenden Sequenzen unterscheidet. Zur Modulation der Aktivität wird das Protein bevorzugt am C-Terminus verkürzt.In a preferred embodiment, the recombinant growth factor further comprises form the SEQ ID NO: 1 ("174 (-2 AS) variant"), SEQ ID NO: 2 ("177 (-2 AS) variant"), SEQ ID NO: 3 ("Met-174 (-2 AS) variant") or SEQ ID NO: 4 ("Met-177 (-2 AS) variant te ") shown amino acid sequence or a sequence derived therefrom Sequence differs in deletion, insertion, addition and / or amino acid Real exchange in one or more positions from one of the SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 4 sequences shown. It is particularly preferred that the derived one Sequence in 1 to 5 amino acid residues from one of those in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 sequences shown by one of the mutations mentioned; extremely be it is preferred if a derived sequence is in only one amino acid residue differs from one of the above sequences. To modulate the activity the protein is preferably truncated at the C-terminus.

Die im folgenden verwendete Numerierung der Aminosäuren bezieht sich auf die in SEQ ID NR:1 dargestellte Sequenz und unterscheidet sich folglich um jeweils 2 Aminosäure positionen von der bekannten natürlichen Sequenz des humanen G-CSFs. Dabei ist jedoch grundsätzlich immer auch die um 3 Aminosäuren längere Spleiß-Variante (siehe SEQ ID Nr. 2) von SEQ ID Nr. 1 von der Erfindung mit umfaßt, ohne daß die Position des jeweiligen Aminosäurerestes oder der jeweiligen Region in der Sequenz für die Spleiß- Variante explizit noch einmal erwähnt wird. The numbering of the amino acids used in the following refers to that in SEQ ID NO: 1 sequence shown and therefore differs by 2 amino acids each positions from the known natural sequence of the human G-CSF. It is however, always the splice variant that is 3 amino acids longer (see SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 1 by the invention without the position of the respective amino acid residue or region in the sequence for the splice Variant is explicitly mentioned again.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen rekombinanten Wachstumsfaktors sind Wachstumsfaktoren, in denen ein oder mehrere der Histidinreste an den Positionen 41, 77, 154 und 168 durch eine andere natürliche Aminosäure, be vorzugt Glutamin (Gln), ersetzt sind. Des weiteren kann der erfindungsgemäße rekombi nante Wachstumsfaktor in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein oder mehrere Mutationen im Bereich der Aminosäuren 48 bis 54 tragen. Wie bereits in US-Patent 5,399,345 gezeigt, reduzieren Mutationen in diesen Aminosäu reresten die Aktivität des resultierenden Proteins. So führen die Kombinationen der ak tivitätssteigernden Mutationen unmittelbar am N-Terminus und der aktivitätsreduzieren den Mutationen in den oben angegebenen Positionen zu zahlreiche Varianten des G- CSF Wachstumsfaktors mit einer Vielzahl an unterschiedlichen biologischen Aktivitäten.Particularly preferred embodiments of the recombinant according to the invention Growth factors are growth factors in which one or more of the histidine residues at positions 41, 77, 154 and 168 by another natural amino acid, be preferably glutamine (Gln), are replaced. Furthermore, the recombi according to the invention nante growth factor in a further particularly preferred embodiment also carry one or more mutations in the range of amino acids 48 to 54. As already shown in U.S. Patent 5,399,345, mutations in this amino acid reduce rest the activity of the resulting protein. So the combinations of ak activity-increasing mutations directly at the N-terminus and reduce activity the mutations in the positions indicated above too many variants of the G- CSF growth factor with a variety of different biological activities.

Darüber hinaus ist der erfindungsgemäße rekombinante Wachstumsfaktor in einer bevorzugten Ausführungsform posttranslational modifiziert. Eine solche posttranslationa le Modifikation umfaßt besonders bevorzugt die Abspaltung eines N-terminalen Methio nins und/oder die Glykosylierung des Wachstumsfaktors und weitere mögliche andere Modifikationen.In addition, the recombinant growth factor according to the invention is in one preferred embodiment post-translationally modified. Such a posttranslationa The modification particularly preferably comprises the cleavage of an N-terminal methio nins and / or the glycosylation of the growth factor and other possible others Modifications.

Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für einen wie oben beschriebenen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF kodieren. Dabei umfaßt ein solches Nukleinsäuremolekül Nukleinsäuresequenzen, die für ein Protein mit einer der in SEQ ID NR:1 bis SEQ ID NR:4 dargestellten Aminosäuresequenzen kodieren und schließt insbesondere eine der in SEQ ID NR: 5 bis SEQ ID NR: 8 dargestellten Nuklein säuresequenzen ein, sowie Nukleinsäuresequenzen, die sich durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleinsäureaustausch von einer dieser Nukleinsäuresequenzen ableiten und für ein Protein mit der biologi schen Aktivität eines G-CSF kodieren. Des weiteren sind ebenfalls Nukleinsäuresequen zen umfaßt, die mit einer zu den oben aufgezählten Sequenzen komplementären Se quenz hybridisieren können. Diese Varianten der Nukleinsäuremoleküle, die für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodieren, sollen unter Bedingungen moderater Stringenz, bevorzugt aber unter stringenten Bedingungen (siehe Maniatis et al., 1989) mit einer zu den in SEQ ID NR:5 bis SEQ ID NR:8 dargestellten Sequenzen komplemen tären Sequenz hybridisieren können. Unter moderater Stringenz ist z. B. eine Hybridisie rung bei 42°C in 50% Formamid und anschließenden wenig stringenten Waschschritten zu verstehen, wobei die Waschschritte bei einer Temperatur von weniger als 12°C bis 20°C unter der errechneten T_m des zu untersuchenden Hybridmoleküls durchgeführt werden. Stringente Bedingungen bedeuten eine Hybridisierung in 5 × SSC bei 65°C. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin jede zu den vorgenannten Sequenzen komple mentäre Sequenz, deren Gegenstrang für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSF's kodiert.The present invention further encompasses nucleic acid molecules which code for a recombinant growth factor G-CSF as described above. Such a nucleic acid molecule comprises nucleic acid sequences which code for a protein with one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 and in particular includes one of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8 , and nucleic acid sequences which are derived from one of these nucleic acid sequences by degeneration of the genetic code, by deletion, insertion, addition and / or nucleic acid exchange and which code for a protein with the biological activity of a G-CSF. Furthermore, nucleic acid sequences are also included which can hybridize to a sequence which is complementary to the sequences listed above. These variants of the nucleic acid molecules which code for a growth factor according to the invention are to be used under conditions of moderate stringency, but preferably under stringent conditions (see Maniatis et al., 1989) with one of the sequences shown in SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8 can hybridize complementary sequence. With moderate stringency is z. B. to understand a hybridization at 42 ° C in 50% formamide and subsequent less stringent washing steps, the washing steps being carried out at a temperature of less than 12 ° C to 20 ° C below the calculated T _{m of} the hybrid molecule to be examined. Stringent conditions mean hybridization in 5 × SSC at 65 ° C. The invention furthermore relates to any sequence complementary to the abovementioned sequences, the opposite strand of which codes for a protein with the biological activity of a G-CSF.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül weiterhin für eine funktionelle Leader-Sequenz. Sekretorische Proteine werden aus einer Vorstufe prozessiert, die eine N-terminale Leader-Sequenz für den Import eines Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat enthält. Derar tige Leader-Sequenzen können aus Prä-Sequenzen oder Prä-Pro-Sequenzen bestehen.In a particularly preferred embodiment, the above-described code Nucleic acid molecule continues for a functional leader sequence. Secretarial Proteins are processed from a precursor that has an N-terminal leader sequence for the import of a translation product into the secretary apparatus. Derar Current leader sequences can consist of pre-sequences or pre-pro sequences.

