DE19839115A1

DE19839115A1 - Cloning and expression of bovine estrogen receptor beta

Info

Publication number: DE19839115A1
Application number: DE1998139115
Authority: DE
Inventors: Norbert Walther
Original assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Current assignee: IHF Institut fur Hormon und Fortpflanzungsforschung GmbH
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1998-08-27
Publication date: 2000-03-09
Also published as: WO2000012697A1

Abstract

The invention relates to isolated bovine estrogen receptor- beta , isoforms thereof as well as polypeptides containing the ligand binding domain of bovine ER beta . The invention further relates to nucleic acids coding for said polypeptides and to recombinant vectors and cells containing said nucleic acids. These polypeptides, nucleic acids, vectors and cells can be used for the identification of ER beta ligands, notably for the identification of new medicines.

Description

Die Erfindung betrifft isolierten Rinder Estrogenrezeptor-β, Isoformen davon sowie Polypeptide, welche die Ligandenbindungsdomäne von Rinder ERβ enthalten. Weiterhin werden für diese Polypeptide kodierende Nukleinsäuren sowie diese Nukleinsäuren enthaltende rekombinante Vektoren und Zellen offenbart. Die Polypeptide, Nukleinsäuren, Vektoren und Zellen können zur Identifizierung von Liganden für ERβ, insbesondere zur Identifizierung von neuen Arzneimitteln eingesetzt werden.The invention relates to isolated cattle estrogen receptor-β, isoforms thereof as well as polypeptides which the ligand binding domain of bovine ERβ contain. Furthermore, nucleic acids coding for these polypeptides and recombinant vectors and cells containing these nucleic acids disclosed. The polypeptides, nucleic acids, vectors and cells can be used for Identification of ligands for ERβ, especially for the identification of new drugs are used.

Das Geschlechtshormon Estradiol übt seine Funktion bei der Genregulation durch Bindung an einen spezifischen intrazelllären Rezeptor aus (Jensen, Ann. NY Acad. Sci. 784 (1996), 1-17). Dieser Estrogenrezeptor gehört zur Superfamilie der nuklearen Rezeptoren (Tsai und O'Malley, Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 451-486), von denen viele durch Bindung kleiner lipophiler Liganden aktivierbar sind. Obwohl eine Anzahl von Hormonligan den spezifisch an verschiedene Rezeptorsubtypen bindet, war man viele Jahre lang der Meinung, daß jedes Steroid nur einen einzigen Rezeptor subtyp besitzt. Vor kurzem wurde jedoch in der Rattenprostata ein zweiter Estrogenrezeptor (ERβ) entdeckt (Kuiper et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 5925-5930). Homologe ERβ-Polypeptide wurden aus dem Menschen (Mosselman et al. FEBS Lett. 392 (1996), 49-53) und der Maus (Tremblay et al., Mol. Endocrinol. 11 (1997), 353-365) kloniert. Beide Formen des Estrogenrezeptors sind für sich alleine wirksam, sie können jedoch auch Heterodimere miteinander bilden, die an Estrogen-Response- Elemente binden (Pace et al. J. Biol. Chem. 272 (1997), 25832-25838 und Petterson et al., Mol. Endocrinol. 11 (1997), 1486-1496). Die Expressions muster von ERβ und ERα sind unterschiedlich. Darüber hinaus ist die Expression von mehreren Isoformen des ERα und ERβ-Gens bekannt, was zur Komplexität der Expressionskontrolle von Estrogen-regulierten Genen beiträgt. Die Expression von ERα-Isoformen ist seit langem bekannt (Wang und Miksicek, Mol. Endocrinol. 5 (1991), 1707-1715; Murphy et al. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 62 (1997), 363-372). Darüber hinaus wurden vor kurzem auch ERβ-Isoformen beschrieben (Chu und Fuller, Mol. Cell. Endocrinol. 132 (1997), 195-199; Maruyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246 (1998), 142-147, Petersen et al., Endocrinology 139 (1998), 1082-1092, und Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 247 (1998), 75-78). Angesichts der Komplexität bisheriger Resultate zur Expression von ERβ-Genen und der Wirkung der ERβ-Proteine auf die Genregulation besteht ein großes Bedürfnis, weitere Estrogenrezeptor β Polypeptide bereitzustellen.The sex hormone estradiol performs its function in gene regulation by binding to a specific intracellular receptor (Jensen, Ann. NY Acad. Sci. 784 (1996), 1-17). This estrogen receptor belongs to Super Family of Nuclear Receptors (Tsai and O'Malley, Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 451-486), many of which are smaller by binding lipophilic ligands can be activated. Although a number of hormone ligands that specifically binds to different receptor subtypes, there were many For years believed that each steroid had only one receptor subtype. Recently, however, a second became in the rat prostate Estrogen receptor (ERβ) discovered (Kuiper et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5925-5930 (1996)). Homologous ERβ polypeptides were made from the Humans (Mosselman et al. FEBS Lett. 392 (1996), 49-53) and the mouse (Tremblay et al., Mol. Endocrinol. 11 (1997), 353-365). Both Forms of the estrogen receptor are effective on their own, they can however, also form heterodimers with one another which are linked to estrogen response Bind elements (Pace et al. J. Biol. Chem. 272 (1997), 25832-25838 and Petterson et al., Mol. Endocrinol. 11: 1486-1496 (1997). The expressions patterns of ERβ and ERα are different. In addition, the Expression of several isoforms of the ERα and ERβ gene is known on the complexity of the expression control of estrogen-regulated genes contributes. The expression of ERα isoforms has long been known (Wang and Miksicek, Mol. Endocrinol. 5: 1707-1715 (1991); Murphy et al. J. Steroid biochem. Mol. Biol. 62 (1997), 363-372). Beyond that recently also described ERβ isoforms (Chu and Fuller, Mol. Cell. Endocrinol. 132: 195-199 (1997); Maruyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 246 (1998), 142-147, Petersen et al., Endocrinology 139 (1998), 1082-1092, and Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 247 (1998), 75-78). Given the complexity of previous results on Expression of ERβ genes and the effect of ERβ proteins on There is a great need for gene regulation to further estrogen receptor β To provide polypeptides.

