Die SSCP-(single strand conformation polymorphism) sowie auch die DGGE-
(denaturing gradient gel electrophoresis) Analyse wird momentan bei einer
Reihe von Instituten zur beschleunigten Erkennung von Punktmutationen
(mutation screening) an zahlreichen Genen angewandt. Beide Techniken
basieren auf der gelelektrophoretischen Auftrennung spezifischer DNA-
Abschnitte, welche zuvor mittels der PCR-(polymerase chain reaction) Technik
vervielfältigt (amplifiziert) wurden. Die Mutationserkennung über die SSCP-
Analyse in nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen beruht im Prinzip auf der
Darstellung von Laufunterschieden der über eine Abschreckung im Eiswasserbad
stabilisierten Einzelstränge (unterschiedliche Laufgeschwindigkeit durch
geänderte Sekundärstruktur).The SSCP (single strand conformation polymorphism) as well as the DGGE
(denaturing gradient gel electrophoresis) Analysis is currently in progress
Series of institutes for the accelerated detection of point mutations
(mutation screening) applied to numerous genes. Both techniques
are based on the gel electrophoretic separation of specific DNA
Sections previously made using the PCR (polymerase chain reaction) technique
were reproduced (amplified). Mutation detection via the SSCP
Analysis in non-denaturing polyacrylamide gels is based in principle on the
Representation of running differences of a deterrent in an ice water bath
stabilized single strands (different running speed through
changed secondary structure).
Die Mutationserkennung über die DGGE-Analyse in graduell zunehmend
denaturierenden Polyacrylamidgelen beruht hingegen auf der Darstellung von
Laufunterschieden bedingt durch unterschiedliches Denaturierungsverhalten
von Doppelsträngen (unterschiedliche Laufgeschwindigkeit durch geändertes
Schmelzverhalten). Ein vollständiges Aufschmelzen der untersuchten
Doppelstränge wird dabei durch eine obligatorische "GC-Klammer" verhindert.
(Bei der alternativ in einigen Laboratorien angewandten TGGE-(temperature
gradient gel electrophoresis) Analyse handelt es sich im Prinzip um eine
modifizierte DGGE-Analyse, da der Formamid/Harnstoff-Gradient unter
Temperaturkonstanz lediglich durch einen Temperatur-Gradienten substituiert
wird. Deshalb schließt das beschriebene zu patentierende Kopplungsverfahren
eine alternativ zur DGGE-Analyse angewandte TGGE-Analyse mit ein).Mutation detection via DGGE analysis is gradually increasing
denaturing polyacrylamide gels, however, is based on the representation of
Run differences due to different denaturing behavior
of double strands (different running speed due to changed
Melting behavior). A complete melting of the examined
Double strands are prevented by an obligatory "GC bracket".
(With the TGGE (temperature
gradient gel electrophoresis) analysis is basically a
modified DGGE analysis because of the formamide / urea gradient below
Constant temperature is only substituted by a temperature gradient
becomes. Therefore, the coupling process described, which is patented, closes
a TGGE analysis used as an alternative to the DGGE analysis).
Im Gegensatz zur DGGE-Analyse wird die SSCP-Analyse momentan von der
Mehrzahl der molekularbiologischen Laboratorien zur Punktmutationssuche
eingesetzt. Dies ist ein Umstand, der sich hauptsächlich durch den relativ
geringen Arbeits- und Zeitaufwand der SSCP-Technik erklären läßt. Im Vergleich
zur labortechnisch aufwendigeren DGGE-Analyse, erwies sich die SSCP-Analyse,
allerdings als weniger sensitiv (geringere Erkennungskapazität für
Punktmutationen). Die hauptsächliche Ursache für die bisher relativ
zurückhaltende Nutzung der DGGE-Technik, ist wahrscheinlich der sehr hohe
Kostenaufwand bezüglich der Primerherstellung. Zur Untersuchung eines
spezifischen Genabschnittes, ist nämlich neben den beiden
Voramplifikationsprimern (jeweils 20 Basen) immer auch die Synthese eines
eingeschobenen Primers (20 Basen) zuzüglich angehängter GC-Klammer
notwendig, und diese umfaßt eine Mindestlänge von 40 Nukleotiden. Eine
Verknüpfung von SSCP- und DGGE-Technik, verbunden mit dem erklärten Ziel
einer beschleunigten Probendurchsatzrate bei gleichzeitiger Steigerung des
Mutationserkennungspotentials, wird unseres Wissens nach bisher an keiner
Forschungseinrichtung angewandt.In contrast to the DGGE analysis, the SSCP analysis is currently carried out by the
Most of the molecular biological laboratories for point mutation search
used. This is a fact that is mainly due to the relative
explains the small amount of work and time involved in SSCP technology. Compared
for the more complex DGGE analysis in terms of laboratory technology, the SSCP analysis turned out to be
however, as less sensitive (lower detection capacity for
Point mutations). The main cause of the relative so far
reluctant use of DGGE technology is probably the very high one
Primer manufacturing cost. To examine a
specific gene segment, namely, is next to the two
Pre-amplification primers (20 bases each) always synthesize one
inserted primers (20 bases) plus attached GC clamp
necessary, and this has a minimum length of 40 nucleotides. A
Linking SSCP and DGGE technology, linked to the stated goal
an accelerated sample throughput rate while increasing the
As far as we know, no mutation detection potential has been found in any
Research facility applied.
