DE19827837A1 - Preparation of conjugates for predictive testing, diagnosis, prophylaxis or therapy of immunological sensitization to chemicals - Google Patents

Preparation of conjugates for predictive testing, diagnosis, prophylaxis or therapy of immunological sensitization to chemicals

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Abstract

Peptides that are universally capable of binding in the peptide-binding grooves of genetically different major histocompatibility complex class II molecules are used to prepare conjugates with chemicals for the predictive testing, diagnosis, prophylaxis or therapy of immunological sensitization to chemicals.- ACTIVITY - None given.- MECHANISM OF ACTION - None given

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a device according to the preamble of claim 1.

Reaktionen des Immunsystems gegen Chemikalien, gegenüber denen Menschen beispiels­ weise am Arbeitsplatz in Form von Arbeitsstoffen, im Haushalt, über die Nahrung oder über die Umwelt exponiert sind, können sich in allergischen oder autoimmunen Symptomen manifestieren. Als Chemikalien werden im folgenden alle Stoffe, d. h. chemische Elemente, chemische Verbindungen und Gemische chemischer Verbindungen, welche natürlich vorkommen oder hergestellt werden können, sowie ihre Synthesezwischenprodukte und chemisch, photochemisch oder im Stoffwechsel erzeugten Metabolite bezeichnet. Die frühzeitige Erkennung des Gefährdungspotentials, die Diagnose und die Therapie dieser unerwünschten Immunreaktionen gegen Chemikalien, die zu erheblichen individuellen Gesundheitsrisiken und zu beträchtlichen Kosten für die Volkswirtschaft führen können, stellen ein bislang nur unbefriedigend gelöstes medizinisches Problem dar. Immune system reactions to chemicals against which humans, for example wise in the workplace in the form of agents, in the household, via food or via The environment may be exposed to allergic or autoimmune symptoms manifest. All substances, i.e. H. chemical elements, chemical compounds and mixtures of chemical compounds which are natural occur or can be produced, as well as their synthesis intermediates and chemical, photochemical or metabolites produced in metabolism. The early detection of the hazard potential, diagnosis and therapy of this unwanted immune reactions to chemicals that lead to significant individual Health risks and can lead to considerable costs for the economy, represent a previously unsatisfactorily solved medical problem.  

Eine Voraussetzung für das Auftreten von Symptomen unerwünschter Immunreaktionen gegen Chemikalien ist die Aktivierung von T-Lymphozyten, die spezifisch auf die Chemikalien, bzw. durch sie geschaffene Neoantigene, reagieren. Die T-Lymphozyten reagieren dabei nicht gegen freie Chemikalien sondern gegen Konjugate der Chemikalien mit körpereigenen Peptiden, welche in die Peptidbindungsfurchen von Haupthistokompati­ bilitätskomplexmolekülen (MHC-Molekülen) (H.-G. Rammensee et al. MHC Ligands and Peptide Motifs, Springer Verlag, Heidelberg 1997) binden können. Chemikalien können kovalente Bindungen mit Seitenketten der Aminosäuren Cystein, Histidin, Lysin, Methionin, Tryptophan oder Tyrosin eingehen (D. Basketter et al. Contact Dermatitis 32 (1995) 65-73; I. Kimber und T. Maurer Toxicology of Contact Hypersensitivity, Verlag Taylor & Francis, London 1996; J.-P. Lepoittevin et al. Allergic Contact Dermatitis, Springer Verlag, Heidelberg 1998).A prerequisite for the appearance of symptoms of unwanted immune reactions against chemicals is the activation of T lymphocytes that are specific to that Chemicals, or neoantigens created by them, react. The T lymphocytes do not react to free chemicals but to conjugates of the chemicals with endogenous peptides, which are in the peptide binding furrows of major histocompati bility complex molecules (MHC molecules) (H.-G. Rammenee et al. MHC Ligands and Peptide Motifs, Springer Verlag, Heidelberg 1997) can bind. Chemicals can covalent bonds with side chains of the amino acids cysteine, histidine, lysine, methionine, Tryptophan or tyrosine (D. Basketter et al. Contact Dermatitis 32 (1995) 65-73; I. Kimber and T. Maurer Toxicology of Contact Hypersensitivity, Verlag Taylor & Francis, London 1996; J.-P. Lepoittevin et al. Allergic Contact Dermatitis, Springer Verlag, Heidelberg 1998).

Für die Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle besteht innerhalb der menschlichen Spezies ein großer Polymorphismus, d. h. es existiert eine große Anzahl (über 350) genetischer Allele, von denen ein einzelnes Individuum jeweils nur eine Kombination von in der Regel 4 bis 12 verschiedenen Allelen besitzt (H.-G. Rammensee et al. MHC Ligands and Peptide Motifs, Springer Verlag, Heidelberg 1997). Die einzelnen Haupthistokompatibilitäts­ komplexmoleküle der Klasse II unterscheiden sich insbesondere in der Ausgestaltung der Taschen, in die Aminosäureseitenketten des in der Peptidbindungsfurche des Haupthisto­ kompatibilitätskomplexmoleküls gebundenen Peptids zu liegen kommen. In die zwei bis vier Taschen binden jeweils bevorzugt bestimmte Aminosäureseitenketten, so daß die Ausgestaltung der Taschen eines Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküls ein Aminosäurebindemotiv bestimmen. Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle binden daher bevorzugt solche Peptide, die das jeweilige Aminosäurebindemotiv enthalten.The major histocompatibility complex molecules exist within the human Species a large polymorphism, i.e. H. there are a large number (over 350) genetic alleles, of which a single individual each only a combination of in usually has 4 to 12 different alleles (H.-G. Rammenee et al. MHC Ligands and Peptide Motifs, Springer Verlag, Heidelberg 1997). The individual major histocompatibility Class II complex molecules differ in particular in the design of the Pockets, in the amino acid side chains of the in the peptide binding groove of the main histo compatibility peptide bound to the complex. In the two to four Bags each bind certain amino acid side chains, so that the Design of the pockets of a major histocompatibility complex molecule Determine amino acid binding motif. Major histocompatibility complex molecules therefore bind preferably those peptides that contain the respective amino acid binding motif.

