DE19860602A1 - Gene transfer vector for the diagnosis and therapy of malignant tumors - Google Patents

Gene transfer vector for the diagnosis and therapy of malignant tumors

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Abstract

The invention relates to a gene transfer vector for the diagnosis and the therapy of malign tumors which codes for any transgene under the control of the tumor-specific YB-1 promoter. Said transgenic vector consists of the YB-1 promoter, a transgene and two multiple cloning sites for restriction enzymes that surround the transgene which cloning sites are suitable for cutting out the transgene. Any gene can be cloned into the construct for its tissue-specific expression in chemo-resistant tumor cells.

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Gentransfervektor und seine Verwendung, insbesondere zur Behandlung von chemoresistenten Tumorzellen.The invention relates to a new gene transfer vector and its use, especially for the treatment of chemoresistant tumor cells.

Bekanntermaßen sind etwa 50% aller Tumoren nicht behandelbar, da diese "multi-drug resistant" sind. So können z. B. Brustkrebszellen entweder primär resistent gegen Chemotherapie sein oder können diese Resistenz nach anfangs erfolgreicher Behandlung in einer späteren Phase entwickeln (sekundäre Therapieresistenz).It is known that around 50% of all tumors cannot be treated because of this are multi-drug resistant. So z. B. Breast cancer cells either primary be resistant to chemotherapy or may have this resistance initially develop successful treatment in a later phase (secondary Resistance to therapy).

Ein solcher resistenter Phänotyp kann durch die Überexpression eines Transporterproteins zustande kommen. Dieses sogenannte P-Glycoprotein bildet als Transmembranprotein eine Art Pumpe für u. a. Chemotherapeutika, wodurch diese zurück in den extrazellulären Raum transportiert werden. Das P- Glycoprotein wird durch das MDR-1 ("Multi-drug-resistance") Gen kodiert, das auf transkriptioneller Ebene durch das YB-1 Bindungsprotein reguliert wird, indem dieses an der "Y-box" innerhalb der DNA Sequenz des MDR-1 Gens bindet (Van Veen and Konings et al. 1997, Sem Cancer Biol, 8, 183-191).Such a resistant phenotype can be caused by the overexpression of a Transporter protein come about. This so-called P-glycoprotein forms as a transmembrane protein a kind of pump for u. a. Chemotherapy drugs, whereby these are transported back into the extracellular space. The P- Glycoprotein is encoded by the MDR-1 ("multi-drug resistance") gene that is regulated at the transcriptional level by the YB-1 binding protein, by this on the "Y box" within the DNA sequence of the MDR-1 gene binds (Van Veen and Konings et al. 1997, Sem Cancer Biol, 8, 183-191).

Der YB-1 Promotor kontrolliert die Expression des YB-1 Proteins, welches zur Familie der "Y-box" Bindungsproteine gehört. Diese Y-box Faktoren gehören einer hoch konservierten Klasse von Proteinen an, die in der Regulation von Transkription und Translation eine Rolle spielen. Die Proteine binden an eine Sequenz innerhalb der DNA eines Zielgens (die sogenannte Y-box Sequenz) wodurch es zur Expression dieses Gens kommt (Bargou et al. 1997, Nat Med, 3, 447-450).The YB-1 promoter controls the expression of the YB-1 protein, which is used for Family of "Y-box" binding proteins belongs. These Y-box factors include a highly conserved class of proteins involved in the regulation of Transcription and translation play a role. The proteins bind to one Sequence within the DNA of a target gene (the so-called Y-box sequence) which leads to the expression of this gene (Bargou et al. 1997, Nat Med, 3, 447-450).

YB-1 ist im Rahmen der Zellproliferation verstärkt exprimiert und kann durch genotoxische Substanzen, z. B. Chemotherapeutika, UV Licht und ionisierende Strahlen induziert werden (Koike et al. 1997, Febs Lett, 417, 390-394). Außerdem konnte festgestellt werden, daß die Expression von YB-1 in proliferierenden Zellen wie embryonalen und regenerierenden Geweben wesentlich erhöht ist, während dieser Zustand sich bei Gewebedifferenzierung umkehrt (Grant and Deeley, 1993, Mol Cell Biol, 12, 4186-4196, Spitkovsky et al. 1992, Nucleic Acido Res, 20, 797-803).YB-1 is increasingly expressed in the context of cell proliferation and can by genotoxic substances, e.g. B. chemotherapy drugs, UV light and ionizing Rays are induced (Koike et al. 1997, Febs Lett, 417, 390-394). It was also found that the expression of YB-1 in proliferating cells such as embryonic and regenerating tissues is significantly increased, while this condition changes with tissue differentiation reverses (Grant and Deeley, 1993, Mol Cell Biol, 12, 4186-4196, Spitkovsky et al. 1992, Nucleic Acido Res, 20, 797-803).

