DE19826350A1

DE19826350A1 - Preservation of blood cells, especially red blood cells

Info

Publication number: DE19826350A1
Application number: DE1998126350
Authority: DE
Inventors: Holger Schmid-Schoenbein
Original assignee: SCHMID SCHOENBEIN HOLGER
Current assignee: SCHMID SCHOENBEIN HOLGER
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 1999-12-23

Abstract

Blood cells are preserved by suspending them in an aqueous preserving solution, exposing the suspension to a high hydrostatic pressure, cooling the suspension to a temperature below 263 K, and storing the suspension at this pressure and temperature.- DETAILED DESCRIPTION - An INDEPENDENT CLAIM is also included for an apparatus for carrying out the process, comprising a pressure vessel containing the suspension and device for monitoring the pressure

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Konservieren von zellulären Blutkomponenten, insbesondere von Erythrozyten, durch Lagerung bei tiefen Temperaturen, sowie Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens.The invention relates to a method for preserving cellular blood components, especially erythrocytes Storage at low temperatures, as well as devices for Execution of the procedure.

Zelluläre Blutkomponenten werden bekanntlich durch Gefriervorgänge irreversibel geschädigt. Die Lagerung von Blutbestandteilen in sogenannten Blutbanken erfolgt deshalb in der Weise, daß das zu konservierende Blut durch Zusatz einer Stabilisierungslösung ungerinnbar gemacht, das Blutplasma durch Zentrifugierung von den zellulären Blutkomponenten abgetrennt und Blutplasma und zelluläre Blutkomponenten getrennt konserviert werden. Das Blutplasma wird als tiefgefrorene Flüssigkeit gelagert. Die biochemischen, physikochemischen und enzymologischen Eigenschaften des Blutplasmas werden durch den Gefriervorgang nicht verändert, und das zu einem Eisblock schockgefrorene Blutplasma kann auf diese Weise beliebig lange gelagert werden.Cellular blood components are known to freeze irreversibly damaged. The storage of blood components in So-called blood banks therefore takes place in such a way that the preserving blood by adding a stabilizing solution made the blood plasma impenetrable by centrifugation from the cellular blood components separated and blood plasma and cellular Blood components can be preserved separately. The blood plasma is stored as a frozen liquid. The biochemical, physicochemical and enzymological properties of Blood plasma is not changed by the freezing process, and the blood plasma shock-frozen into an ice block can be on this Be stored for any length of time.

Bei zellulären Blutbestandteilen liegen die Verhältnisse anders. Thrombozyten z. B., die für die Blutgerinnung verantwortlich sind, können bis heute nur in frischem Zustand erfolgreich transfundiert werden. Kühlschritte, bei denen es zur Bildung von Eiskristallen innerhalb und/oder außerhalb der Blutzellen kommt, zerstören oder schädigen in erheblichem Maße die Zellwände und die Zellen und müssen daher auf jeden Fall vermieden werden. Eine beschränkte Konservierung läßt sich nur durch Lagerung in geeigneten Stabilisierungslösungen erreichen. Insbesondere die Erythrozyten, die die an Masse wichtigste Komponente des Blutes darstellen, sind gegen intrazelluläre Eisbildung sehr empfindlich. Eine Tiefkühlung ist nur dann möglich, wenn durch geeignete Zusätze der Gefrierpunkt gesenkt wird. Doch auch bei Tiefkühlung unter Zusatz von den Gefrierpunkt erniedrigenden Stoffen ist eine Konservierung nur in sehr beschränktem Umfang möglich. Offensichtlich kommt es nämlich bei den hierfür bekannten Verfahren ebenfalls zu Schädigungen der Zellen und vor allem der Zellmembranen, wodurch die Überlebensfähigkeit der Erythrozyten beeinträchtigt wird.The situation is different for cellular blood components. Platelets e.g. B. who are responsible for blood clotting, can only be successfully transfused until today become. Cooling steps, which lead to the formation of ice crystals comes inside and / or outside the blood cells, destroy or significantly damage the cell walls and the cells and must therefore be avoided in any case. A limited one Preservation can only be achieved by storing it in suitable Achieve stabilization solutions. Especially the erythrocytes, which are the most important component of blood in terms of mass very sensitive to intracellular ice formation. Freezing is only possible if the Freezing point is lowered. But also with deep-freezing with the addition of freezing substances is a preservation only possible to a very limited extent. Obviously it is coming namely also in the known methods for this Damage to the cells and especially the cell membranes, causing the viability of the erythrocytes is impaired.

