DE19823351A1

DE19823351A1 - Agent for inhibiting apoptosis

Info

Publication number: DE19823351A1
Application number: DE19823351A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Krause; Thomas Dr Pohl; Silvia Dr Dr Bulfone-Paus; Ulrich Prof Dr Kunzendorf
Original assignee: BULFONE PAUS SILVIA DR DR
Current assignee: BULFONE PAUS SILVIA DR DR
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 1998-12-10

Abstract

Agent for inhibiting apoptosis in the treatment of diseases comprises interleukin-15 (IL-15), an IL-15 derivative, an IL-15 fusion protein or a substance coupled to the interleukin-15 receptor (no details given).

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Verhinderung der Zellapoptose. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a means for preventing Cell apoptosis. Areas of application of the invention are Medicine and the pharmaceutical industry.

Der programmierte Zelltod, die Apoptose, ist ein natürlicher Vorgang des Organismus, der bei der Entwicklung eines Organismus auftritt, aber auch bei einer Reihe von pathologischen Zuständen. So sind verschiedene virale Infektionen mit Apoptose assoziiert. Unter anderem wird das akute Leberversagen nach Infektion mit Hepatitisviren durch Leberzellapoptose verursacht. Ein entscheidender Pathomechanismus der HIV-Erkrankung liegt in der Potenz des Virus, Apoptose zu induzieren. Darüberhinaus gehen neurodegenerative Erkrankungen mit einer pathologisch gesteigerten Apoptose einher. Tumoren, wie z. B. Melanome werden deshalb nicht vom Körper effektiv bekämpft, weil die für die Bekämpfung zuständigen Leukozyten durch Tumorzellen in die Apoptose getrieben werden. Eine Reihe von Cytostatika, wie Adreamycin und Etoproxid sind deswegen so knochenmarkstoxisch, weil blutbildende Stammzellen in die Apoptose getrieben werden. Insofern ist es von großem medizinischen Interesse, eine Substanz in der Hand zu haben, die gezielt eingesetzt werden kann, um Apoptose zu hemmen.The programmed cell death, apoptosis, is a natural one Process of the organism involved in the development of a Organism occurs, but also in a number of pathological conditions. So are different virals Infections associated with apoptosis. Among other things, it will acute liver failure after infection with hepatitis viruses Causes liver cell apoptosis. A crucial one Pathomechanism of HIV disease lies in the potency of the Virus to induce apoptosis. Go beyond neurodegenerative diseases with a pathological increased apoptosis. Tumors such as B. Melanoma are not effectively combated by the body because the leukocytes responsible for the control by tumor cells be driven into apoptosis. A row of This is why cytostatics such as adreamycin and etoproxide are so Bone marrow toxic because hematopoietic stem cells in the Be driven apoptosis. In this respect, it is of great size medical interest to have a substance in hand which can be used to inhibit apoptosis.

Es sind bereits einige Apoptosehemmer bekannt. Hierbei handelt es sich um virale Genprodukte und pharmakologisch wirksame Substanzen, die jedoch nur in ganz speziellen Situationen Apoptose hemmen können und deshalb nicht klinisch realisiert worden sind (vgl. Science 267, S. 1457; 1995).Some apoptosis inhibitors are already known. Here are viral gene products and pharmacologically effective substances, but only in very special Situations can inhibit apoptosis and therefore not have been clinically realized (cf. Science 267, p. 1457; 1995).

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, eine Substanz zur Verfügung zu stellen, die effektiv zur Hemmung der Apoptose bei Krankheiten eingesetzt werden kann. The invention was therefore based on the object of a substance to provide those that are effective in inhibiting the Apoptosis can be used in diseases.

Der Erfindung liegt die überraschende Entdeckung zugrunde, daß die Aktivierung des Interleukin-15-Rezeptors Zellen vor der Apoptose schützt.The invention is based on the surprising discovery, that activation of the interleukin-15 receptor precells cells which protects apoptosis.

Erfindungsgemäß erfolgt die Aktivierung des Interleukin-15-Rezeptors vorzugsweise durch Interleukin 15 oder andere Substanzen, wie z. B. Derivate des IL-15 oder Antikörper gegen den Interleukin-15-Rezeptor.According to the invention, the interleukin 15 receptor is activated preferably by interleukin 15 or others Substances such as B. IL-15 derivatives or antibodies against the interleukin 15 receptor.

Interleukin-15 ist überraschenderweise in der Lage, unterschiedliche Zelltypen vor dem programmierten Zelltod zu bewahren; es ist ein Zytokin, das natürlicherweise von verschiedenen Zellen des Körpers produziert wird und erstmalig von einer amerikanischen Gruppe 1994 beschrieben wurde (Science 264, S. 965; 1994). Unabhängig von seinen bekannten Funktionen in der Unterstützung der Zellproliferation (Zellvermehrung) wurde erfindungsgemäß nachgewiesen, daß Interleukin-15 eine Reihe von Zellen mesenchymalen, epidermalen und endodermalen Ursprungs vor dem programmierten Zelltod bewahrt.Interleukin-15 is surprisingly able different cell types before programmed cell death preserve; it is a cytokine that is naturally from different cells of the body is produced and first described by an American group in 1994 (Science 264, p. 965; 1994). Regardless of its known functions in support of the Cell proliferation was carried out according to the invention demonstrated that interleukin-15 a number of cells mesenchymal, epidermal and endodermal in origin saved programmed cell death.