Überraschenderweise konnten aus Rindergranulosazellen mehrere cDNA- Klone erhalten werden, die für verschiedene Rinder ERβ Isoformen kodieren und im Reproduktionssystem ein unterschiedliches Expressionsmuster aufweisen. Weiterhin konnte die Transaktivierung heterologer Genexpres sion durch vollständigen Rinder ERβ gezeigt werden, dessen Nukleinsäure und korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 1 und 2 des beiliegenden Sequenzprotokolls gezeigt sind.Surprisingly, several cDNA- from bovine granulosa cells Clones are obtained which encode ERβ isoforms for different cattle and a different expression pattern in the reproductive system exhibit. Furthermore, the transactivation of heterologous gene expresses sion shown by complete cattle ERβ, its nucleic acid and corresponding amino acid sequence in SEQ ID NO. 1 and 2 of enclosed sequence listing are shown.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft daher einen isolierten Rinderestro gen-Rezeptor β (ERβ) umfassend die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Amino säuresequenz. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, welches eine Isoform eines Rinder ERβ, vorzugsweise eine natürlich vorkommende Isoform ist. Erfindungsgemäße Isoformen zeichnen sich beispielsweise dadurch aus, daß eine oder mehrere funktionale Domänen von Rinder ERβ teilweise oder vollständig deletiert sind, beispiels weise die N-terminale Domäne, die DNA-bindende Domäne oder/und die Liganden-bindende Domäne. Spezifische Beispiele sind die in Fig. 2 dargestellten Isoformen ΔLBD, Δ11, Δ21 und Δ31. A first aspect of the invention therefore relates to an isolated bovine estrogen receptor β (ERβ) comprising the one in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence shown. Another aspect of the invention relates to an isolated polypeptide which is an isoform of a bovine ERβ, preferably a naturally occurring isoform. Isoforms according to the invention are distinguished, for example, by the fact that one or more functional domains of bovine ERβ have been partially or completely deleted, for example the N-terminal domain, the DNA-binding domain and / or the ligand-binding domain. Specific examples are the isoforms ΔLBD, Δ11, Δ21 and Δ31 shown in FIG. 2.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polypeptid umfassend die Ligandenbindungsdomäne eines Rinderestrogenre zeptor β entsprechend Position 247 Position 445 in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminoäuresequenz oder eine dazu mindestens 93%, vorzugsweise mindestens 95% und besonders bevorzugt mindestens 98% identische Aminosäuresequenz. Weiterhin umfaßt dieses Polypeptid eine DNA-Bindungsdomäne, beispielweise eine DNA-Bindungsdomäne, die aus einem nuklearen Rezeptor wie etwa einem ERβ oder aber aus einem heterologen nuklearen Rezeptor wie etwa ERα stammt. Alternativ kann die DNA-Bindungsdomäne auch von anderen Polypeptiden stammen, z. B. Helix- Turn-Helix-Motive, Zinkfinger, basische Leucinzipper (Struhl, TIBS 14 (1989), 137-140).Yet another aspect of the present invention is an isolated one Polypeptide comprising the ligand binding domain of a bovine estrogen zeptor β corresponding to position 247 position 445 in SEQ ID NO. 2nd amino acid sequence shown or at least 93% of this, preferably at least 95% and particularly preferably at least 98% identical amino acid sequence. Furthermore, this polypeptide comprises one DNA binding domain, for example a DNA binding domain consisting of a nuclear receptor such as an ERβ or from one heterologous nuclear receptor such as ERα. Alternatively, the DNA binding domains are also derived from other polypeptides, e.g. B. Helix Turn helix motifs, zinc fingers, basic leucine zippers (Struhl, TIBS 14 (1989), 137-140).

