DE19846011C2

DE19846011C2 - Process for the purification of preparations containing granulocytes

Info

Publication number: DE19846011C2
Application number: DE19846011A
Authority: DE
Inventors: Andreas Emmendoerffer; Kerstin Puellmann; Janos Kadar
Original assignee: DRK Blutspendedienst Nordrhein Westfalen gGmbH
Current assignee: DRK Blutspendedienst Nordrhein Westfalen gGmbH
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2001-09-27
Anticipated expiration: 2018-10-07
Also published as: DE19846011A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufreinigung von Granulozyten enthaltenden Präparaten, bei dem die nicht funktionellen Granulozyten, insbesondere Vor läuferzellen von Granulozyten, aus dem Präparat abgetrennt werden. Derartige Granulozyten enthaltende Präparate werden im Bereich der Transfusionsmedizin, Hämatologie, Onkologie Blutspende, Pädiatrie etc. erzeugt bzw. verwendet. Insbeson dere werden Granulozytenpräparate für die Granulozytentrans fusion bei der Therapie antibiotisch schwer zu beherrschen der Infektionen, bei der Prophylaxe bei Patienten mit hohem Infektionsrisiko oder auch zur Behandlung angeborener Granu lozytenfunktionsstörungen beispielsweise in der Pädiatrie eingesetzt.The present invention relates to a method for Purification of preparations containing granulocytes, at which the non-functional granulocytes, especially Vor Runner cells from granulocytes, separated from the preparation become. Such granulocyte-containing preparations in the field of transfusion medicine, hematology, oncology Blood donation, pediatrics etc. generated or used. In particular others are granulocyte preparations for the granulocyte trans antibiotic therapy difficult to master in therapy infections, in prophylaxis in patients with high Risk of infection or for the treatment of congenital granu oocyte dysfunction, for example in pediatrics used.

Die Transfusion von Granulozytenpräparaten ist seit mehreren Jahrzehnten Bestandteil der Therapie antibiotisch schwer zu beherrschender Infektionen. Für die Transfusion werden min destens 1 bis 2 × 10¹⁰ Zellen benötigt. Diese hohe Zahl von Zellen wird von Normalspendern nur selten erreicht, so daß gewöhnlich die Granulozyten aus dem Knochenmark durch Gabe von Steroiden, wie beispielsweise Dexamethason, Prednison oder Methylprednison, mobilisiert werden. Mit Einführung von G-CSF in den klinischen Bereich für die Mobilisation von Granulozyten zur Vorbereitung von Spendern für Granulozyten präparate konnte die Effizienz der Mobilisierung gegenüber den Steroiden weiter gesteigert werden. Der Stand der Tech nik bei dem Einsatz von Granulozytenpräparaten wird bei spielsweise in Emmendoerffer A. et al. "Kinetics of transfu sed neutrophils in peripheral blood and BAL fluid of a pati ent with x-linked chronic granulomatous disease" Eur. J. Haematol, Bd. 47, S. 246-252, 1991, beschrieben.The transfusion of granulocyte preparations has been part of the therapy of antibiotically difficult to control infections for several decades. At least 1 to 2 × 10 ¹⁰ cells are required for the transfusion. This high number of cells is rarely reached by normal donors, so that the granulocytes from the bone marrow are usually mobilized by administration of steroids, such as, for example, dexamethasone, prednisone or methylprednisone. With the introduction of G-CSF in the clinical area for the mobilization of granulocytes for the preparation of donors for granulocyte preparations, the efficiency of the mobilization compared to the steroids could be further increased. The state of the art in the use of granulocyte preparations is, for example, in Emmendoerffer A. et al. "Kinetics of transfu sed neutrophils in peripheral blood and BAL fluid of a patient with x-linked chronic granulomatous disease" Eur. J. Haematol, Vol. 47, pp. 246-252, 1991.