Ausgehend von diesem Befund wurde das erfindungsgemäße Mittel entwickelt, das durch einen Gehalt an Interleukin-15, seine Derivate oder Interleukin-15 Fusionsproteine gekennzeichnet ist.Based on this finding, the invention Developed agents that contain interleukin-15, its derivatives or interleukin-15 fusion proteins is marked.

Als Derivate von IL-15 kommen alle Proteine in Betracht, die an den IL-15-Rezeptor binden.All proteins which can be considered as derivatives of IL-15 are: bind to the IL-15 receptor.

Als IL-15 Fusionsproteine werden bevorzugt alle Substanzen eingesetzt, bei denen IL 15 oder seine Derivate an ein Protein fusioniert ist und der antiapoptotische Effekt durch Bindung an den IL-15-Rezeptor vermittelt wird. Besonders bevorzugt ist das Fusionsprotein IL15-IgG2b.All substances are preferred as IL-15 fusion proteins used in which IL 15 or its derivatives on a Protein is fused and by the antiapoptotic effect Binding to the IL-15 receptor is mediated. Especially the fusion protein IL15-IgG2b is preferred.

Wird IL-15 an Immunglobuline gekoppelt, so wird die Plasma-Halbwertzeit so verlängert, daß es im Körper praktikabel eingesetzt werden kann. Im Mausmodell wurde gezeigt, daß dieses Interleukin-15 Fusionsprotein die Fas-vermittelte, üblicherweise zu 100% tödliche Leberzellapoptose in allen Fällen komplett hemmt. Darüber hinaus wurde im Mausmodell auch die nichttödliche Apoptose von aktivierten T-Zellen und B-Zellen durch dieses Fusionsprotein komplett gehemmt.When IL-15 is coupled to immunoglobulins, the plasma half-life becomes lengthened so that it is workable in the body can be used. The mouse model showed that this interleukin-15 fusion protein the Fas-mediated usually 100% fatal liver cell apoptosis in all Completely inhibits cases. It was also used in the mouse model also the non-fatal apoptosis of activated T cells and B cells are completely inhibited by this fusion protein.

Diese Eigenschaften machen IL-15, seine Derivate und IL-15 Fusionsproteine hervorragend für eine Verwendung zur Verhinderung der Zellapoptose bei Krankheiten geeignet. Das in Frage kommende Krankheitsspektrum ist sehr groß. So fallen unter anderem vorzugsweise darunter: Entzündungen der Leber durch Viren verursacht, HIV-Infektionen, strahleninduzierte Schäden, neurodegenerative Erkrankungen sowie toxische Schäden, Effektivierung der Tumortherapie und eine Reihe weiterer Erkrankungen.These properties make IL-15, its derivatives and IL-15 Fusion proteins excellent for use in Prevention of cell apoptosis in diseases. The The range of diseases in question is very large. So among other things, preferably include: inflammation of the Liver caused by viruses, HIV infections, radiation-induced damage, neurodegenerative diseases as well as toxic damage, effectiveness of tumor therapy and a number of other diseases.

Darüber hinaus werden erfindungsgemäß pharmazeutische Wirkstoffe eingesetzt, die durch Bindung an den IL-Rezeptor antiapoptotische Wirkungen entfalten.In addition, pharmaceutical Active ingredients used by binding to the IL receptor develop anti-apoptotic effects.

Die erfindungsgemäßen Mittel werden vorzugsweise mit an sich üblichen pharmazeutischen Hilfs-, Träger- und Zusatzstoffen hergestellt und appliziert, besonders bevorzugt als isotonische Lösung.The agents according to the invention are preferably with itself usual pharmaceutical auxiliaries, carriers and additives manufactured and applied, particularly preferred as isotonic solution.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. The invention is intended to be described in the following by means of exemplary embodiments are explained in more detail.

Embodiments 1.) IL-15 inhibits apoptosis in activated B cells caused by anti-IgM antibodies, anti-Fas Antibody or anti-IgM antibody and dexamethasone is induced

Durch Behandlung mit anti-Fas/APO 1(1), anti-IgM (2) oder anti-IgM plus Dexamethason (2) konnte bei aktivierten, humanen B Zellen Apoptose induziert werden. Nach Koinkubation mit 10 ng/ml rekombinantem, humanem IL-15 wurden die Zellen der Apoptoseinduktion gegenüber resistent, und zwar gegenüber allen drei Stimuli (Fig. 1). IL-15 unterdrückt offensichtlich experimentell induzierte DNA Fragmentierung (Fig. IA) und verhindert die Bildung von Kernen mit hypodiploider DNA (Fig. IB), ein Indikator der Apoptose, welches durchflußzytometrisch mittels Propidiumjodidfärbung (Pl) sichtbar gemacht werden kann (3).Treatment with anti-Fas / APO 1 (1), anti-IgM (2) or anti-IgM plus dexamethasone (2) was able to induce apoptosis in activated human B cells. After coincubation with 10 ng / ml recombinant human IL-15, the cells became resistant to the induction of apoptosis, namely to all three stimuli ( FIG. 1). IL-15 apparently suppresses experimentally induced DNA fragmentation ( Fig. 1A) and prevents the formation of nuclei with hypodiploid DNA ( Fig. IB), an indicator of apoptosis, which can be visualized by flow cytometry using propidium iodide staining (Pl) (3).