Wir haben ein Verfahren entwickelt, das eine kostengünstige und zeitsparende
Analyse mit anschließender Sequenzierung ermöglicht:
Im Anschluß an die Voramplifikation, erfolgt eine Nachamplifikation mit
einem eingeschobenen Primer (nested PCR). Dabei ist an den eingeschobenen
Primer am 5'-Ende eine möglichst kurze GC-reiche Sequenz (kleiner/gleich 14
Nukleotide) angehängt (Adapter). Dies hat auf die Amplifikationseffizienz des
nested PCR Produktes keinen nachteiligen Einfluß. Ebenso ist eine
uneingeschränkte Mutationsanalyse des resultierenden Amplifikations
produktes mittels SSCP-Technik möglich. An die Adaptersequenz kann
anschließend in einer weiteren PCR eine universelle GC-Klammer angehängt
werden. Dadurch ist nun zusätzlich die Analyse mittels DGGE-Technik möglich.
Die Adaptersequenz dient außerdem parallel als Template für einen
universellen biotinmarkierten Sequenzprimer (Chemilumineszenz-
Sequenzierung) zur endgültigen Charakterisierung der mittels einer der beiden
oben beschriebenen Screening-Methoden aufgefundenen Mutationen.We have developed a process that enables cost-effective and time-saving analysis with subsequent sequencing:
After pre-amplification, post-amplification is carried out with an inserted primer (nested PCR). A short GC-rich sequence (less than or equal to 14 nucleotides) is attached to the inserted primer at the 5 'end (adapter). This has no adverse effect on the amplification efficiency of the nested PCR product. An unrestricted mutation analysis of the resulting amplification product is also possible using SSCP technology. A universal GC clamp can then be attached to the adapter sequence in a further PCR. This means that analysis using DGGE technology is now also possible. The adapter sequence also serves in parallel as a template for a universal biotin-labeled sequence primer (chemiluminescence sequencing) for the final characterization of the mutations found using one of the two screening methods described above.
Strategie und Vorteile der gekoppelten SSCP/DGGE-AnalyseStrategy and benefits of coupled SSCP / DGGE analysis
1. Alle Proben, die über die SSCP-Analyse keine Mutation zeigen, werden einer
zusätzlichen DGGE-Analyse unterzogen. Diese Verknüpfungsstrategie beider
Methoden erlaubt neben einer maximalen Zeit- und Resourcenersparnis die
Detektion von Punktmutationen mit einer annähernd 100%-igen
Detektionseffizienz. Neben Punktmutationen können auch Mikrodeletionen
und Allelverluste erfaßt werden.1. All samples that show no mutation via the SSCP analysis become one
subjected to additional DGGE analysis. This linking strategy of both
In addition to maximum time and resource savings, methods allow
Detection of point mutations with an almost 100%
Detection efficiency. In addition to point mutations, microdeletions can also be found
and allele losses are recorded.
2. Die konventionelle direkte Sequenzierung von PCR-Produkten arbeitet mit
der DNA aller Zellen eines exzidierten Tumors, von denen jedoch oft nur ein
Teil die kritische Mutation trägt (Gründe: 1. Kontamination des Tumors durch
Normalzellen wie beispielsweise Lymphozyten oder Normalgewebe aus
Blutgefäßen oder Marginalregionen, 2. Tumorsubpopulationen). Dadurch wird
das Erkennen latent vorhandener Mutationen oft unmöglich (zu schwaches
Signal, nicht abgrenzbar von generell meist vorhandenen unspezifischen
Hintergrundsignalen). Sowohl SSCP- als auch DGGE-Analyse erlauben hingegen
eine Anreicherung der sich als schwache Bande manifestierenden mutierten
Sequenz durch Nachamplifikation. Die danach erfolgende Sequenzierung erhält
dann als Ausgangsmaterial nur noch mutierte DNA. Dies bedeutet, daß
Mutationen eindeutig nachweisbar werden, was beim alleinigen Einsatz der
Sequenzierung nicht der Fall ist.2. The conventional direct sequencing of PCR products works with
the DNA of all cells in an excised tumor, but often only one of them
Part carries the critical mutation (reasons: 1. Contamination of the tumor by
Normal cells such as lymphocytes or normal tissue
Blood vessels or marginal regions, 2. tumor subpopulations). This will
the detection of latent mutations is often impossible (too weak
Signal that cannot be distinguished from generally non-specific ones that are usually present
Background signals). Both SSCP and DGGE analysis, however, allow
an enrichment of the mutations that manifested themselves as weak bonds
Sequence through post-amplification. The sequencing that follows takes place
then only mutated DNA as the starting material. This means that
Mutations become clearly demonstrable what if the sole use of the
Sequencing is not the case.
Das anzumeldende Patent für die Kopplung von SSCP und DGGE bezieht sich
auf die Anwendung eines eingeschobenen Primers mit GC-Adapter-Sequenz
hinsichtlich der im folgenden beschriebenen Mutationsscreeningstrategie:
The patent to be applied for the coupling of SSCP and DGGE relates to the use of an inserted primer with GC adapter sequence with regard to the mutation screening strategy described below:
-
1. SSCP-Mutationsanalyse des Nested-PCR-Produktes aller Proben.1. SSCP mutation analysis of the nested PCR product of all samples.
-
2. DGGE-Mutationsanalyse des Nested-PCR-Produktes plus angehängter
universeller GC-Klammer aller Proben, die nach SSCP-Analyse kein
Mutationssignal aufweisen.2. DGGE mutation analysis of the nested PCR product plus the attached one
universal GC clamp of all samples, which according to SSCP analysis no
Have mutation signal.
-
3. Sequenzanalyse der über eine der beiden Screening-Methoden detektierten
Mutationen nach eventuell notwendiger Nachamplifkation unter Einsatz
des universellen biotinmarkierten Sequenzprimers.3. Sequence analysis of those detected using one of the two screening methods
Mutations after post-amplification may be necessary
of the universal biotin-labeled sequence primer.