Die Erfindung betrifft auch eine isolierte Nukleinsäure, die für eines der vorgenannten Polypeptide kodiert. Die Nukleinsäure ist vorzugsweise eine rekombinante Nukleinsäure, z. B. eine rekombinante DNA oder RNA. Besonders bevorzugt ist die Nukleinsäure eine cDNA oder eine genomische DNA.The invention also relates to an isolated nucleic acid suitable for one of the encodes the aforementioned polypeptides. The nucleic acid is preferably one recombinant nucleic acid, e.g. B. a recombinant DNA or RNA. The nucleic acid is particularly preferably a cDNA or a genomic DNA.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält, wobei die Nukleinsäure vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz ist. Bei dem Vektor kann es sich um einen prokaryontischen oder eukaryontischen Vektor handeln, der entweder extrachromosomal sein kann oder in das Chromosom einer Wirtszelle integrierbar ist. Vorzugsweise ist der Vektor ein Plasmidvektor. Beispiele für geeignete Vektoren sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben, beispielsweise in den Kapiteln 1 bis 4 und 16 bis 17. Dort finden sich auch Hinweise auf geeignete prokaryontische und eukaryontische Expressionskontrollsequenzen, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in entsprechenden Wirtszellen ermögli chen.Yet another aspect of the invention is a recombinant vector that contains at least one copy of a nucleic acid according to the invention, wherein the nucleic acid is preferably operatively linked to a Expression control sequence. The vector can be one prokaryotic or eukaryotic vector act either can be extrachromosomal or into the chromosome of a host cell can be integrated. The vector is preferably a plasmid vector. examples for suitable vectors are described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, for example in chapters 1 to 4 and 16 to 17. There are also indications of suitable prokaryotic and eukaryotic expression control sequences, the expression of the nucleic acid according to the invention in corresponding host cells chen.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem erfindungs gemäßen Vektor transfiziert ist. "Transfektion" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß die Zelle die Nukleinsäure oder den Vektor in beliebiger heterologer Form, beispielsweise extrachromosomal auf einem Plasmid oder chromosomal unter Kontrolle einer heterologen Expressions kontrollsequenz enthält. Die Zelle kann eine prokaryontische Zelle sein, z. B. eine gram-negative Bakterienzelle, wie etwa E.coli, sie kann jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, z. B. eine Hefezelle oder eine höhere eukaryontische Zelle, z. B. eine Säugerzelle. Besonders bevorzugt ist die Zelle eine Säugerzelle.Yet another aspect of the present invention is a recombinant Cell with a nucleic acid according to the invention or a fiction according to the vector is transfected. "Transfection" in the sense of the present Invention means that the cell contains the nucleic acid or the vector any heterologous form, for example extrachromosomally on one Plasmid or chromosomal under the control of heterologous expression contains control sequence. The cell can be a prokaryotic cell, e.g. B. a gram-negative bacterial cell, such as E. coli, but it can also be a eukaryotic cell, e.g. B. a yeast cell or higher eukaryotic cell, e.g. B. a mammalian cell. The is particularly preferred Cell a mammalian cell.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Zelle weiterhin eine Reportergen unter Kontrolle einer durch Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids regulierbaren Expressionskontrollsequenz. Das Reportergen kann beispielsweise ein für ein durch visuelle Mittel nachweisbares Protein wie Luciferase, β-Galactosidase oder Green- Fluorescence-Protein kodierendes Gen sein. Die Expressionskontrollsequenz des Reportergens enthält vorzugsweise ein Element, an das die DNA- Bindungsdomäne eines nuklearen Rezeptors binden kann, beispielsweise ein Estrogen-Response-Element. Durch Cotransfektion einer Zelle mit einem Vektor, der für ein erfindungsgemäßes Rinder ERβ Polypeptid kodiert, und einem weiteren Vektor, der für ein durch Expression des Rinder ERβ regulierbares Reportergen enthält, können Bindungsuntersuchungen durchgeführt werden. Dabei bringt man die erfindungsgemäße Zelle mit einem potentiellen Liganden für den ERβ in Kontakt und bestimmt - indirekt - über die Expression des Reportergens die Bindefähigkeit des Liganden an den Rinder ERβ. In a preferred embodiment of the invention, the cell contains continue to control a reporter gene by expressing the The expression control sequence of the polypeptide according to the invention. The reporter gene can be, for example, one by one by visual means detectable protein such as luciferase, β-galactosidase or green Fluorescence protein coding gene. The expression control sequence of the reporter gene preferably contains an element to which the DNA Binding domain of a nuclear receptor can bind, for example Estrogen response element. By cotransfecting a cell with a Vector coding for a bovine ERβ polypeptide according to the invention, and another vector which is responsible for expression of the bovine ERβ regulatable reporter gene contains, binding studies be performed. The cell according to the invention is brought along a potential ligand for ERβ in contact and determines - indirectly - the ability of the ligand to bind via the expression of the reporter gene the cattle ERβ.

Wenn die Expression des Reportergens nach Zugabe des Liganden induziert wird, kann der Ligand als Rezeptoragonist wirken. Wenn die Expression des Reportergens jedoch verringert wird, kann es sich bei dem Liganden um einen Rezeptorantagonisten handeln. Entsprechende Tests mit anderen Steroidrezeptoren sind beispielsweise in WO-A-88 031 68 oder von Tsai et al. (Cell 57 (1989), 443) oder Meyer et al. (Cell 57 (1989), 433) beschrie ben.If expression of the reporter gene is induced after addition of the ligand the ligand can act as a receptor agonist. If the expression of the However, if the reporter gene is reduced, the ligand can be act as a receptor antagonist. Appropriate tests with others Steroid receptors are described, for example, in WO-A-88 031 68 or by Tsai et al. (Cell 57 (1989), 443) or Meyer et al. (1989, Cell 57: 433) ben.

Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Polypeptiden, Nukleinsäuren, Vektoren und Zellen wie zuvor beschrieben zur Identifizie rung von Liganden für einen ERβ und insbesondere zur Identifizierung von ERβ-spezifischen Liganden, d. h. von Liganden, die eine differenzielle Bindung an ERβ und ERα zeigen. Somit wird durch die vorliegende Erfindung ein wesentlicher Beitrag zur Identifizierung von potentiellen neuen Arzneimit teln insbesondere auf dem Gebiet von mit der Expression von ERβ assoziierten Krankheiten, z. B. Prostata- oder Eierstockkrebs, Osteoporose etc. geleistet.The invention thus also relates to the use of polypeptides, Nucleic acids, vectors and cells as described above for identification tion of ligands for ERβ and in particular for the identification of ERβ specific ligands, i.e. H. of ligands that have a differential Show binding to ERβ and ERα. Thus, by the present invention an essential contribution to the identification of potential new drugs especially in the field of with the expression of ERβ associated diseases, e.g. B. prostate or ovarian cancer, osteoporosis etc. done.

Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Sequenzprotokolle, Figuren und Beispiele verdeutlicht werden.Furthermore, the invention is intended to be carried out by the following sequence protocols, Figures and examples are illustrated.

Es zeigen:
SEQ ID NO. 1/2: die Nukleotidsequenz von Rinder ERβ cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz,
SEQ ID NO. 3-21: die Nukleotidsequenzen von Primern.Show it:
SEQ ID NO. 1/2: the nucleotide sequence of bovine ERβ cDNA and the amino acid sequence derived therefrom,
SEQ ID NO. 3-21: the nucleotide sequences of primers.