Eigene Studien konnten zeigen, daß die Überexpression des MDR-1 Gens in Brustkrebszellen und die damit zusammenhängende intrinsische Multidrug Resistenz mit der Aktivität und Lokalisation des YB-1 Proteins zusammenhängen (Bargou et al. 1997, Nat Med, 3, 447-450).Our own studies have shown that the overexpression of the MDR-1 gene in Breast cancer cells and the related intrinsic multidrug Resistance to the activity and localization of the YB-1 protein (Bargou et al. 1997, Nat Med, 3, 447-450).

Bei vorhandener Chemoresistenz ist es also nötig, eine Alternative zum Gebrauch von Chemotherapeutika zu finden.If chemoresistance is present, an alternative to use is necessary of chemotherapy drugs.

Bekanntermaßen wird Gentherapie für die Behandlung von erworbenen und vererbten Krankheiten eingesetzt, wobei es um den Transfer eines therapeutischen Gens, wie z. B. eines Tumorsuppressorgens, geht. Verschiedene Vektorsysteme stehen dabei zur Verfügung, um beim Gentransfer einen möglichst hohen Anteil der Zellen des Zielgewebes zu erreichen. Hierbei sind virale Vektoren bisher am geeignetsten. Adenovirale Vektoren werden zunehmend häufiger eingesetzt, da sie mit einer großen Effektivität eine Anzahl von Tumorgeweben infizieren können. Diese Vektoren enthalten eine jeweils spezifische Expressionskassette (EK), die durch die adenovirale Infektion in die Zielzelle gelangt. Diese Expressionskassette besteht aus einem Promotor und einem therapeutischem Gen, wobei der Promotor für die Expression des Gens in den Zielzellen sorgt. Häufig zum Einsatz kommende Promotoren sind z. B. SV40, RSV und CMV (Sandig et al. 1997, Nat med, 3, 313-319).As is known, gene therapy is used for the treatment of acquired and inherited diseases used, it being the transfer of a  therapeutic gene, such as B. a tumor suppressor gene goes. Various Vector systems are available to unite one during gene transfer to achieve the highest possible proportion of cells in the target tissue. Here are viral vectors most suitable so far. Adenoviral vectors will be increasingly used because they are a number with great effectiveness can infect from tumor tissues. These vectors each contain one specific expression cassette (EK), which is caused by the adenoviral infection in the Target cell arrives. This expression cassette consists of a promoter and a therapeutic gene, the promoter for the expression of the gene in the target cells. Promoters frequently used are e.g. B. SV40, RSV and CMV (Sandig et al. 1997, Nat med, 3, 313-319).

Die Tatsache, daß Adenoviren viele Gewebstypen infizieren können, ist einerseits ein Vorteil dieses Gentransfersystems. Gewöhnliche adenovirale Strategien sind andererseits bei gewissen Krankheiten/Therapien nicht ausreichend. Es ist also nötig, Verfahren zu entwickeln, bei denen die Genexpression nur auf bestimmte Zellen beschränkt wird. Dies kann durch gewebsspezifische Promotoren erreicht werden. Durch den Einsatz von z. B. tumorspezifischen Promotoren wird die Möglichkeit geschaffen, das therapeutische Gen nur im Tumorgewebe zu exprimieren und nicht in angrenzendem auch infizierten normalen Gewebe (Robbins et al. 1998, Trends Biotechnol, 16, 35-40). Hiermit erhöht sich die Zielgenauigkeit des Gentransfers, wodurch es möglich wird, auch solche therapeutischen Gene einzusetzen, die für die normalen Zellen schädlich sind.The fact that adenoviruses can infect many types of tissues is on the one hand, an advantage of this gene transfer system. Ordinary adenoviral On the other hand, strategies are not for certain diseases / therapies sufficient. It is therefore necessary to develop processes in which the Gene expression is restricted to certain cells only. This can be done by tissue-specific promoters can be achieved. By using z. B. tumor-specific promoters the possibility is created that to express therapeutic gene only in tumor tissue and not in adjacent also infected normal tissue (Robbins et al. 1998, Trends Biotechnol, 16, 35-40). This increases the accuracy of gene transfer, which makes it possible to use therapeutic genes that are used for the normal cells are harmful.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, einen Vektor mit einer Expressionskassette zu entwickeln, die einen tumorspezifischen Promotor enthält, der zielgerichtet nur in chemoresistenten Tumorzellen ein relevantes Gen exprimiert. Dieser Gentherapievektor soll also in Tumorzellen zum Einsatz kommen, die schon chemoresistent und damit auf eine konventionelle Chemotherapie nicht mehr ansprechen.The invention was therefore based on the object of a vector with a Expression cassette to develop a tumor-specific promoter contains a targeted gene only in chemoresistant tumor cells expressed. This gene therapy vector is said to be used in tumor cells come that are already chemo-resistant and therefore conventional Stop responding to chemotherapy.