Weiße Blutkörperchen, die für die Infektabwehr des Blutes zuständig sind, sind hingegen überraschenderweise resistenter gegen intrazelluläre Eisbildung als andere Blutzellen.White blood cells necessary for the defense against blood infection are surprisingly more resistant against intracellular ice formation than other blood cells.

Aus den genannten Gründen ist es bis heute nicht möglich, die gegen Eisbildung empfindlichen zellulären Blutkomponenten so zu konservieren, daß ihre biochemische Aktivität auch über längere Zeiträume voll erhalten bleibt.For the reasons mentioned, it is not possible to date cellular blood components sensitive to ice formation conserve their biochemical activity even over prolonged periods Periods is fully preserved.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Konservierung von zellulären Blutkomponenten zu entwickeln, das es ermöglicht, diese Blutkomponenten auch über verhältnismäßig lange Zeiträume zu lagern, ohne daß die Zellen oder die Zellmembranen in wesentlichem Umfang geschädigt werden.The invention has for its object a method for Preservation of cellular blood components to develop it allows these blood components to last for a relatively long time Periods of storage without the cells or cell membranes in to a significant extent.

Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die zellulären Blutkomponenten nach ihrer Abtrennung vom Blut in einer wässrigen Konservierungslösung einem hohen hydrostatischen Druck ausgesetzt, unter diesem Druck auf eine Temperatur von weniger als 263 Kelvin abgekühlt und unter diesem Druck und bei dieser Temperatur gelagert werden.According to the invention, this object is achieved in that the cellular blood components after their separation from the blood in one aqueous preservation solution under high hydrostatic pressure exposed to this pressure at a temperature less than 263 Kelvin cooled and under this pressure and at this Temperature.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht sich das "Le-Chatelier- Prinzip" zunutze, wonach das Gleichgewicht eines unter äußeren Einflüssen stehenden Systems sich stets in Richtung des kleinsten Zwanges verschiebt. Da Wasser unterhalb von 4 Grad C und Eis aufgrund ihres anomalen Wärmeausdehnungsverhaltens mit abnehmender Temperatur ihr Volumen vergrößern, führt die Anwendung von hohen hydrostatischen Drücken dazu, daß das Phasengleichgewicht Wasser-Eis, das heißt der Gefrierpunkt des Wassers, mit zunehmendem Druck sich zu tieferen Temperaturen verschiebt. Es ist anzunehmen, daß mit zunehmendem hydrostatischen Druck auch die Keimbildung von Eiskristallen zu tieferen Temperaturen verschoben wird. Das hat zur Folge, daß unter hohen hydrostatischen Drücken die Temperatur der Blutzellen-Suspension stark herabgesetzt werden kann, ohne daß die Gefahr einer Eisbildung und der damit einhergehenden Schädigung und Zerstörung der Zellmembranen besteht. Auf diese Weise ist es also möglich, nunmehr auch für zelluläre Blutkomponenten die Tiefkühlkonservierung anzuwenden, und zwar bis zu derart tiefen Temperaturen, bei denen Diffusionsvorgänge und Ionenbewegungen nur noch in sehr eingeschränktem Umfang möglich sind. Auf diese Weise kann die Konservierungszeit gegenüber den bekannten Verfahren erheblich gesteigert werden. Insbesondere hat es sich gezeigt, daß in den auf diese Weise extrem unterkühlten Erythrozyten alle ATP (Adenosintriphosphat) verbrauchenden Prozesse auf ein Minimum reduziert werden. Damit bleibt das in den Zellen akkumulierte Mg- ATP für die Zellen verfügbar, auch wenn über längere Zeiten keine nennenswerte Neusynthese erfolgt.The method according to the invention makes use of the "Le Chatelier Principle "take advantage of the equilibrium of an external one Influenced standing system always towards the smallest Forced shifts. Because water below 4 degrees C and ice due to their abnormal thermal expansion behavior decreasing temperature increase their volume, the application leads of high hydrostatic pressures that the Phase equilibrium between water and ice, i.e. the freezing point of the Water, with increasing pressure to lower temperatures shifts. It can be assumed that with increasing hydrostatic Pressure also to deepen the nucleation of ice crystals Temperatures is shifted. The result is that under high hydrostatic pressures the temperature of the blood cell suspension can be greatly reduced without the risk of a Ice formation and the associated damage and destruction of the cell membranes. So in this way it is possible now also for cellular blood components Apply deep-freeze preservation to such depths Temperatures at which diffusion processes and ion movements only are still possible to a very limited extent. In this way can the preservation time compared to the known methods be significantly increased. In particular, it has been shown that in the extremely supercooled erythrocytes in this way all ATP (Adenosine triphosphate) consuming processes to a minimum be reduced. This keeps the Mg- accumulated in the cells ATP available to the cells, even if none for long periods significant new synthesis takes place.