Bemerkenswerterweise unterdrückte die IL-15 Behandlung nicht nur die Apoptose, sondern hielt B-Zellen auch in der S-Phase des Zellzyklus; dies konnte durch die IL-15 vermittelte Wiederherstellung des normalen, breiten, einschultrigen, diploiden DNA Peaks erkannt werden, der den tripel Pl Peaks, wie aus Fig. 1B (4) hervorgeht, gegenübersteht (Zellen in der Apoptose, in G1 oder G2/M Phase darstellend).Remarkably, the IL-15 treatment not only suppressed apoptosis but also kept B cells in the S phase of the cell cycle; this could be recognized by the IL-15 mediated restoration of the normal, broad, one-shouldered, diploid DNA peak, which contrasts with the triple PI peaks, as can be seen in FIG. 1B (4) (cells in apoptosis, in G1 or G2 / Representing M phase).

2.) IL-15 inhibits apoptosis in activated T cells, which by anti-Fas antibodies, anti CD3 antibody or dexamethasone is induced

Vergleichbare anti-apoptotische in vitro Effekte von IL-15 konnten gefunden werden, wenn ConA-aktivierte, humane T-Lymphoblasten, die wie bereits beschrieben hergestellt wurden (5), durch Behandlung mit anti-Fas/APO 1 (1), mit anti-CD3 Antikörpern (6) oder durch Dexamethason (7) in die Apoptose getrieben wurden: in allen Fällen wurde die Apoptose signifikant durch Koinkubation mit 10 ng/ml IL-15 gehemmt, gezeigt durch DNA-laddering (Fig. 2A) und Pl Durchflußzytometrie (Fig. 2B).Comparable anti-apoptotic in vitro effects of IL-15 could be found when ConA-activated human T-lymphoblasts, which were produced as already described (5), by treatment with anti-Fas / APO 1 (1) with anti -CD3 antibodies (6) or by dexamethasone (7) into apoptosis: in all cases, apoptosis was significantly inhibited by coincubation with 10 ng / ml IL-15, shown by DNA laddering ( Fig. 2A) and PI flow cytometry ( Fig. 2B).

Wie bereits beschrieben (8), war die durch anti-Fas Antikörper induzierte T Zell Apoptose unabhängig von der Proteinsynthese. Demgegenüber war jedoch die IL-15 vermittelte Unterdrückung der anti-Fas Antikörper induzierten T Zell Apoptose streng Proteinsyntheseabhängig, so beeinflußte IL-15 die bereits induzierte Apoptose nicht mehr in Gegenwart von Aktinornycin D als Inhibitor der RNA und Proteinbiosynthese (Fig. 2C). Diese Ergebnisse der DNA-laddering Experimente stehen den Daten der Dexamethason induzierten T Zell Apoptose gegenüber, die ausschließlich in Abwesenheit von Aktinomycin D induziert werden konnte (Fig. 2C). Demzufolge moduliert IL-15 in breitem Rahmen apoptotische Mechanismen in T und B Zellen (1,9). Vorläufige Ergebnisse aus unserer Arbeitsgruppe deuten darauf hin, daß IL-15 auch die TNF-α induzierte Apoptose in transformierten, murinen L929 Fibroblasten hemmt, und daß es die Adriamycin- oder Etoposide-, nicht jedoch die γ-strahlungsinduzierte Apoptose in murinen T Blasten unterdrücken kann (Bulfone-Paus et al., unveröffentlichte Ergebnisse).As already described (8), T cell apoptosis induced by anti-Fas antibodies was independent of protein synthesis. In contrast, however, the IL-15 mediated suppression of the anti-Fas antibody-induced T cell apoptosis was strictly dependent on protein synthesis, so IL-15 no longer influenced the already induced apoptosis in the presence of actinornycin D as an inhibitor of RNA and protein biosynthesis ( FIG. 2C). These results of the DNA laddering experiments contrast with the data of dexamethasone-induced T cell apoptosis, which could only be induced in the absence of actinomycin D ( FIG. 2C). As a result, IL-15 widely modulates apoptotic mechanisms in T and B cells (1,9). Preliminary results from our group suggest that IL-15 also inhibits TNF-α induced apoptosis in transformed, murine L929 fibroblasts and that it suppresses adriamycin or etoposide, but not γ-radiation induced apoptosis in murine T blasts can (Bulfone-Paus et al., unpublished results).

