DE19834913A1 - Detecting target nucleic acids, especially single-stranded DNAs, using a labeled primer system - Google Patents

Detecting target nucleic acids, especially single-stranded DNAs, using a labeled primer system

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DE19834913A1 DE19834913A DE19834913A DE19834913A1 DE 19834913 A1 DE19834913 A1 DE 19834913A1 DE 19834913 A DE19834913 A DE 19834913A DE 19834913 A DE19834913 A DE 19834913A DE 19834913 A1 DE19834913 A1 DE 19834913A1
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Abstract

A method for detecting single-stranded DNA in a sample is new and comprises contacting the sample with a forward and/or reverse primer (I), at least one of which carries at least part of a label system in a 3' mismatched portion of the primer. The mismatched region is at least one, preferably at least 2-5 nucleotides long. At least one template-dependent polymerase with a 3'-5' proofreading activity cleaves the annealed labeled primer in its mismatched region to release the label and this release is then detected. An Independent claim is included for a kit for the detection of a target nucleic acid in a sample, comprising (I), and at least one nucleic acid polymerase.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein markierter Primer für Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionen (z. B. die Polymerasekettenreaktion) und ein Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz mittels Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, bei dem ein markierter Primer eingesetzt wird.The invention relates to a labeled primer for nucleic acid Amplification reactions (e.g. the polymerase chain reaction) and a method for the detection of a DNA sequence using nucleic acid amplification methods, where a labeled primer is used.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist bekanntlich eine sehr wirkungsvolle Methode zum Nachweis geringer Mengen einer bekannten Nukleinsäure-Sequenz in einer Probe (Erlich H. A., Gelfand, D. Sninsky J. J. (1991), Science, 252, pp. 1643-1651; PCR Protocols. Current methods and applications (1993) edited by B. A. White, Humana Press, Totowa, New Jersey, ISBN 0-89603-244-2). Wenn die Sequenz z. B. einer Virus-DNA bereits bekannt ist, kann ein Primerpaar synthetisiert werden, das zu Regionen auf einander gegenüberliegenden Einzelsträngen komplementär ist und die gesuchte DNA-Sequenz flankiert. Unter den an sich bekannten Bedingungen einer PCR lassen sich dann in vitro durch Aufeinanderfolge von in der Regel mehr als 30 Reaktionszyklen große Mengen einer spezifischen DNA amplifizieren. Durch die PCR-Zyklen wird ein DNA Fragment einer spezifischen Größe, das sich aus den Längen der beiden Primer plus der Länge der Virus-DNA zwischen Ihnen zusammensetzt, nur dann amplifiziert, wenn die gesuchte Virus-DNA in der Probe vorhanden ist. Die PCR- Technik ist so empfindlich, daß damit außerordentlich geringe Mengen einer DNA mit großer Sicherheit nachgewiesen werden können.The polymerase chain reaction (PCR) is known to be a very effective one Method for the detection of small amounts of a known nucleic acid sequence in a sample (Erlich H.A., Gelfand, D. Sninsky J.J. (1991), Science, 252, pp. 1643-1651; PCR protocols. Current methods and applications (1993) edited by B. A. White, Humana Press, Totowa, New Jersey, ISBN 0-89603-244-2). If the Sequence z. B. a virus DNA is already known, a pair of primers be synthesized to regions opposite to each other Single strands are complementary and flanked the searched DNA sequence. Under The known conditions of a PCR can then be tested in vitro Sequence of usually more than 30 reaction cycles large quantities amplify a specific DNA. Through the PCR cycles, a DNA Fragment of a specific size resulting from the lengths of the two primers plus the length of virus DNA put together between you, only then amplified if the searched virus DNA is present in the sample. The PCR Technology is so sensitive that extremely small amounts of DNA can be demonstrated with great certainty.