Die Kassette soll zum einen so konstruiert sein, daß sie in verschiedene Gentransfervektoren, wie z. B. in adenovirale Vektoren, hineinkloniert werden kann. Zum anderen soll es gleichzeitig möglich sein, die verschiedensten therapeutischen Gene ohne großen technischen Aufwand "downstream" vom Promotor in diese Kassette hineinzuklonieren.On the one hand, the cassette should be designed so that it can be divided into different Gene transfer vectors, such as B. cloned into adenoviral vectors can. On the other hand, it should be possible at the same time, the most varied therapeutic genes "downstream" from the Clone promoter into this cassette.

Die Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen durch einen Vektor gelöst, der die folgenden Bestandteile hat: den YB-1 Promotor, ein Transgen und zwei "Multiple cloning sites" (MCS). Hierbei soll der tumorspezifische YB-1 Promotor in chemoresistenten Tumorzellen durch adenoviralen Gentransfer ein Transgen zur Expression bringen. Dieses Transgen kann ein therapeutisch relevantes, wie z. B. ein Apoptose-induzierendes Gen sein, wodurch ein Absterben der Tumorzellen eingeleitet wird. Es kann auch ein "Prodrug converting enzyme" sein, das ein bestimmtes von außen zugefügtes Molekül ("prodrug") in einen pharmakologisch aktiven Stoff umwandelt, der dann seine therapeutische Wirkung auf die Tumorzellen auswirkt. Weiterhin können auch zwei verschiedene therapeutisch relevante Gene in einem sogenanntem Doppelgentransfer unter die Kontrolle des YB-1 Promotors gestellt werden. Der YB-1 Promotor ist dabei in eine dementsprechend angepasste MCS eines Vektors kloniert. Diese ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Anzahl ausgewählter Restriktionsenzym-Schnittstellen (RES) enthält, die es zulassen, ein neues therapeutisches Gen "downstream" des Promotors in die Expressionskassette zu klonieren, ohne daß am restlichen Vektor bzw. am sich schon im Vektor befindlichen YB-1 Promotor Veränderungen vorgenommen werden müssen.According to the claims, the object is achieved by a vector which has the following components: the YB-1 promoter, a transgene and two "Multiple cloning sites" (MCS). The tumor-specific YB-1 Promoter in chemoresistant tumor cells by adenoviral gene transfer Bring transgene to expression. This transgene can be therapeutic relevant, such as B. an apoptosis-inducing gene, whereby a  Death of the tumor cells is initiated. It can also be a "prodrug converting enzyme ", which is a specific molecule added from the outside ("prodrug") converted into a pharmacologically active substance, which then its therapeutic effect on the tumor cells. Furthermore can also two different therapeutically relevant genes in one so-called Double gene transfer are placed under the control of the YB-1 promoter. The YB-1 promoter is one in a correspondingly adapted MCS Vector cloned. This is characterized in that it is a number contains selected restriction enzyme interfaces (RES) that allow it new therapeutic gene "downstream" of the promoter in the To clone the expression cassette without affecting the rest of the vector or itself Changes already made in the vector YB-1 promoter Need to become.

Der neue Gentransfervektor ist zur Behandlung von Tumoren einsetzbar. Bevorzugt eignet er sich zur Behandlung von chemoresistenten Tumoren. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit besteht in der Diagnostik (Mikrolokalisation von Tumoren).The new gene transfer vector can be used to treat tumors. It is preferably suitable for the treatment of chemoresistant tumors. A Another application is in diagnostics (microlocalization of tumors).

