DE19823079A1 - A method to detect mutations associated with pancreatitis - Google Patents

A method to detect mutations associated with pancreatitis

Info

Publication number
DE19823079A1
DE19823079A1 DE19823079A DE19823079A DE19823079A1 DE 19823079 A1 DE19823079 A1 DE 19823079A1 DE 19823079 A DE19823079 A DE 19823079A DE 19823079 A DE19823079 A DE 19823079A DE 19823079 A1 DE19823079 A1 DE 19823079A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
mutation
primer
pcr
specific
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE19823079A
Other languages
German (de)
Inventor
Joachim Moessner
Volker Keim
Kurt Engeland
Niels Teich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Leipzig
Original Assignee
Universitaet Leipzig
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Leipzig filed Critical Universitaet Leipzig
Priority to DE19823079A priority Critical patent/DE19823079A1/en
Publication of DE19823079A1 publication Critical patent/DE19823079A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A method to detect a mutation associated with pancreatitis comprises DNA extraction by standard protocols and then: a gene specific polymerase chain reaction (PCR), where exon 2 of the cationic trypsinogen is amplified out; purification of the PCR product; use of three primers, which are a reverse primer, a forward control primer and a mutation specific primer that hybridizes specifically to the product of the gene specific PCR; and detection by hybridization through acrylamide gel electrophoresis or a similar method.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum vereinfachten Nachweis einer krankheits­ assoziierten Mutation bei hereditärer Pankreatitis.The invention relates to a method for the simplified detection of a disease associated mutation in hereditary pancreatitis.

Die Pankreatitis ist eine entzündliche Erkrankung der Bauchspeicheldrüse. Die Ursache liegen im wesentlichen in chronischem Alkoholgenuß sowie in Gallengangs­ steinen, die Ausführungsgang der Bauchspeicheldrüse verschließen und vermutlich hierdurch zu einer Entzündung führen. Darüber hinaus gibt es seltene Formen wie z. B. die hereditäre Pankreatitis. Bei dieser Erkrankung leiden die Betroffenen von früher Jugend an unter Bauchbeschwerden, Übelkeit und Brechreiz. Darüber hinaus kann sich frühzeitig ein Diabetes mellitus (Zuckererkrankung) entwickeln. Bei einer nicht unwesentlichen Anzahl von Erkrankten manifestieren sich die Beschwerden jedoch erst im frühen Erwachsenenalter, so daß es schwierig ist, diese Erkrankung von einer Pankreatitis anderer Genese abzugrenzen.Pancreatitis is an inflammatory disease of the pancreas. The The main cause is chronic alcohol consumption and bile duct stones that occlude the pancreatic duct and presumably this leads to inflammation. In addition, there are rare forms such as e.g. B. Hereditary pancreatitis. In this disease, those affected suffer from early adolescence with abdominal discomfort, nausea and nausea. Furthermore Diabetes mellitus (sugar disease) can develop early. At a The symptoms manifest themselves in a not insignificant number of sufferers however, only in early adulthood, so it is difficult to get this disease distinguish it from pancreatitis of a different origin.

Wesentliche Risikofaktoren der hereditären Pankreatitis sind Mutationen in den Exonen 2 und 3 des kationischen Trypsinogen, welche vermutlich zu einer ver­ längerten oder verstärkten Aktivität des Trypsinogens im Pankreas führen und über diesen Weg die Erkrankung auslösen können. Die bekannte Mutation im Exon 2 des kationischen Trypsinogens liegt als A→T Punktmutation am Nucleotid 131945 im T- Zell-Rezeptor-beta-Locus vor. Es ist durch Arbeiten von Gorry et al., Gastroenterology 1997 sowie von Teich et al., Human Mutation, bekannt, daß diese Mutation als krankheitassoziierte Mutation bei hereditärer Pankreatis anzusehen ist. Der Nachweis der Mutation erfolgt durch direkte SNA-Sequentierung.Essential risk factors of hereditary pancreatitis are mutations in the Exons 2 and 3 of the cationic trypsinogen, which presumably lead to a ver prolonged or increased activity of the trypsinogen in the pancreas this way can trigger the disease. The known mutation in exon 2 of the cationic trypsinogen is located as an A → T point mutation on nucleotide 131945 in T- Cell receptor beta locus. It is through work by Gorry et al., Gastroenterology 1997 and from Teich et al., Human Mutation, known that this mutation as  disease-associated mutation in hereditary pancreatis. Of the The mutation is detected by direct SNA sequencing.