Prä-Sequenzen dirigieren ein Translationsprodukt in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) und werden beim Eintritt in das ER proteolytisch entfernt. Bei Prä-Pro- Sequenzen erfolgt eine zweistufige Reifung des Proteins. Nach dem Eintritt in das ER wird wie im ersten Typus die Prä-Sequenz entfernt. Das verbleibende Pro-Protein erfährt im Golgi-Apparat der Zelle eine zusätzliche proteolytische Reifung, bei der die noch vor handene Pro-Sequenz mit Hilfe einer dibasischen Endopeptidase abgespalten wird. Mit Hilfe von Leader-Sequenzen, die diesen beiden Grundtypen entsprechen, können he terologe Proteine aus Wirtszellen sezerniert werden.Pre-sequences direct a translation product into the lumen of the endoplasmic Reticulum (ER) and are removed proteolytically when entering the ER. With pre-pro Sequences are followed by a two-stage maturation of the protein. After entering the ER the pre-sequence is removed as in the first type. The remaining pro protein experiences an additional proteolytic ripening in the cell's Golgi apparatus, during which the existing pro sequence is cleaved using a dibasic endopeptidase. With With the help of leader sequences that correspond to these two basic types, he terologic proteins are secreted from host cells.

Ein besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung enthält als funktionel le Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des hyperglykämischen Crustaceen-Hormons (CHH) aus Carcinus maenas oder ein Derivat derselben. So konnte von Weydemann und Kollegen bereits gezeigt werden, daß die Fusion dieser Prä-Pro-Sequenz mit der für Hirudin kodierenden Sequenz zu einer effizienten Sezemierung des reifen Hirudinpro teins mir korrekt prozessiertem N-Terminus führt (Weydemann et al., 1995). Die Fusion der für die CHH-Leader-Sequenz kodierenden DNA mit einer der in den SEQ ID NR: 5 bsi 8 dargestellten Nukleinsäuresequenzen wird daher ebenfalls zur korrekten Abspal tung der CHH-Prä-Pro-Sequenz führen.A particularly preferred nucleic acid molecule of this invention contains as functional le Leader sequence the leader sequence of the hyperglycemic crustacean hormone (CHH) from Carcinus maenas or a derivative thereof. So von Weydemann and colleagues have already shown that the fusion of this pre-pro sequence with that for Hirudin coding sequence for an efficient secretion of the mature Hirudinpro leads me to a correctly processed N-terminus (Weydemann et al., 1995). The merger the DNA coding for the CHH leader sequence with one of those in SEQ ID NO: 5 bsi 8 shown nucleic acid sequences is therefore also the correct Abspal lead of the CHH pre-pro sequence.

In einer überaus bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Nuklein säuremolekül als Leader-Sequenz die Leader-Sequenz des Mating Factors α (MFα1) aus Hefe. Eine zur Expression in Hefewirtszellen etablierte Konstruktion kodiert für ein Fusionsprotein, welches die Präpro-Sequenz des Pheromons MFα1 enthält (Brake et al., 1984). Aminosäuren in der Umgebung der neu entstandenen Fusionsstelle können da bei die Position der Prozessierungstelle und damit die N-terminale Sequenz des durch Proteolyse entstandenen reifen Proteins beeinflussen. Von Bedeutung ist hierbei insbe sondere das Vorhandensein von Pro-Resten (Zurek et al., 1996).In a very preferred embodiment, the nucleic acid according to the invention contains acid molecule as leader sequence the leader sequence of the mating factor α (MFα1) from yeast. A construction established for expression in yeast host cells codes for a Fusion protein which contains the prepro sequence of the pheromone MFα1 (Brake et al., 1984). Amino acids in the vicinity of the newly created fusion site can be there at the position of the processing point and thus the N-terminal sequence of the through Proteolysis affects mature protein. Of particular importance here especially the presence of pro residues (Zurek et al., 1996).

Ein weiteres besonders bevorzugtes Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß es die natürliche MFα1 Sequenz in funktioneller Verbindung mit der für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierenden natürlichen Sequenz, einschließlich der Co dons für die beiden N-terminalen Aminosäuren von G-CSF, umfaßt. Dabei wird durch Verwendung der natürlichen MFα1-Sequenz ein primäres Translationsprodukt erzeugt, das aufgrund seiner Aminosäuresequenz im Bereich der Fusionsstelle zwischen MFα-1 Leader-Sequenz und der für den rekombinanten Wachstumsfaktor kodierenden Se quenz von einer Protease zwischen Aminosäure +2 und +3 der nicht verkürzten Ami nosäuresequenz des Wachstumsfaktor gespalten wird. Die Prozessierung des Translati onsproduktes führt entsprechend zu einer Verkürzung des N-Terminus um zwei Ami nosäuren. Der Vorteil der Nutzung eines geeigneten Sekretions-Leaders besteht damit neben der Einschleusung des Translationsproduktes in den sekretorischen Apparat in der Generierung eines definierten N-Terminus in dem ausgewählten Organismus.Another particularly preferred nucleic acid molecule of this invention stands out characterized in that it is the natural MFα1 sequence in functional connection with that for the natural sequence encoding the growth factor G-CSF, including the Co dons for the two N-terminal amino acids of G-CSF. This is done by Generates a primary translation product using the natural MFα1 sequence, that due to its amino acid sequence in the area of the fusion site between MFα-1 Leader sequence and the Se coding for the recombinant growth factor sequence of a protease between amino acid +2 and +3 of the unabridged Ami nos acid sequence of the growth factor is cleaved. The processing of the Translati product leads to a shortening of the N-terminus by two Ami nonacids. The advantage of using a suitable secretion leader is thus in addition to introducing the translation product into the secretory apparatus in the generation of a defined N-terminus in the selected organism.

Ein solches bevorzugtes Nukleinsäuremolekül kodiert z.B für die hier in NR:1 oder SEQ ID NR:2 dargestellte Aminosäuresequenz. In weiteren Ausführungsformen umfaßt sie die in SEQ ID NR:9 ("natürlicher Leader + 174 × 3 Variante (incl. 6 Nu)") oder SEQ ID NR:10 ("natürlicher Leader + 177 × 3 Variante (incl. 6 Nu)") dargestellte Aminosäuresequenz oder eine sich davon durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Aminosäureaustausch ableitende Sequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität eines G-CSFs kodiert. Weiterhin kann ein solches Nukleinsäure molekül eine Sequenz enthalten, die mit einer der zu den oben aufgeführten Nukleinsäu resequenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann bzw. zu einer der oben ge nannten Sequenzen komplementär ist.Such a preferred nucleic acid molecule encodes, for example, the one here in NR: 1 or SEQ ID NO: 2 amino acid sequence shown. In other embodiments, it includes in SEQ ID NO: 9 ("natural leader + 174 × 3 variant (incl. 6 nu)") or SEQ ID NO: 10 ("natural leader + 177 × 3 variant (incl. 6 Nu)") shown amino acid sequence or one of them by degeneration of the genetic code, by deletion, insertion, Addition and / or amino acid exchange-deducing sequence that is necessary for a protein with the encoded biological activity of a G-CSF. Furthermore, such a nucleic acid Molecule contain a sequence with one of the nucleic acid listed above can sequence hybridize complementary sequence or to one of the ge called sequences is complementary.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül eine in der 3'-Region modifizierte MFα1 Se quenz und weiterhin die für den Wachstumsfaktor G-CSF kodierende Sequenz, wobei die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR:5 oder SEQ ID NR:6 oder eine davon abgelei tete Sequenz bevorzugt ist. Um eine proteolytische Spaltung unmittelbar am C-Terminus des MFα-1-Peptids zu erzielen, muß die Aminosäuresequenz des MFα1 Leaders in der Nähe der Prozessierungsstelle verändert werden. Veränderungen dieser Art sind in frü heren MFαI/G-CSF Fusionen beschrieben (z. B. U.S. Patent 5,055,555). Dahingegen führt die Verwendung der unveränderten MFα1 Leader Sequenz wie oben beschrieben zur proteolytischen Spaltung zwischen den Aminosäuren +2 und +3 der Sequenz des vollständigen reifen Proteins, d. h. vor Position +1 eines erfindungsgemäßen Proteins.In a further preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule according to the invention an MFα1 Se modified in the 3 'region quenz and further the sequence coding for the growth factor G-CSF, where the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 or one of them tete sequence is preferred. Proteolytic cleavage directly at the C-terminus To achieve the MFα-1 peptide, the amino acid sequence of the MFα1 leader in the Be changed near the processing point. Changes of this kind are early other MFαI / G-CSF fusions (e.g. U.S. Patent 5,055,555). On the other hand performs the use of the unchanged MFα1 leader sequence as described above for proteolytic cleavage between amino acids +2 and +3 of the sequence of whole mature protein, d. H. before position +1 of a protein according to the invention.