Derzeit erfolgt der Nachweis der Sensibilisierung gegen Chemikalien in der Regel an der Haut des Probanden selbst, in dem die Chemikalien auf die Haut gebracht (Epikutantest) oder in die Haut eingebracht (Prick-Test, Intrakutantest) wird und die allergische Reaktion an der behandelten Hautstelle nach unterschiedlichen Zeiträumen, beispielsweise 30 Minuten, ein Tag oder zwei Tage, durch visuelle Beurteilung durch den Arzt erfaßt wird (R. L. Rietschel und J. F. Fowler Jr. Fischer's Contact Dermatitis, 4. Auflage, Verlag Williams & Wilkins, Baltimore 1995).Sensitization to chemicals is currently generally demonstrated at the Skin of the test subject himself, in which the chemicals were applied to the skin (patch test) or introduced into the skin (prick test, intracutaneous test) and the allergic reaction the treated skin area after different periods, for example 30 minutes, a day or two, by visual assessment by the doctor (R. L. Rietschel and J. F. Fowler Jr. Fischer's Contact Dermatitis, 4th edition, Williams & Wilkins Verlag, Baltimore 1995).

Eine Alternative zum Hauttest stellt die Untersuchung von Zellen des peripheren Blutes in Zellkulturexperimenten dar, in denen z. B. durch Messung der Zellproliferation oder der Zytokinproduktion (I. Kimber und T. Maurer Toxicology of Contact Hypersensitivity, Verlag Taylor & Francis, London 1996) die antigenabhängige Aktivierung der T-Lymphozyten des peripheren Blutes des Probanden gegen Chemikalien oder gegen Konjugate der Chemikalien mit Proteinen, z. B. humanes Serumalbumin (I. Kimber et al. Contact Dermatitis 24 (1991) 164-171), gemessen werden.An alternative to the skin test is the examination of peripheral blood cells Cell culture experiments in which, for. B. by measuring cell proliferation or Cytokine production (I. Kimber and T. Maurer Toxicology of Contact Hypersensitivity, Verlag  Taylor & Francis, London 1996) the antigen-dependent activation of the T-lymphocytes of the peripheral blood of the subject against chemicals or against conjugates of Chemicals with proteins, e.g. B. human serum albumin (I. Kimber et al. Contact Dermatitis 24 (1991) 164-171).

Die Therapie mit dem Ziel, die Reaktionen der chemikalienspezifischen T-Lymphozyten zu unterdrücken, abzuschalten oder so abzuändern, daß die Symptome und pathologischen Schäden der unerwünschten Immunreaktion nicht mehr auftreten, befindet sich noch im Entwicklungsstadium. Bislang wurde eine Toleranzinduktion bei Mäusen durch die Applikation von Konjugaten von Penicillin mit Aminosäurepolymeren oder Dextran erreicht (N. Chiorazzi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73 (1976) 210-216; U. Otz et al. Eur. J. Immunol. 8 (1978) 406-410; C. H. Schneider et al. Eur. J. Immunol. 8 (1978) 401-414).Therapy with the aim of increasing the reactions of the chemical-specific T lymphocytes suppress, switch off or change so that the symptoms and pathological Damage to the unwanted immune response no longer occurs is still in the Stage of development. So far, a tolerance induction in mice by the Application of conjugates of penicillin with amino acid polymers or dextran achieved (N. Chiorazzi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (1976) 210-216; U. Otz et al. Eur. J. Immunol. 8 (1978) 406-410; C.H. Schneider et al. Eur. J. Immunol. 8 (1978) 401-414).

Die prädiktive Testung des sensibilisierenden Potentials von Chemikalien erfolgt in der Regel in Tierexperimenten, in denen nach der Sensibilisierung der Tiere untersucht wird, ob sich durch die Chemikalie allergische Reaktionen am Tier auslösen lassen (OECD Guidelines for Testing of Chemicals, Nr. 406 Skin Sensitization, 1992; J. H. Dean et al. Immunotoxicology and Immunopharmacology, 2. Auflage, Verlag Raven Press, New York 1994; I. Kimber und T. Maurer Toxicology of Contact Hypersensitivity, Verlag Taylor & Francis, London 1996). Die prädiktive Testung des sensibilisierenden Potentials von Chemikalien kann auch durch wiederholtes Auftragen auf die Haut von nicht sensibilisierten Menschen erfolgen (R. L. Rietschel und J. F. Fowler Jr. Fische(s Contact Dermatitis, 4. Auflage, Verlag Williams & Wilkins, Baltimore 1995). Prädiktive Tests, die ausschließlich in vitro durchgeführt werden, befinden sich noch in der Entwicklung (C. Moulon et al. Immunology 80 (1993) 373-379; H. Yokozeki et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 106 (1995) 394-400; M. Krasteva et al. Clin. Exp. Allergy 26 (1996) 563-570).Predictive testing of the sensitizing potential of chemicals is usually done in animal experiments in which, after sensitizing the animals, it is examined whether have the chemical trigger allergic reactions in animals (OECD Guidelines for Testing of Chemicals, No. 406 Skin Sensitization, 1992; J.H. Dean et al. Immunotoxicology and Immunopharmacology, 2nd edition, Raven Press, New York 1994; I. Kimber and T. Maurer Toxicology of Contact Hypersensitivity, Taylor & Francis Verlag, London 1996). Predictive testing of the sensitizing potential of chemicals can also be done by repeated application to the skin of non-sensitized people (R.L. Rietschel and J.F. Fowler Jr.Fishes (s Contact Dermatitis, 4th edition, publisher Williams & Wilkins, Baltimore 1995). Predictive tests, which are carried out exclusively in vitro, are still in development (C. Moulon et al. Immunology 80 (1993) 373-379; H. Yokozeki et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 106: 394-400 (1995); M. Krasteva et al. Clin. Exp. Allergy 26 (1996) 563-570).