Die direkte DNA-Sequenzierung ist eine Methodik, die Basenfolge in einem DNA- Strang zu analysieren. Es ist zur erstmaligen genauen Charakterisierung einer Mutation das heute einzig durchgeführte Verfahren.Direct DNA sequencing is a methodology that bases sequences in a DNA Analyze strand. It is for the first precise characterization of a Mutation is the only procedure carried out today.

Die bekannte Methodik hat einige Nachteile. So ist die direkte DNA-Sequenzierung eine arbeits- und kostenaufwendige Methode. Es ist der bisher einzige praktizierte Nachweis für die bezeichnete Mutation. Sie ist in der Routineanalytik nicht einsetzbar aufgrund des ungewöhnlich hohen Aufwandes. Dieser besteht einmal in der Gerä­ tetechnik - es ist ein DNA-Sequencer erforderlich - ferner in hohen Kosten an Verbrauchsmaterial, einer aufwendigen Ausbildung des Personals und dem notwendig hohen Zeitbedarf.The known methodology has some disadvantages. This is the direct DNA sequencing a labor-intensive and costly method. It is the only one practiced so far Proof of the designated mutation. It cannot be used in routine analysis due to the unusually high effort. This consists once in the device tetechnik - a DNA sequencer is required - also at high cost Consumables, extensive training of the staff and the necessary high time requirement.

Die Ursachen der Nachteile sind darin begründet, daß zum Nachweis einer gut charakterisierten Punktmutation das Verfahren der DNA-Sequenzierung einen unnötigen Informationsüberschuß ergibt. Letztlich reicht der Nachweis der Ver­ änderung einer einzigen Base aus, um die krankheitsassoziierte Mutation bei hereditärer Pankreatitis zu erkennen.The causes of the disadvantages are based on the fact that it is good point mutation characterized the method of DNA sequencing results in unnecessary excess information. Ultimately, proof of ver change a single base to contribute to the disease-associated mutation to recognize hereditary pancreatitis.

Die Erfindung hat das Ziel, ein wenig aufwendiges, in der Routine einsetzbares und praktikables Verfahren zum Nachweis einer krankheitsassoziierten Punktmutation bei hereditärer Pankreatitis auszuarbeiten und zu empfehlen. Der Einsatz teurer Geräte­ technik soll vermindert werden. Die Kosten an Verbrauchsmaterial sollen gesenkt werden, der Arbeitszeitaufwand qualifizierter Mitarbeiter soll sich deutlich vermindern.The invention has the aim of being a little complex and routine practical method for the detection of a disease-associated point mutation Develop and recommend hereditary pancreatitis. The use of expensive devices technology should be reduced. The cost of consumables should be reduced  the workload of qualified employees should decrease significantly.

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein Verfahren anzugeben, das die notwendigen Informationen zur Diagnose der hereditären Pankreatitis bereitstellt und sich auf diese konzentriert und beschränkt.The invention has for its object to provide a method that the necessary Provides information on and diagnoses hereditary pancreatitis concentrated and limited.

Die Aufgabe der Erfindung wird wie folgt gelöst.
Im ersten Schritt der Durchführung des Verfahrens wird zunächst in an sich bekannter Weise die DNA-Extraktion entsprechend Standardprotokollen durchgeführt. Die extrahierte genomische DNA stellt die Grundlage der weiteren Untersuchungen dar.The object of the invention is achieved as follows.
In the first step of carrying out the method, the DNA extraction is first carried out according to standard protocols in a manner known per se. The extracted genomic DNA forms the basis for further investigations.