Außerdem umfaßt die vorliegende Erfindung einen Vektor, der ein wie oben beschriebe nes Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon sowie einen damit funktionell ver bundenen Promotor und ein mit der Nukleinsäure funktionell verbundenes Terminati onssignal umfaßt.The present invention also includes a vector which is as described above Nes nucleic acid molecule or a fragment thereof and a functionally ver bound promoter and a terminate functionally linked to the nucleic acid on signal includes.

Ein solcher Vektor enthält in einer bevorzugten Ausführungsform einen Promotor und ein Terminationssignal, die jeweils für eine vorgesehene Wirtszelle spezifisch sind. Dabei bedeutet spezifisch, daß der Promotor und das Terminationssignal aus dem für die Ex pression verwendeten Wirtsorganismus stammen. Ein beispielhafter Expressionsvektor für Hefe, wie der in der vorliegenden Erfindung genutzte, umfaßt eine Expressionskas sette mit den folgenden funktionellen Elementen in der angegebenen Reihenfolge:
In a preferred embodiment, such a vector contains a promoter and a termination signal, each of which is specific for an intended host cell. Specifically, this means that the promoter and the termination signal originate from the host organism used for the expression. An exemplary expression vector for yeast, such as that used in the present invention, comprises an expression cassette with the following functional elements in the order given:

- FMD promoter
- heterologous coding sequence
- MOX terminator

Die einzelnen Elemente eines solchen bevorzugten Vektors sind in der Literatur gut be schrieben, z. B. in Gellissen und Melber, 1996; Hollenberg und Gellissen, 1997.The individual elements of such a preferred vector are well known in the literature wrote, e.g. B. in Gellissen and Melber, 1996; Hollenberg and Gellissen, 1997.

Darüber hinaus enthält ein solcher Vektor Selektionssequenzen und eine HARS (Hansenula autonomously replicating sequence) für eine Propagierung und Selektion in einem geeigneten Hefewirt, einen bakteriellen Replikationsursprung und ein für ein Bak terium geeignetes Selektionsgen für die Vermehrung und Selektion z. B. in einem E.coli Wirt (Gellissen und Hollenberg, 1997; Hollenberg und Gellissen, 1997). Ein Expressions vektor für die erfindungsgemäße Produktion von G-CSF wurde mit Hilfe von allgemein bekannten Methoden und Verfahren hergestellt, z. B. wie in den laufend aktualisierten Protokollen zur Molekularbiologie beschrieben (Ausubel et al., 1987). Die folgenden Komponenten wurden genutzt: Eine Gensequenz, die für die Aminosäuresequenz des reifen G-CSF kodiert, wurde auf Grundlage der veröffentlichten cDNA-Sequenz (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986) synthetisiert und an ein geeignetes DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für die Prä-Pro-Sequenz des Hefepheromons MFα1 fusioniert. Erfindungsgemäß wurde bewußt ein Element mit unveränderter Aminosäuresequenz eingesetzt (Brake et al., 1984). Die Nutzung eines derartigen Elementes resultiert in ei ner Prozessierung zwischen Position +2 und +3 und damit in der N-terminalen Verkür zung der G-CSF Sequenz um zwei Aminosäuren (siehe dazu Beispiel 5). Die fusionierte DNA-Sequenz wurde als EcoRI/BamHI Fragment in den Hansenula polymorpha Ex pressionsvektor pFPMT121 integriert. In diesem Vektor dient ein FMD-Promotor Element zur Kontrolle der Fremdgenexpression. Der Vektor pFPMT121 und abgeleitete Varianten sind in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben (u. a. Gellissen und Hollenberg, 1997). Die DNA-Sequenzen für die erzeugte MFαI/G-CSF Fusion und der erzeugte Ex pressionsvektor für die Produktion von G-CSF in Hansenula polymorpha sind in den Abb. 1 und 2 wiedergegeben (Abb. 1 zeigt die in SEQ ID NR. 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz in Verbindung mit dem Initiationscodon "ATG" sowie die entspre chende Aminosäuresequenz).In addition, such a vector contains selection sequences and a HARS (Hansenula autonomously replicating sequence) for propagation and selection in a suitable yeast host, a bacterial origin of replication and a selection gene suitable for a bacterium for the propagation and selection z. B. in an E.coli host (Gellissen and Hollenberg, 1997; Hollenberg and Gellissen, 1997). An expression vector for the production of G-CSF according to the invention was produced using generally known methods and processes, e.g. B. as described in the continuously updated protocols on molecular biology (Ausubel et al., 1987). The following components were used: A gene sequence coding for the amino acid sequence of the mature G-CSF was synthesized on the basis of the published cDNA sequence (Nagata et al., 1986; Souza et al., 1986) and linked to a suitable DNA Fragment fused with the coding sequence for the pre-pro sequence of the yeast pheromone MFα1. According to the invention, an element with an unchanged amino acid sequence was deliberately used (Brake et al., 1984). The use of such an element results in a processing between position +2 and +3 and thus in the N-terminal shortening of the G-CSF sequence by two amino acids (see example 5). The fused DNA sequence was integrated as an EcoRI / BamHI fragment in the Hansenula polymorpha expression vector pFPMT121. In this vector, an FMD promoter element is used to control foreign gene expression. The vector pFPMT121 and derived variants have been described in various publications (including Gellissen and Hollenberg, 1997). The DNA sequences for the generated MFαI / G-CSF fusion and the generated expression vector for the production of G-CSF in Hansenula polymorpha are shown in Figs. 1 and 2 ( Fig. 1 shows those shown in SEQ ID NO. 9 Nucleic acid sequence in connection with the initiation codon "ATG" and the corresponding amino acid sequence).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der oben beschriebene Vektor ein RNA-Vektor. Auf diese Weise können verschiedene Virus- Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, für die Transfektion von Säugerzellen genutzt werden. DNA-Vektoren sind jedoch ebenfalls umfaßt.In a preferred embodiment of the present invention, the above is described vector an RNA vector. In this way, different virus Vectors containing a nucleic acid according to the invention for the transfection of Mammalian cells can be used. However, DNA vectors are also included.

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin Wirtszellen, die einen der oben beschriebe nen Vektoren enthalten.The present invention further encompasses host cells that describe one of the above contain vectors.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine prokaryotische Wirtszelle. Dabei ist besonders bevorzugt, daß sie eine Wirtszelle der Gattung Escherichia oder Bacillus ist. Eine solche Wirtszelle ist z. B. E.coli oder B. subtilis.In a preferred embodiment, the host cell is a prokaryotic host cell. It is particularly preferred that it is a host cell of the genus Escherichia or Bacillus is. Such a host cell is e.g. B. E. coli or B. subtilis.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine eukaryotische Wirtszelle. Dabei ist die Wirtszelle bevorzugt eine Säugerzelle, z. B. CHO, HeLa, WISH, COS oder NIH-Zellen, eine Hefezelle oder Pilzzelle. Unter den verschiedenen mikrobiel len Expressionssystemen bieten Hefearten verschiedene Vorteile für industrielle Appli kationen. Sie sind in der Lage, rekombinante Produkte effizient zu sezernieren und ei nem generellen eukaryotischen Muster entsprechend zu prozessieren und modifizieren.In a further preferred embodiment, the host cell is a eukaryotic Host cell. The host cell is preferably a mammalian cell, e.g. B. CHO, HeLa, WISH, COS or NIH cells, a yeast cell or fungal cell. Among the different microbiels Expression systems offer various advantages for industrial applications cations. They are able to efficiently secrete recombinant products and egg to process and modify according to a general eukaryotic pattern.