Fig. 1 die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz von vollständigem Rinder ERβ. Die Nukleotidsequenz des am häufigsten vorkommenden vollständigen Rinder ERβ Transkripts ist zusammen mit der korrespondierenden Aminosäuresequenz des Rinder ERβ Proteins gezeigt. Start- und Stopkodon des offenen Leserahmens unterstrichen. Die in Kleinbuchstaben angegebenen Aminosäuren können gegebenenfalls den Leserahmen 5'-seitig des ATG-Kodons verlängern. Die Grenzen der funktionalen Domänen des ERβ Proteins (A bis F definiert durch Homologie mit anderen nuklearen Rezeptoren) sind durch vertikale Striche angezeigt. E bezeichnet die Ligandenbindungsdomäne und reicht von Nukleotidpo sition 891 bis 1485. Der Pfeil zeigt das 3'-Ende der Homologie zwischen dem vollständigen Transkript und dem unvollständigen Transkript ΔLBD. Fig. 1 shows the nucleotide sequence and the derived amino acid sequence of complete bovine ERβ. The nucleotide sequence of the most common complete bovine ERβ transcript is shown together with the corresponding amino acid sequence of the bovine ERβ protein. The start and stop codons of the open reading frame are underlined. The amino acids given in lower case letters can, if necessary, extend the reading frame on the 5 'side of the ATG codon. The boundaries of the functional domains of the ERβ protein (A to F defined by homology with other nuclear receptors) are indicated by vertical lines. E denotes the ligand binding domain and ranges from nucleotide position 891 to 1485. The arrow shows the 3 'end of the homology between the complete transcript and the incomplete transcript ΔLBD.

Fig. 2 die Struktur von Rinder ERβ-lsoformen. Die Strukturen der klonierten und sequenzierten Rinder ERβ-Isoformen sind schematisch gezeigt, wobei sich die Numerierung auf die Nukleotidpositionen des vollstän digen Transkripts (siehe Fig. 1) bezieht. Die Startpositionen der funktionalen Proteindomänen und die Position des Stopkodons sind in Bezug auf das vollständige Transkript angegeben. Die kursive Zahl bei dem Transkript ΔLBD zeigt das Ende der Homologie mit dem vollständigen Transkript, während die kursiven Zahlen bei den Transkripten Δ11, Δ21 und Δ31 den Beginn und das Ende der jeweiligen Deletion zeigen. Die unterstrichenen Zahlen zeigen die Positionen der eingeführen Stopkodons, wobei der Stern angibt, daß das entsprechende Stopkodon aus Intronsequenzen stammt. Der schraffierte Bereich zeigt, daß diese Region des Transkripts aufgrund der durch die 5'-Deletion in diesem Klon eingeführten Leserahmenver schiebung nicht in ERβ-Proteinsequenzen translatiert werden kann. Figure 2 shows the structure of bovine ERβ isoforms. The structures of the cloned and sequenced bovine ERβ isoforms are shown schematically, the numbering relating to the nucleotide positions of the complete transcript (see FIG. 1). The starting positions of the functional protein domains and the position of the stop codon are given in relation to the complete transcript. The italic number for the transcript ΔLBD shows the end of homology with the complete transcript, while the italic number for the transcripts Δ11, Δ21 and Δ31 show the beginning and the end of the respective deletion. The underlined numbers show the positions of the inserted stop codons, with the asterisk indicating that the corresponding stop codon comes from intron sequences. The hatched area shows that this region of the transcript cannot be translated into ERβ protein sequences due to the reading frame shift introduced by the 5 'deletion in this clone.

Fig. 3 das Expressionsmustervon zwei Rinder ERβ-Isoformen (vollständiges Transkript und ΔLBD). Die Expression wurde durch RT-PCR in Proben aus Gesamt RNA von Rindergewebe nachgewiesen. Die PCR- Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und durch Hybridisierung an eine Oligonukleotidsonde identifiziert. Als Kontrolle wurde das Transkript des konstitutiv exprimierten Gens Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase nachgewiesen. GC: Granulosazellen; TC: Thecazellen; CL: Corpus luteum. Figure 3 shows the expression pattern of two bovine ERβ isoforms (full transcript and ΔLBD). Expression was detected by RT-PCR in samples from total RNA from bovine tissue. The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and identified by hybridization to an oligonucleotide probe. As a control, the transcript of the constitutively expressed gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase was detected. GC: granulosa cells; TC: Theca cells; CL: Corpus luteum.

Fig. 4 die Transkriptionsaktivität von Rinder ERβ in einem transienten Transfektionstest. HEK 293 Zellen wurden mit einem Reporterkon strukt zum Nachweis der Expression von Luciferase transfiziert. Expressionsvektoren für vollständigen Rinder ERβ (Δ) die ERβ Isoform ΔLBD (V) oder humanem ERα (O) wurden cotransfiziert. Estradiol wurde den transfizierten Zellen in den angegebenen Endkonzentra tionen zugesetzt. Fig. 4 shows the transcription activity of bovine ERβ in a transient transfection test. HEK 293 cells were transfected with a reporter construct to detect the expression of luciferase. Expression vectors for whole bovine ERβ (Δ) the ERβ isoform ΔLBD (V) or human ERα (O) were co-transfected. Estradiol was added to the transfected cells in the stated final concentrations.

Examples 1. Material and methods 1.1 RNA preparation and primer design

Rindergewebe wurden aus einem Schlachthofbezogen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt. Primäre Rindergranulosa zellen wurden unter Zusatz von 100 ng/ml Insulin wie von Lioutas et al. (Endocrinology 138 (1997), 5059-5062) beschrieben kultiviert. Gesamt- RNA wurde aus den Geweben und Zellkulturen unter Verwendung des RNA- Clean-System (AGF, Heidelberg, Deutschland) präpariert.Bovine tissues were obtained from a slaughterhouse, in liquid Frozen nitrogen and stored at -80 ° C. Primary bovine granulosa cells were added with 100 ng / ml insulin as described by Lioutas et al. (Endocrinology 138 (1997), 5059-5062). Total- RNA was extracted from the tissues and cell cultures using the RNA Clean-System (AGF, Heidelberg, Germany) prepared.