In einem zweiten Schritt wird eine genspezifische Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Hierbei wird das Exon 2 des kationischen Trypsinogens aus der hochgradig homologen Trypsinogenfamilie herausamplifiziert, daß es isoliert untersucht werden kann. Dabei können sehr viele verschiedene Primersequenzen Ver­ wendung finden. Es muß lediglich sicher sein, daß ausschließlich die Region des Gens des kationischen Trypsinogens amplifiziert wird. Das geschieht, indem man beispielsweise die in Tabelle 1 genannten genspezifischen Primer in einem Reaktionsansatz verwendet.In a second step, a gene-specific polymerase chain reaction (PCR) carried out. Here, exon 2 of the cationic trypsinogen is derived from the highly homologous trypsinogen family amplified to isolate it can be examined. A large number of different primer sequences Ver find application. It only has to be certain that only the region of the Gene of the cationic trypsinogen is amplified. This is done by for example the gene-specific primers listed in Table 1 in one Reaction approach used.

Im dritten Schritt wird das PCR-Produkt gereinigt. Dazu läßt sich erfolgreich der PCR Purification Kit von Quiagen einsetzen. Die Reinigung ist insbesondere zur Eliminie­ rung genomischer DNA erforderlich, so daß für den nächsten Schritt ausschließlich PCR-Produkt der genspezifischen PCR zur Verfügung steht. In the third step, the PCR product is cleaned. For this, the PCR can be successfully Use Quiagen Purification Kit. The cleaning is especially for elimination tion of genomic DNA is required so that for the next step exclusively PCR product of gene-specific PCR is available.  

Nunmehr wird eine mutationsspezifische PCR als eigentlicher Gegenstand der Erfindung durchgeführt. Es wird mit drei Primern gearbeitet, wie in Abb. 1 dargestellt. Zusammen mit einem "Rückwärtsprimer" und einem "Vorwärtsprimer" wird ein "mutationsspezifischer Primer" eingesetzt. Letzterer kann nur dann am Produkt der genspezifischen PCR binden, wenn die oben beschriebene Mutation des Exons 2 vorliegt. Mit Hilfe dieser Primer wird dann eine PCR durchgeführt, wobei die Vervielfältigung des DNA-Abschnittes zwischen "Rückwärts"- und "Vorwärtsprimer" immer, jedoch zwischen "mutationsspezifischem Primer" und dem "Rückwärtsprimer" nur bei Vorliegen der Mutation erfolgt. Folglich werden im Fall der Mutation in der anschließenden durchgeführten Acrylamidgelelektrophorese zwei Banden mit 117 und 165 Basenpaaren sichtbar, während bei Nichtvorliegen nur die Kontrollbande von 163 Baasenpaaren erscheint. Im übrigen ist die Auswahl des "vorwärts"- und des "rückwärts"-Primers ist nur insofern beschränkt, als sie mit dem Produkt der genspezifischen PCR binden (hybridisieren) müssen, prinzipiell könnte man auch andere Primersequenzen oberhalb und unterhalb der mutationstragenden Position auswählen.A mutation-specific PCR is now carried out as the actual subject of the invention. Three primers are used, as shown in Fig. 1. A "mutation-specific primer" is used together with a "reverse primer" and a "forward primer". The latter can only bind to the product of gene-specific PCR if the mutation of exon 2 described above is present. A PCR is then carried out with the aid of these primers, the duplication of the DNA section between “reverse” and “forward primer” always taking place, but between “mutation-specific primer” and the “reverse primer” only when the mutation is present. Consequently, in the case of the mutation, two bands with 117 and 165 base pairs are visible in the subsequent acrylamide gel electrophoresis, whereas only the control band of 163 base pairs appears if none is present. For the rest, the choice of the "forward" and the "backward" primer is limited only insofar as they have to bind (hybridize) with the product of the gene-specific PCR, in principle one could also select other primer sequences above and below the mutation-bearing position.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung verfährt man im vierten Schritt des Verfahrens derart, daß man zur mutationsspezifischen PCR die dem zweiten DNA- Strang komplementären Primer verwendet. Auch bei dieser Variante muß sich das mutierte Nucleotid am 3'-Ende des Primers befinden. Die Sequenzen der alternativen Primer sind in Tabelle 1 angegeben.In a second embodiment of the invention, the fourth step of Method in such a way that for mutation-specific PCR the second DNA Strand uses complementary primers. With this variant, too mutated nucleotide at the 3 'end of the primer. The sequences of the alternative Primers are given in Table 1.