In einem weiteren Dokument [M. K. Thomsen et al., "Enhanced granulocyte function in a case of chronic granulocytic leu kemia in a dog"; Zeitschrift Veterinary Immunology and Immu nopathology; 28 (1991), Seiten 143-156] wird beschrieben, wie Granulocytenproben in einzelne Fraktionen mit einer Dichtegradienten-Zentrifugation aufgetrennt werden. Dieses Verfahren erlaubt nur eine unscharfe Trennung und ergibt da mit eine relativ geringe therapeutische Effektivität des Produktes.In another document [M. K. Thomsen et al., "Enhanced granulocyte function in a case of chronic granulocytic leu kemia in a dog "; Journal Veterinary Immunology and Immu nopathology; 28 (1991), pages 143-156] is described like granulocyte samples into individual fractions with a Density gradient centrifugation can be separated. This The method only allows an unsharp separation and results in that with a relatively low therapeutic effectiveness of the Product.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Aufreinigung von Granulozyten zur Verfügung zu steilen, um den Reinheitsgrad, die therapeutische Effektivität und die Qualität der zur Granulozytentransfusion verwendeten Präpa rate zu verbessern, sowie nach diesem Verfahren hergestellte Granulozyten enthaltende Präparate in der Medizin zu verwen den.The object of the present invention is to provide a method for Purification of granulocytes available to steep the degree of purity, the therapeutic effectiveness and the Quality of the preparation used for granulocyte transfusion rate to improve, as well as manufactured by this method Preparations containing granulocytes can be used in medicine the.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1, so wie die Verwendung der nach diesem Verfahren hergestellten Präparate nach Anspruch 10 gelöst. This object is achieved by the method according to claim 1 how the use of the preparations prepared by this method according to claim 10 solved.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfah rens werden in den abhängigen Ansprüchen 2-9 gegeben. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Aufreinigung von Granulozyten enthaltenden Präparaten werden aus diesen Prä paraten die nicht funktionalen, beispielsweise die chemotak tisch nicht aktiven, in der Sauerstoffradikalproduktion schwachen oder negativen Granulozyten, insbesondere die Vor läuferzellen der Granulozyten abgetrennt. Wesentlich für dieses Verfahren ist die Erkenntnis, daß Granulozyten, die z. B. durch G-CSF beschleunigt aus dem Knochenmark ausge schüttet wurden und in das periphere Blut gelangten sich in Abhängigkeit von ihrem Reifungs- und Differenzierungsgrad von normalen neutrophilen Granulozyten in der Expression be stimmter Oberflächenantigene und in ihrer Funktion (Chemota xis, Sauerstoffradikalproduktion) unterscheiden.Advantageous further developments of the method according to the invention rens are given in dependent claims 2-9. According to the inventive method for the purification of Preparations containing granulocytes are prepared from these preparations prepare the non-functional ones, for example the chemotak table not active, in oxygen radical production weak or negative granulocytes, especially the pre rotor cells of the granulocytes separated. Essential for this method is the discovery that granulocytes that e.g. B. accelerated by G-CSF from the bone marrow were poured and got into the peripheral blood Depends on their degree of maturation and differentiation of normal neutrophil granulocytes in expression surface antigens and in their function (Chemota xis, oxygen radical production) distinguish.