3.) IL-15 inhibits apoptosis in an anti-Fas antibody induced Multicomponent system of short-term lethal liver failure

Um zu überprüfen, ob diese in vitro Effekte auch in vivo auftreten und um herauszufinden, ob die anti-apoptotischen Effekte von IL-15 sich auch über das lymphatische System hinaus erstrecken, haben wir die Modulation der anti-Fas Antikörper induzierten, multi-Systern Apoptose und des kurzfristig lethalen Leberversagens in Mäusen (10) nach systemischer Gabe von IL-15 untersucht. Anstatt IL-15 Zytokin mit seiner kurzen biologischen Halbwertszeit zu verwenden, haben wir zu diesem Zweck ein neues, chimäres Fusionsprotein aus humanem IL-15 und murinem IgG2b hergestellt (IL-15-IgG2b), das den Vorteil einer erheblich verlängerten biologischen Halbwertszeit bietet. Zur Herstellung des IL-15-IgG2b Fusionsproteins wurden grundsätzlich die gleichen Methoden zur Konstruktion und Produktion von Zytokin-lmmunglobulin Fusionsproteinen verwendet, die bereits bei der Erzeugung IL-2-IgG chimärer Proteine benutzt wurden (11). Vergleichsweise wurden Fusionproteine aus murinem IL-2 und murinem Immunglobulin G2b (IL-2-IgG2b) (11) in dem gleichen murinen Modell der durch anti-murines Fas induzierten, massiven Apoptose in zwei verschiedenen Mausstämmen getestet (BALB/c and C57BL/6). Die intraperitonealen Injektion von 100 µg von anti-murines Fas monoklonalem Antikörper (Jo2) verursachte innerhalb weniger Stunden fulminantes Leberversagen und Tod von BALB/c Mäusen, bedingt durch massive, Fas-vermittelte Apoptose der Hepatozyten, wie bereits beschrieben (10).To check whether these in vitro effects also occur in vivo and to find out whether the anti-apoptotic effects of IL-15 extend beyond the lymphatic system we have the modulation of anti-Fas antibody induced, multi-systems Apoptosis and short-term lethal liver failure in mice (10) after systemic Administration of IL-15 examined. Instead of IL-15 cytokine with its short biological To use half-life, we have a new chimeric for this purpose Fusion protein made from human IL-15 and murine IgG2b (IL-15-IgG2b), which the Advantage of a significantly extended biological half-life. To make the IL-15-IgG2b fusion protein were basically the same construction methods and production of cytokine-immunoglobulin fusion proteins already used in the Generation of IL-2 IgG chimeric proteins were used (11). Have been comparatively Fusion proteins from murine IL-2 and murine immunoglobulin G2b (IL-2-IgG2b) (11) in the same murine model of massive apoptosis induced by anti-murine Fas tested two different mouse strains (BALB / c and C57BL / 6). The intraperitoneal Injection of 100 µg of anti-murine Fas monoclonal antibody (Jo2) caused brilliant liver failure and death of BALB / c mice within a few hours, due to massive, Fas-mediated apoptosis of the hepatocytes, as already described (10).

In beeindruckender Weise verhinderte die simultane, intraperitoneale Injektion von 75 µg IL-15-IgG2b Fusionsprotein vollständig die anti-Fas-induzierte Apoptose der Hepatozyten und das Leberversagen, und führte zu einer 100%igen Überlebensrate der mit Fusionsprotein behandelten Mäuse, im Gegensatz zu 0% Überlebensrate der ausschließlich anti-Fas behandelten Tiere (Fig. 3A). Gleiche Ergebnisse wurden mit C57BLI5 Mäusen erhalten (Daten nicht gezeigt).Impressively, simultaneous intraperitoneal injection of 75 µg IL-15-IgG2b fusion protein completely prevented anti-Fas-induced hepatocyte apoptosis and liver failure, and resulted in a 100% survival rate of the mice treated with fusion protein, as opposed to 0 % Survival of the anti-Fas treated animals only ( Fig. 3A). Similar results were obtained with C57BLI5 mice (data not shown).

Dieser Effekt war abhängig von der applizierten Dosis, d. h. mit niedrigeren Konzentrationen an IL-15 Fusionsprotein konnte der anti-Fas induzierte Tod zwar nicht verhindert, sein Eintreten jedoch signifikant verzögert werden: in BALB/c Mäuse (n=5 Mäuse pro Gruppe) wurde 100 µg anti-murines Fas Antikörper (Jo2) und unterschiedliche Mengen an IL-15-IgG2b Fusionsprotein injiziert: 100 µg, 75 µg, 50 µg, 25 µg, 0 µg.This effect was dependent on the dose applied, i.e. H. with lower concentrations anti-Fas-induced death could not be prevented on IL-15 fusion protein However, onset is significantly delayed: in BALB / c mice (n = 5 mice per group) was 100 µg anti-murine Fas antibody (Jo2) and different amounts of IL-15-IgG2b fusion protein injected: 100 µg, 75 µg, 50 µg, 25 µg, 0 µg.

Bei Mäusen, die mit IL-15-IgG2b Fusionsprotein in Gegenwart von neutralisierendem anti- IL-15 Antikörper behandelt wurden, konnte kein protektiver Effekt festgestellt werden; so ist anzunehmen, daß die anti-apoptotischen Eigenschaften des Fusionsproteins durch seinen IL-15 Teil vermittelt werden. So verlängerte in der Tat die Injektion von nativem IL-15 (1 µg) in Verbindung mit anti-Fas Antikörper die Überlebensdauer der Testmäuse (n=5) im Vergleich zu Kontrollen, die nur anti-Fas Antikörper erhalten hatten (n=5), jedoch lediglich für einen Zeitraum von 6-12 Stunden (Daten nicht gezeigt).In mice treated with IL-15-IgG2b fusion protein in the presence of neutralizing anti IL-15 antibodies were treated, no protective effect could be determined; so is to assume that the anti-apoptotic properties of the fusion protein through its IL-15 part can be taught. Indeed, prolonged injection of native IL-15 (1 µg) in connection with anti-Fas antibody the survival time of the test mice (n = 5) in However, compared to controls that had only received anti-Fas antibodies (n = 5) for a period of 6-12 hours (data not shown).