AUSFÜHRUNGSBEISPIELEXAMPLE EXAMPLE

Zunächst wird das entsprechende therapeutische Gen hinter den YB-1 Promotor (Nukleotid 259-294 der MCS des pCR2.1 Vektors von Invitrogen und Nukleotid 453-2150 der YB-1 Promotor-Sequenz, Genbank Acc.# X96666) kloniert. Diese beiden Elemente stellen die Expressionskassette dar (siehe Abb. 1). Hierbei wird der YB-1 Promotor so in eine speziell für diese Zwecke angepasste MCS eines Vektors kloniert, daß verschiedene therapeutische Gene unter die Kontrolle des Promotors gesetzt werden können, ohne daß die MCS erneut angepasst werden muß. Dabei handelt es sich um eine MCS, die eine Gruppe speziell ausgewählter RES enthält. Diese Schnittstellen sollen einen schnellen und unkomplizierten Austausch der therapeutischen Gene "downstream" vom Promotor in die Expressionskassette zulassen. Zusätzliche Veränderungen am restlichen Vektor bzw. am schon vorhandenen YB-1 Promotor werden hierdurch vermieden. Es entsteht somit eine Art "Baukastensystem", in dem die therapeutischen Gene unter geringem Aufwand auswechselbar sind (siehe Abb. 2).First, the corresponding therapeutic gene is cloned behind the YB-1 promoter (nucleotide 259-294 of the MCS of the pCR2.1 vector from Invitrogen and nucleotide 453-2150 of the YB-1 promoter sequence, Genbank Acc. # X96666). These two elements represent the expression cassette (see Fig. 1). Here, the YB-1 promoter is cloned into an MCS of a vector specially adapted for this purpose in such a way that various therapeutic genes can be placed under the control of the promoter without the MCS having to be readjusted. This is an MCS that contains a group of specially selected RES. These interfaces are intended to allow rapid and uncomplicated exchange of the therapeutic genes “downstream” from the promoter into the expression cassette. This avoids additional changes to the remaining vector or to the YB-1 promoter already present. This creates a kind of "modular system" in which the therapeutic genes can be replaced with little effort (see Fig. 2).

Die den YB-1 Promotor und das therapeutische Gen enthaltende Expressionskassette wird dann in ein sogenanntes Transferplasmid (TP) hineinkloniert. Dieses Plasmid enthält einen Teil des adenoviralen Genoms. Für diesen Schritt werden die RES der MCS genutzt, die die EK umgeben und die auch im Transferplasmid vorhanden sind. Das TP wird dann zusammen mit dem "Helferplasmid" (HP) in Bakterien (BJ Zellen) transformiert. Das Helferplasmid besitzt bis auf die E1- und E3-Region das gesamte adenovirale Genom, wobei die E1 Deletion den Virus replikationsdefizient macht. Da die adenoviralen Genomabschnitte, die die EK im TP umgeben, eine Homologie mit bestimmten Abschnitten des Genoms des HP aufweisen, wird durch homologe Rekombination in den BJ Zellen ein rekombinantes adenovirales Plasmid generiert, das die Expressionskassette enthält (siehe Abb. 3). Durch Gentransfertechniken, wie z. B. Calciumphosphat-Präzipitation oder Liposomen, wird dieses rekombinante adenovirale Plasmid dann in eine Produktionszellinie (293; humane, embryonale Nierenzellinie) eingebracht, um zur Produktion von replikationsdefizienten Viren zu führen. Diese enthalten das therapeutische Gen unter der Kontrolle des tumorspezifischen YB-1 Promotors. Danach werden in unterschiedlichen Mausstämmen (SCID und nude Mäuse) Tumore chemoresistenter Zellinien (z. B. epithelialen Ursprungs) etabliert, die dann mit dem rekombinanten Virus infiziert werden. Die Messung der Transgenexpression durch z. B. ELISA- und immunhistochemische Techniken und seine Wirkung auf den Tumor werden dann in Hinsicht auf einen möglichen therapeutischen Ansatz analysiert.The expression cassette containing the YB-1 promoter and the therapeutic gene is then cloned into a so-called transfer plasmid (TP). This plasmid contains part of the adenoviral genome. The RES of the MCS, which surround the EK and which are also present in the transfer plasmid, are used for this step. The TP is then transformed together with the "helper plasmid" (HP) into bacteria (BJ cells). The helper plasmid has the entire adenoviral genome except for the E1 and E3 region, the E1 deletion making the virus replication-deficient. Since the adenoviral genome sections that surround the EK in the TP have homology with certain sections of the genome of the HP, a recombinant adenoviral plasmid that contains the expression cassette is generated by homologous recombination in the BJ cells (see FIG. 3). Through gene transfer techniques such as B. calcium phosphate precipitation or liposomes, this recombinant adenoviral plasmid is then introduced into a production cell line (293; human, embryonic kidney cell line) to lead to the production of replication-deficient viruses. These contain the therapeutic gene under the control of the tumor-specific YB-1 promoter. Afterwards, tumors of chemoresistant cell lines (e.g. epithelial origin) are established in different mouse strains (SCID and nude mice), which are then infected with the recombinant virus. The measurement of transgene expression by e.g. B. ELISA and immunohistochemical techniques and its effect on the tumor are then analyzed for a possible therapeutic approach.

