DE19853185C1 - Exponential amplification of molecular matrices, useful for chemical evolution of e.g. peptides or nucleic acids, by synthesizing copies of immobilized matrices - Google Patents

Exponential amplification of molecular matrices, useful for chemical evolution of e.g. peptides or nucleic acids, by synthesizing copies of immobilized matrices

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Abstract

Exponential amplification of molecular matrices (MM) comprises: (i) binding MM to the surface of a solid phase via a reversible linker; (ii) adding matrix fragments (MF), one of which contains an optionally protected linker unit; (iii) synthesizing copies of MM; (iv) removing excess MF and reaction auxiliaries; (v) separating copies of MM and (vi) populating free binding sites on a solid phase with the synthesized copies. An Independent claim is also included for chemical evolution that includes one or more cycles of: (i) selection of a subpopulation of MM from a starting combinatorial library; and (ii) amplification and mutation of the selected MM to prepare a mutant library, comprising at least one round of the new amplification process.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemischen Evolution durch exponentiellen Amplifikation molekularer Matrizen, d. h. sequenzisomeren Verbindungen mit Templat-Eigenschaften.The present invention relates to a method for chemical evolution by exponential amplification of molecular matrices, i.e. H. sequence isomers Connections with template properties.

Chemisch selbst-replizierende Systeme wurden entworfen, um die minimalen Anforde­ rungen für eine molekulare Replikation zu identifizieren [D. Sievers et al., Self-Reprod. of Supramolecular Structures, Kluwer Publishers, Dordrecht (1994)], um das Prinzip auf synthetische supramolekulare Systeme zu übertragen [E. A. Wintner et al., Acc. Chem. Res. 27, 198-203 (1994)] und um zu einem besseren Verständnis der Reich­ weite und der Beschränkungen von Selbstorganisationsvorgängen [M. Eigen, Natur­ wissenschaften 58, 465-523 (1971)] zu gelangen, von denen man glaubt, daß sie für die Entstehung des Lebens auf der Erde relevant sind [L. Orgel, Acc. Chem. Res. 28, 109-118 (1995)]. Derzeitige Ausführungen verwenden Oligonucleotid-Analoga [G. von Kiedrowski, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25, 932-935 (1986); W. S. Zielinski et al., Nature 327, 346-347 (1987); G. von Kiedrowski et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30, 423-426, ibid. 892 (1991); T. Achilles et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1198-1201 (1993); D. Sievers et al., Nature 369, 221-224 (1994); T. Li et al., Nature 369, 218-221 (1994); B. Martin et al. Helv. Chim Acta 80, 1901-1951 (1997); D. Sievers et al., Chem. Eur. J. 4, 629-641 (1998)], Peptide [D. Lee et al., Nature 382, 525-528 (1996); K. Severin et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37, 126-128 (1998); D. H. Lee et al., Nature 390, 591-594 (1997); S. Yao et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37, 478-481 (1998); K. S. Severin et al. Chem. Eur. J. 3, 1017-1024 (1997)] und andere Moleküle [T. Tjivikua et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 1249-1250 (1990); A. Terfort et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31, 654-656 (1992); J.-I. Hong et al., Science 225, 848-850 (1992); Q. Feng et al., Science 256, 1179-1180 (1992); R. J. Pieters et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 106, 1579-1581 (1994); D. N. Reinhoudt et al., J. Am. Chem. Soc. 118, 6880-6889 (1996); B. Wang et al., Chem. Commun. 16, 1495-1496 (1997)] als Matrizen und beruhen entweder auf autokatalytischen, kreuzkatalytischen oder kollek­ tiv katalytischen Wegen der Matrizenbildung. Ein häufiges Problem dieser Systeme ist die Produkthemmung, die zu einer parabolischen anstelle einer exponentiellen Amplifi­ kation führt [G. von Kiedrowski, Bioorg. Chem. Front. 3, 113-146 (1993)]. Letztere ist die dynamische Voraussetzung für eine Selektion im Darwinschen Sinn [E. Szathmáry et al., J. Theor. Biol. 138, 55-58 (1989); R. W. Wills et al., Santa Fe Institute Working Paper 97-07-065 (1997)].Chemically self-replicating systems have been designed to meet the minimal requirements identify molecular replication [D. Sievers et al., Self-Reprod. of Supramolecular Structures, Kluwer Publishers, Dordrecht (1994)] to the principle to be transferred to synthetic supramolecular systems [E. A. Wintner et al., Acc. Chem. Res. 27, 198-203 (1994)] and to better understand the Reich wide and the limitations of self-organization processes [M. Own, nature sciences 58, 465-523 (1971)], which are believed to be for the origin of life on earth are relevant [L. Organ, Acc. Chem. Res. 28, 109-118 (1995)]. Current designs use oligonucleotide analogs [G. of Kiedrowski, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25: 932-935 (1986); W. S. Zielinski et al., Nature 327: 346-347 (1987); G. von Kiedrowski et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30, 423-426, ibid. 892 (1991); T. Achilles et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1198-1201 (1993); Sievers, D., et al., Nature 369: 221-224 (1994); T. Li et al., Nature 369, 218-221 (1994); B. Martin et al. Helv. Chim Acta 80, 1901-1951 (1997); D. Sievers et al., Chem. Eur. J. 4, 629-641 (1998)], peptides [D. Lee et al., Nature 382, 525-528 (1996); K. Severin et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37: 126-128 (1998); D.H. Lee et al., Nature 390, 591-594 (1997); S. Yao et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37: 478-481 (1998); K. S. Severin et al. Chem. Eur. J. 3, 1017-1024 (1997)] and other molecules [T. Tjivikua et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1249-1250 (1990); A. Terfort et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31, 654-656 (1992); J.-I. Hong et al., Science 225, 848-850 (1992); Q. Feng et al., Science 256: 1179-1180 (1992); R.J. Pieters et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 106: 1579-1581 (1994); D. N. Reinhoudt et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 6880-6889 (1996); B. Wang et al., Chem. Commun. 16, 1495-1496 (1997)] as Matrices and are based on either autocatalytic, cross-catalytic or collective tiv catalytic ways of matrix formation. A common problem with these systems is the product inhibition leading to a parabolic instead of an exponential amplifi cation leads [G. by Kiedrowski, Bioorg. Chem. Front. 3, 113-146 (1993)]. The latter is the dynamic prerequisite for selection in the Darwinian sense [E. Szathmáry  et al., J. Theor. Biol. 138: 55-58 (1989); R. W. Wills et al., Santa Fe Institute Working Paper 97-07-065 (1997)].

Mehrere Theorien der Entstehung des Lebens haben die Bedeutung von Oberflächen für die chemische Evolution hervorgehoben [J. D. Bernal, The Physical Base of Life, Routledge & Kegan Paul, London, 1951; A. G. Cairns-Smitz, The Life Puzzle, Oliever & Boyd, Edinburgh, 1971; H. Kuhn et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 20, 500-520 (1981); G. Wächtershäuser, Microbiol. Rev. 52, 452-484 (1988); E. Szathmáry et al., J. Theor. Biol. 187, 555-571 (1997); L. Orgel, Origins Life Evol. Biosphere 28, 227-234 (1998)]. So wurden Verfahren mit schrittweiser Zufuhr schon früher in zwei verschie­ denen chemischen Systemen eingesetzt, die als Modelle für potentielle präbiotische Prozesse beschrieben wurden [T. Li et. al., Nature 369, 218-221 (1994); J. P. Ferris et al., Nature 381, 59-61 (1996); G. von Kiedrowski, Nature 381, 20-21 (1996)]. In Li et al. werden eine chemische Replikation von Duplex-DNA, die aus palindromischen (symmetrischen) Homopyrimidin- und Homopurin-Strängen bestand, erreicht. Der Homopyrimidin-Strang wurde über Dreifachhelix-Verknüpfung aus seinen Vorstufen­ fragmenten synthetisiert und diente dann als Matrize für die chemische Verknüpfung der Vorstufen des Homopurin-Stranges. Die schrittweise Zufuhr von Homopyrimidin- und Homopurin-Fragmenten ermöglichte dabei, eine Komplexierung der Fragmente zu verhindern und daher zwischen den jeweiligen Triplex- und Duplex-Verknüpfungs- Zwischenstufen hin- und herzuschalten. Ferris et al. haben die Synthese von langen Oligonucleotid- und peptidartigen Materialien auf der Oberfläche von mineralischen Trägern nachgewiesen. In diesen Systemen erlaubte die schrittweise Zufuhr die Er­ gänzung aktivierter Vorstufen und ermöglichte es damit, den längenbeschränkenden Effekt der Vorstufenhydrolyse zu überwinden.Several theories of the origin of life have the meaning of surfaces highlighted for chemical evolution [J. D. Bernal, The Physical Base of Life, Routledge & Kegan Paul, London, 1951; A. G. Cairns-Smitz, The Life Puzzle, Oliever & Boyd, Edinburgh, 1971; H. Kuhn et al., Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 20, 500-520 (1981); G. Wächtershäuser, Microbiol. Rev. 52, 452-484 (1988); E. Szathmáry et al., J. Theor. Biol. 187: 555-571 (1997); L. Organ, Origins Life Evol. Biosphere 28, 227-234 (1998)]. Processes with gradual feeding have previously been divided into two those chemical systems used as models for potential prebiotic Processes have been described [T. Li et. al., Nature 369: 218-221 (1994); J.P. Ferris et al., Nature 381: 59-61 (1996); G. von Kiedrowski, Nature 381, 20-21 (1996)]. In Li et al. are a chemical replication of duplex DNA that comes from palindromic (symmetrical) homopyrimidine and homopurine strands. The Homopyrimidine strand was triple-helix linked from its precursors synthesized fragments and then served as a template for the chemical linkage the precursors of the homopurin strand. The gradual delivery of homopyrimidine and homopurin fragments enabled complexation of the fragments prevent and therefore between the respective triplex and duplex link Switch intermediate stages back and forth. Ferris et al. have the synthesis of long Oligonucleotide and peptide-like materials on the surface of mineral Carriers proven. In these systems, the gradual feeding allowed the Er addition of activated preliminary stages and thus made it possible for the length-limiting To overcome the effect of precursor hydrolysis.