Demgegenüber ergab sich nach Injektion von IL-2-IgG2b Fusionsprotein keinerlei protektiver Effekt (Fig. 3A-D). Zwar ist es nicht überraschend, daß das IL-2 Fusionsprotein die massive Apoptose der Hepatozyten nicht verhindern konnte, da Hepatozyten keine IL-2 Rezeptoren exprimieren, bemerkenswert ist jedoch, daß die anti-Fas induzierte Apoptose in Thymozyten und Splenozyten mit ihrer reichen Expression an IL-2 Rezeptor (12) nicht durch IL-2 Fusionsprotein beeinflußt wird.In contrast, there was no protective effect after injection of IL-2-IgG2b fusion protein ( FIGS. 3A-D). It is not surprising that the IL-2 fusion protein was unable to prevent the massive apoptosis of the hepatocytes, since hepatocytes do not express IL-2 receptors, but it is noteworthy that the anti-Fas-induced apoptosis in thymocytes and splenocytes is indicated with its rich expression IL-2 receptor (12) is not affected by IL-2 fusion protein.

Diese Ergebnisse unterstreichen einen weiteren funktionellen Unterschied zwischen IL-2 und IL-15 und zwar bezogen auf ihre verschiedenen Effekte auf die Apoptose in vivo, und verdeutlichen eine verwirrende Vielfalt der Mechanismen zur Apoptosemodulation durch IL-2 in vivo (13, 14). Da beide Fusionsproteine denselben IgG2b Teil enthalten,legen diese Ergebnisse nahe, daß dieser keinen wesentlichen Einfluß auf die Modulation der Apoptose besitzt. Leber, Milz und Thymus von Versuchs- und Kontrollmäusen wurden zum Zeitpunkt des Todes entnommen, bzw. spätestens sechs Stunden nach den anti-Fas Injektionen im Falle der überlebenden Tiere. Die aus Leber, Milz und Thymus extrahierte DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese auf mögliche Endonukleaseaktivität, sowie Gefrierschnitte der Gewebe mit der in situ - end-labeling TUNEL Technik zur Darstellung der Apoptose untersucht. In Fig. 3B ist repräsentativ gezeigt, wie die DNA aus allen Tieren, die lediglich mit anti-Fas Antikörper allein oder zusätzlich mit IL-2-IgG2b Fusionsprotein behandelt worden waren, fragmentiert war. Demgegenüber konnte nach gleichzeitiger Gabe von IL-15-IgG2b Fusionsprotein keinerlei DNA Fragmentierung gefunden werden, die eine massive Apoptose in Leber, Milz oder Thymus anzeigt (Fig. 3B). Eine Blockierung der IL-15-IgG2b Aktivität durch gleichzeitige in vivo Gabe von neutralisierendem, anti-IL-15 Antikörper stellte die anti-Fas induzierte DNA Fragmentierung wieder her (Fig. 3B). Diese Ergebnisse konnten durch morphologische Daten (TUNEL, Hoechst 33342 Färbung) bestätigt werden, die zeigen, daß Schnitte von Milz (Fig. 3C) und Leber (Fig. 3D) ebensowenige TUNEL-positive Zellen aufweisen wie die Kontrollschnitte.These results underscore another functional difference between IL-2 and IL-15 in terms of their different effects on apoptosis in vivo, and illustrate a confusing variety of mechanisms for apoptosis modulation by IL-2 in vivo (13, 14). Since both fusion proteins contain the same IgG2b part, these results suggest that this has no significant influence on the modulation of apoptosis. Liver, spleen and thymus from experimental and control mice were removed at the time of death or at the latest six hours after the anti-Fas injections in the case of the surviving animals. The DNA extracted from the liver, spleen and thymus was examined by agarose gel electrophoresis for possible endonuclease activity, as well as frozen sections of the tissue using the in situ - end-labeling TUNEL technique to demonstrate apoptosis. FIG. 3B representatively shows how the DNA from all animals that had been treated only with anti-Fas antibody alone or additionally with IL-2-IgG2b fusion protein was fragmented. In contrast, after simultaneous administration of IL-15-IgG2b fusion protein, no DNA fragmentation was found, which indicates massive apoptosis in the liver, spleen or thymus ( FIG. 3B). Blocking of IL-15-IgG2b activity by simultaneous in vivo administration of neutralizing, anti-IL-15 antibody restored the anti-Fas-induced DNA fragmentation ( FIG. 3B). These results could be confirmed by morphological data (TUNEL, Hoechst 33342 staining), which show that sections of the spleen ( FIG. 3C) and liver ( FIG. 3D) have just as little TUNEL-positive cells as the control sections.

