DE19832840C1 - Means for immunotherapy of tumor diseases - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel, die sich zur Immuntherapie von Tumorerkrankungen eignen. Solche Mittel sind Tumorzellen mit einer in einem Menschen vorliegenden Kombination von MHC I- und MHC II-Genen, wobei die Gene exprimiert werden, eine die Tumorzelle enthaltende Tumorzell-Bibliothek und die Tumorzellen umfassende Vakzine. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Tumorzellen und die Verwendung dieser sowie der Vakzine und der Tumorzell-Bibliothek.The present invention relates to agents which are suitable for the immunotherapy of tumor diseases. Such agents are tumor cells with a combination of MHC I and MHC II genes present in a human, the genes being expressed, a tumor cell library containing the tumor cell and the vaccine comprising the tumor cells. Furthermore, the invention relates to a method for producing the tumor cells and the use of these as well as the vaccine and the tumor cell library.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel, die sich zur Immuntherapie von Tumorerkrankungen eignen. Solche Mittel sind Tumorzellen, eine diese enthaltende Tumorzell-Bibliothek und die Tumorzellen umfassende Vakzine. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Tumorzellen und die Verwendung dieser sowie der Vakzine und der Tumorzell-Bibliothek.The present invention relates to means for Immunotherapy for tumor diseases are suitable. Such means are Tumor cells, a tumor cell library containing them and the Vaccine comprising tumor cells. The invention further relates to a method of producing the tumor cells and use this as well as the vaccine and the tumor cell library.
Zur Behandlung von Tumorerkrankungen werden die verschiedensten Verfahren durchgeführt. Vielfach werden Primärtumoren chirurgisch entfernt und die Patienten einer Nachbehandlung in Form einer Chemo- und/oder Strahlentherapie unterzogen. Durch die Nachbehandlung soll erreicht werden, daß restliche Tumorzellen zerstört werden. Auch werden Immuntherapie-Verfahren versucht, in denen aus den Primärtumoren erhaltene Tumorzellen manipuliert und den Patienten wieder zurückgegeben werden. Damit soll eine Sensibilisierung des Immunsystems für die Tumorzellen erreicht werden, wodurch eine spätere Metastasenbildung verhindert werden soll. Die Immuntherapie-Verfahren zeigen allerdings noch nicht die gewünschten Erfolge. Vielfach reicht die Sensibilisierung des Immunsystems nicht aus, wodurch Tumorzellen unerkannt bleiben und sich zu Metastasen ausbilden können. Auch fordern Immuntherapie-Verfahren, daß Patienten eigene Tumorzellen zur Behandlung verwendet werden. Dies bedeutet einen großen Kosten- und Zeitaufwand. Vielfach kann eine Immuntherapie überhaupt nicht durchgeführt werden, weil nicht genügend Tumorzellen aus dem einzelnen Patienten erhalten werden.A wide variety of treatments are used to treat tumor diseases Procedure carried out. Often become primary tumors surgically removed and patients undergo follow-up treatment Form undergo chemotherapy and / or radiation therapy. By the aftertreatment should be achieved that the remaining Tumor cells are destroyed. Also immunotherapy procedures tried in which tumor cells obtained from the primary tumors manipulated and returned to the patient. In order to is supposed to sensitize the immune system to the tumor cells can be achieved, causing a later metastasis should be prevented. The immunotherapy procedures show but not yet the desired success. Often enough the sensitization of the immune system does not mean that Tumor cells remain undetected and develop into metastases can. Immunotherapy procedures also require that patients own tumor cells can be used for treatment. This means a great expense and time. Often can immunotherapy cannot be done at all because did not receive enough tumor cells from the individual patient become.