Insbesondere bei mehrfacher Gabe von G-CSF erhöht sich hier der Anteil an jungen Granulozyten aus dem Knochenmark. Ne benwirkung der allogenen Granulozytentransfusion ist das Auftreten antigranulozytärer Antikörper im Empfänger, wobei die Wahrscheinlichkeit hierfür und der jeweilige, Titer der Antikörper mit der Zahl der transfundierten Präparate korre liert. Zum anderen werden durch die intensive Mobilisation auch Vorläuferzellen von Granulozyten aus dem Knochenmark ausgeschüttet, die im Hinblick auf die Sauerstoffradikalpro duktion negativ bzw. signifikant schwächer und außerdem che motaktisch inaktiv sind. Der Anteil dieser Zellen schwankt in Abhängigkeit von der Art und Dauer der Mobilisation, in Abhängigkeit von der Art der Zellapharese bzw. der Lagerdau er des Präparates zwischen 5% und 80% der Zellen des Prä parates. Dies bedeutet eine hohe Variabilität in der Quali tät der Präparate, was sowohl für den therapeutischen Erfolg als auch für die mit der Transfusion verbundenen Nebenwir kungen beim Empfänger eine unnötige Belastung darstellt. Durch die Abtrennung der chemotaktisch inaktiven und bei der Sauerstoffradikalproduktion negativ bzw. signifikant schwä cheren Vorläuferzellen oder überalterten Granulozyten werden die reifen, funktionell aktiven Granulozyten angereichert und der Anteil funktionell inkompetenter und somit unnötig transfundierter Zellen reduziert. Dies führt zu einer Ver minderung der Belastung des Empfängers, da die funktionell inkompetenten Zellen von dessen Makrophagensystem abgebaut werden und gegebenenfalls die Induktion von Alloantikörpern gegen die transfundierten Granulozyten fördern. Es ergibt sich folglich eine bessere Qualität der Granulozyten enthal tenden Präparate und eine damit verbundene bessere Steuer barkeit der Therapie. Der erhöhte Anteil funktionell aktiver Granulozyten, die transfundiert werden und sofort für die Infektabwehr zur Verfügung stehen, führt zu einer erhöhten therapeutischen Effektivität des Granulozyten enthaltenden Präparates.In particular when G-CSF is administered more than once, this increases the proportion of young granulocytes from the bone marrow. No This is the effect of the allogeneic granulocyte transfusion Antigranulocytic antibodies appear in the recipient, whereby the probability of this and the respective, titer of Antibodies correct with the number of preparations transfused profiled. On the other hand, through intensive mobilization also precursor cells of granulocytes from the bone marrow distributed in terms of oxygen radicalpro Production negative or significantly weaker and also che are motively inactive. The proportion of these cells fluctuates depending on the type and duration of the mobilization, in Depends on the type of cell aparesis or the storage period he of the preparation between 5% and 80% of the cells of the pre ready. This means a high variability in quality act of the preparations, both for the therapeutic success as well as for the side effects associated with the transfusion a unnecessary burden on the recipient. By separating the chemotactically inactive and at the Oxygen radical production negatively or significantly weak chere precursor cells or aged granulocytes the mature, functionally active granulocytes are enriched and the proportion is functionally incompetent and therefore unnecessary transfused cells reduced. This leads to a ver reduce the burden on the recipient as the functional incompetent cells are broken down by its macrophage system and if necessary the induction of alloantibodies against the transfused granulocytes. It results consequently, the quality of the granulocytes is better trending preparations and a related better tax availability of therapy. The increased proportion is functionally more active Granulocytes that are transfused and immediately for the Defense against infection is available leads to an increased therapeutic effectiveness of the granulocyte-containing Preparation.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren dadurch durchgeführt, daß das Granulozyten enthaltende Präparat mit Annexin V oder Antikörpern, die Verläuferzellen der Granulo zyten erkennen, inkubiert wird. Dabei macht man sich die Er kenntnis zunutze, daß die aus dem Knochenmark, z. B. durch G- CSF, Steroide oder eine Kombination aus Steroiden und G-CSF oder durch pflanzliche oder bakterielle Polysaccharide mobi lisierten Granulozyten sich gemäß der nachfolgenden Tabelle 1 in einer Reihe von Oberflächenmarkern und Funktionen von den normalen Granulozyten unterscheiden According to the present invention, the method is thereby carried out that the preparation containing granulocytes with Annexin V or antibodies, the proliferative cells of the granulo recognize cells, is incubated. You make the Er knowledge that the bone marrow, e.g. B. by G- CSF, steroids or a combination of steroids and G-CSF or by plant or bacterial polysaccharides mobi Granulocytes were identified according to the table below 1 in a range of surface markers and functions from distinguish the normal granulocytes

Tabelle 1 Table 1

Veränderung Oberflächenmarker auf G-CSF induzier ten Granulozyten im Vergleich zu normalen Granulozyten Change in surface markers on G-CSF induced granulocytes compared to normal granulocytes

Die Erfindung macht sich dabei den Umstand zunutze, daß die se Zellen sich in der Durchflußzytometrie neben dem Scatter profil (Größe und Granularität) deutlich in der Expression von Phosphatidylserin von normalen Granulozyten unterschei den. Sie zeichnen sich durch eine äußerst hohe Expression von Phosphatidylserin aus. Diese Expression kann im Durch flußzytometer mittels einer Bindung von beispielsweise FITC- markiertem Annexin V nachgewiesen werden. Diese Erkenntnis, daß die Vorläuferzellen der Granulozyten Annexin V binden und folglich mit Annexin V markiert werden können kann nun vorteilhaft zur Abtrennung dieser Vorläuferzellen verwendet werden.The invention takes advantage of the fact that the These cells are located in the flow cytometry next to the scatter profile (size and granularity) clearly in the expression of phosphatidylserine different from normal granulocytes the. They are characterized by an extremely high expression from phosphatidylserine. This expression can be flow cytometer using a binding of, for example, FITC labeled Annexin V can be detected. This realization that the precursor cells of granulocytes bind Annexin V. and consequently can be marked with Annexin V now used advantageously for the separation of these precursor cells become.

Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, daß Annexin V an Trägermaterial gebunden wird und anschließend in der Gegen wart von Kalziumionen das Granulozyten enthaltende Präparat mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht wird. Das Träger material kann dabei auch aus magnetischen Beads bestehen. Geraten die Vorläuferzellen der Granulozyten in Kontakt mit dem Annexin V, so binden sie sich an dieses und sind folg lich auch an das Trägermaterial gebunden. Sie können daher einfach durch Entfernung des Trägermaterials, beispielsweise über ein Magnetfeld zur Entfernung der magnetischen Beads, entfernt werden. Dasselbe Verfahren läßt sich statt mit An nexin V auch mit Antikörpern durchführen, die die Vorläuferzellen der Granulozyten erkennen. Derartige Antikörper sind beispielsweise die Antikörper CD13, CD33, CD117.This can happen, for example, that Annexin V on Backing material is bound and then in the counter were calcium ion the granulocyte-containing preparation is brought into contact with the carrier material. The carrier Material can also consist of magnetic beads. If the precursor cells of the granulocytes come into contact with Annexin V, they bind themselves to this and are followed Lich also bound to the carrier material. So you can simply by removing the carrier material, for example via a magnetic field to remove the magnetic beads, be removed. The same procedure can be used instead of An nexin V also perform with antibodies that target the progenitor cells of granulocytes. Such antibodies are for example the antibodies CD13, CD33, CD117.

Als Alternative hierzu können markiertes Annexin V oder ent sprechende markierte Antikörper eingesetzt werden, indem diese mit dem Granulozyten enthaltenden Präparat vermischt werden. Die Vorläuferzellen der Granulozyten binden an schließend an das markierte Annexin V bzw. an die markierten Antikörper und können anschließend aufgrund der Markierung abgetrennt werden. Besonders geeignet ist dabei eine fluoro chrome Markierung des Annexin V oder der Antikörper. Diese können anschließend zusammen mit den Vorläuferzellen der Granulozyten beispielsweise durch Chromatographie oder in einem Sorter, aus dem Präparat abgetrennt werden.As an alternative, labeled Annexin V or ent speaking labeled antibodies can be used by this mixed with the preparation containing granulocytes become. The granulocyte progenitor cells bind following the marked Annexin V or the marked Antibodies and can subsequently due to the labeling be separated. A fluoro is particularly suitable chrome marking of Annexin V or antibodies. This can then together with the precursor cells of the Granulocytes for example by chromatography or in a sorter from which the preparation is separated.

Die durch dieses erfindungsgemäße Verfahren aufgereinigten Granulozyten enthaltenden Präparate werden in der Transfusi onsmedizin, Hämatologie, Onkologie, Blutspende, Pädiatrie, insbesondere zur Behandlung von antibiotisch schwer zu be herrschenden Infektionen oder zur Prophylaxe von Patienten mit hohem Infektionsrisiko eingesetzt.The purified by this inventive method Granulocyte-containing preparations are in the Transfusi ons medicine, hematology, oncology, blood donation, pediatrics, especially for the treatment of antibiotic difficult to be prevalent infections or for the prophylaxis of patients used with a high risk of infection.

Im folgenden werden einige vorteilhafte Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Granulozyten enthaltenden Präparate beschrieben. Es zeigenThe following are some advantageous embodiments of the inventive method and the inventive Preparations containing granulocytes are described. Show it

Fig. 1a den Anteil an Annexin-V-positiven Zellen 24 Stunden nach Gabe von G-CSF (Fall 1) im FSC/SSC-Dotplot; FIG. 1a is the percentage of annexin V-positive cells 24 hours after administration of G-CSF (case 1) in the FSC / SSC dot plot;

Fig. 1b denselben Anteil im FL1-Histogramm mit Annexin V- FITO zum Anfärben der Zellen; FIG. 1b shows the same portion in the FL1 histogram with Annexin V- FITO for staining of the cells;

Fig. 2a den Anteil Annexin-V-positiver Zellen 48 Stunden nach der Gabe von G-CSF im Blut von Fall 1 im FSC/SSC-Dotplot; FIG. 2a shows the proportion annexin V-positive cells 48 hours after the administration of G-CSF in the blood of the case 1 in the FSC / SSC dot plot;

Fig. 2b das zu Fig. 2a zugehörige FL1-Histogramm mit Annexin V-FITC zum Anfärben der Zellen; FIG. 2b shows the Figure 2a corresponding FL1 histogram with Annexin V-FITC staining of the cells.