Dies steht im Gegensatz zum dramatischen Ausmaß der Apoptose von Splenozyten und Hepatozyten, in Gewebsschnitten aus Milz (Fig. 3C) und Leber (Fig. 3D) von Mäusen, die nur mit anti-Fas allein behandelt worden waren. Die Hemmung der anti-Fas induzierten Apoptose in Leberschnitten von IL-15-IgG2b behandelten Mäusen war mit einer Bcl-2 Immunoreaktivität assoziiert, vergleichbar der in Kontrolltieren (Daten nicht gezeigt). This is in contrast to the dramatic extent of splenocyte and hepatocyte apoptosis, in tissue sections from spleen ( Fig. 3C) and liver ( Fig. 3D) from mice that had been treated only with anti-Fas alone. Inhibition of anti-Fas induced apoptosis in liver sections from IL-15-IgG2b treated mice was associated with Bcl-2 immunoreactivity comparable to that in control animals (data not shown).

Demzufolge korrelieren die Effekte von IL-15 auf die induzierte Apoptose in humanen T und B Zellen in vitro (Fig. 1, 2) mit der Unterdrückung des experimentell induzierten programmierten Zelltodes im murinen Thymus und der Milz durch ein IL-15 Fusionsprotein in vivo (Fig. 3). Darüberhinaus wurde die lethale Apoptose von epithelialen Zellen (Hepatozyten) in vivo vollständig durch den IL-15 Teil dieses Fusionsproteins gehemmt, dieses zeigt, daß die anti-apoptotischen Eigenschaften von IL-15 über das lymphatische System hinausgehen.Accordingly, the effects of IL-15 (Fig. 1, 2) correlate to the induced apoptosis in human T and B cells in vitro with the suppression of experimentally induced programmed cell death in the murine thymus and spleen by an IL-15 fusion protein in vivo ( Fig. 3). Furthermore, lethal apoptosis of epithelial cells (hepatocytes) was completely inhibited in vivo by the IL-15 part of this fusion protein, which shows that the anti-apoptotic properties of IL-15 go beyond the lymphatic system.

Die Signalübertragungswege, auf denen IL-15 in die Kontrollmaschinerie der Apoptose eingreift, z. B. in Lymphozyten und Hepatozyten, müssen erst noch geklärt werden. Immerhin zeigen unsere Ergebnisse, daß IL-15 den induzierenden Effekt zum programmierten Zelltod einer Reihe wichtiger, physiologischer Stimuli hemmt, und daß zumindest zur Unterdrückung der Fas-vermittelten Apoptose in humanen Lymphozyten de novo Proteinsynthese erforderlich ist. In Verbindung mit den verschiedenen Mechanismen der Lymphozytenapoptose, die von IL-15 in vitro unterbunden werden, legt dies die Vermutung nahe, daß IL-15 seinen anti-apoptotischen Effekt durch Modulation allgemeiner Schlüsselelemente der Apoptosekontrolle ausübt, die durch unterschiedlichste Zellpopulationen und die Apoptose regulierende Systeme verwendet werden; als Beispiel seien die Mitglieder der Bcl-2 und/oder der ICE-Familien der Apoptosekontrollproteine genannt (1, 9).The signaling pathways on which IL-15 is used in the control machinery of apoptosis intervenes, e.g. B. in lymphocytes and hepatocytes, have yet to be clarified. After all, our results show that IL-15 has the inducing effect for programmed cell death inhibits a number of important physiological stimuli, and that at least to suppress Fas-mediated apoptosis in human lymphocytes novo protein synthesis is required. In connection with the different mechanisms lymphocyte apoptosis, which is prevented by IL-15 in vitro It is suspected that IL-15 is more general in modulating its anti-apoptotic effect Key elements of apoptosis control exerted by various Cell populations and apoptosis regulating systems are used; as an an example be the members of the Bcl-2 and / or the ICE families of the apoptosis control proteins called (1, 9).

Zusammengefaßt belegt die vorliegende Studie IL-15 als einen potenten, allgemeinen Inhibitor der Apoptose in vivo und in vitro. Mit hoher Wahrscheinlichkeit besitzen IL-15 und IL-15 Fusionsproteine ein sehr vielversprechendes therapeutisches Potential, nicht nur in der Hemmung der Lymphozytenapoptose, beispielsweise bei einer HIV Infektion, sondern vielmehr auch zur Behandlung eines Organversagens oder Atrophie aufgrund überhöhter Apoptose, z. B. bei kurzfristig toxischen, lethalen Leberversagen und bei neurodegenerativen Prozessen (15). In summary, the present study proves IL-15 as a potent, general one Inhibitor of apoptosis in vivo and in vitro. There is a high probability that IL-15 and IL-15 fusion proteins have a very promising therapeutic potential, not only in the inhibition of lymphocyte apoptosis, for example in the case of HIV infection, but rather also for the treatment of organ failure or atrophy due to excessive Apoptosis, e.g. B. in short-term toxic, lethal liver failure and neurodegenerative processes (15).