Aus J. Biol. Regul. Homeostatic Agents, Vol. 7, No. 3 (1993), 99-105 geht hervor, daß in der humanen Melanom-Zellinie SK-Mel28 nach Zugabe von α-IFN die Expression von MHC I- und MHC II-Genen erhöht wird. Ferner weist CA 125:16501n darauf hin, daß die Zugabe von rhIL-4 in Tumorzellen eine Erhöhung der Expression der MHC I- und MHC II-Gene sowie des Gens für das Tumor assoziierte Antigen (TAA) bewirkt.From J. Biol. Regul. Homeostatic Agents, Vol. 7, No. 3 (1993), 99-105 shows that in the human melanoma cell line SK-Mel28 after adding α-IFN, expression of MHC I and MHC II genes is increased. CA 125: 16501n also points out that the Addition of rhIL-4 in tumor cells increases expression the MHC I and MHC II genes and the gene for the tumor associated antigen (TAA).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Mittel bereitzustellen, mit dem eine Immuntherapie von Tumorerkrankungen durchgeführt werden kann, wobei die vorstehenden Nachteile vermieden werden.The present invention is based on the object of a means provide with which an immunotherapy of Tumor diseases can be carried out with the the above disadvantages can be avoided.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht. According to the invention this is the subject of the Claims achieved.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders über den Zusammenhang zwischen der Expression von MHC ("major histocompatibility complex") I-, II-Genen in Tumorzellen und der Immunogenität dieser. MHC I-Gene werden auch mit HLA-A-, HLA-B- und HLA-C-Genen bezeichnet. Ferner werden MHCII-Gene auch mit HLA-Dr-, HLA-DQ- und HLA-DP-Genen bezeichnet. Der Anmelder hat erkannt, daß in Tumorzellen die Expression von MHC I und/oder MHC II-Genen gestört ist. Insbesondere hat er gefunden, daß viele Tumorzellen keine MHC II-Gene exprimieren. Desweiteren hat er erkannt, daß durch die gestörte Expression der MHC I- und/oder MHC II-Gene und dem damit verbundenen Fehlen der entsprechenden Genprodukte auf der Oberfläche von Tumorzellen die dort vorliegenden Tumorantigene vom Immunsystem nicht als Fremd-Antigene erkannt und daher die Tumorzellen nicht zerstört werden. Andererseits hat der Anmelder gefunden, daß Tumorzellen, die eine in einem Menschen vorliegende Kombination von MHC I- und MHC II-Genen aufweisen und diese auch exprimie ren, eine hohe Immunogenität aufweisen. Solche Kombinationen sind insbesondere jene, die in Tabelle I angegeben sind. Desweiteren hat er erkannt, daß die Immunogenität solcher Tumorzellen noch gesteigert werden kann, wenn sie ferner kostimulatorische Moleküle und/oder Zytokine exprimieren.The present invention is based on the knowledge of Applicant on the relationship between the expression of MHC ("major histocompatibility complex") I, II genes in tumor cells and the immunogenicity of this. MHC I genes are also associated with HLA-A, HLA-B and HLA-C genes designated. Furthermore, MHCII genes also labeled with HLA-Dr, HLA-DQ and HLA-DP genes. The The applicant has recognized that the expression of MHC I and / or MHC II genes is disturbed. In particular, he has found that many tumor cells do not express MHC II genes. Furthermore, he recognized that by the disturbed expression the MHC I and / or MHC II genes and the associated absence of the corresponding gene products on the surface of Tumor cells the tumor antigens present there from the immune system not recognized as foreign antigens and therefore not the tumor cells be destroyed. On the other hand, the applicant has found that Tumor cells, a combination present in a human of MHC I and MHC II genes and also express them ren, have a high immunogenicity. Such combinations are, in particular, those given in Table I. He also recognized that the immunogenicity of such Tumor cells can still be increased if they are further express costimulatory molecules and / or cytokines.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, Tumorzellen mit einer in einem Menschen vorliegenden Kombination von MHC I- und MHC II-Genen, die experimiert werden, bereit zustellen, wobei die MHC I- und/oder MHC II-Gene transfiziert worden sind.According to the invention, the knowledge of the applicant is used, Tumor cells with a combination present in a human of MHC I and MHC II genes being experimented deliver, the MHC I and / or MHC II genes transfected have been.
Der Ausdruck "Tumorzellen" umfaßt Tumorzellen jeglichen Tumors des Menschen. Beispiele von Tumoren umfassen Mamakarzinom, Anogenitalkarzinom, Lungenkarzinom, Colonkarzinom, Hirntumor, Magenkarzinom, Blasenkarzinom, Leberzellkarzinom und Melanom. Die Tumorzellen können frisch isoliert sein oder in Kultur vorliegen. Auch können sie als solche oder in einem Zellverband, z. B. (Primär)Tumor oder Metastase, vorliegen.The term "tumor cells" includes tumor cells from any tumor of the human. Examples of tumors include breast cancer, Anogenital carcinoma, lung carcinoma, colon carcinoma, brain tumor, Gastric carcinoma, bladder carcinoma, liver cell carcinoma and melanoma. The tumor cells can be freshly isolated or in culture available. They can also be used as such or in a cell assembly, e.g. B. (primary) tumor or metastasis.