Die Erfindung wird nachstehend an zwei Ausführungsbeispiel erläutert.The invention is explained below using two exemplary embodiments.

1. Beispiel1st example

Der erste Schritt besteht in einer DNA-Extraktion aus EDTA-Blut (Leukozyten) die mit dem Micromix Ultra Fast Genomic DNA Extraction Kit (TALENT / Italien) nach Angaben des Herstellers durchgeführt wird.The first step is a DNA extraction from EDTA blood (leukocytes) with the the Micromix Ultra Fast Genomic DNA Extraction Kit (TALENT / Italy) Manufacturer's information is carried out.

Im zweiten Schritt erfolgt die genspezifische Polymerasekettenreaktionen, die beiden eingesetzten Primer finden sich in Tabelle 1 ("genspezifischer Vorwärtsprimer", "genspezifischer Rückwärtsprimer"). Alle PCR-Reaktionen werden mit dem GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Eimer) durchgeführt. Diese genspezifische PCR erfolgt mit 45 mM MgCl2, 200 fmol Primer und unter folgendem Temperaturprofil: ein 2 min Denaturierungsschritt bei 94°C, danach 35 Zyklen der PCR-Reaktion mit 20 sec bei 94°C, 30 s bei 52°C und 45 s bei 72°C. Am Ende der Zyklen wird für 7 min bei 72°C inkubiert.In the second step, the gene-specific polymerase chain reactions take place; the two primers used can be found in Table 1 ("gene-specific forward primer", "gene-specific reverse primer"). All PCR reactions are carried out with the GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer). This gene-specific PCR is carried out with 45 mM MgCl 2 , 200 fmol primer and under the following temperature profile: a 2 min denaturation step at 94 ° C, then 35 cycles of the PCR reaction with 20 sec at 94 ° C, 30 s at 52 ° C and 45 s at 72 ° C. At the end of the cycles, incubate at 72 ° C for 7 min.

Der dritte Schritt besteht in der Reinigung des PCR-Produkts von den übrigen Bestandteilen dieser genspezifischen PCR, der mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen/BRD) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt wird.The third step is to clean the PCR product from the rest Components of this gene-specific PCR, which is included in the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen / FRG) is carried out according to the manufacturer's instructions.

Der vierte Schritt besteht in der Durchführung der "mutationsspezifischen" PCR. Dieser erfolgt mit der AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin EImer/USA). Das Reaktionsvolumen von 20 µl enthält 6 pg gereinigtes PCR-Produkt des ersten PCR-Reaktion, 45 mM MgCl2, 200 fmol "Vorwärtsprimer", 200 fmol "mutationsspezifischer Primer", 400 fmol "Rückwärtsprimer" (Primersequenzen siehe Tabelle 1) und 125 mM eines jeden dNTP. Es wird der vom Hersteller der Polymerase empfohlene Reaktionspuffer verwandt. Das Temperaturprofil besteht aus 35 Zyklen mit folgenden Profil: 15 s bei 94°C, 30 s bei 65°C und 20 s bei 72°C. Anschließend erfolgt eine Extension von 7 min bei 72°C. Etwa 10 µl des PCR-Produktes werden auf ein vertikales 18% Polyacrylamidgel aufgetragen. Der Elektrophorese (4 Stunden; 70 Volt) folgte eine Silberfärbung entsprechend Standardprotokollen (Sommerville 1981).The fourth step is to carry out the "mutation-specific" PCR. This is done with the AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer / USA). The reaction volume of 20 ul contains 6 pg of purified PCR product of the first PCR reaction, 45 mM MgCl 2 , 200 fmol "forward primer", 200 fmol "mutation-specific primer", 400 fmol "backward primer" (primer sequences see Table 1) and 125 mM of every dNTP. The reaction buffer recommended by the manufacturer of the polymerase is used. The temperature profile consists of 35 cycles with the following profile: 15 s at 94 ° C, 30 s at 65 ° C and 20 s at 72 ° C. This is followed by an extension of 7 min at 72 ° C. About 10 µl of the PCR product is applied to a vertical 18% polyacrylamide gel. The electrophoresis (4 hours; 70 volts) was followed by silver staining according to standard protocols (Sommerville 1981).