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Fig. 1 IL-15 hemmt die Apoptose in aktivierten B Zellen. (A) Agarosegel Electrophorese von DVA, extrahiert aus humanen B Zellen, die für 48 Stunden mit 10 ng/ml PMA stimuliert wurden und nachfolgend 12 Stunden mit Medium (Spur 1) oder 10 ng/ml rekombinantem humanen IL-15 (Spur 2) oder 250 ng/ml anti-Fas (anti-APO-1/FAS) (Spur 3) oder anti-Fas und IL-15 (Spur 4) oder 0,1 µg/ml anti-humanen IgM (Spur 5) oder anti-humanen IgM und IL-15 (Spur 6) oder anti-humanen IgM und einem 1 pM Dexametason (Dex) (Spur 7) oder einem anti humanen IgM in Kombination mit Dexamtetason und IL-15 (Spur 8) behandelt wurden. (B) DNA fluoreszenz-cytometrische Profile von Pl-gefärbten, aktivierten B Zellen die, die gleichen experimentellen Bedingungen wie unter A beschrieben, durchlaufen haben. Die Ergebnisse wurden in drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten erhalten, die B Zell Präperation erfolgten von verschiedenen Tonsillen. Fig. 1 IL-15 inhibits apoptosis in activated B cells. (A) Agarose gel electrophoresis from DVA, extracted from human B cells stimulated with 10 ng / ml PMA for 48 hours and subsequently with medium (lane 1) or 10 ng / ml recombinant human IL-15 (lane 2) for 12 hours or 250 ng / ml anti-Fas (anti-APO-1 / FAS) (lane 3) or anti-Fas and IL-15 (lane 4) or 0.1 µg / ml anti-human IgM (lane 5) or anti -human IgM and IL-15 (lane 6) or anti-human IgM and a 1 pM dexametasone (Dex) (lane 7) or an anti-human IgM in combination with dexam etasone and IL-15 (lane 8) were treated. (B) DNA fluorescence-cytometric profiles of Pl-stained, activated B cells which have undergone the same experimental conditions as described under A. The results were obtained in three experiments carried out independently of one another, the B cell preparation was carried out from different tonsils.

Fig. 2 IL-15 schützt aktivierte T Zellen vor der Apoptose. (A)10 µg/ml ConA-aktivierte humane T-Blasten werden für 12 Stunden in Anwesenheit von Medium alleine (Spur 1), oder 10 µg/ml rekombinanten humanen IL-15 (Spur 2) oder anti-Fas Antikörpern (Spur 3) oder anti-Fas plus IL-15 (Spur 4) oder 10 µg/ml anti-CD3 (Spur 5) oder anti-CD3 plus IL-15 (Spur 6) oder 0,1 µM Dex (Spur 7) oder Dex plus IL-15 (Spur 8) kultiviert. Die Fragmentation der DNA wurde mittels Elektrophorese auf einem 2% Agaraosegel analysiert. (B) DNA FACS-Analyse von Pl gefärbten ConA-aktivierten humanen T-Lymphoblasten nach 12 Stunden Inkubation unter den gleichen experimentelle Bedingungen wie oben beschrieben. (C) Das DNA Degratationsassay erfolgt zum Nachweis der Apoptose in aktivierten T-Zellen, die für 12 Stunden in Medium (Spur 1, 7) IL-15 (Spur 2, 8) anti-Fas (Spur 3, 9) anti-Fas und IL-15 (Spur 4, 10) Dex (Spur 5, 11) oder Dex und IL-15 (Spur 6, 12) in Abwesenheit (Spur 1 bis 6) oder in Anwesenheit (Spur 7 bis 12) von 50 ng/ml Actinomycin D (GIBCO BRL, Grand Island, N. Y.) behandelt wurden. Die Abbildungen zeigen representative Ergebnisse von mindestens drei unabhängig durchgeführten Experimenten pro Gruppe, wobei humane T-Zellen von drei verschiedenen Spendern benutzt wurden. Fig. 2 IL-15 protects activated T cells from apoptosis. (A) 10 µg / ml ConA-activated human T-blasts are used for 12 hours in the presence of medium alone (lane 1), or 10 µg / ml recombinant human IL-15 (lane 2) or anti-Fas antibodies (lane 3 ) or anti-Fas plus IL-15 (lane 4) or 10 µg / ml anti-CD3 (lane 5) or anti-CD3 plus IL-15 (lane 6) or 0.1 µM Dex (lane 7) or Dex plus IL-15 (lane 8) cultivated. The fragmentation of the DNA was analyzed by electrophoresis on a 2% agaraose gel. (B) DNA FACS analysis of Pl stained ConA-activated human T lymphoblasts after 12 hours of incubation under the same experimental conditions as described above. (C) The DNA degradation assay is carried out for the detection of apoptosis in activated T cells which are anti-Fas (lane 3, 9) anti-Fas in medium (lane 1, 7) IL-15 (lane 2, 8) for 12 hours and IL-15 (lane 4, 10) Dex (lane 5, 11) or Dex and IL-15 (lane 6, 12) in the absence (lane 1 to 6) or in the presence (lane 7 to 12) of 50 ng / ml actinomycin D (GIBCO BRL, Grand Island, NY). The figures show representative results from at least three independently performed experiments per group, using human T cells from three different donors.