Der Ausdruck "Kombination von MHC I- und MHC II-Genen" umfaßt jegliche Kombination von MHC I- und MHC II-Genen, die in einem Menschen vorliegen kann. Insbesondere ist die Kombination aus den in Tabelle I angegebenen Kombinationen ausgewählt.The term "combination of MHC I and MHC II genes" includes any combination of MHC I and MHC II genes that are in one People can exist. In particular, the combination of the combinations specified in Table I selected.
Der Ausdruck "exprimierte MHC I- und MHC II-Gene" weist darauf hin, daß die Kombination von MHC I- und MHC II-Genen exprimiert wird, wobei die MHC I- und/oder MHC II-Gene in die Tumorzellen transfiziert worden sind. Dies kann durch übliche Verfahren erreicht werden. Günstig ist es, die Tumorzellen und ggfs. andere Zellen, z. B. Lymphozyten, des gleichen Patienten, zunächst einer Gewebetypisierung zu unterziehen um festzustellen, welche der MHC I- und/oder MHC II-Gene eine gestörte Expression aufweisen. Die Gewebetypisierung kann z. B. durch serologische Verfahren, wie sie von dem "11th International Histocompatibility Workshop" bekannt sind, erfolgen. Die gestörte Expression der MHC I- und/oder MHC II- Gene wird dann durch Transfektion von entsprechenden exogenen, ggfs. auf Expressionsvektoren vorliegenden Genen in die Tumorzellen kompensiert. Beispiele von Expressionsvektoren umfassen pUHD10-I, pRcRSV, pBSK, RSV.5 hygro, pBJ und B45-neo, Beispiele von Transfektionsverfahren umfassen Calciumphosphat- Copräzipitation, Elektroporation, Lipofektion, DOTAP-Liposome und retrovirale Transfektion. Die Expression von transfizierten MHC I- und/oder MHC II-Genen kann stabil oder transient sein, wobei stabil bevorzugt ist. Der Nachweis der Expression kann durch übliche Verfahren, z. B. serologische Verfahren, vgl. vorstehend, erfolgen.The expression "expressed MHC I and MHC II genes" indicates this indicates that the combination of MHC I and MHC II genes express is, the MHC I and / or MHC II genes in the tumor cells have been transfected. This can be done through common procedures can be achieved. It is favorable to the tumor cells and possibly. other cells, e.g. B. lymphocytes, from the same patient, first undergo tissue typing in order to determine which of the MHC I and / or MHC II genes is one have disturbed expression. The tissue typing can e.g. B. by serological methods as described by the "11th International Histocompatibility Workshop "are known respectively. The disturbed expression of the MHC I and / or MHC II Genes are then transfected from appropriate exogenous, if necessary, genes present on expression vectors in the Tumor cells compensated. Examples of expression vectors include pUHD10-I, pRcRSV, pBSK, RSV.5 hygro, pBJ and B45-neo, Examples of transfection methods include calcium phosphate Coprecipitation, electroporation, lipofection, DOTAP liposomes and retroviral transfection. Expression of transfected MHC I and / or MHC II genes can be stable or transient, preference being given to stable. Evidence of expression can by usual methods, e.g. B. serological methods, cf. above.
In bevorzugter Ausführungsform weisen vorstehende Tumorzellen auch ein oder mehrere für kostimulatorische Moleküle und/oder Zytokine kodierende Gene auf, die exprimiert werden. Beispiele von kostimulatorischen Molekülen umfassen B7, wie B7-1 oder B7- 2, und CD44. Beispiele von Zytokinen umfassen Interleukine, wie IL-2, GM-CSF, TNF-α und Interferon-γ. Das Vorliegen der angesprochenen Gene in den Tumorzellen und die Expression der Gene können in üblicher Weise erreicht werden. Es wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.In a preferred embodiment, the above tumor cells have also one or more for costimulatory molecules and / or Genes encoding cytokines that are expressed. Examples of costimulatory molecules include B7, such as B7-1 or B7- 2, and CD44. Examples of cytokines include interleukins such as IL-2, GM-CSF, TNF-α and interferon-γ. The presence of the addressed genes in the tumor cells and the expression of the Genes can be reached in the usual way. It's going on referenced above.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein
Verfahren zur Herstellung vorstehender Tumorzellen. Ein solches
Verfahren umfaßt die folgenden Verfahrensschritte:
Another object of the present invention is a method for producing the above tumor cells. Such a process comprises the following process steps:
- a) Gewebetypisierung von Tumorzellen,a) tissue typing of tumor cells,
- b) Transfektion der Tumorzellen mit MHC I- und/oder MHC II-Genen, wo durch eine in einem Menschen vorliegende Kombination dieser Gene erhalten wird, undb) transfection of the tumor cells with MHC I and / or MHC II genes, where through a combination of these genes present in a human is obtained, and
- c) Selektion auf jene Tumorzellen, welche die MHC I- und MHC II-Gene ex primieren.c) Selection for those tumor cells that the MHC I and MHC II genes ex prime.