Ein Selektions- und Amplifikationsverfahren mit evolutivem Charakter ist weiterhin aus der WO 91/19813 bekannt. In diesem Verfahren wird eine Subpopulation einer Ausgangsmutantenbibliothek durch reversibles Binden (Partitionieren) an einer Zielstruktur erzeugt und die selektierten Mutanten nachfolgend amplifiziert. Bei einer solchen Amplifikation tritt jedoch häufig das auch z. B. bei der PCR bekannte Problem der Produkthemmung auf.A selection and amplification process with an evolutionary character is still pending WO 91/19813 known. In this procedure, a subpopulation of one Output mutant library by reversible binding (partitioning) to one Target structure generated and the selected mutants subsequently amplified. At a Such amplification, however, often occurs z. B. known problem in PCR of product inhibition.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand nun darin ein Verfahren zur Evolution mulekularer Matrizen (d. h. sequenzisomere Verbindungen mit Templateigenschaften) zur Verfügung zu stellen, in dem der Amplifikationsschritt keinen limitierenden Faktor darstellt, d. h., daß eine unbegrenzte Vervielfältigung der molekularen Matrize ohne Produkthemmung möglich ist.The object of the present invention was now a method for evolution molecular matrices (i.e., sequence isomeric compounds with template properties) to make available in which the amplification step is not a limiting factor  represents, d. that is, an unlimited duplication of the molecular template without Product inhibition is possible.

Überraschenderweise wurde ein iteratives schrittweises Amplifikationsverfahren gefunden, das es erlaubt, die vorhandene Menge an molekularer Matrize exponentiell zu erhöhen und somit einen sinnvollen Evolutionsprozeß ermöglicht. Das Verfahren verwendet dazu die Oberfläche eines festen Trägers. Durch chemische Verknüpfung auf immobilisierten Matrizen werden Kopien aus Vorstufenfragmenten synthetisiert, die dann freigesetzt und immobilisiert werden, so daß sie zu neuen Matrizen werden. Der Vorgang kann beliebig of wiederholt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur chemischen Evolution durch exponentielle Amplifikation molekularer Matrizen, umfassend einen oder mehrere der Evolutionszyklen
Surprisingly, an iterative step-by-step amplification method was found which allows the amount of molecular matrix present to be increased exponentially and thus enables a meaningful evolutionary process. The method uses the surface of a solid support for this. Copies of precursor fragments are synthesized by chemical linkage on immobilized matrices, which are then released and immobilized so that they become new matrices. The process can be repeated any number of times. The present invention thus relates to a method for chemical evolution by exponential amplification of molecular matrices, comprising one or more of the evolution cycles

  • 1. Selektion einer Subpopulation molekularer Matrizen aus einer kombinatorischen Ausgagsbibliothek; und1. Selection of a subpopulation of molecular matrices from a combinatorial Ausgagsbibliothek; and
  • 2. Amplifikation und Mutation der selektiven Matrizen zur Bereitstellung einer Mutantenbibliothek, umfassend eine oder mehrere der folgenden Amplifikationszyklen:
    • a) Binden von molekularen Matrizen an die Oberfläche einer Festphase mittels eines reversiblen Linkers an der Matrize;
    • b) Zugabe von Matrizenfragmenten, wobei eines der Fragmente eine gegebenenfalls geschützte Linkereinheit aufweist;
    • c) Synthese von Kopien der Matrize;
    • d) Entfernen von überschüssigen Matrizenfragmenten und Reaktionshilfstoffen;
    • e) Ablösen der Kopien von der Matrizen; und
    • f) Besiedlung freier Bindungsstellen an der Festphase durch synthetisierte Matrizenkopien.
    2. Amplification and mutation of the selective matrices to provide a mutant library, comprising one or more of the following amplification cycles:
    • a) binding of molecular matrices to the surface of a solid phase by means of a reversible linker on the matrix;
    • b) addition of template fragments, one of the fragments having an optionally protected linker unit;
    • c) synthesis of copies of the template;
    • d) removing excess template fragments and reaction aids;
    • e) removing the copies from the matrices; and
    • f) Colonization of free binding sites on the solid phase by synthesized template copies.

Die Rolle der Festphase (nachfolgend auch "Träger") im erfindungsgemäßen Verfah­ ren besteht darin, komplementäre Matrizen, die in Lösung stabile Duplexe bilden wür­ den, voneinander getrennt zu halten. Geeignete Trägermaterialien bestehen dabei aus organischem oder anorganischem Material oder aus einem Hybrid dieser Materialien. Organische Trägermaterialien sind Polymere auf Zuckerbasis, vorzugsweise Agarose, Cellulose sowie geeignete Derivate oder technische Polymere wie Polystyrol, Poly­ acrylat, Polyacrylnitril, Polyalkene oder Pfropfcopolymer (z. B. PS-PEG, PAN-PEG, PAN-PAG usw.). Anorganische Trägermaterialien können z. B. Glas, funktionalisiertes Hydroxyapatit sowie Metalle sein, wobei insbesondere der Goldoberfläche (infolge der Goldthiolatwechselwirkung) besondere Bedeutung zukommt. Als Hybride sind z. B. paramagnetische Beads denkbar.The role of the solid phase (hereinafter also "carrier") in the process according to the invention ren is complementary matrices that would form stable duplexes in solution to keep them separate. Suitable carrier materials consist of organic or inorganic material or a hybrid of these materials. Organic carrier materials are polymers based on sugar, preferably agarose, Cellulose and suitable derivatives or technical polymers such as polystyrene, poly acrylate, polyacrylonitrile, polyalkenes or graft copolymer (e.g. PS-PEG, PAN-PEG, PAN-PAG etc.). Inorganic carrier materials can e.g. B. glass, functionalized Hydroxyapatite and metals, in particular the gold surface (due to the  Gold thiolate interaction) is of particular importance. As a hybrid z. B. paramagnetic beads conceivable.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können dabei die in Schritt (e) erzeugten Matri­ zenkopien identisch oder komplementär zu den Ausgangsmatrizen sein. Unter "komplementär" im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, daß die Kopie der Matrize sich von der Ausgangsmatrize unterscheidet, die Kopie dieser Kopie jedoch wieder identisch mit der Ausgangsmatrize ist. Nachfolgend wird dies auch kurz mit "(+)- Strang" und "(-)-Strang" bezeichnet. Im Falle der Identität von Ausgangsmatrizen und Matrizenkopien kann der nach der Besiedlung von freien Bindungsstellen (Schritt (f)) folgender nächster Reaktionszyklus im selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Andererseits wird, falls die erzeugten Matrizenkopien komplementär zur Ausgangsma­ trize sind, Schritt (f) vorzugsweise in einem zweiten Reaktionsgefäß erfolgen und erst Schritt (f) des nächsten Reaktionszyklus wieder mit dem ursprünglichen Matrizen­ fragmenten zusammen erfolgen.In the method according to the invention, the matrices generated in step (e) can be used zenkopien be identical or complementary to the original matrices. Under "Complementary" in the sense of the invention is to be understood to mean that the copy of the die differs from the original matrix, but the copy of this copy again is identical to the starting matrix. This is also briefly followed by "(+) - Strand "and" (-) - strand ". In the case of the identity of parent matrices and You can copy the template after the settlement of free binding sites (step (f)) following next reaction cycle can be carried out in the same reaction vessel. On the other hand, if the template copies created become complementary to the original dimension trize, step (f) preferably take place in a second reaction vessel and only Step (f) of the next reaction cycle again with the original templates fragments are made together.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden nach Bin­ den von molekularen Matrizen an der Oberfläche der Festphase überschüssige Bin­ dungsstellen an der Festphase blockiert. Dieses Blockieren ist dabei abhängig von der Art der Verküpfung der verwendeten Matrizenfragmente an die Festphase, d. h. von der Art des Linkers. Die Bindung des Linkers in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl mittels kovalenter als auch nichtkovalenter Bindung erfolgen, wobei unter nichtkovalenter Bindung sowohl ionische als auch nichtionische Bindungssysteme und insbesondere Mitglieder von immunologischen Bindungspaaren wie Avidin/Streptavidin oder Antigen-Antikörper umfaßt sind. Grundsätzliche Voraussetzung für die Auswahl der geeigneten Linker ist jedoch, daß diese orthogonal zu den übrigen in dem System verwendeten chemischen Bindungen, insbesondere zu den chemischen Bindungen in den Matrizen selbst und zwischen Matrize und Matrizenkopie ist, so daß die Matrizen ohne Bindungsbruch von der Festphasenoberfläche wieder entfernt werden können, d. h., ein schaltbares Binden an die Festphase gewährleistet ist. Für die Blockierung der überschüssigen Bindungsstellen an der Festphase bedeutet dies, daß die Blockierung entweder durch Umsetzung mit chemischen Reagenzien, die eine kovalente Bindung mit freien Bindungsstellen eingehen (z. B. bei freien Thiolgruppen an der Festphase: eine Umsetzung mit geeigneten Thiolreagenzien unter Ausbildung von Disulfiden) oder durch Umsetzung mit geeigneten nichtkovalenten Verbindungen die freien Bindungsstellen abgesättigen werden (z. B. bei freien Antigenen in der Festphase eine Umsetzung mit den entsprechenden Antikörpern), erfolgen kann. Der Linker kann sich dabei an jedem beliebigen Ende der Matrize befinden, d. h. er kann bei einem Oligonukleotid sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende sein und bei einem Peptid sowohl am N- als auch am C-Terminus.In a preferred embodiment of the present invention, according to bin the bin surplus from molecular matrices on the surface of the solid phase blocked at the solid phase. This blocking depends on the Type of linking of the used matrix fragments to the solid phase, d. H. of the type of linker. Binding of the linker in the method according to the invention can be done by means of covalent as well as noncovalent binding, whereby under noncovalent binding both ionic and nonionic binding systems and especially members of immunological binding pairs such as avidin / streptavidin or antigen antibodies are included. Basic requirement for the selection however, the appropriate linker is that it is orthogonal to the rest of the system chemical bonds used, in particular to the chemical bonds in the matrix itself and between the matrix and the copy of the matrix, so that the matrix can be removed from the solid phase surface without breaking the bond, d. H., switchable binding to the solid phase is guaranteed. For blocking the excess binding sites on the solid phase means that the blocking either by reaction with chemical reagents that form a covalent bond enter with free binding sites (e.g. with free thiol groups on the solid phase: a reaction with suitable thiol reagents with the formation of disulfides) or by reaction with suitable non-covalent compounds the free Binding sites are saturated (e.g. one with free antigens in the solid phase Implementation with the appropriate antibodies). The linker can  are at any end of the die, d. H. he can with one Oligonucleotide at both the 5 'and 3' ends and with a peptide both at the N- as well as at the C-terminus.