Die Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle der Klasse II (MHC-II-Moleküle) sind nach ihrer Synthese im Endoplasmatischen Retikulum jeweils mit einer Invarianten Kette (P. Cresswell Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 259-293) assoziiert, wobei der Sequenzbereich 107-115 der humanen Invarianten Kette (M. Strubin et al. EMBO J. 3 (1984) 869-872; J. Kudo et al. Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8827-8841; D. M. O'Sulllivan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (1986) 4484-4488) in der Peptidbindungsfurche der MHC-II-Moleküle liegt (N. Bangia und T. H. Watts Int. Immunol. 7 (1995) 1585-1591). Nach dem proteolytischen Abbau der Invarianten Ketten verbleiben in den Peptidbindungsfurchen Peptide der Invarianten Kette von unterschiedlicher Länge, die alle den Sequenzbereich 107-115 umfassen und als mit der Klasse II assoziierte Peptide der Invarianten Kette (CLIP) bezeichnet werden. Im Gegensatz zu den stark polymorphen Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes ist die Invariante Kette monomorph, d. h. es existiert nur eine einzige Invariante Kette, deren CLIP-Bereich an alle Formen der Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle der Klasse II binden kann. Die Aminosäuresequenz Met-Arg-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met im Sequenzbereich 107-115 der humanen Invarianten Kette ist identisch mit den homologen Sequenzbereichen 90-108 der Invarianten Kette der Maus (P. A. Singer et al. EMBO J. 3 (1984) 873-877; N. Koch et al. EMBO J. 6 (1987) 1677-1683; L. Zhu und P. P. Jones Nucleic Acids Res. 17 (1989) 447-448) und Sequenzbereich 91-109 der Ratte (W. Henkes et al. Nucleic Acids Res. 16 (1988) 11822-11822; A. J. McKnight et al. Nucleic Acids Res. 17 (1989) 3983-3984). Die universelle Bindefähigkeit der CLIP-Peptide an verschiedene Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle wird durch die Anordnung der drei Methioninreste in den Positionen 107, 109 und 115 der humanen Invarianten Kette ermöglicht, die in die Bindungstaschen für Aminosäureseiten­ ketten in der Peptidbindungsfurche der Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle binden können (A. Geluk et al. Mol. Immunol. 32 (1995) 975-981, P. Ghosh et al. Nature 378 (1995) 457-462).The major class II histocompatibility complex molecules (MHC-II molecules) are after their synthesis in the endoplasmic reticulum with an invariant chain (P. Cresswell Annu. Rev. Immunol. 12 (1994) 259-293) associated with the sequence area 107-115 of the human invariant chain (M. Strubin et al. EMBO J. 3 (1984) 869-872; J. Kudo et al. Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8827-8841; D.M. O'Sulllivan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (1986) 4484-4488) lies in the peptide binding groove of the MHC-II molecules (N. Bangia and T. H. Watts Int. Immunol. 7 (1995) 1585-1591). After the proteolytic Degradation of the invariant chains remain in the peptide binding grooves Invariant chain of different lengths, all of the sequence range 107-115 and as class II associated peptides of the invariant chain (CLIP)  be designated. In contrast to the strongly polymorphic molecules of The main histocompatibility complex is the invariant chain monomorphic, i.e. H. it only exists a single invariant chain, the CLIP range to all forms of Major class II histocompatibility complex molecules can bind. The Amino acid sequence Met-Arg-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met in the sequence region 107-115 the human invariante chain is identical to the homologous sequence regions 90-108 the mouse invariant chain (P.A. Singer et al. EMBO J. 3 (1984) 873-877; N. Koch et al. EMBO J. 6 (1987) 1677-1683; L. Zhu and P.P. Jones Nucleic Acids Res. 17 (1989) 447-448) and sequence region 91-109 of the rat (W. Henkes et al. Nucleic Acids Res. 16 (1988) 11822-11822; A.J. McKnight et al. Nucleic Acids Res. 17 (1989) 3983-3984). The universal Binding ability of the CLIP peptides to various major histocompatibility complex molecules is the arrangement of the three methionine residues in positions 107, 109 and 115 of the allows human invariants chain to enter the binding pockets for amino acid sites bind chains in the peptide binding groove of the main histocompatibility complex molecules (A. Geluk et al. Mol. Immunol. 32 (1995) 975-981, P. Ghosh et al. Nature 378 (1995) 457-462).

Die Anwendung von Chemikalien in diagnostischen Hauttests ist mit der Gefahr des Auslösens systemischer allergischer Reaktionen, z. B. eines anaphylaktischen Schocks, verbunden. Darüber hinaus besteht das Risiko, durch den Hauttest Probanden erst gegen Chemikalien zu sensibilisieren, weshalb besonders allergene Chemikalien, wie z. B. Brandowski's Base, nicht im Hauttest eingesetzt werden können (R. L. Rietschel und J. F. Fowler Jr. Fischer's Contact Dermatitis, 4. Auflage, Verlag Williams & Wilkins, Baltimore 1995).The use of chemicals in diagnostic skin tests is at risk Triggering systemic allergic reactions, e.g. B. an anaphylactic shock, connected. In addition, there is a risk that the skin test will only test subjects Sensitize chemicals, which is why especially allergenic chemicals such. B. Brandowski's Base, cannot be used in the skin test (R. L. Rietschel and J. F. Fowler Jr. Fischer's Contact Dermatitis, 4th edition, published by Williams & Wilkins, Baltimore 1995).