Der Ausdruck "Gewebetypisierung von Tumorzellen" umfaßt jegliches Verfahren, mit dem die Expression von MHC I- und MHC II-Genen bestimmt werden kann. Es wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Günstig kann es sein, daß von dem gleichen Patienten, von dem die Tumorzellen stammen, auch andere Zellen, z. B. Lymphozyten, einer Gewebetypisierung unterzogen werden. Damit wird die Feststellung der für diesen Patienten geeigneten Kombination von MHC I und MHC II-Genen noch erleichtert.The term "tissue typing of tumor cells" encompasses any method with which the expression of MHC I and MHC II genes can be determined. Reference is made to the above explanations. It may well be that from the same patient from whom the tumor cells originate, also others Cells, e.g. B. lymphocytes, a tissue typing. In order to the determination of the combination of MHC I and MHC II genes even easier.
Der Ausdruck "Transfektion von Tumorzellen" umfaßt jegliches Verfahren, mit dem MHC I- und/oder MHC II-Gene, in Tumorzellen transfiziert werden können. Es wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.The term "transfection of tumor cells" encompasses any method with the MHC I and / or MHC II genes, can be transfected in tumor cells. Reference is made to the above explanations.
Der Ausdruck "Selektion auf Tumorzellen" umfaßt jegliches Verfahren, mit dem auf Tumorzellen selektioniert werden kann, die MHC I- und MHC II-Gene ex primieren. Es wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.The term "selection for tumor cells" encompasses any method by which can be selected for tumor cells, the MHC I and MHC II genes ex prime. Reference is made to the above explanations.
In bevorzugter Ausführungsform werden die Tumorzellen auch mit ein oder mehreren für kostimulatorische Moleküle und/oder Zytokine kodierenden Gene transfiziert und auf die Expression dieser Gene selektioniert. Es wird auf vor stehende Ausführungen verwiesen.In a preferred embodiment, the tumor cells are also with or several genes coding for costimulatory molecules and / or cytokines transfected and selected for the expression of these genes. It will be on before referenced explanations.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Tumorzell-Biblio thek, die vorstehende Tumorzellen umfaßt. Bevorzugt ist es, wenn die Tumorzel len von jeglichem Tumor des Menschen stammen und jegliche in einem Men schen vorliegende Kombination von MHC I- und MHC II-Genen umfassen. Another object of the present invention is a tumor cell library thek, which includes the above tumor cells. It is preferred if the tumor cell len come from any human tumor and all in one men present combination of MHC I and MHC II genes include.
Besonders bevorzugt umfassen die Tumorzellen die in Tabelle I angegebenen Kombinationen von MHC I- und MHC II-Genen.The tumor cells particularly preferably comprise those given in Table I. Combinations of MHC I and MHC II genes.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vakzine, die vor stehende Tumorzellen und übliche Hilfsstoffe, z. B. Puffer, Trägermittel und Ver dünnungsmittel, umfaßt. Bevorzugt ist es, wenn die Vakzine, Tumorzellen ver schiedener Tumoren mit jeweils gleicher Kombination von MHC I- und MHC II- Gene umfaßt.Another object of the present invention is a vaccine, which standing tumor cells and usual auxiliary substances, e.g. B. buffers, vehicles and Ver fertilizers. It is preferred if the vaccine ver. Tumor cells different tumors, each with the same combination of MHC I and MHC II Includes genes.