In zweckmäßiger Weiterbildung des Verfahrens werden die zellulären Blutkomponenten in wässrigen Konservierungslösungen suspendiert, die Na⁺-, K⁺- und Ca⁺⁺-Ionen in Konzentrationen enthalten, die transmembranale Ionenflüsse zwischen den Blutzellen und der Konservierungslösung praktisch ausschließen. Um die Diffusion von Na⁺- und Ca⁺⁺-Ionen in die Blutzellen zu verhindern, werden deshalb für diese Ionen in der Konservierungslösung Konzentrationen gewählt, die weit unter der natürlichen Konzentration dieser Ionen im Blut liegen. Die natürliche Konzentration dieser Ionen außerhalb der Blutzellen liegt bei etwa 150 mMol/l für Na⁺ und bei etwa 3000 µMol/l für Ca⁺⁺, während die Konzentration dieser Ionen innerhalb der Zellen bei 5 mMol/l für Na⁺ und bei 1 µ Mol/l für Ca⁺⁺ liegt. In der erfindungsgemäß verwendeten Konservierungslösung wird deshalb die Ionenkonzentration von Na⁺ und Ca⁺⁺ etwa auf diese natürliche intrazelluläre Konzentration dieser Ionen eingestellt.In an expedient development of the method, the cellular Blood components suspended in aqueous preservation solutions, contain the Na⁺, K⁺ and Ca⁺⁺ ions in concentrations that transmembrane ion flows between the blood cells and the Practically exclude the preservation solution. To the diffusion of Prevent Na⁺⁺ and Ca⁺⁺ ions from entering the blood cells therefore for these ions in the preservation solution Concentrations chosen that are far below natural Concentration of these ions in the blood. The natural The concentration of these ions outside the blood cells is around 150 mmol / l for Na⁺ and at about 3000 µmol / l for Ca⁺⁺, while the Concentration of these ions within the cells at 5 mmol / l for Na⁺ and is 1 µ mol / l for Ca⁺⁺. In the invention The preservation solution used is therefore the Ion concentration of Na⁺ and Ca⁺⁺ about this natural set intracellular concentration of these ions.

Andererseits ist es zweckmäßig, die Diffusion von K⁺ aus den Blutzellen in die Konservierungslösung dadurch zu minimieren, daß der K⁺-Gehalt der wässrigen Konservierungslösung auf Werte von über 120 mMol/l gesteigert wird. Nach der Renormalisierung des Zellkonzentrats wird zur Herstellung eines transfusionsfähigen Gemischs durch Zugabe von K⁺-freien Lösungen die K⁺-Konzentration wieder auf etwa 6 mMol/l gesenkt, d. h. auf etwa physiologische Werte.On the other hand, it is useful to diffuse K⁺ from the To minimize blood cells in the preservation solution by the K⁺ content of the aqueous preservation solution to values of is increased above 120 mmol / l. After the renormalization of the Cell concentrate is used to make a transfusible Mix the K⁺ concentration by adding K⁺-free solutions lowered again to about 6 mmol / l, d. H. to about physiological Values.