Die Aussagekraft diagnostischer Hauttests wird dadurch herabgesetzt, daß die Beurteilung der Hautreaktion in subjektiver Weise durch visuelle Beurteilung erfolgt.The informative value of diagnostic skin tests is reduced by the fact that the assessment the skin reaction is done subjectively by visual assessment.

Die Beurteilung diagnostischer Hauttests, die mit farbigen oder während des Tests einen Farbstoff entwickelnden Chemikalien durchgeführt werden, ist schwer oder unmöglich, da die Farbigkeit der Chemikalie die zu beurteilende Hautrötung überdeckt.Assessing diagnostic skin tests using colored or during the test Dye-developing chemicals are difficult or impossible since the Color of the chemical covers the reddened skin to be assessed.

Die Beurteilung diagnostischer Hauttests, die mit irritativ wirkenden Chemikalien durchgeführt werden, ist schwer oder unmöglich, weil die durch eine Irritation hervorgerufene Hautrötung nicht allein durch visuelle Beurteilung von der durch eine spezifische Immunreaktion hervorgerufenen Hautrötung unterschieden werden kann. Assessing diagnostic skin tests that use irritant chemicals is difficult or impossible because the one caused by an irritation Reddening of the skin is not solely by visual assessment of that by a specific Immune response-induced skin redness can be distinguished.  

Hauttests mit Chemikalien zur Diagnose von Sensibilisierungen weisen eine nicht zufriedenstellende Reproduzierbarkeit bei der wiederholten Durchführung an denselben Probanden auf (R. Gollhausen et al. J. Am. Acad. Dermatol. 21 (1989) 1196-1202, J. Brasch et al. J. Am. Acad. Dermatol. 31 (1994) 584-591).Skin tests with chemicals to diagnose sensitizations do not show one satisfactory reproducibility when repeated on the same Subjects on (R. Gollhausen et al. J. Am. Acad. Dermatol. 21 (1989) 1196-1202, J. Brasch et al. J. Am. Acad. Dermatol. 31 (1994) 584-591).

Die Anzahl der Chemikalien und Konzentrationen die im Hauttest untersucht werden kann, wird dadurch begrenzt, daß die Belastung für die Probanden möglichst gering gehalten werden muß.The number of chemicals and concentrations that can be examined in the skin test, is limited by the fact that the burden on the test subjects is kept as low as possible must become.

Bei der Verwendung von Chemikalien bilden diese zum Teil durch Bindung an niedermolekulare Substanzen, wie Glutathion oder freie Aminosäuren, hinsichtlich des gewünschten Anwendungszwecks nicht relevante Konjugate.When chemicals are used, they form in part through binding low molecular weight substances, such as glutathione or free amino acids, with regard to the not relevant conjugates for the intended application.

Die Risiken einer systemischen allergischen Reaktion oder der Sensibilisierung des Probanden könnten durch Zellkulturuntersuchungen vermieden werden. Die Untersuchung von T-Lymphozytenreaktionen in Zellkulturexperimenten wird allerdings dadurch beschränkt, daß viele allergene Chemikalien sehr reaktiv sind, wodurch sie zytotoxische Effekte auf Lymphozyten ausüben. Daher können oft nicht genügend hohe Konzentrationen der chemischen Verbindungen eingesetzt werden.The risks of a systemic allergic reaction or sensitization of the Subjects could be avoided by cell culture studies. The investigation T-lymphocyte reactions in cell culture experiments are limited by that many allergenic chemicals are very reactive, causing them to have cytotoxic effects Exercise lymphocytes. Therefore often not enough high concentrations of chemical compounds are used.

Die Verwendung von weit weniger toxischen Konjugaten von Chemikalien mit Proteinen, z. B. humanem Serumalbumin, in Zellkulturexperimenten führt oft nur bei einem Teil der gegen die Chemikalien sensibilisierten Probanden zu einer positiven Reaktion. Die Ursache liegt darin, daß aus den eingesetzten Proteinkonjugaten nur wenige verschiedene, mit den Chemikalien konjugierte, d. h. haptenisierte, Peptide im Vorgang der Antigenprozessierung ausgeschnitten werden und daß diese haptenisierten Peptide nur an bestimmte Allele der Haupthisto­ kompatibilitätskomplexmoleküle binden können, nämlich solche, die ein geeignetes Aminosäurebindemotiv aufweisen. Daher werden nur die T-Lymphozyten der Probanden reagieren, die Träger entsprechender Allele der Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle sind.The use of far less toxic conjugates of chemicals with proteins, e.g. B. human serum albumin, in cell culture experiments often leads only to a part of those against the Chemicals sensitized test subjects to a positive reaction. The reason is that only a few different from the protein conjugates used, with the chemicals conjugated, d. H. haptenized, peptides cut out in the process of antigen processing and that these haptenized peptides only to certain alleles of the main histo can bind compatibility complex molecules, namely those that have a suitable Have amino acid binding motif. Therefore, only the T lymphocytes of the test subjects react, the carrier of corresponding alleles of the main histocompatibility complex molecules are.

Hydrophobe Chemikalien können werden ihrer geringen Wasserlöslichkeit nicht oder nur eingeschränkt in Zellkulturexperimenten eingesetzt werden.Hydrophobic chemicals cannot or only become poorly soluble in water limited use in cell culture experiments.

Bei der Verwendung von haptenisierten Proteinen für die Toleranzinduktion in Probanden wird theoretisch nur bei dem Teil der Probanden eine therapeutische Wirkung zu beobachten sein, der Träger derjenigen Allele der Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle ist, an die die aus den haptenisierten Proteinen im Verlauf der Antigenprozessierung ausgeschnittenen haptenisierten Peptide binden können. In ähnlicher Weise sind bei der Verwendung von haptenisierten Peptiden nur in dem Teil der Probanden positive Reaktionen möglich, die Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle besitzen, dessen Aminosäurebindemotive hinreichend in den haptenisierten Peptiden enthalten sind.When using haptenized proteins for tolerance induction in test subjects Theoretically, a therapeutic effect can only be observed in the part of the test subjects  be the carrier of those alleles of the main histocompatibility complex molecules to which those cut out from the haptenized proteins in the course of antigen processing can bind haptenized peptides. Similarly, when using haptenized peptides positive reactions are only possible in the part of the test persons who Main histocompatibility complex molecules possess its amino acid binding motifs are sufficiently contained in the haptenized peptides.