Die vorliegende Erfindung stellt Tumorzellen bereit, in denen eine Kombination von MHC I- und MHC II-Genen exprimiert wird, wobei die Kombination in einem Menschen vorliegt. Insbesondere ist die Kombination eine solche, die bei vielen Menschen vorliegt. Somit stellen die erfindungsgemäßen Tumorzellen ein Mittel dar, das nicht nur einem bestimmten Menschen, sondern vielen Menschen verabreicht werden kann. Ferner stammen die Tumorzellen von jeglichem Tumor des Menschen. Insofern ist die vorliegende Erfindung auch nicht auf die Be handlung eines bestimmten Tumors beschränkt, sondern kann für ein beliebig großes Spektrum von Tumoren verwendet werden.The present invention provides tumor cells in which a combination of MHC I and MHC II genes is expressed, the combination in one People. In particular, the combination is one that many People. The tumor cells according to the invention thus represent an agent that is not just for one person, but for many people can be administered. Furthermore, the tumor cells come from any tumor of the human. In this respect, the present invention is not limited to the Be act limited to a particular tumor, but can be for any wide range of tumors can be used.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Patienten, die an einer Tumor erkrankung leiden, eine Immuntherapie anzubieten. Diese hat den großen Vorteil, daß sie rasch erfolgen kann. Nach Feststellung der Tumorart und seiner Typisie rung bzw. von anderen aus dem gleichen Patienten stammenden Zellen, können geeignete erfindungsgemäße Tumorzellen, z. B. aus der Tumorzell-Bibliothek, ausgewählt und dem Pateinten verabreicht werden. Günstig ist es, wenn vor Verabreichung der Tumorzellen diese durch Maßnahmen, wie Bestrahlung, an einer Replikation gehindert werden.With the present invention it is possible to treat patients suffering from a tumor suffer from the disease, to offer immunotherapy. This has the great advantage that it can be done quickly. After determining the type of tumor and its type tion or from other cells originating from the same patient suitable tumor cells according to the invention, e.g. B. from the tumor cell library, selected and administered to the patient. It is favorable if before The tumor cells are administered by measures such as radiation be prevented from replication.
Desweiteren ermöglicht es die vorliegende Erfindung, prophylaktisch gegen alle möglichen Tumoren vorzugehen. Hierzu ist es nur notwendig, eine Gewebetypi sierung von Zellen des zu behandelnden Menschen durchzuführen und diesem dann eine geeignete erfindungsgemäße Vakzine zu verabreichen. Furthermore, the present invention enables prophylactic against all possible tumors. For this it is only necessary to use a tissue type and cells of the person to be treated then to administer a suitable vaccine according to the invention.
Somit stellt die vorliegende Erfindung einen Durchbruch auf dem Gebiet der Immuntherapie von Tumorerkrankungen dar.Thus, the present invention represents a breakthrough in the field of Immunotherapy of tumor diseases.
Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel erläutert.The invention is illustrated by the example below.
Aus einem Melanom-Patienten wird der Tumor entfernt, zerkleinert und in mehrere Zellkulturflaschen mit DMEM-Medium gegeben. Nach 48 Stunden Kultivierung (37°C, 5% CO2) wird das Medium gewechselt. Nach 1-2 Wochen werden fünf Zellkulturflaschen ausgewählt, die unabhängig voneinander behan delt werden.The tumor is removed from a melanoma patient, crushed and placed in several cell culture bottles with DMEM medium. After 48 hours of cultivation (37 ° C, 5% CO 2 ), the medium is changed. After 1-2 weeks, five cell culture bottles are selected, which are treated independently of one another.
Melanom-Patienten von (A) wird Blut entnommen. Dieses wird mit einem Anti- Koagulantium versehen und mit gleichem Volumen an HBSS-Lösung verdünnt. Das Blut wird in Röhrchen gegeben, in denen Fikol vorgelegt ist. Die Röhrchen werden 20 min bei 800 g zentrifugiert. Die erhaltene Zwischenphase wird entnommen, in HBSS-Lösung resuspendiert und 5 min bei 500 g zentrifugiert. Die erhaltenen Lymphozyten werden gezählt und für die Gewebetypisierung als Lösung mit einer Konzentration von 1-2 × 106/ml standardisiert.Blood is taken from melanoma patients of (A). This is provided with an anti-coagulant and diluted with the same volume of HBSS solution. The blood is given in tubes in which Fikol is presented. The tubes are centrifuged at 800 g for 20 min. The intermediate phase obtained is removed, resuspended in HBSS solution and centrifuged for 5 min at 500 g. The lymphocytes obtained are counted and standardized for tissue typing as a solution with a concentration of 1-2 × 10 6 / ml.