Weiterhin erfordert die Besiedlung freier Bindungsstellen an der Festphase durch synthetisierte Matrizenkopien, daß freie Bindungsstellen für den nächsten Reaktions­ zyklus vorhanden sind. Dies kann zum einen durch Freisetzen neuer Bindungsstellen an der bereits in der Synthese vorhandenen Festphase erfolgen, andererseits aber auch durch Zugabe von neuem Festphasenmaterial erfolgen, bzw. durch Transfer der gebildeten Matrizenkopie auf neues Festmaterial. Von diesen drei Möglichkeiten sind die ersten beiden besonders für die Situation geeignet, wo Ausgangsmatrize und Matrizenkopie identisch sind. Die dritte Möglichkeit ist eher für solche Systeme geeig­ net, in denen die erzeugte Matrize komplementär zu der Ausgangsmatrize ist.Furthermore, the settlement of free binding sites on the solid phase requires synthesized template copies that free binding sites for the next reaction cycle are present. This can be done by releasing new binding sites on the solid phase already present in the synthesis, but on the other hand also by adding new solid phase material, or by transferring the formed matrix copy on new solid material. Of these three options are the first two are particularly suitable for the situation where output matrix and Copy of the matrix are identical. The third option is more suitable for such systems net, in which the generated matrix is complementary to the starting matrix.

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können ge­ schützte Linkereinheiten der Matrizenkopien an dieser Stelle des Reaktionszyklus (d. h. vor, während oder nach Schritt (e) entschützt werden. Nach dem Entschützen rea­ gieren diese dann mit freien Bindungsstellen an dem Trägermaterial. Bei dieser Aus­ führungsform können auch während der Schritte (b)-(e) freie Bindngsstellen an der Festphase vorliegen. Ein Blockieren überschüssiger Bindungsstellen nach dem Schritt (a) ist bei dieser Ausführungsform nicht notwendig.In another embodiment of the method according to the invention, ge protected linker units of the template copies at this point in the reaction cycle (i.e. H. be deprotected before, during or after step (e). After deprotection rea then yaw these with free binding sites on the carrier material. With this out leadership form can also during the steps (b) - (e) free binding sites on the Solid phase. Blocking excess binding sites after the step (a) is not necessary in this embodiment.

Für die Art dieser Linkerschutzgruppen gelten die gleichen Voraussetzungen wie vorstehend für die Linkerchemie. Es muß auch hier Orthogonalität zu den übrigen chemischen Verbindungen gewährleistet sein. Für das jeweilige Amplifikationssystem geeignete Schutzgruppen sind z. B. T. W. Green, Protective Groups in Organic Syn­ thesis, Wiley & Sons, N. J. zu entnehmen.The same requirements apply to the type of these link protection groups as above for linker chemistry. Here too there must be orthogonality to the others chemical compounds can be guaranteed. For the respective amplification system suitable protecting groups are e.g. B. T. W. Green, Protective Groups in Organic Syn thesis, Wiley & Sons, N.J.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Matrizen mit einer Länge von 2 bis 2000, insbesondere von 4 bis 50 Monomereinheiten verwendet werden. Als "Matrizenfragmente" in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens können sowohl einzelne Monomereinheiten als auch Oligomere dieser Monomereinheiten eingesetzt werden. Voraussetzung ist jedoch, daß eines dieser Monomereinheiten oder Oligo­ mereinheiten eine geschützte Linkereinheit aufweist, wobei die Art der Linkerschutz­ gruppe wie vorstehend definiert ist. In the method according to the invention, matrices with a length of 2 to 2000, in particular from 4 to 50 monomer units can be used. As "Matrix fragments" in step (b) of the method according to the invention can both individual monomer units as well as oligomers of these monomer units are used become. However, the prerequisite is that one of these monomer units or oligo has a protected linker unit, the type of linker protection group as defined above.  

Die Konzentration eingesetzter Matrizen im erfindungsgemäßen Verfahren ist abhän­ gig von dem verwendeten Festphasenmaterial, insbesondere der Größe der Partikel und der Anzahl der Bindungsstellen an dessen Oberfläche. Ein weiterer begrenzender Faktor ist die Länge der Matrizen. Im allgemeinen sollte die Konstruktion der Matri­ zenmoleküle in der Reaktionsmischung von 10-15 bis 10-1 insbesondere von 10-12 bis 10-3 mol/l betragen. Die verwendeten Matrizensegmente sollten in einer Konzentration von 10-12 bis 1 mol/l, insbesondere von 10-9 bis 10-1 mol/l eingesetzt werden, wobei ein gewisser Überschuß an Matrizenfragmenten, bezogen auf die für die entsprechende Matrize benötigten Monomereinheiten eingesetzt wird. Besonders bevorzugt ist ein Überschuß von 1 : 1,1 bis 1 : 100 der Monomeeinheiten, wobei bei einem Überschuß von über 10 die Reaktion unökonomisch ist.The concentration of matrices used in the method according to the invention depends on the solid phase material used, in particular the size of the particles and the number of binding sites on its surface. Another limiting factor is the length of the matrices. In general, the construction of the matrix molecules in the reaction mixture should be from 10 -15 to 10 -1, in particular from 10 -12 to 10 -3 mol / l. The matrix segments used should be used in a concentration of 10 -12 to 1 mol / l, in particular 10 -9 to 10 -1 mol / l, a certain excess of template fragments, based on the monomer units required for the corresponding template, being used . An excess of 1: 1.1 to 1: 100 of the monomer units is particularly preferred, the reaction being uneconomical if the excess is more than 10.

Unter molekulare Matrizen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle sequenzen­ isomeren Verbindungen, die Templat-Eigenschaften aufweisen, zu verstehen. Dies sind insbesondere Oligonukleotide und Oligonukleotidabkömmlinge (inklusive PNA, pRNA, 2'-5' Nukleotide und RNA/DNA-Spiegelmere), Oligopeptide und Oligopeptidabkömmlinge (insbesondere in coiled-coil (z. B. Leucin-Zipper) und Faltblatt-Arrangements). Bei den Oligonukleotid- und Oligopeptidderivaten sind insbesondere nicht natürliche Strukturen zu nennen, wie Oligonukleotide mit 2'-5' Strukturen und Peptide mit D-Aminosäuren, die eine höhere Stabilität gegen spaltende Enzyme aufweisen. Als Templat-Rückgrat können vorzugsweise Phosphorsäurediester, -amidate, -thioate, -pyrrophosphate und andere Phosphorsäurederivate sowie Amide, aber auch Ester, Harnstoffe, Urethane, Disulfide, Imine, Acetale und C-C-Verknüpfungen verwendet werden. Die in den Templaten stattfindende molekulare Erkennung kann über Heterozyklen (insbesondere Nukleobasen), Salzbrücken (insbesondere Amidiniumcarboxylat-Wechselwirkung), Ion-Ion-Wechselwirkung, Ion-Dipol-Wechselwirkung, Dipol-Dipol-Wechselwirkung, Einschlußkomplexierung (inbesondere via Cyclodextrine und sogenannte molekulare Pinzetten), Stapel- und Chargetransfer-Wechselwirkung (insbesondere via Stapelung elektronenreicher und elektronenarmer Aromate) sowie über Ligand-Metall-Ligand- Wechselwirkung erfolgen. Die Template können sowohl lineare, zyklische, verzweigte (dendrimerartige) sowie zweidimensionale Topologie besitzen.Molecular matrices in the sense of the present invention are all sequences to understand isomeric compounds which have template properties. This are in particular oligonucleotides and oligonucleotide derivatives (including PNA, pRNA, 2'-5 'nucleotides and RNA / DNA Spiegelmers), oligopeptides and Oligopeptide derivatives (especially in coiled-coils (e.g. leucine zippers) and Leaflet arrangements). The oligonucleotide and oligopeptide derivatives are in particular not to mention natural structures, such as oligonucleotides with 2'-5 ' Structures and peptides with D-amino acids, which have a higher stability against cleaving Have enzymes. As a template backbone can preferably Phosphoric acid diesters, amidates, thioates, pyrrophosphates and others Phosphoric acid derivatives and amides, but also esters, ureas, urethanes, disulfides, Imines, acetals and C-C linkages can be used. The ones in the templates Molecular recognition can take place over heterocycles (in particular Nucleobases), salt bridges (especially amidinium carboxylate interaction), Ion-ion interaction, ion-dipole interaction, dipole-dipole interaction, Inclusion complexation (especially via cyclodextrins and so-called molecular Tweezers), stack and batch transfer interaction (especially via stacking electron-rich and electron-poor aromatics) and via ligand-metal-ligand Interaction. The templates can be linear, cyclic, branched (dendrimer-like) and two-dimensional topology.

Geeignete Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren sind Wasser und orga­ nischen Reaktionsmedien oder Gemische derselben. Falls die Matrizen und Matri­ zenfragmente ionische Gruppen enthalten (wie Phosphorsäuremono- oder -dieester), sind wäßrige Lösungsmittelsysteme besonders bevorzugt. Die Lösungsmittel können weiterhin geeignete Puffersysteme enthalten.Suitable solvents for the process according to the invention are water and orga African reaction media or mixtures thereof. If the matrices and matri zen fragments contain ionic groups (such as phosphoric acid monoesters or diesters),  aqueous solvent systems are particularly preferred. The solvents can continue to contain suitable buffer systems.

Die Bindungsverknüpfung in Schritt (c) kann sowohl chemisch oder enzymatisch erfolgen. Bei der chemischen Verknüpfung erfolgt dabei die Umsetzung der Reaktions­ partner mit für die jeweilige Bindungsknüpfung geeigneten Aktivierungsreagenzien und Kondensationsmitteln. So erfolgt die Kondensationsreaktion von Phosphorsäure­ derivaten bei Reaktionsführung in wäßrigen Medien vorzugsweise unter Verwendung von wasserlöslichen Carbodiimiden. Für die enzymatische Verknüpfung können alle Enzyme verwendet werden, die die entsprechenden katalytischen Eingenschaften aufweisen (Ligasen, Polymerasen, Esterasen usw.).The linkage in step (c) can be either chemical or enzymatic respectively. The chemical linkage implements the reaction partner with activation reagents suitable for the respective binding and Condensing agents. This is how the condensation reaction of phosphoric acid takes place derivatives when carrying out the reaction in aqueous media, preferably using of water soluble carbodiimides. For the enzymatic link everyone can Enzymes are used that have the appropriate catalytic properties have (ligases, polymerases, esterases, etc.).