Bei der Verwendung von hydrophoben Chemikalien für die Toleranzinduktion in Probanden kann es infolge einer Depotwirkung zu einer nicht beabsichtigten Sensibilisierung kommen. Die Benutzung von Tieren für die prädiktive Testung des sensibilisierenden Potentials von Chemikalien ist mit erheblich höheren Kosten und einer geringeren, und zukünftig noch kleiner werdenden, gesellschaftlichen Akzeptanz verbunden als alternative Zellkulturexperimente. So ist beispielsweise die Durchführung von Tierversuchen zur Überprüfung des sensibilisierenden Potentials von Bestandteilen kosmetischer Mittel seit dem 1.1.1998 verboten (Richtlinie 93/95 EWG zur sechsten Änderung der Richtlinie 76/76 EWG). Die Übertragbarkeit der Ergebnisse prädiktiver Tests an Tieren auf den Menschen stellt noch immer ein nicht vollständig gelöstes Problem dar.When using hydrophobic chemicals for tolerance induction in test subjects an unintended sensitization may occur as a result of a deposit effect. The use of animals for predictive testing of the sensitizing potential of Chemicals is at a significantly higher cost and a lower one, and will be in the future decreasing social acceptance linked as an alternative Cell culture experiments. For example, animal testing is required Review of the sensitizing potential of components of cosmetic products since prohibited 1.1.1998 (Directive 93/95 EEC for the sixth amendment of Directive 76/76 EEC). The transferability of the results of predictive tests on animals to humans is still not a fully resolved problem.

Aufgabe der Erfindung ist es, solche Peptide für die Herstellung von Konjugaten mit Chemikalien bereitzustellen, die universell an genetisch verschiedene Haupthisto­ kompatibilitätskomplexmoleküle binden können und so die prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe und Therapie von Sensibilisierungen gegen Chemikalien verbessern.The object of the invention is to use such peptides for the production of conjugates To provide chemicals that are universally linked to genetically different main histos can bind compatibility complex molecules and thus predictive testing, diagnostics, Improve prophylaxis and therapy of sensitization to chemicals.

Diese Aufgabe wird durch eine Methode mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.This object is achieved by a method with the features of claim 1.

Durch verbesserte diagnostische Zellkulturtests könnte die Anzahl notwendiger diagnostischer Hauttests herabgesetzt werden. Das Risiko, Probanden erst durch den Hauttest gegen Chemikalien zu sensibilisieren würde dadurch herabgesetzt.Improved diagnostic cell culture tests could increase the number needed diagnostic skin tests are lowered. The risk of being exposed to the test subject This would reduce skin sensitivity to chemicals.

Im Gegensatz zu diagnostischen Hauttests, kann die Reaktion von Lymphozyten in Zellkulturexperimenten objektiv und quantitativ ermittelt werden. Unlike diagnostic skin tests, the reaction of lymphocytes in Cell culture experiments can be determined objectively and quantitatively.  

Die Farbigkeit einer Chemikalie hat keinen Einfluß auf das Ergebnis von Zellkulturexperimenten.The color of a chemical has no influence on the result of Cell culture experiments.

Durch die Verwendung von Konjugaten universell bindender Peptide mit Chemikalien werden irritative Wirkungen der Chemikalien verhindert.By using conjugates of universally binding peptides with chemicals irritant effects of the chemicals are prevented.

In ersten Versuchen zeigten Zellkulturexperimente unter Verwendung von Konjugaten universell bindender Peptide mit Chemikalien eine gute Reproduzierbarkeit.In the first experiments, cell culture experiments using conjugates were shown universally binding peptides with chemicals good reproducibility.

Die Durchführung diagnostischer Tests in Zellkulturexperimenten erlaubt die Verwendung einer beliebigen Anzahl von Konjugaten von universell bindenden Peptiden mit Chemikalien und beliebig vieler Konzentrationen, ohne zu einer zusätzlichen Belastung für den Probanden zu führen.The implementation of diagnostic tests in cell culture experiments allows the use any number of conjugates of universally binding peptides with chemicals and any number of concentrations, without placing an additional burden on the To lead subjects.

Durch den Einsatz von Konjugaten von universell bindenden Peptiden mit Chemikalien anstelle der Chemikalien selbst wird verhindert, daß diese durch Bindung an niedermolekulare Substanzen, wie Glutathion oder freie Aminosäuren, hinsichtlich des gewünschten Anwendungszwecks nicht relevante Konjugate bilden.By using conjugates of universally binding peptides with chemicals instead of the chemicals themselves, they are prevented from binding by low molecular weight substances, such as glutathione or free amino acids, with regard to the form irrelevant conjugates for the intended application.

Die Zytotoxizität von Konjugaten von universell bindenden Peptiden und Chemikalien ist wesentlich geringer als die der ungebundenen, freien Chemikalien. Dadurch können in Zellkulturuntersuchungen höhere Konzentrationen der Chemikalien eingesetzt werden. Der Einsatz hydrophober Chemikalien in Zellkulturuntersuchungen wird durch die Verwendung von Konjugaten dieser Chemikalien mit universell bindenden Peptiden erleichtert, da die Konjugate gut wasserlöslich sind.The cytotoxicity of conjugates of universally binding peptides and chemicals is much lower than that of the unbound, free chemicals. This allows in Cell culture studies higher concentrations of chemicals are used. The use of hydrophobic chemicals in cell culture studies is supported by the Use of conjugates of these chemicals with universally binding peptides relieved, since the conjugates are well soluble in water.