Die etablierten Tumorzellen von (A) werden in gleicher Konzentration standardi siert. The established tumor cells from (A) are standardized in the same concentration siert.
Es werden Polystyren-Platten verwendet, die mit Antiseren gegen HLA-A, HLA- C, HLA-B, HLA-DR, HLA-DQ bzw. HLA-DP beschichtet sind. Diesen Platten wird jeweils 1 µl der Lymphozyten-Lösung bzw. Tumorzell-Lösung von (B) 1. zu gegeben. Die Platten werden 30 min bei 22°C inkubiert, bevor jeweils 5 µl frisches Komplement zugegeben werden. Anschließend werden die Platten 60 min bei 22°C inkubiert, bevor jeweils 1 µl eines Acridinorange/Ethidiumbromid- Cocktail und 1 µl Quentscher-Lösung zugegeben werden. Die Platten werden bei Raumtemperatur 4 Stunden stehengelassen. Positive Proben werden durch die Entwicklung der fluoreszierenden Färbung ausgewiesen.Polystyrene plates are used, which are treated with antisera against HLA-A, HLA- C, HLA-B, HLA-DR, HLA-DQ and HLA-DP are coated. These plates will 1 µl each of the lymphocyte solution or tumor cell solution from (B) 1. zu given. The plates are incubated at 22 ° C for 30 min before 5 µl each fresh complement can be added. Then the plates 60 incubated min at 22 ° C before 1 µl each of an acridine orange / ethidium bromide Cocktail and 1 µl Quentscher solution are added. The plates are at Allow room temperature to stand for 4 hours. Positive samples are provided by the Development of fluorescent coloration shown.
Es zeigt sich, daß die Lymphozyten folgende HLA-Moleküle aufweisen:
A*01; Cw*07; B*08; DRB1*03; DQA1*02; DQB1*02; DPA1*02; DPB1*02.It can be seen that the lymphocytes have the following HLA molecules:
A * 01; Cw * 07; B * 08; DRB1 * 03; DQA1 * 02; DQB1 * 02; DPA1 * 02; DPB1 * 02.
Die Tumorzellen weisen dagegen nur folgende HLA-Moleküle auf:
A*01; Cw*07; B*08.In contrast, the tumor cells only have the following HLA molecules:
A * 01; Cw * 07; B * 08.
Aus den Lymphozyten von (B) 1. wird RNA isoliert und einer reversen Trans
kription unterzogen. Die erhaltene cDNA wird einem PCR-Verfahren unterworfen,
bei dem Primer-Gruppen verwendet werden, die entsprechend der HLA-Moleküle
von (B) 2. ausgewählt sind. Insbesondere werden folgende Primer verwendet:
RNA is isolated from the lymphocytes of (B) 1. and subjected to reverse transcription. The cDNA obtained is subjected to a PCR method in which primer groups are used which are selected in accordance with the HLA molecules of (B) 2. The following primers are used in particular:
Die PCR-Bedingungen sind wie folgt: 24 Zyklen: 1 min, 94°C; 45 sec, 65°C; 2 min, 72°C. Endzyklus: 1 min, 94°C; 45 sec, 65°C; 10 min, 72°C.The PCR conditions are as follows: 24 cycles: 1 min, 94 ° C; 45 sec, 65 ° C; 2nd min, 72 ° C. End cycle: 1 min, 94 ° C; 45 sec, 65 ° C; 10 min, 72 ° C.
Die amplifizierte DNA wird mit den Restriktionsenzymen Sall und HindIII gespal ten und in den entsprechend gespaltenen Vektor M13 mp18 bzw. M13 mp19 inseriert. Rekombinante DNA-Moleküle werden zur Transformation von E. coli. JM109 verwendet. Erhaltene Klone werden einem Screening-Verfahren mittels Hybridisierung mit der amplifizierten DNA unterzogen. Positive Klone werden einer Sequenzierung unterworfen.The amplified DNA is split with the restriction enzymes Sall and HindIII and into the correspondingly split vector M13 mp18 or M13 mp19 advertises. Recombinant DNA molecules are used to transform E. coli. JM109 used. Clones obtained are subjected to a screening process Hybridized with the amplified DNA. Become positive clones subjected to sequencing.
Es zeigt sich, daß die HLA-Moleküle von (B) 2. durch folgende HLA-Gene kodiert
sind:
A*0101; Cw*0701; B*0801; DRB1*0301; DQA1*0201; DQB1*0201; DPA1-
*0201; DPB1*0201.