Aus der internationalen Patentanmeldung WO 92/02638 ist ein Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz bekannt, bei dem eine Probe, in der die nachzuweisende DNA als Einzelstrang vorliegt, mit zwei unterschiedlichen Primern hybridisiert wird, dem forward-Primer und dem reverse-Primer, die den zu amplifizierenden DNA-Strang flankieren. Außerdem wird bei der Reaktion noch eine Oligonukleotid-Sonde eingesetzt, die am 5'-Ende und am 3'-Ende mit je einem Fluoreszenzfarbstoff versehen ist. Diese markierte Sonde wird so ausgewählt, daß sie mit dem zu amplifizierenden DNA-Abschnitt hybridisiert. Die beiden an der Sonde befestigten Fluoreszenzfarbstoffe zeichnen sich dadurch aus, daß die Fluoreszenz des einen Farbstoffes, des Reporters, durch die Nähe des zweiten Moleküls, gegebenenfalls auch eines Fluoreszenzfarbstoffes, des Quenchers, vermindert wird. Diese markierte Sonde, die zwischen den beiden durch die vorstehend genannten Sequenzen charakterisierten Primern an die DNA angelagert ist, weist dann z. B. folgende Sequenz auf:
From international patent application WO 92/02638 a method for detecting a DNA sequence is known, in which a sample in which the DNA to be detected is present as a single strand is hybridized with two different primers, the forward primer and the reverse primer, that flank the DNA strand to be amplified. In addition, an oligonucleotide probe is used in the reaction, which is provided with a fluorescent dye at the 5 'end and at the 3' end. This labeled probe is selected so that it hybridizes with the DNA section to be amplified. The two fluorescent dyes attached to the probe are distinguished by the fact that the fluorescence of one dye, the reporter, is reduced by the proximity of the second molecule, optionally also a fluorescent dye, the quencher. This labeled probe, which is attached to the DNA between the two primers characterized by the abovementioned sequences, then has z. B. the following sequence:

SEQ ID NO. 3: 5'FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA3' SEQ ID NO. 3: 5 ' FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA 3'

Solch eine Sequenz kann unter der Bezeichnung TaqMan® Sonde bei einigen Firmen bestellt und erworben werden und ist zur Verwendung im 5'-Nuklease- Assay, dem TaqMan® Assay, bestimmt. Im einzelnen ist diese Methode beschrieben von Livak K. J., Flood S. J. A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K., Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Method and Appl. 1995; 4 : 357-362.Such a sequence can be called TaqMan® probe in some Companies are ordered and acquired and is for use in the 5'-nuclease Assay, the TaqMan® assay. This method is in detail described by Livak K.J., Flood S.J.A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K., Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Method and Appl. 1995; 4: 357-362.

Die besondere Eigenschaft dieser Sonde besteht darin, daß die Fluoreszenz des am 5'-Ende der Sonde befestigten Farbstoffes (FAM), des Reporters, durch die Nähe des am 3'-Ende des Primers angeordneten zweiten Fluoreszenzfarbstoffes (TAMRA), des Quenchers, reduziert wird, siehe oben.The special property of this probe is that the fluorescence of the at the 5 'end of the probe attached dye (FAM), the reporter, by the Close to the second fluorescent dye located at the 3 'end of the primer (TAMRA), the quencher, is reduced, see above.

Wird nun im Verlauf der Amplifikation unter der Einwirkung einer geeigneten, vorzugsweise thermostabilen DNA-Polymerase der neue DNA-Strang ausgebildet, dann verdrängt die DNA-Polymerase die markierte Sonde nicht nur vom Einzelstrang, sondern zerlegt ihn mittels ihrer endonukleolytischen Aktivität und setzt dabei die beiden Fluoreszenzfarbstoffe frei. Die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes wird jetzt nicht mehr durch den Quencherfarbstoff unterdrückt und steigt an. Mißt man nun mit einem Fluoreszenzspektrometer die Fluoreszenz bei der Wellenlänge des Reporterfarbstoffes, dann läßt sich ein Anstieg der Fluoreszenz feststellen, die der Menge der neu gebildeten DNA entspricht.If, in the course of the amplification, a suitable, preferably thermostable DNA polymerase the new DNA strand is formed,  then the DNA polymerase not only displaces the labeled probe from the Single strand, but disassembles it by means of its endonucleolytic activity and releases the two fluorescent dyes. The fluorescence of the Reporter dye is no longer suppressed by the quencher dye and increases. Now measure the fluorescence with a fluorescence spectrometer at the wavelength of the reporter dye, then an increase in Determine fluorescence that corresponds to the amount of newly formed DNA.