Die Reaktionstemperatur für die vorstehend genannten Reaktionsschritte, insbesonde­ re dem Verknüpfungsschritt (c), kann dabei je nach Reaktionsystem zwischen -20 und 100°C liegen. Besonders bevorzugt sind Temperaturen zwischen 0 und 50°C. Ins­ besondere für die Verknüpfungsreaktion mittels Polymerasen ermöglicht das erfin­ dungsgemäße Amplifikationssystem eine Reaktionsführung unterhalb von 50°C.The reaction temperature for the above-mentioned reaction steps, in particular right the linking step (c), depending on the reaction system between -20 and 100 ° C. Temperatures between 0 and 50 ° C. are particularly preferred. Ins This enables inventions in particular for the linking reaction using polymerases amplification system according to the invention a reaction below 50 ° C.

Nach der Synthese der Matrizenkopien wird in Schritt (d) überschüssige Matrizenfrag­ mente und Reaktionshilfsstoffe (d. h. Kondensationsmittel, Aktivierungsreagentien, Puffer, Enzyme usw.) entfernt, die für die Verknüpfung benötigt wurden.After the synthesis of the template copies, excess template question is asked in step (d) agents and reaction aids (i.e. condensing agents, activating reagents, Buffers, enzymes, etc.) that were needed for the linkage.

Das Ablösen der Matrizenkopien von den Matrizen ist abhängig von dem jeweiligen Matrizensystem und muß so erfolgen, daß sowohl die genküpften chemischen Verbin­ dungen als auch die Verknüpfung des Linkers mit Oberflächen bzw. geeignete Linker­ schutzgruppen an den Matrizenkopien unbeeiträchtigt bleiben. Geeignete Maßnahmen sind z. B. Behandlungen von wäßrigen oder organisch wäßrigen Lösungen mit Dena­ turierungsreagenzien, Temperaturerhöhung, elektrische und magnetische Felder, mechanische Verfahren und Kombinationen derselben. Die vorliegende Erfindung bietet somit eine Vielzahl von Denaturierungsmöglichkeiten, d. h. ein Erhitzen auf über 90°C wie bei TAQ-Polymerase in der PCR ist nicht zwingend erforderlich.The detachment of the matrix copies from the matrices depends on the respective one Matrix system and must be done in such a way that both the gene-linked chemical compound as well as linking the linker with surfaces or suitable linkers protection groups on the matrix copies remain unaffected. Appropriate measures are z. B. Treatments of aqueous or organic aqueous solutions with Dena turking reagents, temperature increase, electric and magnetic fields, mechanical processes and combinations thereof. The present invention thus offers a variety of denaturing options, i. H. a heating up over 90 ° C as with TAQ polymerase in PCR is not absolutely necessary.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Selektion der Subpopulation molekularer Matrizen durch eine reversible Bindung an eine oder mehrere Zielstrukturen (Targetmoleküle). Dies erfolgt vorzugsweise durch eine Adsorptionschromatographie. In dem erfindungsgemäßen Evolutionszyklus wird, falls die Ausgangsmutantenbibliothek keinen geeigneten Linker aufweist, in einem zusätzlichen Schritt (1') die selektierten molekularen Matrizen mit einem reversiblen Linker versehen. Die in Schritt (2) des Verfahrens erhaltene Mutantenbibliothek ist die Ausgangsbibliothek für den nächsten Evolutionszyklus. Die Mutation im Amplifikationszyklus wird durch die Reaktionsparameter in den Schritten (b) und (c) gesteuert. Die Anzahl der Evolutionszyklen hängt dabei zum einen von der Komplexität (d. h. der Anzahl der möglichen Variablen der zu selektierenden Struktur), das Abnahmeverhältnis im Selektionsschritt, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung zwischen 0,01 und 50% liegt, sowie dem gegenläufigen Effekt der Mutation im Amplifikationsschritt bestimmt. Zusätzlich zu dem Selektionsschritt in (1) kann auch durch den Ablöseschritt (2)(e) eine zusätzliche Selektion erfolgen.In the method according to the invention, the subpopulation of molecular matrices is selected by reversible binding to one or more target structures (target molecules). This is preferably done by adsorption chromatography. In the evolution cycle according to the invention, if the starting mutant library does not have a suitable linker, the selected molecular matrices are provided with a reversible linker in an additional step ( 1 '). The mutant library obtained in step ( 2 ) of the method is the starting library for the next evolution cycle. The mutation in the amplification cycle is controlled by the reaction parameters in steps (b) and (c). The number of evolution cycles depends on the one hand on the complexity (ie the number of possible variables of the structure to be selected), the decrease ratio in the selection step, which in the context of the present invention is between 0.01 and 50%, and the opposite effect of the mutation determined in the amplification step. In addition to the selection step in ( 1 ), the replacement step ( 2 ) (e) can also be used for an additional selection.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei weiterhin entweder nach jedem Evolutionszyklus oder nach dem letzten Evolutionszyklus weiterhin noch die zusätzlichen Schritte der Vereinzelung der erhaltenen Matrizenmoleküle und nachfolgende Analyse umfassen.The inventive method can continue either after each Evolution cycle or after the last evolution cycle still the additional steps of the separation of the matrix molecules obtained and include subsequent analysis.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren näher erläutert.The present invention is illustrated by the following figures.

FigurenbeschreibungFigure description

Fig. 1: Allgemeines Schema des erfindungsgemäßen Verfahrens: Fig. 1: General scheme of the method according to the invention:

1Immobilisierungsschritt: Eine Matrize wird durch eine irreversible Reaktion mit der Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert. 1 Immobilization step: A matrix is immobilized by an irreversible reaction with the surface of a solid support.

2Hybridisierungsschritt: Die Matrize bindet komplementäre Fragmente aus der Lö­ sung. 2 Hybridization step: The template binds complementary fragments from the solution.

3Ligationsschritt: Die Fragmente werden durch chemische Verknüpfung miteinander verknüpft. 3 Ligation step: The fragments are linked together by chemical linkage.

4Ablösungsschritt: Die Kopie wird freigesetzt und an einem anderen Teil des festen Trägers erneut immobilisiert, wobei sie zu einer Matrize für den nächsten Cyclus von Schritten wird. 4 Detachment step: The copy is released and re-immobilized on another part of the solid support, becoming a template for the next cycle of steps.

Fig. 2: In dem Experiment eingesetzte Oligonucleotid-Analoga und Reaktionen: Fig. 2: In the experiment used oligonucleotide analogs and reactions:

Die einzelnen Schritte des Verfahrens (1)-(4) wurden für die komplementären Matri­ zen X und Y getrennt in verschiedenen Röhrchen durchgeführt. PySS bezeichnet eine 2-Pyridyldisulfid-Struktureinheit, die bei der Immobilisierung (1a) und Verkappung (1b) unter Bildung von 2-Thiopyridon gespalten wird. Die Gerüstmodifikation X an der zen­ tralen Internucleotid-Verknüpfung von X und Y ist X = N-H, außer bei der ersten Im­ mobilisierung, wo X = O ist. Ax, Bx, Ay und By bezeichnen die entsprechenden Matri­ zenfragmente. Der Hybridisierungsschritt (2) ergibt einen termolekularen Komplex aus den immobilisierten Matrizen und den jeweiligen Fragmenten Ax, Bx, Ay und By. In Ge­ genwart des wasserlöslichen Carbodiimids EDC führt die chemische Verknüpfung (3) zu einer 3'-5'-Phosphoramidat-Bindung zwischen einer 5'-Amino- und einer benach­ barten 3'-Phosphatgruppe. Jeder resultierende doppelsträngige Komplex wird denatu­ riert (4), was den matrizentragenden Träger sowie eine auf frischem SH-Träger immo­ bilisierte PySS-modifizierte Kopie ergibt.The individual steps of the process ( 1 ) - ( 4 ) were carried out separately for the complementary matrices X and Y in different tubes. PySS denotes a 2-pyridyl disulfide structural unit that is cleaved during immobilization (1a) and capping (1b) to form 2-thiopyridone. The framework modification X on the central internucleotide linkage of X and Y is X = NH, except for the first immobilization where X = O. A x , B x , A y and B y denote the corresponding template fragments. The hybridization step ( 2 ) results in a termolecular complex of the immobilized matrices and the respective fragments A x , B x , A y and B y . In the presence of the water-soluble carbodiimide EDC, the chemical linkage ( 3 ) leads to a 3'-5'-phosphoramidate bond between a 5'-amino and an adjacent 3'-phosphate group. Each resulting double-stranded complex is denatured ( 4 ), which results in the matrix-carrying carrier and a PySS-modified copy immobilized on fresh SH carrier.

Fig. 3: HPLC-Analyse von Produkten unter denaturierenden Bedingungen, die man in den aufeinanderfolgenden Schritten eines Amplifikations-Cyclus erhält. Alle HPLC- Proben ohne Reduktionspuffer (RB) wurden vor der Analyse auf eine Konzentration von 100 mM DTT gebracht (außer (a)), um die Reproduzierbarkeit der HPLC-Quantifi­ zierung zu gewährleisten.
tR = Retentionszeit in Minuten
 Fig. 3: HPLC analysis of products under denaturing conditions, which are obtained in the successive steps of an amplification cycle. All HPLC samples without reduction buffer (RB) were brought to a concentration of 100 mM DTT before the analysis (except (a)) to ensure the reproducibility of the HPLC quantification.
t R = retention time in minutes

  • a) = Reaktionsgemisch, das X und GAATCCATGGTAAG (Xref) als internen Standard enthält, vor der Immobilisierunga) = reaction mixture containing X and GAATCCATGGTAAG (X ref ) as internal standard before immobilization
  • b) = Überstand nach der Immobilisierungb) = supernatant after immobilization
  • c) = Reaktionsgemisch nach der Hybridisierung von immobilisiertem X mit Ay und By und Behandlung des Trägers mit RB. (d) Reaktionsgemisch nach der chemischen Verknüpfung und reduktive Abspaltung vom Träger mit Hilfe von RBc) = reaction mixture after hybridization of immobilized X with A y and B y and treatment of the support with RB. (d) Reaction mixture after chemical linkage and reductive cleavage from the carrier using RB
  • d) = HPLC-Analyse der Gruppe von sechzehn Proben, die man durch reduktive Spaltung von immobilisierten Matrizen erhielt, die durch drei Amplifikations-Cyclen erzeugt wurden.d) = HPLC analysis of the group of sixteen samples obtained by reductive Cleavage of immobilized matrices was obtained by three amplification cycles were generated.