Bei Vorliegen der Exon 2-Mutation findet sich auf dem Polyacrylamidgel zwei Banden mit 117 und 163 Nukleotiden, besteht keine Mutation zeigt das Acylamidgel nur eine einzige Bande von 163 Nukleotiden. Somit läßt sich anhand des Vorliegens von 2 Banden die Diagnose einer hereditären Pankreatitis mit Exon 2-Mutante sichern.If the exon 2 mutation is present, two bands are found on the polyacrylamide gel with 117 and 163 nucleotides, there is no mutation, the acylamide gel shows only one only band of 163 nucleotides. Thus, based on the presence of 2 Secure the diagnosis of hereditary pancreatitis with exon 2 mutant.

2. Beispiel2nd example

Im zweiten Beispiel soll das alternative Verfahren erläutert werden. Es besteht darin, daß die DNA-Extration als auch die genspezifische PCR identisch wie beim o. g. Verfahren durchgeführt wird. Als Besonderheit werden jedoch im vierten Schritt bei der mutationsspezifischen PCR die in Tabelle 1 genannten alternativen Primer (alternativer Rückwärtsprimer, alternativer mutationsspezifischer Primer, alternativer Vorwärts­ primer) verwandt. Die Bedingungen der PCR-Reaktion als auch der Nachweis der Banden in einem Polyacrylamidgel sind identisch wie beim erstgenannten Verfahren. Auch hier finden sich nur dann zwei Banden auf dem Polyacrylamidgel, wenn die Mutation in Exon n2 des Trypsinogens vorliegt.In the second example, the alternative method will be explained. It is, that the DNA extraction as well as the gene-specific PCR are identical to those of the above. Procedure is carried out. As a special feature, however, the fourth step in the mutation-specific PCR, the alternative primers listed in Table 1 (alternative Reverse primer, alternative mutation-specific primer, alternative forward primer) related. The conditions of the PCR reaction as well as the detection of the Bands in a polyacrylamide gel are identical to the first method. Again, there are only two bands on the polyacrylamide gel if the There is a mutation in exon n2 of the trypsinogen.

Die technisch-ökonomischen Vorteile der Erfindung sind offensichtlich.The technical-economic advantages of the invention are obvious.

Es wurde ein Verfahren zum Nachweis einer Punktmutation bei hereditärer Pankreatitis beschrieben. Es ist kein anderes Verfahren zum vereinfachten Nachweis dieser Mutation bekannt. Unser Verfahren ist der direkten DNA-Sequenzierung ökonomisch überlegen, in der Anwendung einfacher und weniger Arbeitszeit erfordernd und mit einer molekularbiologischen Basisausstattung in jedem molekular­ biologischen Labor einfach reproduzierbar. Die zahlreichen Indikationen zur Untersuchung von Patienten-DNA auf die beschriebene Mutation geben dem Einsatz des beschriebenen Verfahrens in der Routinediagnostik ein besonderes Gewicht. A method for the detection of a point mutation in hereditary Pancreatitis. It is not another simplified verification method known of this mutation. Our method is direct DNA sequencing Economically superior, easier to use and less working time required and with basic molecular biology in every molecular  biological laboratory easily reproducible. The numerous indications for Examination of patient DNA for the described mutation give the use the procedure described in routine diagnostics is particularly important.  