It can be seen that the HLA molecules of (B) 2. are encoded by the following HLA genes:
A * 0101; Cw * 0701; B * 0801; DRB1 * 0301; DQA1 * 0201; DQB1 * 0201; DPA1- * 0201; DPB1 * 0201.
Dem Melanom-Patienten von (A) wird Blut entnommen. Dieses wird mit einem Anti-Koagulantium versehen und mit achtfachem Überschuß an RCL-Puffer verdünnt. Das Blut wird 30 sec in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wird mit RCL-Puffer aufgenommen und zentrifugiert. Nach mehrmaligem Wie derholen dieses Schrittes wird das Pellet in NLB-Puffer gelöst und mit Proteinase K 1 h bei 63-65°C und 10 min bei 95°C inkubiert. Die Lösung wird 60 sec in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Überstand enthält die DNA aus den Lymphozyten.Blood is drawn from the melanoma patient of (A). This is done with a Provided anti-coagulant and with eight-fold excess of RCL buffer diluted. The blood is centrifuged in a microcentrifuge for 30 seconds. The pellet is taken up with RCL buffer and centrifuged. After repeated how Repeating this step, the pellet is dissolved in NLB buffer and with proteinase K incubated for 1 h at 63-65 ° C and 10 min at 95 ° C. The solution is in 60 sec centrifuged in a microcentrifuge and discarded the pellet. The supernatant contains the DNA from the lymphocytes.
Diese DNA wird einem PCR-Verfahren unterzogen bei dem jene Primer verwen det werden, die in (B) 2. für die HLA-D Gene, DRB1*03, DQA1*02, DQB1*02, DPA1*02 bzw. DPB1*02 eingesetzt worden sind.This DNA is subjected to a PCR process in which those primers are used Detected in (B) 2. for the HLA-D genes, DRB1 * 03, DQA1 * 02, DQB1 * 02, DPA1 * 02 or DPB1 * 02 have been used.
Die PCR-Bedingungen sind wie folgt: 30 Zyklen; 30 sec, 98°C; 60 sec, 55°C; 105 sec, 72°C. Endzyklus: 7 min, 72°C.The PCR conditions are as follows: 30 cycles; 30 sec, 98 ° C; 60 sec, 55 ° C; 105 sec, 72 ° C. End cycle: 7 min, 72 ° C.
Proben der amplifizierten DNA werden auf einem 1% Agarose-Gel elektrophore tisch aufgetrennt. Es werden Fragmente von 216 bp für DRB1*03, von 219 bp für DQA1*02/DQB1*02, und von 245 bp für DPA*02/DPB1*02 erhalten.Samples of the amplified DNA are electrophoresed on a 1% agarose gel table separated. Fragments of 216 bp for DRB1 * 03, of 219 bp obtained for DQA1 * 02 / DQB1 * 02, and of 245 bp for DPA * 02 / DPB1 * 02.
Die amplifizierte DNA wird mit den Restriktionsenzymen Sall und HindIII gespal ten und in den entsprechend gespaltenen Expressionsvektor B45-neo inseriert. Rekombinante DNA-Moleküle werden zur Transformation von E. coli JM109 oder DH5F'α verwendet. Erhaltene Klone werden einem Screening-Verfahren mittels Hybridisierung mit der amplifizierten DNA unterzogen. Positive Klone werden durch Sequenzierung bestätigt.The amplified DNA is split with the restriction enzymes Sall and HindIII ten and inserted into the correspondingly split expression vector B45-neo. Recombinant DNA molecules are used to transform E. coli or JM109 DH5F'α used. Clones obtained are subjected to a screening process Hybridized with the amplified DNA. Become positive clones confirmed by sequencing.