Claims (15)

1. Gentransfervektor, bestehend aus
  • - dem YB-1-Promoter, seinen Mutanten oder Deletionsvarianten,
  • - einem Transgen oder der cDNA eines Transgens
  • - zwei zum Herausschneiden des Transgens geeigneten Multicloningsites(MCS) für Restriktionsenzyme, die das Transgen umgeben.
1. Gene transfer vector consisting of
  • the YB-1 promoter, its mutants or deletion variants,
  • - a transgene or the cDNA of a transgene
  • - Two multicloning sites (MCS) suitable for cutting out the transgene for restriction enzymes which surround the transgene.
2. Gentransfervektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Transgen ein therapeutisches Gen ist.2. Gene transfer vector according to claim 1, characterized in that the transgene is a therapeutic gene. 3. Gentransfervektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Transgen ein Reportergen ist.3. gene transfer vector according to claim 1, characterized in that the transgene is a reporter gene. 4. Gentransfervektor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das therapeutische Gen ein zellzyklusregulierendes oder ein proapoptotisches Gen ist.4. gene transfer vector according to claim 1 and 2, characterized in that the therapeutic gene is a cell cycle regulating or a proapoptotic gene. 5. Gentransfervektor nach Anspruch 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß als therapeutisches Gen p16, p21. p53 oder Bax eingesetzt wird.5. gene transfer vector according to claim 1, 2 and 4, characterized in that as therapeutic gene p16, p21. p53 or Bax is used. 6. Gentransfervektor nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein regulierendes Element in den Vektor eingebracht wird.6. gene transfer vector according to claims 1-5, characterized in that in addition a regulating element is introduced into the vector. 7. Gentransfervektor nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Multicloningsites (MCS) für Restriktionsenzyme mindestens 3 Restriktionsenzymschnittstellen (RES) enthalten.7. gene transfer vector according to claim 1-6, characterized in that the Multicloning sites (MCS) for restriction enzymes at least 3 Restriction enzyme interfaces (RES) included. 8. Gentransfervektor nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Multicloningsites (MCS) für Restriktionsenzyme 5-10 Restriktionsenzymschnittstellen (RES) enthalten.8. gene transfer vector according to claim 1-7, characterized in that the Multicloning sites (MCS) for restriction enzymes 5-10 Restriction enzyme interfaces (RES) included. 9. Gentransfervektor nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Multicloningsites (MCS) für Restriktionsenzyme keine Restriktionsenzymschnittstellen (RES) enthalten, die innerhalb der Sequenzen des YB-1-Promoters vorkommen.9. gene transfer vector according to claim 1-8, characterized in that the Multicloning sites (MCS) for restriction enzymes none Restriction enzyme interfaces (RES) contained within the sequences of the YB-1 promoters occur. 10. Gentransfervektor nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Multicloningsites (MCS) für Restriktionsenzyme sticky-RES und blunt-RES enthalten.10. Gene transfer vector according to claims 1-9, characterized in that the Multicloning sites (MCS) for restriction enzymes sticky-RES and blunt-RES contain. 11. Verwendung des Vektors nach Anspruch 1-10 zur Behandlung von Tumoren. 11. Use of the vector according to claims 1-10 for the treatment of tumors.   12. Verwendung des Vektors nach Anspruch 1-10 zur Behandlung von chemoresistenten Tumoren.12. Use of the vector according to claims 1-10 for the treatment of chemoresistant tumors. 13. Verwendung des Vektors nach Anspruch 1-10 zur Behandlung von chemosensitiven Tumoren.13. Use of the vector according to claims 1-10 for the treatment of chemosensitive tumors. 14. Verwendung des Vektors nach Anspruch 1-10 zur Behandlung von Brustkrebs.14. Use of the vector according to claims 1-10 for the treatment of breast cancer. 15. Verwendung des Vektors nach Anspruch 1-10 zur Mikrolokalisation von Tumoren.15. Use of the vector according to claims 1-10 for microlocalization of Tumors.
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