Als ein Nachteil dieser Methode ist es anzusehen, daß neben dem forward-Primer und dem reverse-Primer noch zusätzlich eine markierte Sonde benötigt wird, um die Amplifikation des nachzuweisenden DNA-Abschnittes feststellen zu können. Es stellte sich deshalb die Aufgabe, dieses bekannte Verfahren zu vereinfachen. Es wurde nun gefunden, daß auf den Einsatz einer zusätzlichen markierten Sonde bei der Polymerasekettenreaktion verzichtet werden kann, wenn einer der beiden Primer mit einem Reporter- und einem Quenchermolekül markiert wird und gleichzeitig dafür Sorge getragen wird, daß der so markierte Primer mit dem zu amplifizierenden DNA-Strang nicht vollständig hybridisiert.A disadvantage of this method is that in addition to the forward primer and the reverse primer additionally requires a labeled probe to be able to determine the amplification of the DNA section to be detected. It the task was therefore to simplify this known method. It has now been found that the use of an additional labeled probe can be dispensed with in the polymerase chain reaction if one of the two Primer is labeled with a reporter and a quencher molecule and at the same time, care is taken to ensure that the primer labeled in this way matches the amplifying DNA strand is not fully hybridized.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein markierter Primer für Amplifikationsreaktionen (z. B. die Polymerasekettenreaktion), der an den beiden Enden des Oligonukleotidsstranges mit einem Reporterfarbstoff und einem Quenchermolekül, markiert ist, und mindestens eine, vorzugsweise wenigstens die letzten zwei bis drei oder auch mehr Basen am 3'-Ende des so markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär sind. Dieser markierte Primer kann mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz keine vollständige Basenpaarung eingehen. Unter der Einwirkung der zur Amplifikation eingesetzten Polymerase, die Korrektureigenschaften (proof-reading) besitzen muß, werden durch deren 3' → 5'-nukleolytische Aktivität die nicht gepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit dem daran befestigten Reporterfarbstoff- oder Quenchermolekül vor der eigentlichen Verlängerungsreaktion freigesetzt. Dann aber befindet sich der Quencher nicht mehr in räumlicher Nähe zum Reporterfarbstoff, so daß dessen Fluoreszenz ansteigt.The invention therefore relates to a labeled primer for Amplification reactions (e.g. the polymerase chain reaction) on the two Ends of the oligonucleotide strand with a reporter dye and a Quencher molecule, is marked, and at least one, preferably at least the last two to three or more bases at the 3 'end of the primer marked in this way are not complementary to the DNA sequence to be amplified. This labeled primer cannot complete with the DNA sequence to be amplified Base pairing. Under the influence of those used for amplification Polymerase, which must have proof-reading properties due to their 3 '→ 5' nucleolytic activity, the unpaired bases of the marked primers together with the reporter dye or attached  Quencher molecule released before the actual extension reaction. Then but the quencher is no longer in close proximity to the Reporter dye so that its fluorescence increases.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz mittels Nukleinsäureamplifikation, bei dem einer der Primer die vorstehend genannten Merkmale aufweist. Bei der Amplifikation, für die eine oder mehrere thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden können, von denen wenigstens eine auch Korrektureigenschaften (proof-reading) haben muß, werden dann die nicht gepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit dem daran befestigten Farbstoff freigesetzt, wodurch die Fluoreszenz auf der Wellenlänge des Reporterfarbstoffes ansteigt.The invention therefore also relates to a method for the detection of a DNA sequence by means of nucleic acid amplification, in which one of the primers is the Features mentioned above. When amplifying, for one or several thermostable DNA polymerases can be used, one of which at least one must also have proofreading properties then the unpaired bases of the labeled primer along with the one on it attached dye released, causing the fluorescence on the wavelength of the Reporter dye increases.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl der forward-Primer als auch der reverse-Primer mit den beiden vorstehend genannten Reporter- und Quenchermolekülen markiert sein. Während der Quencherfarbstoff in die Reaktionslösung abgegeben wird, trägt der neu gebildete DNA-Abschnitt zusammen mit dem Rest des Primers auch noch den fluoreszierenden Reporterfarbstoff. Dies ist die bevorzugte Verfahrensweise für quantitative Anwendungen. Genauso gut kann aber die Markierung mit Quencher und Reporterfarbstoff auch "umgekehrt" erfolgen, so daß der Reporterfarbstoff in die Lösung abgegeben wird und der neu gebildete DNA-Abschnitt den Quencher trägt. Wenn gleichzeitig mehrere Parameter nebeneinander nachgewiesen werden sollen, dann wählt man zweckmäßigerweise Reporter-Farbstoffe, die nebeneinander nachgewiesen werden können.In the method according to the invention, both the forward primer and the reverse primer with the two reporters and Quencher molecules must be labeled. During the quencher dye in the Is released, the newly formed DNA section carries along with the rest of the primer also the fluorescent one Reporter dye. This is the preferred procedure for quantitative Applications. Marking with Quencher and Reporter dye also "reversed" so that the reporter dye in the Solution is released and the newly formed DNA section carries the quencher. When several parameters are detected at the same time then you choose expedient reporter dyes that can be demonstrated side by side.