Besonders bevorzugt ist eine Wirtszelle, die eine methylothrophe Hefezelle ist. Die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha wurde als Expressionssystem für heterologe Proteine entwickelt (Roggenkamp et al., 1986; EP 0 173 378), wobei sich dieser Organis mus insbesondere für die Herstellung pharmazeutischer Produkte eignet (Gellissen und Melber, 1996). Die Komponenten des Expressionssystems sind Gegenstand verschie dener Publikationen und Patentanmeldungen. So ist zum Beispiel die Anwendung des FMD-Promotors (Formiatdehydrogenase-Promotor) als Kontrollelement für heterologe Genexpression in EP 0 299 108 niedergelegt. Ein Plasmid mit einem solchen Kontrollele ment dient in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als Ex pressionsvektor für die Produktion von G-CSF. Nach Aufnahme einer heterologen DNA wird diese stabil in das Hefegenom integriert. Als fakultativ methylotrophe Hefe ist diese Spezies in der Lage, Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen; andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Glyzerin und Glukose. Bei Zugabe von Metha nol oder bei der Zugabe von Glyzerin oder Glukose in definierten Konzentrationen wer den Schlüsselenzyme des Methanolstoffwechsels in hohen Konzentrationen produziert. Die Produktionskontrolle erfolgt auf transkriptioneller Ebene. Um die Sekretion eines heterologen Produktes zu ermöglichen, können unterschiedliche Elemente genutzt wer den. So kann z. B. durch Fusion einer vom Hefepheromon MFα1 abgeleiteten Leader- Sequenz und der DNA-Sequenz, die für das Protein von Interesse kodiert, ein Translati onsprodukt erhalten werden, das nach Einschleusen in den sekretorischen Apparat in prozessierter Form ins Zellmedium sezerniert wird (Brake et al. 1984).A host cell which is a methylothrophic yeast cell is particularly preferred. The Methylotrophic yeast Hansenula polymorpha was used as an expression system for heterologous Proteins developed (Roggenkamp et al., 1986; EP 0 173 378), this organ must be particularly suitable for the manufacture of pharmaceutical products (Gellissen and Melber, 1996). The components of the expression system are different publications and patent applications. For example, the application of the FMD promoter (formate dehydrogenase promoter) as a control element for heterologous Gene expression laid down in EP 0 299 108. A plasmid with such a control element In a preferred embodiment of the present invention, ment serves as an Ex pressure vector for the production of G-CSF. After recording a heterologous DNA it is stably integrated into the yeast genome. This is an optional methylotrophic yeast Species able to use methanol as the only source of energy and carbon; other possible carbon sources are glycerin and glucose. When adding metha nol or when adding glycerin or glucose in defined concentrations produces the key enzymes of methanol metabolism in high concentrations. Production control takes place at the transcriptional level. To the secretion of a To enable heterologous product, different elements can be used the. So z. B. by fusion of a leader derived from yeast pheromone MFα1 Sequence and the DNA sequence encoding the protein of interest, a translati onproduct can be obtained after being sluiced into the secretarial apparatus processed form is secreted into the cell medium (Brake et al. 1984).

Als Wirtszellen bevorzugte methylotrophe Hefezellen sind ausgewählt aus Hansenula, Candida, Pichia und Torulopis. Der Terminus "Hansenula" soll so verstanden werden, daß er alle Spezies einschließt, die die gleiche oder eine ähnliche taxonomische Einord nung mit einer methylotrophen Hansenula Hefe teilen. Dies schließt die Organismen Hansenula polymorpha, Hansenula angusta, Hansenula capsulata, Hansenula saturnus und Hansenula wingei ein, ohne auf sie beschränkt zu sein. Methylotrophic yeast cells preferred as host cells are selected from Hansenula, Candida, Pichia and Torulopis. The term "Hansenula" should be understood as that it includes all species that have the same or a similar taxonomic order Share the solution with a methylotrophic Hansenula yeast. This closes the organisms Hansenula polymorpha, Hansenula angusta, Hansenula capsulata, Hansenula saturnus and Hansenula wingei without being limited to them.

Weitere bevorzugte Wirtszellen, die nicht zu den methylothrophen Hefen gezählt wer den, sind aus Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis und Schizosaccharomy ces pombe ausgewählt. Zur Expression besagter G-CSF-Molekülen bestens geeignet sind ferner Insektenzellen. Filamentöse Pilzzellen sind ebenfalls bevorzugte Wirtszellen, wobei Aspergillus niger, Aspergillus oryzae und Neurospora crassa besonders bevorzugt sind.Other preferred host cells that are not counted among the methylothrophic yeast are from Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis and Schizosaccharomy ces pombe selected. Ideally suited for the expression of said G-CSF molecules are also insect cells. Filamentous fungal cells are also preferred host cells Aspergillus niger, Aspergillus oryzae and Neurospora crassa are particularly preferred are.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinan ten Wachstumsfaktors G-CSF, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsge mäße Wirtszelle wie oben beschrieben unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird und der Wachstumsfaktor G-CSF entweder aus dem Medium oder aus der Zelle gewonnen wird. Die dafür geeigneten Verfahren, die dem Zellaufschluß und der Reinigung dienen, sind dem Fachmann bekannt.The invention further relates to a method for producing a recombinant th growth factor G-CSF, which is characterized in that a erfindungsge moderate host cell is cultivated under suitable conditions as described above and the growth factor G-CSF is obtained either from the medium or from the cell becomes. The appropriate processes for cell disruption and purification are known to the person skilled in the art.

Gemäß der Erfindung wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF zur Mobilisierung von peripheren Blutstammzellen verwendet. Dabei ist unter "Mobilisierung von periphe ren Blutstammzellen" eine Steigerung des Blutvorläuferzellspiegels im peripherem Blut zu verstehen.According to the invention, the recombinant growth factor G-CSF for mobilization used by peripheral blood stem cells. Under "Mobilization of peripheral ren blood stem cells "an increase in the blood precursor cell level in peripheral blood to understand.

Des weiteren wird der rekombinante Wachstumsfaktor G-CSF erfindungsgemäß zur Förderung der Proliferation von Blutstammzellen und/oder Vorläuferzellen eingesetzt.Furthermore, the recombinant growth factor G-CSF according to the invention Promote the proliferation of blood stem cells and / or progenitor cells.

Darüber hinaus ist die Verwendung des rekombinanten Wachstumsfaktors G-CSF zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektio nen und nach Knochenmarkstransplantationen von der vorliegenden Erfindung mit um faßt.In addition, the use of the recombinant growth factor G-CSF for Treat cancer, leukemia, severe burns, opportunistic infection and after bone marrow transplants of the present invention sums up.

Das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül, das für einen erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor kodiert bzw. ein oben beschriebener Vektor, der ein solches Nuklein säuremolekül enthält, wird zur in vitro-Transfektion von Blutstammzellen und/oder Vor läuferzellen verwendet. The nucleic acid molecule described above, which is for a Encodes growth factor or a vector described above, which is such a nucleotide contains acid molecule, is used for in vitro transfection of blood stem cells and / or Vor rotor cells used.

Ein solches Nukleinsäuremolekül wird gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls zum Behandeln von Krebs, Leukämie, schweren Verbrennungen, opportunistischen Infektio nen und nach Knochenmarktransplantationen eingesetzt.Such a nucleic acid molecule is also according to the present invention Treat cancer, leukemia, severe burns, opportunistic infection and after bone marrow transplants.

Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen rekombinanten Wachstumsfaktor G-CSF wie oben beschrieben umfaßt und auf eine weitere pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül oder mindestens einen der Vektoren wie oben dargestellt enthält.Furthermore, the invention relates to a pharmaceutical composition, the at least one recombinant growth factor G-CSF as described above comprises and on a further pharmaceutical composition, the at least one Contains nucleic acid molecule or at least one of the vectors as shown above.

Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen dazu dienen, die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung vollständiger zu beschreiben und zu erläutern. Damit wird die Absicht verfolgt, Hansenula polymorpha als beispielhaften Organismus des Genus Hansenula und anderer methylotropher Hefen darzustellen. Darüber hinaus soll auch die Auswahl der genutzten genetischen Komponenten und DNA-Sequenzen der Erläuterung des Grundprinzips der Erfindung dienen. In diesem Sinne werden die aufgeführten Beispiele als nicht-beschränkend aufgefaßt.The following illustrations and examples are intended to serve the different Describe and explain aspects of the present invention more fully. The aim is to use Hansenula polymorpha as an exemplary organism of the genus Hansenula and other methylotrophic yeasts. Furthermore should also select the genetic components and DNA sequences used serve to explain the basic principle of the invention. In this sense, the listed examples as non-limiting.