Fig. 3 den Anteil an Annexin-V-positiven Zellen 48 Stunden nach der Gabe von G-CSF im Blut von Fall 2 im FSC/SSC-Dotplot; FIG. 3 shows the percentage of annexin V-positive cells 48 hours after the administration of G-CSF in the blood of the case 2 in the FSC / SSC dot plot;

Fig. 4 den Anteil an Annexin-V-positiven Zellen nach Reduk tion in der Magnetseparation im Fall 2; FIG. 4 shows the percentage of annexin V-positive cells after reductive tion in the magnetic separation in the case 2;

Fig. 5 die Anreicherung an Annexin-V-positiven Zellen nach Magnetseparation im Fall 2; FIG. 5 shows the accumulation of Annexin V-positive cells by magnetic separation in the case 2;

Fig. 6 den Phänotyp der Annexin-V-positiven Zellen nach Pap penheim-Färbung. Fig. 6 shows the phenotype of Annexin V positive cells after Pap penheim staining.

Die Fig. 1 bis 6 zeigen Ergebnisse zweier Probandenfälle, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wurde. Figs. 1 to 6 show results of two subjects cases where the inventive method was applied.

In beiden Fällen wurden 300 ml heparinisiertes venöses Voll blut eines gesunden Spenders, der 48 bzw. 24 Stunden zuvor einmalig mit 300 µg rhu G-CSF subcutan behandelt wurde, mit Hydroxyethylstärke (6%) in einem Verhältnis von 1 : 2 ge mischt. Das Vollblut wurde dabei durch einfache Blutabnahme gewonnen. Die Erythrozyten wurden durch Sedimentation für 30 Minuten bei Raumtemperatur aus dem Vollblut abgetrennt. Der leukozytenhaltige Überstand wurde abgenommen und mit phos phatgepufferter Kochsalzlösung ohne Magnesium und Kalzium (PBS-MC) in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt. Die Leuko zyten wurden daraufhin in Granulozyten und mononukleäre Zellen über einen Ficoll-Dichtegradienten (20 Minuten, 750 × g) aufgetrennt. Der Überstand dieses Dichtegradienten wurde entfernt und das granulozytenhaltige Sediment gesammelt. An schließend wurde das granulozytenhaltige Sediment durch hy potone Lyse von kontaminierenden Erythrozyten gereinigt. Ei ne Probengewinnung durch Apharese wäre ebenfalls möglich. Die Zellen wurden gezählt und in einen kalziumhaltigen Puf fer überführt. Der die Granulozyten enthaltende kalziumhal tige Puffer wurde zu Annexin V-beladenen magnetischen Beads gegeben und diese Mischung anschließend inkubiert. Während dieser Inkubation banden diese Vorläuferzeller der Granulo zyten an das Annexin V an und wurden so mit den magnetischen Beads gekoppelt. Die Annexin V-positiven Zellen wurden an schließend über eine Säule magnetisch mit den Beads ent fernt. Die Annexin V-negativen Zellen enthaltende Lösung wurde anschließend mittels durchflußzytometrischer Analyse an einem FACScan (Becton Dickinson) gemessen und mit den Zellen der unseparierten Fraktion verglichen.In both cases, 300 ml heparinized venous whole blood from a healthy donor 48 or 24 hours beforehand was treated subcutaneously with 300 µg rhu G-CSF, with Hydroxyethyl starch (6%) in a ratio of 1: 2 ge mixes. The whole blood was obtained by simply taking a blood sample won. The erythrocytes were sedimented for 30 Minutes separated from whole blood at room temperature. The supernatant containing leukocytes was removed and phos phate-buffered saline without magnesium and calcium (PBS-MC) mixed in a ratio of 1: 1. The Leuko Cytes were then transformed into granulocytes and mononuclear cells via a Ficoll density gradient (20 minutes, 750 × g) separated. The supernatant of this density gradient was removed and the sediment containing granulocytes collected. On the granulocyte-containing sediment was then closed by hy Potonic lysis cleaned from contaminating erythrocytes. Egg ne sampling by apharesis would also be possible. The cells were counted and placed in a calcium-containing pouf fer convicted. The calcium hal containing the granulocytes buffer became annexin V-loaded magnetic beads given and then incubated this mixture. While This precursor cell of the Granulo bound to this incubation cyan to Annexin V and were thus treated with the magnetic Beads coupled. The Annexin V positive cells were on conclude magnetically with the beads via a column distant. Solution containing Annexin V negative cells was then by means of flow cytometric analysis measured on a FACScan (Becton Dickinson) and with the Cells of the unseparated fraction compared.