Sequenzen zur Verwendung als Oligonukleotidprimer für eine RT-PCR wurden aus bekannten ERβ-Sequenzen ausgewählt und die Primer nach bekannten Methoden synthetisiert. Es wurden die in den Sequenzprotokollen SEQ ID No. 3 bis 21 gezeigten Primer Nr. 1 bis Nr. 19 verwendet.Sequences for use as oligonucleotide primers for RT-PCR were selected from known ERβ sequences and the primers matched known methods synthesized. There were those in the sequence listing SEQ ID No. 3 to 21 shown primers No. 1 to No. 19 are used.

1.2 Amplification and cloning of bovine ERβ cDNA sequences

Die RT-PCR wurde wie von Walther et al., (Exp. Cell. Res. 225 (1996), 411- 421) beschrieben durchgeführt. Die optimalen Annealingtemperaturen für die verwendeten Primer mußten - um spezifische Produkte zu erhalten - empirisch ermittelt werden.RT-PCR was performed as described by Walther et al., (Exp. Cell. Res. 225 (1996), 411- 421). The optimal annealing temperatures for the primers used had - in order to obtain specific products - be determined empirically.

Zur Klonierung des 5'-Endes der cDNA durch inverse PCR (Zeiner und Gering, BioTechniques 17 (1994), 1051-1053) und des 3'-Endes durch RACE (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8998-9002) wurde eine Extensionsdauer von 2 min bei 72°C gewählt. Zur Klonierung der ersten partiellen DNA-Sequenz wurden 2 Primerpaare aus der Ratten ERβ-Sequenz (Nr. 1 /Nr. 2 und Nr. 3/Nr. 4) sequenziell in einer "Nested" RT- PCR eingesetzt. Zur Klonierung von LBD-Sequenzen wurde Primer Nr. 5 von 5'-Rindersequenzen und Primer Nr. 6 aus einer zwischen humanem ERα und ERβ konservierten LBD-Region verwendet. Für das 5'-inverse PCR-Protokoll wurde Primer Nr. 7 für die Reverse Transkripion eingesetzt. Doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert und zirkularisiert und Rinder ERβ Sequenzen durch inverse PCR unter Verwendung des Primerpaares Nr. 8/Nr. 9 amplifiziert. Im 3'-RACE Protokoll wurde Primer Nr. 10 für die Reverse Transkription verwendet, gefolgt von einer PCR-Amplifikation von Rinder ERβ Sequenzen unter Verwendung des 3'-RACE Primers Nr. 11 und 2 Sätzen von 5'-Primern (Nr. 12/Nr. 9 und Nr. 13/Nr. 14) für das Transkript ΔLBD bzw. das vollständige ERβ Transkript. Zur Klonierung der vollständi gen cDNAs wurde ein gemeinsamer 5'-Primer (Nr. 15) sowie die jeweils transkriptspezifischen 3'-Primer (Nr. 16/Nr. 17) verwendet.For cloning the 5 'end of the cDNA by inverse PCR (Zeiner and Gering, BioTechniques 17 (1994), 1051-1053) and the 3 'end RACE (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8998-9002) an extension time of 2 min at 72 ° C was chosen. For cloning In the first partial DNA sequence, 2 pairs of primers from the rats ERβ sequence (No. 1 / No. 2 and No. 3 / No. 4) sequentially in a "nested" RT PCR used. To clone LBD sequences, primer No. 5 from 5 'bovine sequences and primer No. 6 from a between human ERα and ERβ conserved LBD region used. For the 5 'inverse PCR protocol No. 7 primer was used for reverse transcription. Double-stranded cDNA was synthesized and circularized and bovine ERβ sequences by inverse PCR using primer pair No. 8 / No. 9 amplified. In the 3'-RACE protocol, primer No. 10 was used for the reverse Transcription used, followed by PCR amplification from cattle ERβ sequences using 3'-RACE Primer Nos. 11 and 2 Sets of 5 'primers (# 12 / # 9 and # 13 / # 14) for the transcript ΔLBD or the complete ERβ transcript. For cloning the complete gene cDNAs was a common 5 'primer (No. 15) and each transcript-specific 3 'primer (No. 16 / No. 17) used.

Die RT-PCR-Produkte wurden in den Plasmidvektor pGEM T-Easy (Promega, Mannheim, Deutschland) kloniert. Für transiente Transfektionsexperimente wurden die vollständigen cDNAs in den eukaryontischen Expressionsvektor pRc/CMV (Invitrogen, Leek, Niederlande) subkloniert.The RT-PCR products were inserted into the plasmid vector pGEM T-Easy (Promega, Mannheim, Germany). For transient transfection experiments the complete cDNAs were in the eukaryotic expression vector pRc / CMV (Invitrogen, Leek, The Netherlands) subcloned.

Alle partiellen RT-PCR-Klone sowie die unabhängig erhaltenen vollständigen cDNAs wurden durch die Dideoxysequenzierung analysiert. Für Expressions untersuchungen wurden 4 µg Gesamt RNA aus verschiedenen Rindergewe ben revers transkribiert und Aliquots der Reaktion wurden wie bei Walther et al. (1996), supra, beschrieben, unter Verwendung der Primerpaare Nr. 5/Nr. 18 für das vollständige Transkript und Nr. 5/Nr. 19 für das Transkript ΔLBD amplifiziert. PCR-Reaktionen zum Nachweis des konstitutiv exprimier ten Glycerin aldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Gens wurden wie von Bathgate et al., (Biol. Reprod. 55 (1996), 1452-1457) beschrieben, durchgeführt.All partial RT-PCR clones as well as the independently obtained complete ones cDNAs were analyzed by dideoxy sequencing. For expressions 4 µg of total RNA from various bovine tissues were examined ben reverse transcribed and aliquots of the reaction were as in Walther et al. (1996), supra, using primer pairs no. 5 / no. 18 for the full transcript and No. 5 / No. 19 for the transcript ΔLBD amplified. PCR reactions to detect the constitutively expressed The glycerol aldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene was as described by Bathgate et al. (Biol. Reprod. 55 (1996), 1452-1457). carried out.