Die Eindiffusion von Ca⁺⁺ in die Blutzellen kann auch dadurch verringert oder verhindert werden, daß der Konservierungslösung Citrat oder ein anderer Komplexbildner für Ca⁺⁺ zugegeben wird.The diffusion of Ca⁺⁺ into the blood cells can also be done be reduced or prevented from preserving the solution Citrate or another complexing agent for Ca⁺⁺ is added.

Auch diese Maßnahme dient dazu, die Gesamtheit von Membran-Lipiden und Membran-Proteinen zu schützen und möglichst unverändert zu erhalten.This measure also serves the entirety of membrane lipids and to protect membrane proteins and, if possible, remain unchanged receive.

Eine weitere günstige Beeinflussung der Konservierung der Blutzellen kann durch Zugabe bestimmter Medikamente zu der Konservierungslösung erfolgen. Beispielsweise können zu diesem Zweck Chlopromazin (Chloroquin-bis(Dihydrogenphosphat) oder ähnlich wirkende Substanzen sowie übliche Lokalanaesthetika zugegeben werden. Die Wirkung solcher Substanzen beruht darauf, daß sie die sogenannte "echinozytogene" Reaktion verhindern bzw. umkehren. Unter echinozytogener Reaktion wird eine Formänderung der normalerweise bikonkav geformten Erythrozyten unter Bildung von mehr oder weniger scharf gerundeten Vorstülpungen der Zellmembran verstanden. Diese Formänderung führt zu einer Versteifung der Erythrozyten mit der Folge, daß ihre Fähigkeit, Engstellen des Gefäßsystems zu passieren, gestört wird. Schließlich führt sie zur Zerstörung der Zellen. Als Folge dessen können sich sogenannte Neoantigene bilden, die ihrerseits Anlaß zu schädlichen immunologischen Reaktionen mit dem Immunsystem des Empfängerblutes sein können.Another beneficial influence on the conservation of the Blood cells can be added to the blood by adding certain medications Preservation solution done. For example, about this Purpose chlopromazine (chloroquine bis (dihydrogen phosphate) or similarly acting substances as well as usual local anesthetics be added. The effect of such substances is based on that they prevent the so-called "echinocytogenic" reaction or turning back. An echinocytogenic reaction results in a change in shape of the normally biconcave erythrocytes with formation of more or less sharply rounded protrusions of the Cell membrane understood. This change in shape leads to a Stiffening of the erythrocytes with the consequence that their ability to Passages of the vascular system are disturbed. Eventually it will destroy the cells. As a result So-called neoantigens can form, which in turn give rise to harmful immunological reactions with the immune system of the Can be recipient blood.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich mit Hilfe von bekannten Druckgefäßen durchgeführt werden, in denen der Überdruck während der gesamten Konservierungszeit bei tiefen Temperaturen aufrechterhalten bleibt.The method according to the invention can in principle with the aid of known pressure vessels are carried out in which the overpressure during the entire preservation period at low temperatures is maintained.

Eine besonders geeignete Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, daß der Druckbehälter als solcher mit einer Druckkontrolleinrichtung versehen ist, die die Überwachung des Überdrucks während der Konservierungszeit gestattet. Präzise Meßinstrumente sind hierfür nicht erforderlich, vielmehr genügen in der Regel einfache Kontrollvorrichtungen. Als solche kommen beispielsweise transparente kleinlumige Rohre in Frage, die einseitig geschlossen sind. Die mit Luft gefüllten Rohre stehen am anderen Ende mit dem unter Druck stehenden Medium in Verbindung. Durch den Überdruck wird die Luftsäule komprimiert, und mit Hilfe einer geeichten Skala auf dem transparenten Rohr kann der Füllstand des Rohres festgestellt, und über den Füllstand des Rohres die Höhe des Überdrucks ermittelt werden. Mit Hilfe geeigneter lichtelektrischer Meßeinrichtungen kann der Überdruck mit Hilfe bekannter Speichereinrichtungen fortlaufend registriert werden.A particularly suitable device for performing the The method is characterized in that the pressure vessel as such is provided with a pressure control device which Monitoring the overpressure during the preservation period allowed. Precise measuring instruments are not required for this, rather, simple control devices are usually sufficient. As such come, for example, transparent small-lumen tubes in question that are closed on one side. The ones filled with air Pipes are at the other end with the pressurized medium in connection. The air column is compressed by the overpressure, and with the help of a calibrated scale on the transparent tube the level of the pipe can be determined and the level the height of the overpressure. With help Suitable photoelectric measuring devices can overpressure continuously registered using known storage devices become.