Die durchflußzytometrische Analyse der angereicherten Granu lozytenfraktion des Probandenfalls 1, der einmalig mit G-CSF 300 µg s. c. behandelt worden war, zeigt gemäß Fig. 1a den Anteil an Annexin V positiven Zellen nach 24 Stunden. Fig. 1a ist dabei ein FSC/SSC-Dotplot (Forward Scatter/Side Scat terDotplot) wobei mit R1 der Meßbereich angegeben ist, des sen Meßwerte dem Anteil Annexin V positiver Zellen ent spricht. Der Bereich R2 entspricht dabei funktionell aktiven neutrophilen Granulozyten. Fig. 1b zeigt im FL 1-Histogramm die Anteile der einzelnen Fraktionen an Vorläuferzellen der Granulozyten und intakten Granulozyten in den einzelnen Be reichen R1 bzw. R2. Dabei entspricht die mit G1 bezeichnete Kurve den Messungen, die bei der Beschränkung der Messung auf ein Fenster gemäß dem Bereich R1 in Fig. 1a bestimmt wurden. Die Kurve G2 wurde mit einem Fenster gemäß dem Be reich R2 in Fig. 1a aufgezeichnet. Fig. 2a und Fig. 2b zeigen dieselben Messungen 48 Stunden nach Gabe des G-CSF, wobei die Bezeichnungen R1, R2 und G1 und G2 wie in Fig. 1a und 1b verwendet werden. Wie unmittelbar in den Fig. 1a, 1b, 2a und 2b zu erkennen ist, zeigt sich die Anwesenheit von Annexin V positiven Zellen im peripheren Blut.The flow cytometric analysis of the enriched granulocyte fraction of test subject 1, which had been treated once with G-CSF 300 μg sc, shows the proportion of annexin V positive cells after 24 hours according to FIG. 1a. Fig. 1a is an FSC / SSC dot plot (forward scatter / side scatter dot plot) where R1 is the measuring range, whose measured values correspond to the proportion of Annexin V positive cells. The area R2 corresponds to functionally active neutrophil granulocytes. Fig. 1b-1 histogram shows the FL, the proportions of the individual fractions of precursor cells of granulocytes and intact granulocytes in the individual Be range R1 or R2. The curve labeled G1 corresponds to the measurements which were determined when the measurement was restricted to a window in accordance with the region R1 in FIG. 1a. The curve G2 was recorded with a window according to the range R2 in Fig. 1a. Fig. 2a and Fig. 2b show the same measurements 48 hours after administration of G-CSF, with the designations R1, R2 and G1 and G2 as shown in Fig. 1a and 1b are used. As can be seen directly in FIGS. 1a, 1b, 2a and 2b, the presence of Annexin V positive cells in the peripheral blood is evident.