1.3 Transient transfection studies

HEK 293 Zellen wurden von der European Collection of Cell Cultures (Nr. 85 120 602) bezogen. Für transiente Transfektionsexperimente wurden die Zellen in 12-Lochplatten (Costar, Bodenheim, Deutschland) in einer Dichte von 75.000 Zellen/Loch ausgesät. Üblicherweise wurde ein Steroid-Mangel Kulturmedium verwendet (DMEM ohne Phenolrot unter Zusatz von 10% Kohle-behandeltem Serum; Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland). Da die Zellen in diesem Medium sehr schlecht wuchsen, wurden die Transfek tionen unter Verwendung von normalen Kulturmedium unter Zusatz von 10% fetalem Kälberserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) wiederholt.HEK 293 cells were from the European Collection of Cell Cultures (No. 85 120 602). For transient transfection experiments, the Cells in 12-hole plates (Costar, Bodenheim, Germany) in one density seeded from 75,000 cells / hole. Usually a steroid deficiency became apparent Culture medium used (DMEM without phenol red with addition of 10% Charcoal-treated serum; Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany). There the cells in this medium grew very poorly, became the transfect tions using normal culture medium with the addition of 10% fetal calf serum (biochrom, Berlin, Germany) repeated.

Die Zellen wurden durch Calciumphosphat-Copräzipitation unter Verwen dung des Profection Mammalian Transfection System (Promega, Mannheim, Deutschland) transfiziert. Ein Estrogen-Response-Element (ERE)-enthaltendes Luciferase-Reporterplasmid wurde durch partielles Ersetzen von Rinderoxy tocin Promotorsequenzen (Walther et al., J. Neuroendocrinol. 3 (1991), 539-549) durch homologe Rattensequenzen mit einem bekannten ERE (Burbach et al., J. Neuroendocrinol. 2 (1990), 633-639; Mosselman et al., FEBS, Lett. 392 (1996), 49-53) und Einfügen dieser 180 bp langen Promotorsequenzen in das pGL2 Luciferasekonstrukt (Promega, Mannheim, Deutschland) hergestellt. 1,6 µg dieses Reporterkonstrukts wurden zusammen mit 1,6 µg der zuvor beschriebenen Expressionskonstrukte oder eines inaktiven Kontrollplasmids sowie 0,8 ng eines β-Galactosidase- Kontrollvektors in jeweils drei Ansätzen in die Zellen kotransfiziert. 24 bis 28 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und die Luciferase- und β- Galactosidaseaktivität nach der Methode von Rust et al. (J. Mol. Endocrinol. 21 (1998), 189-199) bestimmt.The cells were used by calcium phosphate coprecipitation of the Profection Mammalian Transfection System (Promega, Mannheim, Germany) transfected. An estrogen response element (ERE) containing Luciferase reporter plasmid was obtained by partially replacing bovine oxy tocin promoter sequences (Walther et al., J. Neuroendocrinol. 3 (1991), 539-549) by homologous rat sequences with a known ERE (Burbach et al., J. Neuroendocrinol. 2 (1990), 633-639; Mosselman et al., FEBS, Lett. 392 (1996), 49-53) and inserting this 180 bp long Promoter sequences into the pGL2 luciferase construct (Promega, Mannheim, Germany). 1.6 µg of this reporter construct were together with 1.6 µg of the expression constructs described above or an inactive control plasmid and 0.8 ng of a β-galactosidase Control vectors co-transfected into the cells in three batches. 24 to 28 hours after transfection, the cells were lysed and the luciferase and β- Galactosidase activity according to the method of Rust et al. (J. Mol. Endocrinol. 21 (1998), 189-199).

2 results 2.1 Cloning of Bovine ERβ Isoforms from Granulosa Cells

Mehrere cDNA Klone mit Transkripten des Rinder ERβ Gens wurden durch . eine Kombination unterschiedlicher RT-PCR-Strategien aus in Gegenwart von Insulin kultivierten Granulosazellen kloniert.Several cDNA clones with transcripts of the bovine ERβ gene were screened. a combination of different RT-PCR strategies from in the presence cloned from insulin cultured granulosa cells.

Zuerst wurden Primer aus der Ratten ERβ cDNA Sequenz verwendet, um eine partielle Rinder cDNA mit der DNA-Bindungsdomäne (DBD) durch Nested RT-PCR zu amplifizieren. Aus der Sequenz dieses partiellen Rinderklons wurden Primer zur Klonierung der 5'- und 3'-Enden durch inverse PCR und RACE-Protokolle gewonnen. Dabei wurde gefunden, daß der durch inverse PCR identifzierte Klon sich weiter 5'-seitig erstreckt als die kodierende Region, die ursprünglich für die ERβ Gene aus Ratte, Mensch und Maus beschrieben worden war. Allen durch eine direkte 3'-RACE Methode erhaltenen Klone fehlten die 3'-ERβ Sequenzen.First, primers from the rat ERβ cDNA sequence were used to a partial bovine cDNA with the DNA binding domain (DBD) Amplify nested RT-PCR. From the sequence of this partial Bovine clones became primers for cloning the 5 'and 3' ends inverse PCR and RACE protocols obtained. It was found that the clone identified by inverse PCR extends further 5 'than that coding region originally for the ERβ genes from rat, human and mouse had been described. All through a direct 3'-RACE Clones obtained from the method lacked the 3'-ERβ sequences.