Illustrations

Abb. 1 zeigt die Gensequenz für die MFα1/G-CSF Fusion und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz. Fig. 1 shows the gene sequence for the MFα1 / G-CSF fusion and the amino acid sequence derived therefrom.

Abb. 2 zeigt den Expressionsvektor für die Produktion von G-CSF entsprechend der vor liegenden Erfindung. Fig. 2 shows the expression vector for the production of G-CSF according to the present invention.

Abb. 3 zeigt einen Southern Blot der genomischen DNA des rekombinanten Stammes Hansenula polymorpha 27-1, der mit dem Vektor pFPMTaG-CSF transformiert worden war. Die DNA wurde mit XhoI/HindIII geschnitten, in definierten Verdünnungen elektro phoretisch getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit einer markierten FMD-Pro motor Sonde hybridisiert. Das Hybridisationsmuster besteht aus einem Signal bei 1,2 Kb für die genuine Sequenz und einem Signal bei 1,88 Kb für die heterologe Fusion. An hand der Signalstärke läßt sich eine Kopienzahl von 40 Kopien abschätzen.
Spur 1 Größenstandard, Spur 2 Plasmid DNA, Spur 3 nicht-transformierter Ausgangs stamm RB11, Spuren 4-7 Stamm 27-1 (Verdünnungen 1 : 40; 1 : 20, 1 : 10 und unver dünnt). Fig. 3 shows a Southern blot of the genomic DNA of the recombinant strain Hansenula polymorpha 27-1, which had been transformed with the vector pFPMTaG-CSF. The DNA was cut with XhoI / HindIII, electrophoretically separated in defined dilutions, transferred to nitrocellulose and hybridized with a labeled FMD-Pro motor probe. The hybridization pattern consists of a signal at 1.2 Kb for the genuine sequence and a signal at 1.88 Kb for the heterologous fusion. Based on the signal strength, a copy number of 40 copies can be estimated.
Lane 1 size standard, lane 2 plasmid DNA, lane 3 non-transformed starting strain RB11, lanes 4-7 strain 27-1 (dilutions 1:40; 1:20, 1:10 and undiluted).

Abb. 4 zeigt die SDS-elektrophoretische Charakterisierung (15%ige Gele). Die beiden stark gefärbten Banden wurden immunologisch als G-CSF Moleküle identifiziert. Beide Proteine weisen einen identischen N-Terminus auf. Fig. 4 shows the SDS electrophoretic characterization (15% gels). The two strongly stained bands were identified immunologically as G-CSF molecules. Both proteins have an identical N-terminus.

Abb. 5 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Nabelschnurblutzellen nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten. Fig. 5 shows the expression of CD34 on the surface of umbilical cord blood cells after stimulation with different G-CSF isolates.

Abb. 6 zeigt die Expression von CD34 auf der Oberfläche von Blutzellen eines an einem Myelom erkrankten Patienten nach Stimulation mit unterschiedlichen G-CSF Isolaten. Fig. 6 shows the expression of CD34 on the surface of blood cells of a myeloma patient after stimulation with different G-CSF isolates.

example 1 Preparation of a yeast expression vector Construction of an H. polymorpha expression vector for the secretion of G-CSF:

Ein DNA-Fragment mit der kodierenden Sequenz für das reife G-CSF wurde entspre chend der publizierten Sequenz synthetisiert (Abb. 1, Nukleotid 256 ff). Ein EcoRI/HindIII Fragment mit der kodierenden Sequenz für die MFα1-Leadersequenz wurde zusammen mit dem G-CSF-Fragment in einen mit EcoRI/BamHI geöffneten M13mp18 Vektor ligiert. Das neu enstandene ligierte Fragment enthält eine MFα1-Leader/O-SCF Fusion als EcoRI/BamHI Fragment. Durch Mutagenese wurde die Fusionsstelle zwischen Leader und reifem G-CSF dahingehend verändert, daß die ursprüngliche Leader-Sequenz ein schließlich der Lys-Arg-Prozessierungstelle rekonstituiert wurde. An diese Prozessie rungsstelle schließt sich die Sequenz des reifen G-CSF ohne N-terminales Methionin an. Die mutagenisierte Fusionssequenz wurde als EcoRI/BamHI-Fragment in den mit diesen Restriktionsenzymen geöffneten Hansenula polymorpha Expressionsvektor pFPMT121 inseriert. Die inserierte Sequenz für MFα1/G-CSF ist in Abb. 1 und der entstandene Ex pressionsvektor pFPMTaG-CSF ist in der Abb. 2 wiedergegeben. A DNA fragment with the coding sequence for the mature G-CSF was synthesized in accordance with the published sequence ( Fig. 1, nucleotide 256 ff). An EcoRI / HindIII fragment with the coding sequence for the MFα1 leader sequence was ligated together with the G-CSF fragment into an M13mp18 vector opened with EcoRI / BamHI. The newly created ligated fragment contains an MFα1 leader / O-SCF fusion as an EcoRI / BamHI fragment. The fusion site between leader and mature G-CSF was changed by mutagenesis in such a way that the original leader sequence including the Lys-Arg processing site was reconstituted. The sequence of the mature G-CSF without N-terminal methionine follows this processing site. The mutagenized fusion sequence was inserted as an EcoRI / BamHI fragment in the Hansenula polymorpha expression vector pFPMT121 opened with these restriction enzymes. The inserted sequence for MFα1 / G-CSF is shown in Fig. 1 and the resulting expression vector pFPMTaG-CSF is shown in Fig. 2.

Example 2 Transformation of Hansenula polymorpha

Der oben beschriebene Vektor diente zur Transformation des Hansenula polymorpha Stammes RB11, der eine Defizienz in der Orotidin 5'-Phosphat-Dehydrogenase (uraW) aufweist. Kompetente Zellen dieses Stammes wurden nach etablierten Methoden her gestellt (Dohmen et al., 1991, Yeast 7 : 691): 10 ml Hefemedium (YPD; Gemisch aus He feextrakt, Pepton und Glucose) wurden mit Zellen inokuliert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Diese Kultur wurde anschließend zur Beimpfung von 200 ml des beschriebe nen Mediums benutzt. Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von 0,6 bis 1 bei OD₆₀₀ kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation sedimentiert, bei Raumtemperatur mit 100 ml einer Lösung A gewaschen (1 M Sorbitol, 10 mM Bicine pH 8,35, 3% (w/v) Ethy lenglycol) und in 4 ml dieser Lösung resuspendiert. 11 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) wur de zugegeben und die kompetenten Zellen in 200 µl Aliquots aufgeteilt. Sie wurden ent weder sofort genutzt oder bis zur Nutzung bei -70°C gelagert.The vector described above was used to transform the Hansenula polymorpha strain RB11, which has a deficiency in the orotidine 5'-phosphate dehydrogenase (uraW). Competent cells of this strain were produced according to established methods (Dohmen et al., 1991, Yeast 7: 691): 10 ml of yeast medium (YPD; mixture of yeast extract, peptone and glucose) were inoculated with cells and at 37 ° C. overnight cultured. This culture was then used to inoculate 200 ml of the medium described. The cells were cultivated to a cell density of 0.6 to 1 at OD ₆₀₀ . The cells were sedimented by centrifugation, washed at room temperature with 100 ml of a solution A (1 M sorbitol, 10 mM bicine pH 8.35, 3% (w / v) ethylene glycol) and resuspended in 4 ml of this solution. 11 ul dimethyl sulfoxide (DMSO) was added and the competent cells were divided into 200 ul aliquots. They were either used immediately or stored at -70 ° C until used.