Für die erfindungsgemäße Amplifikationsreaktion können verschiedene DNA- Polymerasen eingesetzt werden. Hat die verwendete DNA-Polymerase die Eigenschaft des proof-readings, dann kann die Reaktion mit einer einzigen Polymerase durchgeführt werden (z. B. ULTma®-DNA-Polymerase, hergestellt für Perkin Elmer von Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA). Anderenfalls ist ein Gemisch aus mehreren Polymerasen einzusetzen, indem neben z. B. der Taq DNA-Polymerase auch noch andere Polymerasen mit 3' → 5' Nukleaseaktivität zur Anwendung kommen. Geeignete thermostabile Polymerasen mit 3' - 5' Nukleaseaktivität sind die Tli DNA Polymerase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) oder die Vent DNA Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).For the amplification reaction according to the invention, different DNA Polymerases are used. Does the DNA polymerase used Property of proof-reading, then the reaction with a single Polymerase (e.g. ULTma® DNA polymerase, manufactured for  Perkin Elmer from Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA). Otherwise a mixture of several polymerases must be used by in addition to e.g. B. the Taq DNA polymerase also other polymerases with 3 '→ 5' Nuclease activity are used. Suitable thermostable polymerases with 3 '- 5' nuclease activity are the Tli DNA polymerase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) or the Vent DNA Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß die ungepaarten Basen des Primers ein Angriffspunkt für die Polymerase mit Korrekturfunktion sind. Die eingesetzten thermostabilen DNA-Polymerasen weisen eine 3' → 5'-Nuklea­ seaktivität, vorzugsweise 3' → 5' Exonukleaseaktivität auf, die zur Freisetzung der nicht-hybridisierten Basen zusammen mit dem Quenchermolekül führt.The method according to the invention is based on the knowledge that the unpaired Bases of the primer are a target for the polymerase with correction function. The thermostable DNA polymerases used have a 3 '→ 5' nuclea sea activity, preferably 3 '→ 5' exonuclease activity, which is required to release the leads non-hybridized bases together with the quencher molecule.

Das Verfahren zeichnet sich vor allem durch seine Einfachheit aus, weil nur zwei Oligonukleotide zur Durchführung der Nukleinsäureamplifikation wie z. B. der PCR erforderlich sind. Dies ist beispielsweise dann von Vorteil, wenn zum Nachweis variabler Zielsequenzen wie von Viren konservierte Nukleinsäureabschnitte amplifiziert werden müssen bzw. gleichzeitig mehrere z. B. virale Parameter nachgewiesen werden sollen.The process is mainly characterized by its simplicity, because only two Oligonucleotides for performing nucleic acid amplification such as. B. the PCR required are. This is of advantage, for example, if for verification variable target sequences such as nucleic acid segments conserved by viruses must be amplified or several z. B. Viral parameters should be demonstrated.

Darüber hinaus ist die hier beschriebene Methode bestens zur quantitativen Amplifikation geeignet, da die Fluoreszenzzunahme direkt proportional zur Menge der amplifizierten DNA ist. In addition, the method described here is best for quantitative Amplification is suitable because the increase in fluorescence is directly proportional to the amount of the amplified DNA.  

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:The invention is illustrated by the following example:

Beispielexample

Zum Nachweis von Hepatitis B Virus DNS wird diese zunächst mit Hilfe von Standardverfahren extrahiert (zum Beispiel Ishizawa M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma, S. Simple procedure of DNA Isolation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 19 : 5792). Die Amplifikation wird wie folgt angesetzt:To detect hepatitis B virus DNA, this is first of all using Standard methods extracted (for example, Ishizawa M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma, S. Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991; 19: 5792). The amplification is set up as follows:

Zu 10 µl der extrahierten DNA werden 5 µ 10 × ULTma Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8.8, 100 mM KCl, 0.02% Tween 20, 2.5 mM MgCl2, Perkin-Elmer), 4 µl des Primers 1 (siehe SEQ ID No. 1 des Sequenzprotokolls) (10 pMol/µl), 4 µl des Primers 2 (siehe SEQ ID No. 2 des Sequenzprotokolls) (1 pMol/µl), 4 µl dNTPs (25 mM) und 0,25 µl ULTma DNA Polymerase mit proof-reading-Funktion (Perkin-Elmer 1 bis 1,5 units) werden mit 22,75 µl Wasser gemischt und folgenden Thermozyklen unterworfen:
5 μ 10 × ULTma buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.8, 100 mM KCl, 0.02% Tween 20, 2.5 mM MgCl 2 , Perkin-Elmer), 4 μl of primer 1 (see SEQ ID No. 1 of the sequence listing) (10 pmol / ul), 4 ul of primer 2 (see SEQ ID No. 2 of the sequence listing) (1 pmol / ul), 4 ul dNTPs (25 mM) and 0.25 ul ULTma DNA polymerase with proof-reading function (Perkin-Elmer 1 to 1.5 units) are mixed with 22.75 µl water and subjected to the following thermal cycles:

  • 1. Initiale Denaturierung für 1 Minute bei 90°1. Initial denaturation for 1 minute at 90 °
  • 2. 35 Zyklen, jeweils 28 Sekunden bei 94°C Denaturierung und 1 Minute bei 62°C Annealing und Verlängerung2. 35 cycles, 28 seconds each at 94 ° C denaturation and 1 minute at 62 ° C annealing and extension
  • 3. Kühlen bei 4°C bis zur Auswertung.3. Cool at 4 ° C until evaluation.

Die PCR-Reaktion wird in einem Fluoreszenzspektrometer ausgewertet. Dazu wird die Fluoreszenz bei der Reporterwellenlänge (518 nm für FAM) gemessen. Es wird ein Schwellenwert auf Basis der Fluoreszenz von Negativkontrollen, die keine Zielsequenz enthalten, kalkuliert, und Unbekannte werden daran ausgewertet. The PCR reaction is evaluated in a fluorescence spectrometer. This will fluorescence measured at the reporter wavelength (518 nm for FAM). It will a threshold based on the fluorescence of negative controls that do not Target sequence included, calculated, and unknowns are evaluated on it.  

LegendeLegend

Die Figur stellt einen Zyklus des beanspruchten Verfahrens dar (TaqWoman Assay")
The figure represents a cycle of the claimed method (TaqWoman Assay ")

A bezeichnet den "forward Primer" mit ungepaartem 3'-Ende
B bezeichnet den "reverse Primer"
bezeichnet das Reportermolekül
bezeichnet das QuenchermolekülA denotes the "forward primer" with an unpaired 3 'end
B denotes the "reverse primer"
denotes the reporter molecule
denotes the quencher molecule

Bei 1. findet das sogenannte "annealing" statt, wobei das 3'-Ende ungepaart bleibt, da es nicht komplementär ist.At 1. the so-called "annealing" takes place, with the 3 'end remains unpaired since it is not complementary.

Bei 2. findet das sogenannte "proofreading" statt, wobei das Enzym mit "Proof-reading"-Eigenschaft das ungepaarte 3'-Ende korrigiert, d. h. entfernt.At 2. the so-called "proofreading" takes place, with the enzyme "Proof-reading" property corrects the unpaired 3 'end, d. H. away.

Bei 3. findet die sogenannte Strangverlängerung (Elongationsphase) statt, die bei 4. dann beendet ist.At 3. there is the so-called strand extension (elongation phase) instead, which then ended at 4th.

Claims (8)