Die ein Stopkodon in den Leserahmen einführende Sequenz ist homolog zu Teilsequenzen aus dem Intron H-L1 (Enmark et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 82 (1997), 4258-4265). Um das 3'-Ende des vollständigen Transkripts zu klonieren, mußte daher ein 3'-Primer verwendet werden, der aus einer zwischen ERα und ERβ konservierten Region der Ligandenbindedo mäne (LBD) stammt, um eine partielle cDNA mit LBD-Sequenzen zu amplifizieren. Aus diesen Sequenzen wurden 5'-Primer zur Verwendung im 3'-RACE Protokoll erhalten. The sequence introducing a stop codon into the reading frame is homologous to Partial sequences from the intron H-L1 (Enmark et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 82: 4258-4265 (1997)). To the 3 'end of the full To clone transcripts, a 3 'primer had to be used from a region of the ligand bindedo conserved between ERα and ERβ male (LBD) comes to a partial cDNA with LBD sequences amplify. From these sequences, 5 'primers were used in 3'-RACE protocol received.

Es wurden zwei Arten von Klonen erhalten, die identische Sequenzen innerhalb der für ERβ 3'-kodierenden Region enthielten, sich aber in der 3'- nichtkodierenden Region unterschieden. Die komplette Sequenz des vollständigen Transkripts ist in Fig. 1 gezeigt. Das vollständige Transkript umfaßt einen offenen Leserahmen von 1422 Nukleotiden, wobei das erste Methionin an Position 153 dem durch Homologie zu Sequenzen aus der Ratte, dem Menschen und der Maus vermuteten Startkodon entspricht. Der Translationsstart kann jedoch weiter stromaufwärts liegen, da die 5'-seitig des ersten Methioninrests gelegene Sequenz homolog mit zusätzlichen 5'- Sequenzen ist, die kürzlich für das humane Gen beschrieben wurden (Ogawa et al., Biochem. Biophys. Rev. Commun. 243 (1998), 122-126).Two types of clones were obtained which contained identical sequences within the region coding for ERβ 3 ', but differed in the 3' non-coding region. The complete sequence of the complete transcript is shown in Fig. 1. The complete transcript comprises an open reading frame of 1422 nucleotides, the first methionine at position 153 corresponding to the start codon suspected by homology to sequences from the rat, human and mouse. However, the translation start may be further upstream because the 5 'side of the first methionine residue is homologous to additional 5' sequences recently described for the human gene (Ogawa et al., Biochem. Biophys. Rev. Commun. 243 (1998), 122-126).

Die Aminosäuresequenz von Rinder ERβ hat eine relativ hohe Homologie zu den bekannten Sequenzen aus der Ratte und dem Menschen. In der N- terminalen Domäne (Aminosäureposition 153-428) ist der Homologiegrad 85%, in der DNA-Bindedomäne (429-626) 100% in der Hinge-Region (627-890) 94%, in der Liganden-bindenden Domäne (LBD) und der C- terminalen Domäne (891-1574) 93%, wobei die Berechnung der Homologie auf Aminosäureebene und gegen die Konsensus-Sequenz von Mensch- und Ratten-ERβ erfolgt. Ein die LBD nicht enthaltendes Transkript (ΔLBD) zeigte eine perfekte Homologie mit dem vollständigen Transkript bis zum Exon- Intron-Übergang an Position 936. Durch die Intronsequenzen wird jedoch ein Stopkodon 12 Nukleotide 3'-seitig des Übergangs eingeführt.The amino acid sequence of bovine ERβ has a relatively high level of homology the known sequences from rats and humans. In the N- terminal domain (amino acid position 153-428) is the degree of homology 85%, in the DNA binding domain (429-626) 100% in the hinge region (627-890) 94%, in the ligand-binding domain (LBD) and the C- terminal domain (891-1574) 93%, the calculation of homology at the amino acid level and against the consensus sequence of human and Rat ERβ occurs. A transcript not containing the LBD (ΔLBD) showed perfect homology with the full transcript down to the exon Intron transition at position 936. However, the intron sequences make one Stop codon 12 nucleotides introduced on the 3 'side of the transition.

Die Amplifikation von partiellen ERβ cDNA-Sequenzen aus verschiedenen Rindergeweben zeigte das Vorhandensein zusätzlicher Isoformen. Klonierung und Sequenzierung dieser cDNAs ergab, daß diese Isoformen große Deletionen enthielten. Klon Δ11 enthielt eine Deletion der Nukleotide 637 bis 936, so daß dem Protein ein großer Teil der Hinge-Region und der N-terminale Abschnitt der LBD fehlt. Klon Δ21 zeigt dieselbe Deletion wie Δ11, aber zusätzlich eine Deletion der Nukleotide 347 bis 519. Die resultierende Leserahmenverschiebung führt einen Stopkodon in den Leserahmen an Position 524 der vollständigen cDNA ein, so daß ein kurzes Protein entsteht, welches nur aus Sequenzen der Nterminalen Domäne besteht. Klon Δ31 enthält eine große Deletion (Nukleotide 388 bis 924), wobei ein Protein entsteht, dem die DBD und die Hinge-Region vollständig fehlen. Die Gesamtstruktur der vollständigen ERβ-Transkripte ist in Fig. 2 gezeigt. Mit Ausnahme der Deletion in Klon Δ31 können alle Deletionen durch alternatives Splicing entstehen. Die Mengen der einzelnen Transkripte variieren über einen weiten Bereich. Während das Transkript ΔLBD in relativ hohen Mengen vergleichbar mit dem vollständigen Transkript exprimiert wird wird, können andere deletierten Transkripte durch RT-PCR nur als schwache Banden nachgewiesen werden.The amplification of partial ERβ cDNA sequences from different bovine tissues showed the presence of additional isoforms. Cloning and sequencing of these cDNAs revealed that these isoforms contained large deletions. Clone Δ11 contained a deletion of nucleotides 637 to 936, so that the protein lacks a large part of the hinge region and the N-terminal section of the LBD. Clone Δ21 shows the same deletion as Δ11, but also a deletion of nucleotides 347 to 519. The resulting reading frame shift introduces a stop codon into the reading frame at position 524 of the complete cDNA, so that a short protein is formed, which consists only of sequences from the terminal domain . Clone Δ31 contains a large deletion (nucleotides 388 to 924), producing a protein that is completely devoid of the DBD and the hinge region. The overall structure of the complete ERβ transcripts is shown in FIG. 2. With the exception of the deletion in clone Δ31, all deletions can result from alternative splicing. The amounts of the individual transcripts vary over a wide range. While the transcript ΔLBD is expressed in relatively high amounts comparable to the complete transcript, other deleted transcripts can only be detected as weak bands by RT-PCR.