Die Beschriftungen rechts von den HPLC-Profilen ist nachfolgend in Fig. 4 näher erläutert. Man beachte, daß kleine Verunreinigungen, die in den vorderen Profilen sichtbar sind, die im Verlaufe der Amplifikation nach und nach verschwinden.The labels to the right of the HPLC profiles are explained in more detail in FIG. 4 below. Note that small impurities visible in the front profiles gradually disappear in the course of the amplification.

Fig. 4: Weg der Matrizenübertragungen im Verlaufe von drei Amplifikations-Cyclen: Kästchen und Buchstaben symbolisieren Reaktionsröhrchen bzw. matrizentragende Träger. X-Achse: Zahl der Amplifikationeszyklen; Y-Achse: Anzahl der Proben. Die Pfeile zeigen an, welche Kopie von welcher Matrize erzeugt wird. Die gezeigte Menge des Matrizenmaterials wurde nach der Spaltung der Disulfidbrücken durch Reduktion mit DTT durch HPLC-Analyse quantifiziert. Aus den obigen Daten wurden 14 individuelle Ausbeuten berechnet. Die mittleren Ausbeuten und Standardfehler sind: px = 0.763 +/- 0.071 und py = 0.855 +/- 0.079. Die Stoffmenge der jeweiligen Matrize beim Cyclus n in Nanomol wird mit ihrem theoretischen Wert (in eckigen Klammern) verglichen, der aus (3a, b) berechnet wird: x0 = 38.87 (38.87), y0 = 45.44 (45.44), x1 = 72.81 (73.54), y1 = 80.71 (78.68), x2 = 126.29 (133.58), y2 = 138.97 (141.57), x3 = 238.90 (241.61), y3 = 249.77 (255.80). Fig. 4: Path of the matrix transfers in the course of three amplification cycles: boxes and letters symbolize reaction tubes or matrix-carrying carriers. X axis: number of amplification cycles; Y axis: number of samples. The arrows indicate which copy is made from which die. The amount of the matrix material shown was quantified after cleavage of the disulfide bridges by reduction with DTT by HPLC analysis. 14 individual yields were calculated from the above data. The mean yields and standard errors are: p x = 0.763 +/- 0.071 and p y = 0.855 +/- 0.079. The amount of substance of the respective matrix at the cycle n in nanomoles is compared with its theoretical value (in square brackets), which is calculated from (3a, b): x 0 = 38.87 (38.87), y 0 = 45.44 (45.44), x 1 = 72.81 (73.54), y 1 = 80.71 (78.68), x 2 = 126.29 (133.58), y 2 = 138.97 (141.57), x 3 = 238.90 (241.61), y 3 = 249.77 (255.80).

Fig. 5: Allgemeines Schema des erfindungsgemäßen Verfahrens: Fig. 5: General diagram of the inventive method:

(1) Immobilisierungsschritt: Eine Matrize wird durch eine irreversible Reaktion mit der Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert.( 1 ) Immobilization step: A template is immobilized by an irreversible reaction with the surface of a solid support.

(2) Hybridisierungsschritt: Die Matrize bindet komplementäre Fragmente aus der Lö­ sung.( 2 ) Hybridization step: The template binds complementary fragments from the solution.

(3) Ligationsschritt: Die Fragmente werden durch chemische Verknüpfung miteinander verknüpft.( 3 ) Ligation step: The fragments are linked to one another by chemical linking.

(4) Ablösungsschritt: Die Kopie wird freigesetzt und an einem anderen Teil des festen Trägers erneut immobilisiert, wobei sie zu einer Matrize für den nächsten Cyclus von Schritten wird.( 4 ) Detachment step: The copy is released and re-immobilized on another part of the solid support, becoming a template for the next cycle of steps.

(5) Selektionsschritt: Anlagerung der Matrize an das Targetmolekül.( 5 ) Selection step: attachment of the template to the target molecule.

(6) Verwerfen der nichtbindenden Matrizen.( 6 ) discard the non-binding matrices.

Im einzelnen beschreibt Fig. 1 zwei besondere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit folgenden Schritten: (1) ein Templat-Immobilisierschritt, (2) ein Hybridi­ sierungs- oder Cappingschritt, (3) ein Ligations- oder Kopierschritt und (4) ein Ablö­ sungs- oder Denaturierschritt. Es werden zwei Verfahrensvarianten (I und II) umfaßt, von denen (I) einen nicht-enzymatischen Kopierschritt und (II) einen enzymatischen Kopierschritt impliziert. . In particular, FIG 1 describes two particular embodiments of the present invention comprising the following steps: (1) a template-Immobilisierschritt, (2) sierungs- a hybridized or capping step, (3) a ligation or copying step and (4) a Ablö tration or denaturation step. Two process variants (I and II) are included, of which (I) implies a non-enzymatic copying step and (II) an enzymatic copying step.

(I)(I)

In der ersten Verfahrensvariante werden als Templat Oligodesoxy- oder Oligoribo­ nucleotidderivate verwendet, die 10-100 Nucleotideinheiten besitzen und entweder ein natürliches Rückgrat aus 3'-5'-Phosphoramidatbindungen, 3'-5'-Pyrophsophatbindun­ gen oder anderen Bindungen einschließlich 2'-5'-Internucleotidbindungen enthalten. Natürliche und synthetische Bindungen können im Rückgrat gemischt vorliegen.In the first process variant, the template is oligodeoxy or oligoribo used nucleotide derivatives that have 10-100 nucleotide units and either natural backbone of 3'-5'-phosphoramidate bonds, 3'-5'-pyrophsophate bond gene or other linkages including 2'-5 'internucleotide linkages. Natural and synthetic bonds can be mixed in the backbone.

(ad 1)(ad 1)

Die Immobilisierung des Templats erfolgt 5'-terminal über eine Disulfidbrücke oder über die Biotin-Avidin-Wechselwirkung. Im ersten Fall enthält das zu immobilisie­ rende Oligonucleotid-Templat am 5'-Terminus eine 2-Pyridyldisulfidmodifikation und das Trägermaterial freie Thiolgruppen. Die Immobilisierung findet hier durch Disulfid­ austauschunter Abspaltung von 2-Thiopyridon statt. Im zweiten Fall wird ein 5'-biotiny­ liertes Oligonucleotid-Templat eingesetzt, wobei der Biotin-Modifier auch eine Disulfid­ brücke enthalten kann. Die Immobilisierung findet durch Bindung von Biotin an Avidin statt, das seinerseits an festen Trägern gebunden vorliegt. Als Trägermaterialien kön­ nen Tentagele, Agarose oder andere geeignete Polymere einschließlich Glas oder Papier verwendet werden.The template is immobilized 5'-terminally via a disulfide bridge or via the biotin-avidin interaction. In the first case, that includes immobilization oligonucleotide template at the 5'-terminus a 2-pyridyl disulfide modification and the carrier material free thiol groups. Immobilization takes place here through disulfide  exchange takes place with elimination of 2-thiopyridone. In the second case, a 5'-biotiny gelled oligonucleotide template used, the biotin modifier also a disulfide may contain bridge. Immobilization takes place by binding biotin to avidin instead, which is in turn bound to solid supports. As carrier materials can Tentagele, agarose or other suitable polymers including glass or Paper.

(ad 2)(ad 2)

Nach Immobilisierung werden die nicht-belegten Oberflächenstellen durch Be­ handlung mit einem geeigneten Reagenz desaktiviert. Thiolgruppen werden vorzugs­ weise durch Behandlung mit 2-Hydroxyethyl-(2-pyridyl)-disulfid, aber auch 2,2'-Dipyri­ dyldisulfid, einem milden Alkylans, oder durch Oxidation desaktiviert. Freies Avidin wird mit Biotin desaktiviert.After immobilization, the unoccupied surface areas are replaced by Be deactivated with a suitable reagent. Thiol groups are preferred wise by treatment with 2-hydroxyethyl- (2-pyridyl) disulfide, but also 2,2'-dipyri dyl disulfide, a mild alkylan, or deactivated by oxidation. Free avidin will deactivated with biotin.

(ad 3)(ad 3)

Der Kopierschritt erfolgt durch chemische Ligation: 2-50-mere komplementäre Oligodesoxynucleotide, Oligoribonucleotide oder Abkömmlinge, die entweder eine 5'- Phosphat- und eine 3'-Hydroxygruppe oder eine 5'-Hydroxy- und eine 3'-Phosphat­ gruppe oder eine 5'-Phosphat- und eine 3'-Aminogruppe oder eine 5'-Amino- und eine 3'-Phosphatgruppe oder eine 5'- und eine 3'Phosphatgruppe oder weitere chemisch verknüpfbare Gruppen enthalten, werden an das immobilisierte Templat angelagert und in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimides, vorzugsweise EDC, oder eines anderen Kondensationsmittels wie Bromcyan oder N-Cyanoimidazol verknüpft. Das zum 3'-Ende der immobilisierten Matrize komplementäre Oligodesxoynucleotid besitzt die Funktion eines 5'-Primers. Es enthält am 5'-Ende eine der unter (1) ge­ nannten Modifikationen und am 3'-Ende eine der unter (3) genannten Gruppen.The copying step is done by chemical ligation: 2-50-mers complementary Oligodeoxynucleotides, oligoribonucleotides, or descendants that are either 5'- Phosphate and a 3'-hydroxy group or a 5'-hydroxy and a 3'-phosphate group or a 5'-phosphate and a 3'-amino group or a 5'-amino and one 3'-phosphate group or a 5'- and a 3'-phosphate group or more chemically contain linkable groups are attached to the immobilized template and in the presence of a water-soluble carbodiimide, preferably EDC, or another condensing agent such as cyanogen bromide or N-cyanoimidazole. The oligodexoynucleotide complementary to the 3 'end of the immobilized template has the function of a 5 'primer. At the 5 'end, it contains one of the under (1) ge called modifications and at the 3 'end one of the groups mentioned under (3).

(ad 4)(ad 4)

Die Denaturierung unter Ablösung der Kopie erfolgt entweder durch Einstellen einer geeigneten hohen Temperatur oder durch Elution mit einer Harnstofflösung oder einem anderen Denaturierungsmittel.Denaturation with replacement of the copy is done either by setting an appropriate high temperature or by elution with a urea solution or another denaturant.