1. Markierter Primer für Amplifikationsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß er
  • 1. an den beiden Enden des Oligonukleotid-Stranges mit einem Reporterfarbstoff- und einem Quenchermolekül, markiert ist, und
  • 2. wenigstens eine Base am 3'-Ende des markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist.
1. Labeled primer for amplification reactions, characterized in that it
  • 1. is marked at the two ends of the oligonucleotide strand with a reporter dye and a quencher molecule, and
  • 2. at least one base at the 3 'end of the labeled primer is not complementary to the DNA sequence to be amplified.
2. Markierter Primer für Amplifikationsreaktionen (z. B. die Polymerasekettenreaktion), dadurch gekennzeichnet, daß er
  • 1. an den beiden Enden des Oligonukleotid-Stranges mit einem Reporterfarbstoff- und einem Quenchermolekül markiert ist, und
  • 2. wenigstens die letzten zwei bis drei oder auch mehr Basen am 3'- Ende des markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA- Sequenz nicht komplementär sind.
2. Labeled primer for amplification reactions (z. B. the polymerase chain reaction), characterized in that it
  • 1. is marked at the two ends of the oligonucleotide strand with a reporter dye and a quencher molecule, and
  • 2. at least the last two to three or more bases at the 3 'end of the labeled primer are not complementary to the DNA sequence to be amplified.
3. Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß
  • 1. einer der Primer an den beiden Enden seines Oligonukleotid-Stranges mit einem Reporterfarbstoff- und einem Quenchermolekül markiert ist,
  • 2. wenigstens eine Base am 3'-Ende des markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist und deshalb mit ihr keine Basenpaarung eingehen,
  • 3. für die Amplifikation eine oder mehrere vorzugsweise thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden, von denen eine auch Korrektureigenschaften (proof-reading) hat, und die nicht gepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit dem daran befestigten Quenchermolekül freisetzt,
  • 4. wodurch die Fluoreszenz auf der Wellenlänge des Reporterfarbstoffes ansteigt und damit die Bildung der mit diesem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Sequenz angezeigt wird.
3. A method for detecting a DNA sequence, characterized in that
  • 1. one of the primers is labeled with a reporter dye and a quencher molecule at the two ends of its oligonucleotide strand,
  • 2. at least one base at the 3 'end of the labeled primer is not complementary to the DNA sequence to be amplified and therefore does not enter into a base pairing,
  • 3. one or more preferably thermostable DNA polymerases are used for the amplification, one of which also has correction properties (proof-reading) and which releases the unpaired bases of the labeled primer together with the quencher molecule attached thereto,
  • 4. whereby the fluorescence increases on the wavelength of the reporter dye and thus the formation of the DNA sequence labeled with this fluorescent dye is indicated.
4. Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz mittels der Polymerasekettenreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß
  • 1. einer der Primer an den beiden Enden seines Oligonukleotid-Stranges mit einem Reporterfarbstoff- und einem Quenchermolekül markiert ist,
  • 2. wenigstens zwei bis drei Basen oder mehr am 3'-Ende des markierten Primers mit der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht komplementär sind und deshalb mit ihr keine Basenpaarung eingehen,
  • 3. für die Amplifikation eine oder mehrere vorzugsweise thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden, von denen eine auch Korrektureigenschaften (proof-reading) hat, und die nicht gepaarten Basen des markierten Primers zusammen mit dem daran befestigten Quenchermolekül freisetzt,
  • 4. wodurch die Fluoreszenz auf der Wellenlänge des Reporterfarbstoffes ansteigt und damit die Bildung der mit diesem Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Sequenz angezeigt wird.
4. A method for the detection of a DNA sequence by means of the polymerase chain reaction, characterized in that
  • 1. one of the primers is labeled with a reporter dye and a quencher molecule at the two ends of its oligonucleotide strand,
  • 2. at least two to three bases or more at the 3 'end of the labeled primer are not complementary to the DNA sequence to be amplified and therefore do not form a base pair,
  • 3. one or more preferably thermostable DNA polymerases are used for the amplification, one of which also has correction properties (proof-reading) and which releases the unpaired bases of the labeled primer together with the quencher molecule attached thereto,
  • 4. whereby the fluorescence increases on the wavelength of the reporter dye and thus the formation of the DNA sequence labeled with this fluorescent dye is indicated.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus zwei thermostabilen Polymerasen eine Taq DNA-Polymerase sowie eine Polymerase mit 3' - 5'-Nukleaseaktivität umfaßt.5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that the Mixture of two thermostable polymerases a Taq DNA polymerase and a polymerase with 3 '- 5' nuclease activity. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zunahme der Fluoreszenz des Reporter-Fluoreszenzfarbstoffes proportional zu der Menge der amplifizierten DNA-Sequenz ist.6. The method according to claims 3, 4 or 5, characterized in that the increase in fluorescence of the reporter fluorescent dye is proportional to the amount of amplified DNA sequence. 7. Verfahren nach Ansprüchen 3, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Parameter durch Einsatz der entsprechenden Primer gleichzeitig nachgewiesen werden, wobei die Primer voneinander getrennt nachweisbare Reporter-Farbstoffe enthalten.7. The method according to claims 3, 4 or 6, characterized in that several parameters by using the corresponding primer at the same time are detected, the primers being separated from one another detectable reporter dyes included. 8. Diagnostisches Mittel, enthaltend neben anderen zur Durchführung der PCR nötigen Komponenten einen markierten Primer nach Anspruch 1.8. Diagnostic agent containing, among others, for carrying out the PCR necessary components a labeled primer according to claim 1.
DE19834913A 1997-12-15 1998-08-03 Detecting target nucleic acids, especially single-stranded DNAs, using a labeled primer system Withdrawn DE19834913A1 (en)

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