Universell an Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle der Klasse II bindende Peptide, die über eine Aminosäureseitenkette Konjugate mit Chemikalien bilden können, sind besonders für die Prophylaxe von Sensibilisierungen gegen Chemikalien geeignet, da sie, unabhängig von den Allelen des zu untersuchenden Individuums, praktisch an alle Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes des Menschen binden können.Universally peptides that bind to major class II histocompatibility complex molecules Can form conjugates with chemicals via an amino acid side chain are special suitable for the prophylaxis of sensitization to chemicals, as it is independent from the alleles of the individual to be examined, to practically all molecules of the Main human histocompatibility complex can bind.

Die bessere Wasserlöslichkeit der Konjugate hydrophober Chemikalien mit universell bindenden Peptiden im Vergleich zu den ungebundenen Chemikalien erleichtert ihren Einsatz bei der Toleranzinduktion, da die Bildung von Chemikaliendepots im Körper vermieden wird. The better water solubility of the conjugates of hydrophobic chemicals with universal binding peptides compared to the unbound chemicals eases theirs Use in tolerance induction, since the formation of chemical deposits in the body is avoided.  

Beschreibungdescription

Die Erfindung betrifft Peptide, die universell in die Peptidbindungsfurche von genetisch verschiedenen Haupthistokompatibilitätskomplexmolekülen binden können und die nach Herstellung von Konjugaten mit Chemikalien zur prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe oder Therapie immunologischer Sensibilisierungen gegen Chemikalien verwendet werden können.The invention relates to peptides that are genetically universal in the peptide binding groove can bind various major histocompatibility complex molecules and the after Production of conjugates with chemicals for predictive testing, diagnostics, prophylaxis or therapy of immunological sensitization to chemicals can be used can.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden näher beschrieben. Falls nicht anders angegeben, werden im folgenden die Dreibuchstabensymbole (Pure Appl. Chem. 56 (1984) 595-624, Eur. J. Biochem. 138 (1984) 9-37) für L-konfigurierte Aminosäuren verwendet. Die erfindungsgemäßen Peptide können unter Benutzung der allgemeinen Methoden der Peptidchemie und der organischen Chemie und die Konjugate mit Chemikalien unter Benutzung der allgemeinen Methoden der organischen Chemie hergestellt werden.Embodiments of the invention are described in more detail below. if not otherwise, the three-letter symbols (Pure Appl. Chem. 56 (1984) 595-624, Eur. J. Biochem. 138 (1984) 9-37) for L-configured amino acids used. The peptides of the invention can be used using the general Methods of peptide chemistry and organic chemistry and the conjugates with Chemicals using the general methods of organic chemistry getting produced.

Ein Beispiel für ein erfindungsgemäßes Peptid stellt das Peptid HUII107-115R108C,
Met-Cys-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met oder
An example of a peptide according to the invention is the peptide HUII107-115R108C,
Met-Cys-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met or

mit R = H im nicht mit Chemikalien konjugierten Peptid, dar.with R = H in the peptide not conjugated with chemicals.

Es leitet sich vom Sequenzbereich 107-115 der humanen Invarianten Kette Met-Arg-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met ab, in dem Arg in Position 108 gegen Cys ausgetauscht ist.It derives from sequence region 107-115 of the human invariante chain Met-Arg-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met in which Arg is replaced by Cys in position 108.

Das Peptid HUII107-115R108C kann Konjugate mit Chemikalien bilden, die an die Cysteinseitenkette binden, beispielsweise mit
p-Benzochinon (CAS-Nr. 106-51-4) zu einem Konjugat der Formel (I) mit
The HUII107-115R108C peptide can form conjugates with chemicals that bind to the cysteine side chain, for example with
p-benzoquinone (CAS No. 106-51-4) to a conjugate of formula (I) with

dem o-Benzochinon-Derivat des (15 : 0)Urushiols (CAS-Nr. 492-89-7) zu einem Konjugat der Formel (I) mit
the o-benzoquinone derivative of (15: 0) urushiol (CAS No. 492-89-7) to a conjugate of formula (I) with

2-Hydroxypropylacrylat (CAS-Nr. 999-61-1) zu einem Konjugat der Formel (I) mit
R = -CH2-CH2-CO-O-CH2-CHOH-CH3 oder
Dicyclopentamethylenthiuramdisulfid (CAS-Nr. 94-37-1) zu einem Konjugat der Formel (I) mit
2-hydroxypropyl acrylate (CAS No. 999-61-1) to a conjugate of formula (I) with
R = -CH 2 -CH 2 -CO-O-CH 2 -CHOH-CH 3 or
Dicyclopentamethylene thiuram disulfide (CAS No. 94-37-1) to a conjugate of formula (I) with

Ein weiteres Beispiel für ein erfindungsgemäßes Peptid stellt das Peptid HUII107-115T111 K,
Met-Arg-Met-Ala-Lys-Pro-Leu-Leu-Met oder
Another example of a peptide according to the invention is the peptide HUII107-115T111 K,
Met-Arg-Met-Ala-Lys-Pro-Leu-Leu-Met or

mit R = H im nicht mit Chemikalien konjugierten Peptid, dar.with R = H in the peptide not conjugated with chemicals.

Es leitet sich vom Sequenzbereich 107-115 der humanen Invarianten Kette Met-Arg-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met ab, in dem Thr in Position 111 gegen Lys ausgetauscht ist.It derives from sequence region 107-115 of the human invariante chain Met-Arg-Met-Ala-Thr-Pro-Leu-Leu-Met where Thr is exchanged for Lys in position 111.