Diese Klone werden zur Transfektion der Tumorzellen von (A) verwendet. Die
Tumorzellen werden trypsiniert und es wird eine Elektroporation bei 400 V und
490 µ FD durchgeführt. Die Tumorzellen werden mit G418 (400-1000µg/ml) 4
Wochen selektioniert, bevor sie einem "Fluorescence-Activating-Cell-Sorting"
(FACS) unterzogen werden. Es werden Tumorzellen erhalten, die folgende HLA-
Moleküle exprimieren:
A*0101; Cw*0701; B*0801; DRB1*0301; DQA1*0201; DQB1*0201; DPA1-
*0201; DPB1*0201.These clones are used to transfect the tumor cells from (A). The tumor cells are trypsinized and electroporation is carried out at 400 V and 490 μ FD. The tumor cells are selected with G418 (400-1000µg / ml) for 4 weeks before they are subjected to a "Fluorescence Activating Cell Sorting" (FACS). Tumor cells are obtained which express the following HLA molecules:
A * 0101; Cw * 0701; B * 0801; DRB1 * 0301; DQA1 * 0201; DQB1 * 0201; DPA1- * 0201; DPB1 * 0201.
cDNAs, die für CD44, IFN-γ bzw. GM-CSF kodieren, werden von Invitrogen erhalten. Die cDNAs werden in die Expressionsvektoren RSV.5 hygro (blunt/- BamHl), pUHD10-1 (Xmnl) bzw. pBSK (BamHl) inseriert. Rekombinante DNA- Moleküle werden zur Transformation von E. coli JM109 oder DH5'α verwendet. Erhaltene Klone werden einem Screening-Verfahren mittels Hybridisierung mit den cDNAs unterzogen. Positive Klone werden durch Sequenzierung bestätigt.cDNAs that code for CD44, IFN-γ and GM-CSF are from Invitrogen receive. The cDNAs are expressed in the RSV.5 hygro (blunt / - BamHl), pUHD10-1 (Xmnl) or pBSK (BamHl). Recombinant DNA Molecules are used to transform E. coli JM109 or DH5'α. Clones obtained are subjected to a screening process using hybridization subjected to the cDNAs. Positive clones are confirmed by sequencing.
Diese Klone werden zur Transfektion der in (B) 4. erhaltenen Tumorzellen ver
wendet. Die Transfektion wird mit DOTAP-Liposomen nach Anleitung des
Herstellers Boehringer Mannheim durchgeführt. Die transfizierten Tumorzellen
werden durch FACS bzw. RT-PCR gescreent. Es werden Tumorzellen erhalten,
die folgende HLA-Moleküle und kostimulatorische Moleküle sowie Zytokine
exprimieren:
A*0101; Cw*0701; B*0801; DRB1*0301; DQA1*0201; DQB1*
0201; DPA1*0201; DPB1*0201; IFN-γ; CD44; GM-CSF.
These clones are used to transfect the tumor cells obtained in (B) 4. The transfection is carried out with DOTAP liposomes according to the instructions of the manufacturer Boehringer Mannheim. The transfected tumor cells are screened by FACS or RT-PCR. Tumor cells are obtained which express the following HLA molecules and costimulatory molecules as well as cytokines:
A * 0101; Cw * 0701; B * 0801; DRB1 * 0301; DQA1 * 0201; DQB1 * 0201; DPA1 * 0201; DPB1 * 0201; IFN-γ; CD44; GM-CSF.
Claims (12)
A*0101; Cw*0701; B*0801; DRB1*0301; DQA1*0201; DQB1*0201; DPA1*0201; DPB1*0201.6. Tumor cells according to any one of claims 1-5, comprising the following combination of MHC I and MHC II genes:
A * 0101; Cw * 0701; B * 0801; DRB1 * 0301; DQA1 * 0201; DQB1 * 0201; DPA1 * 0201; DPB1 * 0201.
A*0101; Cw*0701; B*0801; DRB1*0301; DQA1*0201; DQB1*0201; DPA1*0201; DPB1*0201; IFN-γ; CD44; GM-CSF.7. Tumor cells according to one of claims 1-6, comprising the following combination of MHC I / II genes and genes for IFN- γ, CD44 and GM-CSF:
A * 0101; Cw * 0701; B * 0801; DRB1 * 0301; DQA1 * 0201; DQB1 * 0201; DPA1 * 0201; DPB1 * 0201; IFN-γ; CD44; GM-CSF.
- a) Gewebetypisierung von Tumorzellen,
- b) Transfektion der Tumorzellen mit MHC I- und/oder MHC II-Genen, wodurch eine in einem Menschen vorliegende Kombination dieser Gene erhalten wird, und
- c) Selektion auf jene Tumorzellen, welche die MHC I- und MHC II-Gene exprimieren.
- a) tissue typing of tumor cells,
- b) transfection of the tumor cells with MHC I and / or MHC II genes, whereby a combination of these genes present in a human is obtained, and
- c) Selection for those tumor cells that express the MHC I and MHC II genes.
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