Auch Fig. 3, die Messungen am Probandenfall 2 beschreibt, zeigt einen Anteil von Annexin V-positiven Zellen 48 Stunden nach der Gabe von G-CSF. Wie im Vergleich zu Fig. 2a gese hen werden kann, ist auch hier ein Anteil myeloischer, FITC- markierter Vorläuferzellen zu erkennen. Fig. 4 zeigt wei terhin die Ergebnisse eines FSC/SSC-Dotplot nach Reduktion des Anteils an Annexin V positiven Zellen in der in Fig. 3 dargestellten Probe über Magnetseparation. Diese Ergebnisse lassen sich bei mehrfacher Wiederholung des Separa tions/Aufreinigungsschrittes weiter verbessern. Demgegenüber zeigt Fig. 5 eine Fraktion, bei der der Anteil von Annexin V positiven Zellen angereichert wurde. Ausgangspunkt war wiederum das bei Fig. 3 beschriebene Material des Proban denfalles 2. Es ist unmittelbar zu erkennen, daß die im Be reich RI angesiedelten Annexin V-positiven myeloischen Vor läuferzellen gegenüber den in dem Bereich R2 angesiedelten neutrophilen, intakten Granulozyten stark angereichert sind. Fig. 6 zeigt den Phänotyp der Annexin V-positiven Zellen nach Pappenheim-Färbung aus dem Präparat des Probandenfalles 2. Dabei wurden Zellen ausgewählt, die sich in dem Bereich R1 gemäß Fig. 3 befinden. Die hier dargestellten mye loischen Vorläuferzellen entsprechen einem Anteil von ca. 20% bis 50%. Sie bestehen aus unreifen Zellen mit mononukleärem Charakter. Weiterhin sind normale Granulozyten zu erken nen, die durch segmentierte Kerne auffallen. FIG. 3, which describes measurements on test subject case 2, also shows a proportion of Annexin V-positive cells 48 hours after the administration of G-CSF. As can be seen in comparison to FIG. 2a, a portion of myeloid, FITC-labeled progenitor cells can also be seen here. FIG. 4 further shows the results of an FSC / SSC dot plot after reduction of the proportion of Annexin V positive cells in the sample shown in FIG. 3 by magnetic separation. These results can be further improved by repeating the separation / purification step several times. 5 In contrast, Fig., A fraction in which the fraction of Annexin V positive cells was enriched. The starting point was again the material of Proban denfall 2 described in FIG. 3. It can be seen immediately that the Annexin V-positive myeloid progenitor cells located in the RI region are strongly enriched compared to the neutrophilic, intact granulocytes located in the region R2. FIG. 6 shows the phenotype of the Annexin V-positive cells after Pappenheim staining from the preparation of the test subject case 2. In this case, cells were selected which are in the area R1 according to FIG. 3. The myolic progenitor cells shown here correspond to a share of approx. 20% to 50%. They consist of immature cells with a mononuclear character. Furthermore, normal granulocytes can be recognized, which are noticeable due to segmented nuclei.

Claims

1. Process for the purification of granulocytes contain the preparations in which the non-functional granulocytes, in particular precursor cells from granulocytes, are separated from the preparation, characterized in that the granulocytes of the preparation with annexin V or antibodies recognize the precursor cells. are incubated and the cells bound to Annexin V or the antibodies are separated from the preparation.

2. The method according to the preceding claim, characterized ge indicates that the incubation of the granulocytes with attached to support material Annexin V in the presence of Calcium ions occur.

3. The method according to at least one of the preceding An sayings, characterized in that the preparation with a support material is incubated, on the top area Annexin V or antibodies, the progenitor cells of granulocytes are coupled.

4. The method according to at least one of the preceding An sayings, characterized in that the carrier material contains magnetic beads.

5. The method according to at least one of the preceding An sayings, characterized in that the mixture a magnetic field from magnetic beads and specimen placed and the magnetic beads and the preparation ge be separated.

6. The method according to at least one of claims 2 to 5, characterized in that the separation of the carrier terials and the preparation through panning steps or Magnetic separation takes place.

7. The method according to at least one of the preceding An sayings, characterized in that the preparation with labeled Annexin V or with labeled antibodies incubated and then the labeled granulocytes be read out.

8. The method according to the preceding claim, characterized ge indicates that the preparation is coupled with fluorochrome annexin V or fluorochrome-coupled antibodies is incubated and then the fluorescent marker ten granulocytes are separated from the preparation.

9. Follow the procedure according to at least one of the two the claims, characterized in that the separation the labeled granulocytes by chromatography, ins special column chromatography, or in a sorter he follows.

10. Use of preparations containing granulocytes prepared according to one of claims 1 to 9 in the transfusion me medicine, hematology, oncology, blood donation, pediatrics, especially difficult to treat for antibiotics dominant infections, as well as for prophylaxis Patients at high risk of infection.