Die abgelösten Kopien werden an frischem Träger - wie unter (1) beschrieben - immo­ bilisiert und dienen im nächsten Schritt als Matrize. Das neu belegte Trägermaterial wird mit demjenigen aus früheren Zyklen vereinigt. Immobilisierte (+)- und (-)-Stränge können getrennt oder gemeinsam vereinigt werden. Bei getrennter Vereinigung wer­ den die Schritte (3) abwechselnd mit (+)- und (-)-Primern durchgeführt,; bei gemeinsa­ mer Vereinigung wird jeder Schritt (3) mit beiden Primern durchgeführt. The detached copies are immobilized on fresh support - as described under (1) - and serve as a matrix in the next step. The newly occupied carrier material is combined with that from previous cycles. Immobilized (+) and (-) strands can be separated or combined together. In the case of separate union, steps ( 3 ) are carried out alternately with (+) and (-) primers; when combined, each step ( 3 ) is carried out with both primers.

(II)(II)

In der zweiten Verfahrensvariante entsprechen die Schritte (1), (3), (4) denen unter (I) genannten. Schritt (2) impliziert die enzymatische Verlängerung eines Primers oder die enzymatische Ligation von zwei oder mehreren Oligonucleotidfragmenten. Die zu amplifizierende Zielsequenz wird zunächst durch Verwendung eines 5-modifizierten Primers in eine 5'-terminal immobilisierbare Sequenz umgeschrieben. Nach Immobili­ sierung des Templats erfolgt Hybridisierung mit dem 5'-modifizierten Primer und des­ sen Verlängerung durch dNPT in Gegenwart einer Polymerase. Alternativ kann hier eine Ligase-katalysierte Verknüpfung von 5'-phosphorylierten Oligonukleotiden statt­ finden.In the second process variant, steps ( 1 ), ( 3 ), ( 4 ) correspond to those mentioned under (I). Step ( 2 ) implies the enzymatic extension of a primer or the enzymatic ligation of two or more oligonucleotide fragments. The target sequence to be amplified is first rewritten into a 5'-terminally immobilizable sequence using a 5-modified primer. After immobilization of the template, hybridization takes place with the 5'-modified primer and its extension by dNPT in the presence of a polymerase. Alternatively, a ligase-catalyzed linkage of 5'-phosphorylated oligonucleotides can take place here.

Fig. 4 faßt den Weg jedes einzelnen Trägers und die Menge des nach jedem Kopier­ cyclus erhaltenen Materials für das beschriebene Beispiel zusammen. Im allgemeinen braucht die Ausbeute p eines Replikationscyclus nicht notwendigerweise p = 1 zu erreichen, um einen exponentiellen Amplifikationsmodus zu ermöglichen. Im Falle palindromischer Matrizen, bei denen X = Y, Ax = Ay, Bx = By, ist die Menge des Mate­ rials xn, die man nach n Replikationscyclen aus einer Anganfsmenge x0 erhält, gege­ ben durch:
 Fig. 4 summarizes the path of each individual carrier and the amount of material obtained after each copy cycle for the example described. In general, the yield p of a replication cycle need not necessarily reach p = 1 to enable an exponential mode of amplification. In the case of palindromic matrices, in which X = Y, A x = A y , B x = B y , the amount of material x n that is obtained after n replication cycles from an initial set x 0 is given by:

xn = x0 . (1 + p)n (1),
x n = x 0 . (1 + p) n (1),

was für p < 0 ein exponentielles Wachstum ermöglicht. Bei nichtpalindromischen Matrizen, die unseren Experimenten zugrundeliegen, besteht jede Replikationsrunde aus zwei Kopiercyclen mit den individuellen Ausbeuten px und py für die Synthese von X bzw. Y. Hier folgt die Menge der immobilisierten Matrizen X und Y der Iterations­ folge:
which enables exponential growth for p <0. In the case of non-palindromic matrices on which our experiments are based, each replication round consists of two copying cycles with the individual yields p x and p y for the synthesis of X and Y. Here follows the set of immobilized matrices X and Y according to the iteration sequence:

xn+1 = xn + px . yn und yn+1 = yn + py . xn (2a, b),
x n + 1 = x n + p x . y n and y n + 1 = y n + p y . x n (2a, b),

was für ein exponentielles Wachstum sowohl px < 0 als auch py < 0 erfordert. Die Gleichungen (2a, b) ergeben:
which requires both p x <0 and p y <0 for exponential growth. Equations (2a, b) result in:

wobei x0 und y0 die Anfangsmenge von X bzw. Y bezeichnen. Ein Vergleich der expe­ rimentellen und theoretischen Werte für xn und yn wie er in der Legende von Fig. 4 angegeben ist, bestätigt, daß die in Fig. 4 gezeigten Daten mit einem exponentiellen Modus der Amplifikation für Matrizenmaterialien im Einklang stehen.where x 0 and y 0 denote the initial set of X and Y, respectively. A comparison of the experimental and theoretical values for x n and y n as given in the legend of FIG. 4 confirms that the data shown in FIG. 4 are consistent with an exponential mode of amplification for template materials.

Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert die Vorteile der Festphasenchemie mit der chemischen Replikation und kann für die nichtenzymatische und enzymatische Amplifikation von RNA, Peptiden und anderen Matrizen sowie für die Darwinsche Evolution in künstlichen chemischen Ökosystemen weiterentwickelt werden. Ähnliche Vorgänge haben vielleicht auch bei der Entstehung des Lebens auf der Erde eine Rolle gespielt, da sich die frühesten Replikationssysteme durch Ausbreiten auf minera­ lischen Oberflächen vermehrt haben könnten.The method according to the invention combines the advantages of solid-phase chemistry with chemical replication and can be used for non-enzymatic and enzymatic Amplification of RNA, peptides and other templates as well as for the Darwinian Evolution in artificial chemical ecosystems. Similar Events may also have an impact on the origin of life on earth Played a role since the earliest replication systems spread through minera surfaces could have increased.

Weiterhin bildet das erfindungsgemäße Verfahren ein erstes Beispiel für exponentielle Amplifikation und Festphasenchemie bei der chemischen Replikation. Die Festpha­ senchemie ist eine Voraussetzung für eine praktikable Automatisierung des Verfah­ rens, da im wesentlichen nur Pipettier- und Filtrationsschritte beteiligt sind. Die expo­ nentielle Amplifikation eröffnet die Möglichkeit einer gezielten molekularen Evolution. Im letzteren Zusammenhang hat das Verfahren das Potential einer steuerbaren Muta­ tionshäufigkeit, da die Freisetzung der Kopien in Schritt (4) von der thermodynami­ schen Stabilität der immobilisierten Duplexe abhängen sollte und Mutanten damit schneller als perfekte Kopien eluiert werden sollten (Fig. 5). Protokolle, die auf Temperaturcyclen (oder anderen Umgebungsparametern) sowie auf Lösungschemie beruhen, lassen sich weniger gut auf chemische Systeme anwenden, die auf kurzen Matrizen beruhen. Schnelle negative Temperatursprünge sowie eine schnelle Kondensationschemie wären notwendig, um die Reäquilibrierung der beteiligten Oligonucleotidkomplexe zu verhindern. Diese Bedingungen würden dann notwendigerweise die Genauigkeit des Matrizenkopierens beschränken, da die thermodynamische Kontrolle der molekularen Erkennung die Schwelle für die Kopiergenauigkeit in Abwesenheit eines energiedissipierenden Korrekturlesemechanismus festlegt.Furthermore, the method according to the invention forms a first example of exponential amplification and solid-phase chemistry in chemical replication. The solid phase chemistry is a prerequisite for practicable automation of the process, since essentially only pipetting and filtration steps are involved. Exponential amplification opens up the possibility of targeted molecular evolution. In the latter context, the method has the potential for a controllable mutation frequency, since the release of the copies in step ( 4 ) should depend on the thermodynamic stability of the immobilized duplexes and mutants should thus be eluted faster than perfect copies ( FIG. 5). Protocols based on temperature cycles (or other environmental parameters) as well as on solution chemistry are less applicable to chemical systems based on short matrices. Rapid negative temperature jumps as well as rapid condensation chemistry would be necessary to prevent re-equilibration of the oligonucleotide complexes involved. These conditions would then necessarily limit the accuracy of the template copy, since the thermodynamic control of the molecular recognition sets the threshold for the copy accuracy in the absence of an energy-dissipating proofreading mechanism.

Aus dem Vorstehenden ergibt sich unmittelbar, daß das erfindungsgemäße Verfahren von erheblichen Wert für den Entwurf von evolutionären chemischen Systemen sein kann. Andere Matrizen, Oberflächen, Matrizen-Oberflächen-Verknüpfungen können eingesetzt werden, enzymatische Varianten können erforscht werden, und verschie­ dene Schritte können miteinander kombiniert werden, so daß man zu einem höheren Niveau der Prozeßintegration und -autonomie gelangt. Es sind Protokolle denkbar, bei denen verwandte Matrizen nahe beieinander immobilisiert werden, so daß das Kon­ zept der Quasispezies [M. Eigen, Naturwissenschaften 58, 465-523 (1971)] eine räum­ liche Dimension erhält. Weiterhin können Protokolle, bei denen zwei oder mehr ver­ schiedene Klassen von Matrizenmolekülen, wie Oligonucleotide und Peptide, beteiligt sind, zur Selektion und Entdeckung von komplexeren kooperativen Systemen beitra­ gen. Kurzfristig läßt sich das Verfahren bereits auf die Chemie der Peptid- und pRNA- Replikation anwenden, die von den Gruppen von D. H. Lee et al, Nature 382, 525-528 (1996) und B. Martin et al, Helv. Chim. Acta 80, 1901-1951 (1997) beschrieben wur­ den, sowie für die Synthese von sogenannten Spiegelmer-RNA (Jens Fürste et al., Nature Biotechnology 14, 1112, 1116; 15, 229).From the above it follows directly that the method according to the invention be of considerable value for the design of evolutionary chemical systems can. Other matrices, surfaces, matrix-surface links can be be used, enzymatic variants can be researched, and various These steps can be combined with each other, so that you get to a higher one Level of process integration and autonomy. Protocols are conceivable at which related matrices are immobilized close to each other, so that the Kon  the quasi species [M. Eigen, Naturwissenschaften 58, 465-523 (1971)] one room dimension. Furthermore, protocols in which two or more ver different classes of template molecules, such as oligonucleotides and peptides, are involved are involved in the selection and discovery of more complex cooperative systems In the short term, the process can already be applied to the chemistry of peptide and pRNA Apply replication by the groups of D.H. Lee et al, Nature 382, 525-528 (1996) and B. Martin et al, Helv. Chim. Acta 80, 1901-1951 (1997) and for the synthesis of so-called Spiegelmer RNA (Jens Fürste et al., Nature Biotechnology 14, 1112, 1116; 15, 229).