Das Peptid HUII107-115T111K kann Konjugate mit Chemikalien bilden, die an die Lysinseitenkette binden, beispielsweise mit
2,4-Dinitrochlorbenzol (CAS-Nr. 97-00-7) zu einem Konjugat der Formel (II) mit
The HUII107-115T111K peptide can form conjugates with chemicals that bind to the lysine side chain, for example with
2,4-dinitrochlorobenzene (CAS No. 97-00-7) to a conjugate of the formula (II) with

Phthalsäureanhydrid (CAS-Nr. 85-44-9) zu einem Konjugat der Formel (II) mit
Phthalic anhydride (CAS No. 85-44-9) to a conjugate of formula (II) with

oder
Penicillin G (CAS-Nr. 69-57-8) zu einem Konjugat der Formel (II) mit
or
Penicillin G (CAS No. 69-57-8) to a conjugate of formula (II) with

Die erfindungsgemäßen Peptide können anstatt mit einer definierten chemischen Verbindung auch mit natürlichen oder hergestellten Gemischen chemischer Verbindungen oder Zubereitungen, wie beispielsweise Kolophonium (CAS-Nr. 8050-09-7) oder Perubalsam (CAS-Nr. 8007-00-9) Konjugate bilden.The peptides according to the invention can instead of a defined chemical Connection also with natural or manufactured mixtures of chemical compounds or preparations such as rosin (CAS No. 8050-09-7) or Peru balsam (CAS No. 8007-00-9) Form conjugates.

Zur Herstellung der Konjugate der erfindungsgemäßen Peptide mit Chemikalien können auch Konjugate von Aminosäuren mit Chemikalien zur Synthese der Peptide eingesetzt werden. To produce the conjugates of the peptides according to the invention with chemicals conjugates of amino acids with chemicals are used to synthesize the peptides become.  

Zur Konjugation von Chemikalien, die erst nach Umwandlung in chemische, photochemische oder im Stoffwechsel erzeugte, reaktive Metabolite Konjugate mit den erfindungsgemäßen Peptiden bilden können, können die Chemikalien oder Gemische der Chemikalien mit den Peptiden durch chemische oder photochemische Behandlung, Inkubation mit Enzymen, Zelllysaten, Zellen, Organschnitten, oder durch Perfusion durch Organe oder durch Verabreichung an Tiere oder Menschen in Metabolite umgewandelt werden.For conjugation of chemicals that only after conversion into chemical, photochemical or metabolic reactive metabolites conjugates with the invention Peptides can form the chemicals or mixtures of the chemicals with the Peptides by chemical or photochemical treatment, incubation with enzymes, Cell lysates, cells, organ sections, or by perfusion through organs or through Administration to animals or humans can be converted into metabolites.

Die erfindungsgemäßen Peptide können durch Endgruppenmodifikationen, beispielsweise Acetylierung des Aminoterminus oder Methylierung des Carboxylterminus, vor enzymatischen Abbau geschützt werden.The peptides according to the invention can be modified, for example, by end group modifications Acetylation of the amino terminus or methylation of the carboxyl terminus enzymatic degradation are protected.

Die erfindungsgemäßen Peptide können durch die Verwendung einer oder mehrerer mit radioaktiven Isotopen markierten Aminosäuren oder durch Kopplung des Aminoterminus, des Carboxyterminus oder einer Aminosäureseitenkette mit einem im sichtbaren oder ultravioletten Bereich des Lichts absorbierenden Farbstoff oder einem fluoreszierenden Farbstoff zur Erleichterung des analytischen Nachweises verändert sein.The peptides according to the invention can be obtained by using one or more radioactive isotopes labeled amino acids or by coupling the amino terminus, of the carboxy terminus or an amino acid side chain with one in the visible or ultraviolet region of the light absorbing dye or a fluorescent Colorant changed to facilitate analytical evidence.

In diagnostischen Verfahren kann die Bindung von Immunglobulinen aus sensibilisierten oder nicht sensibilisierten Menschen an Konjugate der erfindungsgemäßen Peptide mit Chemikalien beispielsweise durch einen enzymgebundenen Immunoassay nachgewiesen werden. In diagnostischen Verfahren kann die antigenabhängige Aktivierung von T- Lymphozyten aus sensibilisierten oder nicht sensibilisierten Menschen gegen Konjugate der erfindungsgemäßen Peptide mit Chemikalien in Zellkulturexperimenten beispielsweise durch die Messung der Zellproliferation oder der Produktion von Zytokinen nachgewiesen werden.In diagnostic procedures, the binding of immunoglobulins can be sensitized or unsensitized people to conjugates of the peptides of the invention Chemicals detected, for example, by an enzyme-linked immunoassay become. In diagnostic procedures, the antigen-dependent activation of T- Lymphocytes from sensitized or non-sensitized people against conjugates of the Peptides according to the invention with chemicals in cell culture experiments, for example the measurement of cell proliferation or the production of cytokines can be demonstrated.

Die diagnostischen Verfahren können zur Identifikation allergieauslösender Chemikalien in Probanden herangezogen werden. Sie können auch dazu dienen, eine mögliche Sensibilisierung von gegenüber Chemikalien exponierten Personen festzustellen, wobei durch mehrere, zeitlich gestaffelte Messungen, die vor Beginn der Exposition einsetzen, die Entstehung einer Sensibilisierung ursächlich auf die Exposition zurückgeführt werden kann.The diagnostic procedures can be used to identify allergy-causing chemicals Subjects are used. They can also serve one possible purpose Determine sensitization of persons exposed to chemicals, whereby through several measurements staggered over time, which start before the exposure, the Development of sensitization can be attributed to exposure.