Für die Transformation wurden 10 µg der Plasmid DNA (pFPMTaG-CSF) und 100 µl kaltes 0,1 M CaCl₂ zu gefrorenen Zellaliquots gegeben. Nach schnellem Auftauen wurde 1 ml einer Lösung B zugegeben (40% (w/v) PEG 3000, 200 mM Bicine pH 8,35) und die Transformationsansätze bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Zel len in 1 ml einer Lösung C (150 mM NaCl in 10 mM Bicine pH 8,35) gewaschen und in 200 µl resuspendiert. Diese Suspension wurde auf Selektivnährböden (Agar in YNB- Glucose (yeast nitrogen base) ausplattiert. Die Ausstriche wurden bei 37°C für 3 bis 5 Tage inkubiert.For the transformation, 10 μg of the plasmid DNA (pFPMTaG-CSF) and 100 μl of cold 0.1 M CaCl _{2 were added} to frozen cell aliquots. After quick thawing, 1 ml of a solution B was added (40% (w / v) PEG 3000, 200 mM bicine pH 8.35) and the transformation batches were incubated at 37 ° C. for 1 hour. The cells were then washed in 1 ml of a solution C (150 mM NaCl in 10 mM bicine pH 8.35) and resuspended in 200 μl. This suspension was plated on selective media (agar in YNB-glucose (yeast nitrogen base). The smears were incubated at 37 ° C for 3 to 5 days.

Example 3 Generation of mitotic stable strains

Kolonien der Transfomationsausstriche wurden zur Inokulation von 3 ml YNB-Glukose benutzt und bei 37°C kultiviert. Ein 50 µl Aliquot der ausgewachsenen Kultur wurde zur Inokulation weiterer 3 ml YNB genutzt. Dieser Vorgang wurde für ca. 60 Wachstumsge nerationen wiederholt. Während dieser Passagierung wurde die Plasmid-DNA in das Genom der Hefe integriert. Anschließend wurden 3 ml des nicht-selektiven Mediums (YPD) beimpft und bei 37°C inkubiert. Colonies of the transformation smears were used to inoculate 3 ml of YNB glucose used and cultivated at 37 ° C. A 50 µl aliquot of the adult culture was used Inoculation of a further 3 ml of YNB used. This process was for about 60 growth areas repeated generations. During this passage, the plasmid DNA was inserted into the Genome of the yeast integrated. Then 3 ml of the non-selective medium (YPD) inoculated and incubated at 37 ° C.

Example 4 Production of recombinant strains of the species Hansenula polymorpha with the ability ability to secrete G-CSF and identification of recombinant strains that G-CSF se ceremony

Die Herstellung von rekombinanten, G-CSF produzierenden Hefestämmen der Art Han senula polymorpha erfolgte nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode durch Trans formation des Wirtsstammes RB11 mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid pFPMTaG-CSF. Mitotisch stabile Stämme wurden wie beschrieben durch Passagieren in selektivem Medium erzeugt. Die generierten Transformanden wurden im 3 ml Maßstab vergleichend kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in einem Medium, dem Glyzerin in einer Konzentration von 1,5% (w/v) zugesetzt war. Der Verbrauch des Glyzerins durch die wachsende Kultur resultierte in Derepressionsbedingungen für den Promotor. Unter die sen Bedingungen läßt sich die Expression des unter der Kontrolle des FMD-Promotors stehenden Fremdgens nach zwei bis drei Tagen nachweisen. Dabei wurden die Zellen nach zweitägiger Kultur in diesem Medium bei 37°C abzentrifugiert und der Überstand auf das Vorhandensein von G-CSF untersucht. Der Nachweis erfolgte durch einen direk ten ELISA, bei dem ein käuflich erhältliches Anti-G-CSF-Serum aus Ziegenblut verwen det wurde. Der ELISA erfolgte in Polystyrolmikrotiterplatten (F96 Maxisorp, Nung-Immuno Plate) nach etablierten Methoden. Der Nachweis erfolgte über die an einen biotinylierten Zweitantikörper im Laufe der Nachweisschritte gebundene Peroxidaseaktivität. Das En zym katalysiert bei Zugabe eines Substrates eine grüne Farbentwicklung, die bei 405 nm photometrisch gemessen werden kann. Die Quantifizierung erfolgte durch Vergleich mit kalibrierten G-CSF Mengenstandards. Durch diesen vergleichenden quantitativen Nachweis des G-CSF in den Kulturüberständen konnten Kandidaten mit überdurch schnittlichen Produktionseigenschaften identifiziert werden.The production of recombinant, G-CSF-producing yeast strains of the Han type senula polymorpha was carried out by the method described in Example 2 by Trans formation of the host strain RB11 with the plasmid described in Example 1 pFPMTaG-CSF. Mitotically stable strains were described by passengers in selective medium. The transformants generated were on a 3 ml scale comparatively cultivated. The cultivation was carried out in one medium, the glycerin in one Concentration of 1.5% (w / v) was added. The consumption of glycerin by the growing culture resulted in derepression conditions for the promoter. Among the Under these conditions, the expression of the under the control of the FMD promoter Detect the foreign gene after two to three days. The cells after two days of culture in this medium at 37 ° C and the supernatant examined for the presence of G-CSF. The proof was provided by a direct ELISA using a commercially available anti-G-CSF serum from goat blood det was. The ELISA was carried out in polystyrene microtiter plates (F96 Maxisorp, Nung-Immuno Plate) according to established methods. The detection was carried out on a biotinylated Second antibody bound peroxidase activity in the course of the detection steps. The En When a substrate is added, zym catalyzes a green color development that occurs at 405 nm can be measured photometrically. The quantification was done by comparison with calibrated G-CSF quantity standards. Through this comparative quantitative Evidence of the G-CSF in the culture supernatants could be exceeded by candidates average production properties can be identified.

Example 5 Determination of the number of copies in selected strains

Die Kopienzahl der integrierten heterologen DNA wurde durch Southern Blot Hybridisie rung bestimmt. Dazu wurde die genomische DNA ausgesuchter Hefestämme mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI geschnitten, nach elektrophoretischer Trennung auf Nitrozellulosefilter übertragen und mit einer markierten FMD-Promotor Sonde hybri disiert. Die Wahl der Restriktionsenzyme und die Festlegung der Hybridisierungssonde in der angegebenen Weise resultiert in zwei Hybridisierungssignalen für das genuine FMD-Gen und die heterologe Fusion. Durch Vergleich der Signalstärken dieser zwei Si gnale kann die Kopienzahl der rekombinanten DNA festgelegt werden. Die Kopienzahl der beiden als Beispiele dienenden Stämme mit den Seriennummern 12-3 und 27-1 wurde mit jeweils 40 bestimmt (siehe Abb. 3).The copy number of the integrated heterologous DNA was determined by Southern blot hybridization. For this purpose, the genomic DNA of selected yeast strains was cut with the restriction enzymes BamHI and XhoI, transferred to nitrocellulose filters after electrophoretic separation and hybridized with a labeled FMD promoter probe. The selection of the restriction enzymes and the determination of the hybridization probe in the manner indicated result in two hybridization signals for the genuine FMD gene and the heterologous fusion. The number of copies of the recombinant DNA can be determined by comparing the signal strengths of these two signals. The number of copies of the two exemplary strains with serial numbers 12-3 and 27-1 was determined to be 40 in each case (see Fig. 3).

Example 6 cultivation

Die Kultivierung der G-CSF-sezemierenden Hansenula-Stämme erfolgte im 21 Ansatz verfahren in einem synthetischen Medium, supplementiert mit Glyzerin als Kohlenstoff quelle. Die Fermentation erfolgte bei pH 5,5 - 3,2.The G-CSF-secreting Hansenula strains were cultivated in the 21 batch procedure in a synthetic medium, supplemented with glycerin as carbon source. The fermentation took place at pH 5.5-3.2.