Fig. 3 IL-15 Fusionsproteine schützen Zellen vor anti-Fas Antikörper vermittelter Apoptose in vivo. (A) Bei BALB/c Mäusen wurden mit 100 µg anti-Fas Antikörper (Jo2) allein, oder in Kombination mit 100 oder 50 µg IL-15-IgG2b Fusionsprotein oder in Kombination mit 100 µg IL-2-IgG2b und 100 µg mit neutralisierendem anti-IL-15 Antikörper (MIll) oder mit 50 µg IL-2-IgG2b Fusionsprotein behandelt. Die nichtbehandelten Mäuse (Ergebnisse nicht gezeigt) dienten als zusätzliche Kontrollen, deren Überlebenszeit betrug 100% in 24 Stunden. Pro Test und Kontrollgruppe wurden in allen Experimenten 5 Mäuse analysiert, die Experimente wurden mindestens zweimal wiederholt. Die gezeigten Daten sind Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten. (B) DNA Degratationsanalyse von suspensierten Zellen der Milz, Leber und des Thymus von Kontrollmäusen (Spur b bis d) oder anti-Fas (Spur e bis g) oder anti-Fas plus 100 µg IL-15-IgG2b (Spur h bis j) oder anti- Fas plus 50 µg IL-15-IgG2b (Spur k bis m) oder anti-Fas plus 100 µg IL-15-IgG2b und 100 µg anti-IL-15 Antikörper (Spur n bis p) und anti-Fas plus IL-2-IgG2b (Spur q bis s) behandelten Mäusen. Spur a zeigt eine Standard 1 kb Leiter. In-situ-end-labeling - (TUNEL) (grüne Kerne entsprechen apoptotischen Zellen) und Hoechst 33342 (blaue Kerne)- Färbung von Leber- und Milz-Kryoschnitten der Mäuse, die entsprechend der Beschreibung unter 3A behandelt wurden. Fig. 3 IL-15 fusion proteins protect cells from anti-Fas antibody-mediated apoptosis in vivo. (A) In BALB / c mice, 100 µg anti-Fas antibody (Jo2) was used alone, or in combination with 100 or 50 µg IL-15-IgG2b fusion protein or in combination with 100 µg IL-2-IgG2b and 100 µg neutralizing anti-IL-15 antibody (MIll) or treated with 50 µg IL-2-IgG2b fusion protein. The untreated mice (results not shown) served as additional controls, their survival time was 100% in 24 hours. In each experiment, 5 mice were analyzed per test and control group; the experiments were repeated at least twice. The data shown are the results of three independent experiments. (B) DNA degradation analysis of suspected cells of the spleen, liver and thymus from control mice (lane b to d) or anti-Fas (lane e to g) or anti-Fas plus 100 µg IL-15-IgG2b (lane h to j ) or anti-Fas plus 50 µg IL-15-IgG2b (lane k to m) or anti-Fas plus 100 µg IL-15-IgG2b and 100 µg anti-IL-15 antibody (lane n to p) and anti-Fas plus IL-2-IgG2b (lane q to s) treated mice. Lane a shows a standard 1 kb ladder. In-situ end-labeling - (TUNEL) (green nuclei correspond to apoptotic cells) and Hoechst 33342 (blue nuclei) - staining of liver and spleen cryosections of the mice, which were treated as described under 3A.

Fig. 4 Die Hemmung der anti-Fas induzierten Apoptose in vivo durch das IL-15-IgG2b Fusionsproteins ist abhängig von dem IL-15 Teil. Mäuse wurden behandelt mit 100 µg anti- Fas Antikörpern (Jo2) entweder in Kombination mit 100 mg oder 50 µg IL-15-IgG2b Fusionsprotein oder 100 µg IL-15-IgG2b und 100 µg anti-IL-15 Antikörper oder 50 µg IL-2-IgG2b Fusionsprotein. Die histometrische Quantifikation der apoptotischen Zellen (Fig. 3C und 3D) wurde bei einer 400-fachen Vergrößerung durchgeführt, in dem 10 Felder nach TUNEL-positiven Zellen ausgezählt wurden. A repräsentiert Leberschnitte, B Milzschnitte. Fig. 4 The inhibition of anti-Fas induced apoptosis in vivo by the IL-15-IgG2b fusion protein is dependent on the IL-15 part. Mice were treated with 100 µg anti-Fas antibodies (Jo2) either in combination with 100 mg or 50 µg IL-15-IgG2b fusion protein or 100 µg IL-15-IgG2b and 100 µg anti-IL-15 antibodies or 50 µg IL- 2-IgG2b fusion protein. The histometric quantification of the apoptotic cells (FIGS . 3C and 3D) was carried out at a 400-fold magnification, in which 10 fields were counted for TUNEL-positive cells. A represents liver sections, B spleen sections.

Claims

1. Agent for preventing cell apoptosis in diseases, characterized in that it contains interleukin-15, its derivatives, interleukin-15 fusion proteins or substances coupled to the interleukin-15 receptor.

2. Composition according to claim 1, characterized in that it contains the fusion protein IL15-IgG2b.

3. Use of the agent according to claim 1 or 2 for Prevention of cell apoptosis.

4. Use according to claim 3 in virus-caused Inflammation of the liver.

5. Use according to claim 3 in HIV infections.

6. Use according to claim 3 in radiation-induced Damage.

7. Use according to claim 3 in neurodegenerative Diseases.

8. Use according to claim 3 for toxic damage.