2.2 Tissue-specific expression of bovine ERβ isoforms in repro production fabrics

RNA-Proben aus verschiedenen Geweben des Rinderfortpflanzungssystems und verschiedenen Kontrollgeweben sowie aus in vitro kultivierten Rindergranulosa- und Thecazellen wurden auf Expression des vollständigen ERβ-Transkripts und der Isoform ΔLBD durch RT-PCR analysiert. Expression des vollstän digen ERβ Transkripts kann in allen untersuchten Reproduktions- und Kontrollgeweben mit Ausnahme des Seminalvesikels nachgewiesen werden. Im Corpus luteum, insbesondere während der Schwangerschaft, findet man eine signifikante Verringerung der Expression. Ein vollständiges Abschalten der Expression sowohl des vollständigen Transkripts als auch des Trans kripts ΔLBD erfolgt im Endometrium während der lutealen Phase.RNA samples from various tissues of the bovine reproductive system and various control tissues as well as from in vitro cattle granules and theca cells were based on expression of the complete ERβ transcript and the isoform ΔLBD analyzed by RT-PCR. Expression of the complete ERβ transcripts can be found in all reproductive and Control tissues with the exception of the seminal vesicle can be detected. One finds in the corpus luteum, especially during pregnancy a significant decrease in expression. A complete shutdown expression of both the full transcript and the trans ΔLBD script occurs in the endometrium during the luteal phase.

2.3 Transcriptional transactivation by cattle ERβ

Zur Untersuchung der Transaktivierungsaktivität der klonierten Rinder ERβ Isoformen wurden transiente Transfektionsuntersuchungen durchgeführt (Fig. 4). Diese Experimente zeigen, daß vollständiger Rinder ERβ die Estrogen-abhängige Transkription eines ERE Reporterkonstrukts aktivieren kann. Geringe Konzentrationen von Estradiol, die mit denen zur Aktivierung von ERα vergleichbar sind, führen zu einer maximalen Transaktivierungs aktivität von Rinder ERβ (drei- bis vierfache Erhöhung gegenüber der basalen Transkriptionsstärke). Ein direkter Vergleich von Aktivierungskurven zeigte, daß in diesem Experiment die maximale Höhe der ERβ-vermittelten transkrip tionellen Aktivierung signifikant geringer als diejenige von humanem ERα ist. Die ERβ Isoform ΔLBD zeigt keinerlei Transaktivierung in diesem Test. Transient transfection studies were carried out to investigate the transactivation activity of the cloned cattle ERβ isoforms ( FIG. 4). These experiments show that whole bovine ERβ can activate the estrogen-dependent transcription of an ERE reporter construct. Low concentrations of estradiol, which are comparable to those for the activation of ERα, lead to a maximum transactivation activity of bovine ERβ (three to fourfold increase compared to the basal level of transcription). A direct comparison of activation curves showed that in this experiment the maximum level of ERβ-mediated transcriptional activation is significantly lower than that of human ERα. The ERβ isoform ΔLBD shows no transactivation in this test.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Isolated bovine estrogen receptor β comprising those in SEQ ID NO. 2nd amino acid sequence shown.

2. Isolated polypeptide, which is an isoform of a bovine estrogen receptor β according to claim 1.

3. Polypeptide according to claim 2 selected from the group of those in Figure shown isoforms ΔLBD, Δ11, Δ21 and Δ31.

4. Isolated polypeptide comprising the ligand binding domain of one Bovine estrogen receptor β corresponding to position 247 to 445 of the in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence shown or a corresponding at least 93% identical amino acid sequence.

5. The polypeptide of claim 4 further comprising a DNA bin domain.

6. polypeptide according to claim 5, characterized, that the DNA binding domain from a nuclear receptor comes from.

7. Isolated nucleic acid, characterized, that it codes for a polypeptide according to any one of claims 1 to 6.

8. A nucleic acid according to claim 7, which is a cDNA or a genomic DNA is.

9. recombinant vector, characterized, that he has at least one copy of a nucleic acid according to claim 7 or contains 8.

10. Vector according to claim 9, characterized, that the nucleic acid is operatively linked to an express is control sequence.

11. recombinant cell, characterized, that with a nucleic acid according to claim 7 or 8 or one Vector according to claim 9 or 10 is transfected.

12. Cell according to claim 11, characterized, that they continue to have a reporter gene under control of one Expression of the polypeptide according to one of claims 1 to 6 contains adjustable expression control sequence.

13. Cell according to claim 12, characterized, that the reporter gene is one for luciferase, β-galactosidase or green Fluorescence protein coding gene is.

14. Cell according to claim 12 or 13, characterized, that the expression control sequence of the reporter gene is an element contains to which the DNA binding domain of a nuclear receptor can bind.

15. Cell according to claim 14, characterized, that the expression control sequence of the reporter gene is an estrogen Contains response element.

16. Use of polypeptides according to one of claims 1 to 6, Nucleic acids according to one of claims 7 to 8, vectors according to one of claims 9 to 10 and cells according to one of the claims 11 to 14 to identify ligands for ERβ.

17. Use according to claim 16 for the identification of ERβ-specific ligands.

18. Use according to claim 16 or 17 for the identification of new Medicines.