Zur Therapie unerwünschter Immunreaktionen gegen Chemikalien können Konjugate der erfindungsgemäßen Peptide mit Chemikalien oder Gemische von Konjugaten beispielsweise oral, intranasal oder parenteral an sensibilisierte Personen verabreicht werden. Die Auslösung einer immunologischen Toleranz gegen Chemikalien durch Verabreichung von Konjugaten der erfindungsgemäßen Peptide mit Chemikalien oder Gemischen von Konjugaten kann auch prophylaktisch zur Verhinderung des Entstehens einer Allergie gegen Chemikalien eingesetzt werden.Conjugates can be used to treat unwanted immune reactions against chemicals Peptides according to the invention with chemicals or mixtures of conjugates, for example administered orally, intranasally or parenterally to sensitized people. The Initiation of an immunological tolerance against chemicals by administration of Conjugates of the peptides according to the invention with chemicals or mixtures of  Conjugates can also be used prophylactically to prevent the onset of an allergy to Chemicals are used.

Zur prädiktiven Testung des sensibilisierenden Potentials von Chemikalien in Tierexperimenten kann untersucht werden, ob nach Verabreichung von Konjugaten der erfindungsgemäßen Peptide mit Chemikalien oder Gemischen von Konjugaten an Tiere eine Sensibilisierung der Tiere auftritt. Zur prädiktiven Testung des sensibilisierenden Potentials von Chemikalien in Zellkulturexperimenten können T-Lymphozyten aus nicht sensibilisierten Tieren oder Menschen mit Konjugaten der erfindungsgemäßen Peptide mit Chemikalien oder Gemischen von Konjugaten in Gegenwart von antigenpräsentierenden Zellen, z. B. aus Vorläuferzellen kultivierten dendritischen Zellen, kultiviert und ihre Reaktion beispielsweise durch Messung der Zellproliferation oder Zytokinproduktion gemessen werden.For predictive testing of the sensitizing potential of chemicals in Animal experiments can be used to investigate whether after administration of conjugates the Peptides according to the invention with chemicals or mixtures of conjugates on animals Sensitization of animals occurs. For predictive testing of the sensitizing potential of chemicals in cell culture experiments can T-lymphocytes from non-sensitized Animals or humans with conjugates of the peptides according to the invention with chemicals or Mixtures of conjugates in the presence of antigen presenting cells, e.g. B. from Progenitor cells cultured dendritic cells, and cultured their reaction for example can be measured by measuring cell proliferation or cytokine production.

Claims (7)

1. Verwendung von Peptiden für die Herstellung von Konjugaten mit Chemikalien zur prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe oder Therapie immunologischer Sensibilisierungen gegen Chemikalien, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide universell in die Peptidbindungsfurchen von genetisch verschiedenen Haupthistokompatibilitätskomplexmolekülen der Klasse II binden können.1. Use of peptides for the production of conjugates with chemicals for predictive testing, diagnostics, prophylaxis or therapy of immunological sensitizations against chemicals, characterized in that the peptides can bind universally in the peptide binding furrows of genetically different major histocompatibility complex molecules of class II. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide verwendet werden, die vor oder während der Anwendung in der prädiktiven Testung, Diagnostik, Prophylaxe oder Therapie über mindestens eine der Aminosäureseitenketten kovalent mit Chemikalien konjugiert werden.2. Use according to claim 1, characterized in that peptides are used be used before or during use in predictive testing, diagnostics, Prophylaxis or therapy via at least one of the amino acid side chains be covalently conjugated to chemicals. 3. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide verwendet werden, die in mindestens zwei Aminosäurepositionen Methionin enthalten.3. Use according to one or more of claims 1 and 2, characterized characterized in that peptides are used which are present in at least two Contain amino acid positions methionine. 4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide verwendet werden, die die Aminosäuresequenz
Met-A-Met-A-A-A-A-A-Met (III), oder
Met-A-A-Met-A-A-A-A-Met (IV)
enthalten, worin
Met Methionin und
A eine Aminosäure,
bedeuten
und mindestens eine der Positionen A Cystein, Histidin, Lysin, Methionin, Tryptophan, Tyrosin oder eine andere nicht natürlich in Proteinen vorkommende 2- Aminocarbonsäure mit einer nukleophilen oder elektrophilen funktionellen Gruppe in der Seitenkette enthält.4. Use according to one or more of claims 1 to 3, characterized in that peptides are used which have the amino acid sequence
Met-A-Met-AAAAA-Met (III), or
Met-AA-Met-AAAA-Met (IV)
contain what
With methionine and
A an amino acid,
mean
and at least one of positions A contains cysteine, histidine, lysine, methionine, tryptophan, tyrosine or another non-naturally occurring 2-aminocarboxylic acid with a nucleophilic or electrophilic functional group in the side chain. 5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide benutzt werden, die Sequenzvarianten der mit Haupthistokompatibilitätskomplexmolekülen der Klasse II assoziierten Peptide der Invarianten Kette des Menschen oder einer anderen Spezies darstellen.5. Use according to one or more of claims 1 to 4, characterized characterized in that peptides are used, the sequence variants of the with Major class II histocompatibility complex molecules associated peptides of  Represent invariant chain of humans or other species. 6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide verwendet werden, die eine oder mehrere chemische Modifikationen am Aminoterminus, Carboxyterminus oder einer oder mehrerer Aminosäureseitenketten tragen.6. Use according to one or more of claims 1 to 5, characterized characterized in that peptides are used which contain one or more chemical Modifications to the amino terminus, carboxy terminus or one or more Wear amino acid side chains. 7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide verwendet werden, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch nicht natürlich in Proteinen vorkommende 2-Aminocarbonsäuren ersetzt sind.7. Use according to one or more of claims 1 to 6, characterized characterized in that peptides are used in which one or more Amino acids through 2-amino carboxylic acids not naturally occurring in proteins are replaced.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5468481A (en) * 1988-06-23 1995-11-21 Amergen, Inc. MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity
WO1996001650A1 (en) * 1994-07-11 1996-01-25 Pharmacia Ab A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate

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