Die Erfindung wird weiterhin anhand des nachfolgenden Beispiels näher erläutert.The invention is further illustrated by the following example.

Beispielexample Materialienmaterials

Die Synthese zwei komplementäre 14-mere Matrizen, X und Y sowie der vier Matrizenfragmente, Ax The synthesis of two complementary 14-mer matrices, X and Y and the four template fragments, A x

, Bx , B x

, Ay , A y

und By and B y

, erfolgte unter Verwendung von Standard- Phosphoramiditchemie (Literatur?). Der thiolmodifizierter Träger wurde aus kommer­ ziell erhältlicher 2-Pyridyldisulfid-aktivierter Agarose® , was carried out using standard phosphoramidite chemistry (literature?). The thiol-modified support was activated 2-pyridyl disulphide from Kommer essential available agarose ®

(Sepharose® (Sepharose ®

6B, Pharmacia) durch Reduktion mit Dithiothreit (DTT) erhalten.
Reduktionspuffer (RB): 100 mM DTT, 40 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,9; Immobilisierungspuffer (IB): 370 mM Natriumacetat/Essigsäure, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 4,4, entgast mit Argon, um Sauerstoff auszutreiben.
Verkappungspuffer (CB): 60 mM S-(2-Thiopyridyl)-2-mercaptoethanol, 40 mM MES, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 6,5.
Hybridisierungspuffer (HB): 100 mM MES, 40 mM MgCl2 6B, Pharmacia) by reduction with dithiothreitol (DTT).
Reduction buffer (RB): 100mM DTT, 40mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 1mM EDTA, pH 7.9; Immobilization buffer (IB): 370 mM sodium acetate / acetic acid, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 4.4, degassed with argon to drive off oxygen.
Capping buffer (CB): 60 mM S- (2-thiopyridyl) -2-mercaptoethanol, 40 mM MES, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.5.
Hybridization buffer (HB): 100 mM MES, 40 mM MgCl 2

, 1 M NaCl, 1 mM 2,2'-Dipyri­ dyldisulfid, pH 6,1.
Verknüpfungspuffer (LB): HB mit 0,2 M EDC, frisch vor der chemischen Verknüpfung., 1 M NaCl, 1 mM 2,2'-dipyridyl disulfide, pH 6.1.
Linking buffer (LB): HB with 0.2 M EDC, fresh before chemical linkage.

Allgemeine VerfahrenGeneral procedures

Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden alle trägerge­ stützten Reaktionen bei 25°C in Mikro-Spin-Zentrifugenfiltern (0,5 ml, Celluloseacetat mit 0,45-µm-Poren, Roth) durchgeführt, die in Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml) gestapelt waren. Jeder Filter einer Serie von 16 Filtern wurden mit 50 mg feuchter Sepharose® 6B (gemäß den Richtlinien des Herstellers gewaschen) beladen und dann zentrifugiert (3 min bei 4000 × g), um den Überstand zu entfernen. Vor einem Immobilisierungs­ schritt wurden die Kügelchen in 400 µl RB 1 h lang verquirlt, um die Thiolform von Sepharose 6B zu erzeugen. Dann wurde RB durch IB ersetzt, wobei die Zugabe von Puffer, Ultraschallbehandlung (10 s) und Zentrifugation sechsmal wiederholt wurden.Unless otherwise stated, all carrier-supported reactions were carried out at 25 ° C. in micro-spin centrifuge filters (0.5 ml, cellulose acetate with 0.45 μm pores, Roth), which were carried out in Eppendorf tubes (1.5 ml) were stacked. Each filter a series of filters 16 were loaded with 50 mg of moist Sepharose ® 6B (washed according to the manufacturer's guidelines) and then centrifuged (3 min at 4000 xg) to remove the supernatant to. Before an immobilization step, the beads were swirled in 400 ul RB for 1 h to generate the thiol form of Sepharose 6B. Then RB was replaced with IB, the addition of buffer, ultrasound treatment (10 s) and centrifugation being repeated six times.

ImmobilisierungImmobilization

Eine Suspension von SH-Sepharose® in 400 µl IB, die 20-40 nmol der jeweiligen Matrize enthielt, wurde durch 1 h Verquirlen mit 1000 U/min gerührt.A suspension of SH-Sepharose ® in 400 ul IB containing 20-40 nmol of the respective die, was stirred for 1 h by whisking with 1000 U / min.

VerkappenCapping

100 µl CB wurde zu der obigen Suspension gegeben. Nach 1 h Rühren wurden die Kügelchen durch Zentrifugation abgetrennt, in 400 µl CB erneut suspen­ diert und 1 h bei 25°C verquirlt. Dann wurde CB durch eine Lösung von 200 mM S-(2- Thiopyridyl)-2-mercaptoethanol in Ethanol ersetzt. Nach 2 h Verquirlen bei 70°C wurden die Kügelchen mit Ethanol (5 × 200 µl) und 1 M NaCl (5 × 200 µl) gewaschen.100 ul CB was added to the above suspension. After stirring for 1 h the beads were separated by centrifugation, resuspended in 400 µl CB diert and whisked at 25 ° C for 1 h. Then CB was dissolved by a solution of 200 mM S- (2- Thiopyridyl) -2-mercaptoethanol replaced in ethanol. After 2 hours whisking at 70 ° C the beads were washed with ethanol (5 × 200 μl) and 1 M NaCl (5 × 200 μl).

HybridisierungHybridization

Die Kügelchen wurden in 250 µl HB resuspendiert, der die komple­ mentären Heptamere in einer Konzentration von 400 µM enthielt. Die Temperatur wurde auf 85°C erhöht, innerhalb von 1 h auf 4°C gesenkt und 2 h lang auf diesem Wert belassen. Überschüssige Heptamere wurden entfernt, indem man die Kügelchen mit drei 200-µl-Portionen 1 M NaCl von 4°C wusch.The beads were resuspended in 250 ul HB, which the complete contained mental heptamers in a concentration of 400 µM. The temperature was increased to 85 ° C, decreased to 4 ° C within 1 h and on it for 2 h Leave value. Excess heptamers were removed by removing the beads washed with three 200 µl portions of 1 M NaCl at 4 ° C.

Chemische VerknüpfungChemical linkage

Die Kügelchen wurden in 375 µl LB resuspendiert, 40 h bei 4°C verquirlt und dreimal mit 200 µl 1 M NaCl von 4°C gewaschen.The beads were resuspended in 375 ul LB, at 40 h Whisked 4 ° C and washed three times with 200 µl 1 M NaCl at 4 ° C.

DenaturierungDenaturation

Ein Mikro-Spin-Filter mit den entsprechenden Kügelchen wurde in ein Eppendorf-Röhrchen eingesetzt, das 150 µl 1 M Acetatpuffer (pH 4,4) enthielt. Die Kügelchen wurden resuspendiert und in 50 µl 0,1 M NaOH leicht gerührt, und der Überstand wurde durch Zentrifugation (7000 × g, 30 s) in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen. Nach dreimaligem Wiederholen dieses Verfahrensschrittes war die resul­ tierende Lösung (400 µl) bereit für den nächsten Cyclus. Die Kügelchen wurden durch Waschen mit vier Portionen HB recycelt.A micro-spin filter with the appropriate beads was placed in a Eppendorf tube used, which contained 150 ul 1 M acetate buffer (pH 4.4). The Beads were resuspended and gently stirred in 50 µl 0.1 M NaOH, and the The supernatant was centrifuged (7000 x g, 30 s) in an Eppendorf tube transfer. After repeating this process step three times, the result was solution (400 µl) ready for the next cycle. The beads were through Wash with four portions of HB recycled.

HPLCHPLC

Alle HPLC-Proben ohne Reduktionspuffer (RB) wurden vor der Analyse auf eine Konzentration von 100 mM DTT gebracht, um die Reproduzierbarkeit zu gewähr­ leisten. Alle Trennungen wurden auf einer RP-C-18-Säule (250/4, Nucleosil® 120-5 AB, Macherey & Nagel) durchgeführt. Eluate: 0,1 M Triethylammoniumacetat (pH = 7)/MeCN 1% (A) und MeCN (B). Analytische Messungen wurden bei 50°C vorge­ nommen, indem man einen Gradienten von 2% bis 6% A in 2 min, 6% bis 25% A in 30 min und eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min verwendete. Das Eluat wurde gleichzeitig bei 254 nm und 273 nm überwacht. Ausrüstung (Kontron): zwei Pumpen 422, Autosampler 465, Flächenempfänger 440.Kroma 2000 wurde als Datenerfas­ sungssystem verwendet.All HPLC samples without reduction buffer (RB) were brought to a concentration of 100 mM DTT before analysis in order to ensure reproducibility. All separations were RP-C-18 column conducted on a (250/4, 120-5 Nucleosil ® AB, Macherey & Nagel). Eluates: 0.1 M triethylammonium acetate (pH = 7) / MeCN 1% (A) and MeCN (B). Analytical measurements were made at 50 ° C using a gradient of 2% to 6% A in 2 min, 6% to 25% A in 30 min and a flow rate of 1 ml / min. The eluate was monitored simultaneously at 254 nm and 273 nm. Equipment (Kontron): two pumps 422, autosampler 465, area receiver 440. Kroma 2000 was used as the data acquisition system.

Experimentexperiment

Zur Ausführung des in Fig. 2 skizzierten Verfahrens wurde zunächst die 14-meren Matrizen X und Y unter Verwendung von Disulfid-Austauschreaktionen [J. R. Lorsch, Nature 371, 31-36 (1994)] jeweils auf eine Charge des SH-Trägers immobili­ siert, wobei man die matrizentragenden Träger X0 und Y0 erhielt. Die Effizienz des Immobilisierungsschrittes wurde durch HPLC-Analyse des Überstandes bestimmt (Fig. 3a, b). Die restlichen Thiolgruppen der Träger wurden durch Reaktion mit S-(2- Thiopyridyl)-2-mercaptoethanol verkappt. Dann wurden die Fragmente Ax, Bx und Ay, By mit den immobilisierten Matrizen Y0 bzw. X0 hybridisiert.To carry out the process outlined in FIG. 2, the 14-mer matrices X and Y were first immobilized onto a batch of the SH support using disulfide exchange reactions [JR Lorsch, Nature 371, 31-36 (1994)], to obtain the matrix supports X0 and Y0. The efficiency of the immobilization step was determined by HPLC analysis of the supernatant ( Fig. 3a, b). The remaining thiol groups on the supports were capped by reaction with S- (2-thiopyridyl) -2-mercaptoethanol. Then the fragments A x , B x and A y , B y were hybridized with the immobilized matrices Y0 and X0, respectively.