Example 7 Isolation of the secreted G-CSF

Die Isolierung des sezernierten G-CSF erfolgte mit Hilfe der nachfolgenden Aufreini gungsschritte. Der Fermentationsüberstand wurde durch Zentrifugation der Suspension und anschließende Sterilfiltration gewonnen. Daraufhin erfolgte eine Konzentrierung und Entsalzung durch Querstromfiltration mit Hilfe einer 10 kDa Polyethersulfonmembran bei 4-8°C. Das so gewonnene Material wurde 1 : 1 mit einem Puffer A verdünnt (20 mM HOAc/KOH pH 5,2, 0,5 mM EDTA, 02% (w/v) Tween 20), mit KOH auf pH 5,2 eingestellt und auf einen mit diesem Puffer äquilibrierten Kationenaustauscher gegeben (Merck Fractogel EMD-SO^3- 650 M; 1 × 7 cm). Die aufgetragene Proteinmenge war 4,5 mg nach Bradford, die Leitfähigkeit 2,1 mS/cm. Die Elution des gebundenen Proteinmaterials er folgte mit Hilfe eines Salzgradienten mit 10% bis 100% Anteil eines Puffers B (Puffer B entspricht Puffer A mit 0,5 M NaCl). Die Produktfraktionen wurden mit Hilfe eines 10 kDa Filters aufkonzentriert und durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Sephadex G 75 Matrix eluiert. Der G-CSF befand sich unter diesen Bedingungen im Ausschlußvolumen. Das so gewonnene Präparat lag in einer Konzentration von 50 µg/ml vor. Eine elektro phoretische Analyse mit Hilfe von 15%igen SDS-PAGE Gelen nach Laemmli belegte das Vorhandensein der zwei bereits beschriebenen G-CSF Moleküle von 18 und 20 kDa. The secreted G-CSF was isolated using the subsequent purification steps. The fermentation supernatant was obtained by centrifugation of the suspension and subsequent sterile filtration. This was followed by concentration and desalting by crossflow filtration using a 10 kDa polyethersulfone membrane at 4-8 ° C. The material thus obtained was diluted 1: 1 with a buffer A (20 mM HOAc / KOH pH 5.2, 0.5 mM EDTA, 02% (w / v) Tween 20), adjusted to pH 5.2 with KOH and applied to an equilibrated with this buffer cation exchanger (Merck Fractogel EMD-SO ³ 650 M 1 × 7 cm). The amount of protein applied was 4.5 mg according to Bradford, the conductivity was 2.1 mS / cm. Elution of the bound protein material was carried out using a salt gradient with a 10% to 100% proportion of a buffer B (buffer B corresponds to buffer A with 0.5 M NaCl). The product fractions were concentrated using a 10 kDa filter and eluted by gel filtration chromatography on a Sephadex G 75 matrix. The G-CSF was in the exclusion volume under these conditions. The preparation thus obtained was present in a concentration of 50 µg / ml. An electrophoretic analysis using 15% SDS-PAGE gels according to Laemmli confirmed the presence of the two previously described G-CSF molecules of 18 and 20 kDa.

Example 8 Determination of the biological activity of the recombinant G-CSF from Hansenula poly morpha

Das rekombinante Produkt wurde in einem CD34-Synthesetest nach Sutherland et al. (Sutherland et al., 1994) durchflußzytometrisch in Vorläuferzellpräparaten auf seine bio logische Aktivität im Vergleich mit einem in Bakterien hergestellten G-CSF-Isolat (Filgrastim) getestet. Als Testzellen dienten Zellen aus potentiell zur autolog bzw. allogen zur Knochenmarktransplantation vorgesehenen Vorläuferzellpräparaten. Eingesetzt wurden Nabelschnurblutzellen aus Plazentarestblut bzw. mononukleäre Zellen aus auto logen Stammzellapheresaten von zytotoxisch mobilisierten Myelompatienten (jeweils drei verschiedene Chargen). Die Zellproben wurden bei unterschiedlichen G-CSF Konzen trationen 30 Minuten inkubiert, mit monoklonalen fluoreszierenden Antikörpern markiert, fixiert und durchflußzytometrisch analysiert. Dabei wurden G-CSF Konzentrationen ein gesetzt, die der Serumkonzentration bei der klinischen Anwendung entsprechen (Fischer et al., 1994). Nach Inkubation mit rekombinantem G-CSF aus Hansenula polymorpha wiesen Zellen aus Nabelschnurblut eine sechsfach höhere Syntheserate an CD34 Prote in auf als der Kontroll-G-CSF aus E.coli (Filgrastim, Amgen Corporation, Thousand Oaks, CA). Bei Zellen aus Apheresaten von Myelompatienten wurde eine 8,2-fach höhe re Aktivität gegenüber dem E.coli Isolat gefunden. In Vorversuchen wurde demgegen über kein Unterschied zwischen dem E.coli Isolat und einem rekombinanten glykosylier ten Produkt aus Hamsterzellen (Lenograstim, Rhône-Poulenc Rorer; Frankreich) nach gewiesen.The recombinant product was in a CD34 synthesis test according to Sutherland et al. (Sutherland et al., 1994) flow cytometrically in precursor cell preparations for its bio logical activity in comparison with a G-CSF isolate produced in bacteria (Filgrastim) tested. Cells from potentially autologous or allogeneic were used as test cells precursor cell preparations intended for bone marrow transplantation. Used umbilical cord blood cells from placental residual blood or mononuclear cells from auto Stem cell apheresis from cytotoxically mobilized myeloma patients (three each different batches). The cell samples were taken at different G-CSF concentrations incubated for 30 minutes, labeled with monoclonal fluorescent antibodies, fixed and analyzed by flow cytometry. G-CSF concentrations were included that correspond to the serum concentration in clinical use (Fischer et al., 1994). After incubation with recombinant G-CSF from Hansenula polymorpha cells from umbilical cord blood showed a six-fold higher synthesis rate of CD34 protein in as the control G-CSF from E. coli (Filgrastim, Amgen Corporation, Thousand Oaks, CA). In cells from myeloma patient apheresis, the height was 8.2 times higher re activity against the E. coli isolate found. This was countered in preliminary tests no difference between the E.coli isolate and a recombinant glycosylator product from hamster cells (Lenograstim, Rhône-Poulenc Rorer; France) pointed.

Example 9 Characterization of the secreted G-CSF

Die in Beispiel 3 identifizierten Stämme wurden im 2 l Maßstab nach dem bereits be schriebenen Verfahren fermentiert und das sezernierte Produkt wurde nach verschiede nen Methoden charakterisiert. Die apparente relative Masse wurde durch SDS-PAGE nach Schäger und von Jagow mit 19,5 kDa bestimmt. In der SDS-PAGE nach Laemmli traten zwei monomere Formen von 18 und 20 kDa auf, darüber hinaus multimere For men (siehe Abb. 4). Die 18 kDa Form bildete in der vergleichenden SDS-PAGE eine Bande auf derselben Höhe wie G-SCF aus E.coli. Die 18 und die 20 kDa Form der SDS- PAGE Auftrennung nach Laemmli und die 19,5 kDa Form der SDS-PAGE nach Schäg ger und von Jagow wurden mit Hilfe präparativer Gele aufgetrennt, auf PVDF Membra nen transferiert und N-terminal ansequenziert. Für alle Isolate wurde übereinstimmend der folgende N-Terminus bestimmt:
The strains identified in Example 3 were fermented on a 2 liter scale using the method already described and the secreted product was characterized using various methods. The apparent relative mass was determined by SDS-PAGE according to Schäger and von Jagow to be 19.5 kDa. In the Laemmli SDS-PAGE, two monomeric forms of 18 and 20 kDa appeared, as well as multimeric forms (see Fig. 4). In the comparative SDS-PAGE, the 18 kDa form formed a band at the same level as G-SCF from E. coli. The 18 and 20 kDa form of SDS-PAGE separation according to Laemmli and the 19.5 kDa form of SDS-PAGE according to Schägger and von Jagow were separated using preparative gels, transferred to PVDF membranes and sequenced at the N-terminal. The following N-terminus was determined for all isolates:

Referenzsequenz (natürliche Sequenz): TPLGP ASSLP QSFLL KCLEQ VRKIQ GD Nachgewiesene
Sequenzen: LGP ASSLP QSFLL K?LEQ VRKIQ GDReference sequence (natural sequence): TPLGP ASSLP QSFLL KCLEQ VRKIQ GD Detected
Sequences: LGP ASSLP QSFLL K? LEQ VRKIQ GD

Das sezernierte Produkt liegt nicht in monomerer, sondern in multimerer Form vor. Durch ausschlußchromatographische Verfahren konnte bestimmt werden, daß die relati ve Masse des nativen Produktes größer als 75 kDa ist. Das größere Produkt ist nicht N- glykosyliert. Eine O-Glycosylierung konnte durch PAS Färbung (periodic acid Schiff rea gent-Färbung) von SDS-Polyacrylamidgelen sowie durch Glycoblotting nicht detektiert werden. The secreted product is not in monomeric, but in multimeric form. By exclusion chromatographic methods it could be determined that the relati ve mass of the native product is greater than 75 kDa. The bigger product is not N- glycosylated. O-glycosylation was possible by PAS staining (periodic acid Schiff rea gent staining) of SDS-polyacrylamide gels and not detected by glycoblotting become.