Mit bekannten Vorrichtungen ist es technisch möglich, in Flüssigkeiten hydrostatische Drücke in Höhe von 100.000 bis 150.000 hPa (100-150 bar) zu erzeugen und in Druckbehältern langfristig aufrechtzuerhalten. Unter derart hohen Drücken können die wässrigen Konservierungslösungen auf Temperaturen von 250 Kelvin und darunter abgekühlt werden, ohne daß die Gefahr einer Eisbildung besteht.With known devices it is technically possible in Liquids hydrostatic pressures ranging from 100,000 to Generate 150,000 hPa (100-150 bar) and in pressure vessels maintain in the long term. Under such high pressures the aqueous preservation solutions at temperatures of 250 Kelvin and below can be cooled without the risk of a There is ice formation.

Zum Kältekonservieren von roten Blutzellen werden diese vom Blut abgetrennt und in wässrigen Suspensionslösungen aufgeschwemmt. Eine solche Suspensionslösung kann beispielsweise 80 bis 95 Volumenanteile Blutzellen enthalten.For the cold preservation of red blood cells, these are removed from the blood separated and suspended in aqueous suspension solutions. Such a suspension solution can be, for example, 80 to 95 Volume parts contain blood cells.

Für den Einsatz im Rahmen von Blutbank-Prozeduren empfiehlt es sich, Teilproben der kältekonservierten Suspensionslösungen in regelmäßigen Abständen während der Lagerzeit zu überprüfen, um den biochemisch-zellphysiologischen Erfolg zu kontrollieren. Zu diesem Zweck werden von der Suspensionslösung vor der Druck- und Kälteanwendung kleine Teilproben abgetrennt und diese Teilproben derselben Druck- und Kältebehandlung unterworfen. Die Überprüfung erfolgt dann anhand dieser Teilproben.It is recommended for use as part of blood bank procedures themselves, subsamples of the cryopreserved suspension solutions in periodically during the storage period to check the to control biochemical-cell-physiological success. To this Purpose of the suspension solution before printing and Refrigeration application separated small subsamples and these subsamples subjected to the same pressure and cold treatment. The verification is then carried out on the basis of these subsamples.

Claims

1. A method for preserving cellular blood components, in particular erythrocytes, by storage at low temperatures, characterized in that the cellular blood components are exposed to a high hydrostatic pressure after their separation from the blood in an aqueous preservation solution, under this pressure to a temperature of less than 263 Kelvin cooled and stored under the increased pressure and at this temperature.

2. The method according to claim 1, characterized in that the Containing blood cells and under high hydrostatic pressure standing preservation solution to a temperature of about 258 cooled to 243 Kelvin and stored at this temperature becomes.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the preservation solution containing the blood components hydrostatic pressure of more than 20,000 hpa, and preferably from 80,000 to 150,000 hPa, exposed and at this pressure is stored.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the aqueous preservation solution Na⁺- Ions up to a concentration of 1 to 10 mmol / l be added.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the aqueous preservation solution Ca⁺⁺- Ions up to a concentration of 0.5 to 5 µmol / l be added.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized in that the aqueous preservation solution K⁺- Ions up to a concentration of more than 120 mmol / l be added.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized characterized that the aqueous preservation solution Medications that prevent blood cells from changing their shape Chlopromazine or local anesthetics can be added.

8. Device for performing the method according to one of the Claims 1 to 7, characterized in that the Containing blood cells in the preservation solution Pressure vessel with a pressure monitoring allowing pressure measuring device is provided.

9. The device according to claim 8, characterized in that the Pressure measuring device made of a transparent, one-sided closed and filled with air and with a scale provided pipe.

10. The device according to claim 8 or 9, characterized by a registering the level of pressure in the pressure vessels Storage device.