Zur Bestimmung der Hybridisierungseffizienz wurde ein Teil des Trägers mit DTT re­ duziert und durch HPLC analysiert (Fig. 3c). Die chemische Verknüpfung [N. G. Dolinnaya et al., Nucleic Acids Res. 19, 3073-3080 (1991); K. D. James et al. Chem. Biol. 4, 595-605 (1997)] wurde erreicht, indem man den Hybridisierungspuffer gegen einen Verknüpfungspuffer austauschte, der N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)- carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) als Kondensationsmittel enthielt.To determine the hybridization efficiency, part of the support was reduced with DTT and analyzed by HPLC ( FIG. 3c). The chemical linkage [NG Dolinnaya et al., Nucleic Acids Res. 19, 3073-3080 (1991); KD James et al. Chem. Biol. 4, 595-605 (1997)] was achieved by exchanging the hybridization buffer for a linking buffer which contained N-ethyl-N '- (dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) as a condensing agent.

Zur Bestimmung der Effizienz der Ligasierung wurde die Produktbildung durch die HPLC-Analyse des Produktgemischs überwacht, das man nach der Spaltung der Disulfidbindungen eines Aliquots der matrizentragenden Träger mit DTT als Redukti­ onsmittel erhielt (Fig. 3d). Dann wurden die Kopien durch Spülen der Träger mit 0,1 M NaOH freigesetzt, durch HPLC analysiert und auf zwei neuen Chargen des SH- Trägers erneut immobilisiert, was die matrizentragenden Träger X1 (Kopie des matri­ zentragenden Trägers Y0) und Y1 (Kopie des matrizentragenden Trägers X0) ergab.To determine the efficiency of the ligation, the product formation was monitored by HPLC analysis of the product mixture obtained after cleavage of the disulfide bonds of an aliquot of the matrix-carrying supports with DTT as reducing agent ( FIG. 3d). Then the copies were released by rinsing the supports with 0.1 M NaOH, analyzed by HPLC and re-immobilized on two new batches of the SH support, showing the matrix-carrying carriers X1 (copy of the matrix-centering carrier Y0) and Y1 (copy of the matrix-carrying carrier) Carrier X0) resulted.

Für die nächste Generation wurde der gesamte Kreislauf von Schritten mit jeder der vier Chargen X0, Y0, X1 und Y1 wiederholt, was Y2, X2, Y3 bzw. X3 ergab. Eine wei­ tere Runde ergab die matrizentragenden Träger X4. .X7, Y4. .Y7 (Fig. 3e, f). For the next generation, the entire cycle of steps was repeated with each of the four batches X0, Y0, X1 and Y1, resulting in Y2, X2, Y3 and X3, respectively. Another round showed the matrix-bearing beams X4. .X7, Y4. .Y7 ( Fig. 3e, f).

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims (18)

1. Verfahren zur chemischen Evolution durch exponentielle Amplifikation molekularer Matrizen, umfassend einen oder mehrere der Evolutionszyklen
  • 1. Selektion einer Subpopulation molekularer Matrizen aus einer kombinatorischen Ausgagsbibliothek; und
  • 2. Amplifikation und Mutation der selektiven Matrizen zur Bereitstellung einer Mutantenbibliothek, umfassend eine oder mehrere der folgenden Amplifikationszyklen:
    • a) Binden von molekularen Matrizen an die Oberfläche einer Festphase mittels eines reversiblen Linkers an der Matrize;
    • b) Zugabe von Matrizenfragmenten, wobei eines der Fragmente eine gegebenenfalls geschützte Linkereinheit aufweist;
    • c) Synthese von Kopien der Matrize;
    • d) Entfernen von überschüssigen Matrizenfragmenten und Reaktionshilfstoffen;
    • e) Ablösen der Kopien von der Matrizen; und
    • f) Besiedlung freier Bindungsstellen an der Festphase durch synthetisierte Matrizenkopien.
1. A method for chemical evolution by exponential amplification of molecular matrices, comprising one or more of the evolution cycles
  • 1. selection of a subpopulation of molecular matrices from a combinatorial library; and
  • 2. Amplification and mutation of the selective matrices to provide a mutant library, comprising one or more of the following amplification cycles:
    • a) binding of molecular matrices to the surface of a solid phase by means of a reversible linker on the matrix;
    • b) addition of template fragments, one of the fragments having an optionally protected linker unit;
    • c) synthesis of copies of the template;
    • d) removing excess template fragments and reaction aids;
    • e) removing the copies from the matrices; and
    • f) Colonization of free binding sites on the solid phase by synthesized template copies.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die in Schritt (e) erzeugte Matrizenkopie iden­ tisch oder komplementär zu der Ausgangsmatrizen sind.2. The method of claim 1, wherein the template copy generated in step (e) iden are table or complementary to the original matrices. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei nach Schritt (a) überschüssige Bin­ dungsstellen an der Festphase blockiert werden.3. The method according to claim 1 or 2, wherein after step (a) excess bin junction points on the solid phase are blocked. 4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei die freien Bindungsstellen an der Festphase in Schritt (f) durch Freisetzen neuer Bindungsstellen an der Festphase, Zugabe neuen Festphasenmaterials oder Transfer der in (e) gebil­ deten Matrizenkopie auf neues Festphasenmaterial erzeugt werden.4. The method according to one or more of claims 1 to 3, wherein the free Binding sites on the solid phase in step (f) by releasing new binding sites on the solid phase, adding new solid phase material or transfer of the in (e) deten matrix copy are generated on new solid phase material. 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die in Schritt (e) erzeugten Matrizen komple­ mentär zu den Ausgangsmatrizen sind und auf neues Matrizenmaterial transferiert werden. 5. The method according to claim 4, wherein the matrices generated in step (e) are complete are mental to the original matrices and transferred to new matrix material become.   6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Linkereinheit des Matrizenfrag­ ments in Schritt (b) geschützt ist und die in Schritt (e) gebildeten Matrizenkopien ent­ schützt werden.6. The method according to claim 1 or 2, wherein the linker unit of the matrix question is protected in step (b) and ent the matrix copies ent formed in step (e) be protected. 7. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Matrizen eine Länge von 2 bis 2000, insbesondere von 4 bis 50 Monomoreinheiten aufweisen und als Matrizenfragmente Monomereinheiten oder oligomere Monomereinheiten verwendet werden.7. The method according to one or more of claims 1 to 6, wherein the matrices have a length of 2 to 2000, in particular 4 to 50, monomer units and as template fragments, monomer units or oligomeric monomer units be used. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 7, wobei die Menge in Schritt (a) eingesetzter Matrizen von 10-15 bis 10-1 mol/l beträgt und die Konzentration der Matrizenfragmente in Schritt (b) von 10-12 bis 1 mol/l beträgt.8. The method according to claim 1 or 7, wherein the amount of matrices used in step (a) is from 10 -15 to 10 -1 mol / l and the concentration of the template fragments in step (b) is from 10 -12 to 1 mol / l is. 9. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-8, wobei die molekularen Matrizen ausgewählt sind aus Nukleotiden und Nukleotidabkömmlingen, Peptiden und Peptidabkömmlingen.9. The method according to one or more of claims 1-8, wherein the molecular Matrices are selected from nucleotides and nucleotide derivatives, peptides and Peptide derivatives. 10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, wobei die in Schritt (c) gebildeten Bindungen ausgewählt sind aus Phosphorsäuredieester-, Phosphor­ säure-amidester-, Ester-, Amid-, Disulfid-, Acetal- und C-C-Bindungen.10. The method according to one or more of claims 1-9, wherein the step (c) The bonds formed are selected from phosphoric acid diesters, phosphorus acid amide ester, ester, amide, disulfide, acetal and C-C bonds. 11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 10, wobei die Bindungsknüpfung in Schritt (c) chemisch oder durch enzymatische Verknüpfung erfolgt.11. The method according to claim 1 or 10, wherein the binding in step (c) done chemically or by enzymatic linkage. 12. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-11, wobei der Linker mittels kovalenter oder nichtkovalenter Bindungen an die Festphase bindet.12. The method according to one or more of claims 1-11, wherein the linker binds to the solid phase by means of covalent or noncovalent bonds. 13. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-12, wobei das Festpha­ senmaterial ausgewählt ist aus organischem oder anorganischem Material oder aus einem Hybrid dieser Materialien.13. The method according to one or more of claims 1-12, wherein the solid phase is selected from organic or inorganic material or from a hybrid of these materials. 14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-13, Wobei die Selektion der Subpopulation molekularer Matrizenmoleküle in Schritt (1) durch eine reversible Bindung an eine oder mehrere Zielstrukturen erfolgt. 14. The method according to one or more of claims 1-13, wherein the selection of the subpopulation of molecular template molecules in step ( 1 ) is carried out by a reversible binding to one or more target structures. 15. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-14, wobei die in Schritt (2) erhaltene Mutantenbibliothek die Ausgangsbibliothek für den nächsten Evolutionszyklus ist.15. The method according to one or more of claims 1-14, wherein the mutant library obtained in step ( 2 ) is the starting library for the next evolution cycle. 16. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-15, wobei die Mutation durch die Reaktionsparameter in den Schritten (b) und (c) des Amplifikationszyklus gesteuert wird.16. The method according to one or more of claims 1-15, wherein the mutation by the reaction parameters in steps (b) and (c) of the amplification cycle is controlled. 17. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-16, wobei der erste Evolutionszyklus noch den folgenden Schritt (1') umfaßt: (1') Versehen der selektierten molekularen Matrizen mit einem reversiblen Linker.17. The method according to one or more of claims 1-16, wherein the first Evolution cycle still includes the following step (1 '): (1 ') Provide the selected molecular matrices with a reversible linker. 18. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1-17, wobei in Ablöseschritt (e) durch selektives Ablösen eine zusätzliche Selektion erfolgt.18. The method according to one or more of claims 1-17, wherein in Replacement step (s) by selective replacement, an additional selection is made.
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WO1996013609A1 (en) * 1994-10-28 1996-05-09 Genset Solid-phase nucleic acid amplification method and reagent kit therefor

Patent Citations (1)

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