Literature cited

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Claims

1. Recombinant growth factor, which is a mammalian G-CSF (Granulozyten Kolo never-stimulating growth factor) or a homologous protein with the biological activity of a G-CSF, characterized in that the first two N-terminal amino acids of the mature G -CSF proteins are missing.

2. Recombinant growth factor according to claim 1, characterized in that he's a human growth factor.

3. Recombinant growth factor according to one of claims 1 and / or 2, since characterized in that it contains an N-terminal methionine.

4. Recombinant growth factor according to one of claims 1 to 3, characterized in that it comprises an amino acid sequence which is selected from the following groups:

a) SEQ ID NO: 1 ("174 (-2 AS) variant"),
b) SEQ ID NO: 2 ("177 (-2 AS) variant"),
c) SEQ ID NO: 3 ("Met-174 (-2 AS) variant"), and
d) SEQ ID NO: 4 ("Met-177 (-2 AS) variant"),

or an amino acid sequence derived therefrom.

5. Recombinant growth factor according to claim 4, characterized in that the derived sequence by deletion, insertion, addition and / or Amino acid exchange of one or more amino acids from that shown in SEQ ID NO. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 4 specified sequence and makes a difference.

6. Recombinant growth factor according to claim 4 and / or 5, thereby ge indicates that one or more of the histidine residues at positions 41, 77, 154 and 168 are replaced by another natural amino acid.

7. Recombinant growth factor according to claim 6, characterized in that that one or more of the histidine residues at positions 41, 77, 154 and 168 are replaced by glutamine.

8. Recombinant growth factor according to at least one of claims 4 to 7, characterized in that one or more amino acid residues in the Be rich in amino acids 48 to 54 are exchanged.

9. Recombinant growth factor according to at least one of claims 1 to 8, characterized in that it is post-translationally modified.

10. Recombinant growth factor according to claim 9, characterized in that the post-translational modification is the elimination of an N-terminal Methionine and / or the glycosylation of the growth factor comprises.

11. Nucleic acid molecule, characterized in that it comprises a sequence coding for a re-combined growth factor according to one of claims 1 to 9 and is selected from the following group:

a) a nucleic acid sequence which codes for a protein with the sequence shown in SEQ ID NO: 1,
b) a nucleic acid sequence which codes for a protein with the sequence shown in SEQ ID NO: 2,
c) a nucleic acid sequence which codes for a protein with the sequence shown in SEQ ID NO: 3,
d) a nucleic acid sequence which codes for a protein with the sequence shown in SEQ ID NO: 4,
e) the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (“174 × 3 (-6 Nu) variant”),
f) the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 ("177 × 3 (-6 Nu) variant"),
g) the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 ("AUG-174 × 3 (-6 Nu) variant"),
h) the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 ("AUG-177 × 3 (-6 Nu) variant"),
i) a sequence derived by degeneration of the genetic code, by deletion, insertion, addition and / or nucleotide exchange from one of the nucleic acid sequences claimed in a) to h), which codes for a protein with the biological activity of a G-CSF,
j) a nucleic acid sequence which can hybridize with a sequence which is complementary to the nucleic acid sequences claimed in a) to i),

and a sequence complementary to one of the sequences mentioned under a) to k).

12. Nucleic acid molecule according to claim 11, characterized in that it still encoded for a functional leader sequence.

13. Nucleic acid molecule according to claim 12, characterized in that the Leader sequence the leader sequence of the hyperglycemic crustacean Hormone (CHH) from Carcinus maenas or a derivative thereof.

14. Nucleic acid molecule according to claim 12, characterized in that the Leader sequence the leader sequence of the yeast mating factor α (MFα1) or a derivative thereof.

15. Nucleic acid molecule according to claim 14, characterized in that it is the MFα1 leader sequence with the natural MFα1 sequence in functional Link to a sequence coding for the growth factor G-CSF including the codons for the two N-terminal amino acid sequences covered by G-CSF.

16. Nucleic acid molecule according to claim 15, characterized in that it comprises a nucleic acid sequence which is selected from the following group:

a) a nucleic acid sequence which codes for a protein according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and for an MFα1 leader sequence which is functionally linked thereto,
b) SEQ ID NO: 9 ("natural leader + 174 × 3 variant (incl. 6 Nu)"),
c) SEQ ID NO: 10 ("natural leader + 177 × 3 variant (incl. 6 Nu)"),
d) a sequence derived by deletion, insertion, addition and / or nucleotide exchange from one of the nucleic acid sequences claimed in (i), (ii) or (iii), which codes for a protein with the biological activity of a G-CSF,
e) a nucleic acid sequence which can hybridize with a complementary nucleic acid sequence claimed in (i) to (iv),

and a sequence complementary to one of the sequences mentioned in (i) to (v).

17. Nucleic acid molecule according to claim 16, characterized in that the Derivative of the MFα1 leader sequence an MFα1 modified in the 3 'region Sequence and the sequence coding for the growth factor G-CSF is Nucleic acid sequence of SEQ ID NO: S or SEQ ID NO: 6 or one of them derived sequence is.

18. vector, characterized in that it contains a nucleic acid molecule after min at least one of claims 10 to 17 or a fragment thereof, one with it functionally linked promoter and a functional with the nucleic acid connected termination signal comprises.

19. Vector according to claim 18, characterized in that the promoter and the termination signal is a pro specific for an intended host cell engine and specific termination signal.

20. Vector according to claim 18 and / or 19, characterized in that it is a DNA vector or an RNA vector.

21. Host cell, characterized in that it has a vector according to at least contains one of claims 18 to 20.

22. Host cell according to claim 21, characterized in that it is one per is a karyotic host cell.

23. Host cell according to claim 22, characterized in that it is a host cell le of the genus Escherichia or Bacillus.

24. Host cell according to claim 23, characterized in that the host cell E.coli or B. subtilis.

25. Host cell according to claim 21, characterized in that it is an eu is a karyotic host cell.

26. Host cell according to claim 25, characterized in that it is a mammal cell, yeast cell, insect cell or fungal cell.

27. Host cell according to claim 26, characterized in that it is a methy lothrophic yeast cell is.

28. Host cell according to claim 27, characterized in that it is selected is from cells of Hansenula, Candida, Pichia and Torulopis.

29. Host cell according to claim 28, characterized in that it is selected from cells of Hansenula polymorpha, Hansenula angusta, Hansenula capsu lata, Hansenula saturnus and Hansenula wingei.

30. Host cell according to claim 26, characterized in that it is selected is from cells of Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis and Schi zosaccharomyces pombe.

31. Host cell according to claim 25, characterized in that they have a filamen is bad mushroom cell.

32. Host cell according to claim 31, characterized in that it is selected is from cells of Aspergillus niger, Aspergillus oryzae and Neurospora cras sat.

33. Method for producing a recombinant growth factor G-CSF, since characterized in that a host cell according to any one of claims 21 to 32 is cultivated under suitable conditions and the growth factor G-CSF is obtained either from the medium or from the cell.

34. Use of the recombinant growth factor G-CSF after at least one of claims 1 to 10 for mobilizing peripheral blood stem cells len.

35. Use of the recombinant growth factor G-CSF after at least one of claims 1 to 10 for promoting the proliferation of blood stem cells len and / or progenitor cells.

36. Use of the recombinant growth factor G-CSF after at least any one of claims 1 to 10 for treating cancer, leukemia, severe Burns, opportunistic infections and after bone marrow trans plantations.

37. Use of a nucleic acid molecule according to at least one of the claims che 11 to 17 or a vector according to at least one of claims 18 to 20 for in vitro transfection of blood stem cells and / or progenitor cells.

38. Use of a nucleic acid molecule according to at least one of the claims che 11 to 16 or a vector according to at least one of claims 17 to 19 for treating cancer, leukemia, severe burns, opportu infections and after bone marrow transplants.

39. A pharmaceutical composition comprising at least one recombi nanten growth factor G-CSF according to one of claims 1 to 10.

40. Pharmaceutical composition comprising at least one nucleic acid Remolecule according to one of claims 11 to 17 or at least one vector according to one of claims 18 to 20.