Tabelle 1: Sequenzen der PrimerTable 1: Sequences of the primers

Genspezifische PCR:
Gene specific PCR:

Genspezifischer "Vorwärtsprimer": 5'-ccc aaa atc ttg cat ttg ac-3'
Genspezifischer "Rückwärtsprimer": 5'-aca gtt agc aga ggt aga gtg-3'
Gene specific "forward primer": 5'-ccc aaa atc ttg cat ttg ac-3 '
Gene specific "reverse primer": 5'-aca gtt agc aga ggt aga gtg-3 '

Mutationsspezifische PCR:
Mutation-specific PCR:

"Vorwärtsprimer": 5'-ctt ccc atc tcc act cca gtt-3'
Mutationsspezifischer Primer: 5'-aga tcg ttg ggg gct aca t-3'
"Rückwärtsprimer": 5'-ctg ctg ata cca ccc act gtt-3'
"Forward primer": 5'-ctt ccc atc tcc act cca gtt-3 '
Mutation-specific primer: 5'-aga tcg ttg ggg gct aca t-3 '
"Backward primer": 5'-ctg ctg ata cca ccc act gtt-3 '

Alternative mutationsspezifische PCR:
Alternative mutation-specific PCR:

Alternativer "Vorwärtsprimer": 5'-tgg tca tgg cca ggt cta tgc-3'
Alternativer mutationsspezifischer Primer: 5'-gga cag aat tct cct cac aga-3
Alternativer "Rückwärtsprimer" 5'-ctg ctg ata cca ccc act gtt-3'Alternative "forward primer": 5'-tgg tca tgg cca ggt cta tgc-3 '
Alternative mutation-specific primer: 5'-gga cag aat tct cct cac aga-3
Alternative "reverse primer"5'-ctg ctg ata cca ccc act gtt-3 '

Claims (2)

1. Verfahren zum Nachweis einer Mutation bei Pankreatitis nach einer Methodik, die sich an einen ersten Verfahrensschritt einer DNA-Extraktion nach Standardprotokoll anschließt, dadurch gekennzeichnet, daß
sich in einem zweiten Verfahrensschritt eine genspezifische Polymerasekettenreaktion anschließt, bei welcher das Exon 2 des kationischen Trypsinogens herausamplifiziert wird,
in einem dritten Verfahrensschritt das PCR-Produkt gereinigt wird,
in einem vierten Verfahrensschritt mit drei Primern gearbeitet wird, wobei einem reverse Primer ein forward Kontroll-Primer und ein mutationsspezifischer Primer entgegensteht
und der mutationsspezifische Primer am Produkt der genspezifischen PCR hybridisiert,
wobei sich in einem fünften Verfahrensschritt der Nachweis der Hybridisierung durch Acrylamidgelelektrophorese oder ein gleichartiges Verfahren anschließt.1. A method for detecting a mutation in pancreatitis according to a methodology that follows a first step of a DNA extraction according to the standard protocol, characterized in that
a gene-specific polymerase chain reaction follows, in which the exon 2 of the cationic trypsinogen is amplified,
the PCR product is purified in a third process step,
in a fourth process step, three primers are used, a reverse primer being opposed by a forward control primer and a mutation-specific primer
and the mutation-specific primer hybridizes to the product of the gene-specific PCR,
in a fifth method step, the detection of the hybridization by acrylamide gel electrophoresis or a similar method follows. 2. Verfahren zum Nachweis einer Mutation bei Pankreatitis nach einer Methodik, die sich an einen ersten Verfahrensschritt der DNA-Extraktion entsprechend Standard­ protokoll anschließt, dadurch gekennzeichnet, daß
in einem zweiten Verfahrensschritt eine genspezifische Polymerasekettenreaktion anschließt, bei welcher das Exon 2 des kationischen Trysinogens herausamplifiziert wird,
in einem dritten Verfahrensschritt das PCR-Produkt gereinigt wird,
in einem vierten Verfahrensschritt solche Primer verwendet werden, die mit dem zweiten DNA-Strang komplementär sind,
wobei sich in einem fünften Verfahrensschritt der Nachweis der Hybridisierung durch Acrylamidgelelektrophorese oder ein vergleichbares Verfahren anschließt.2. A method for detecting a mutation in pancreatitis according to a methodology which follows a first method step of DNA extraction in accordance with the standard protocol, characterized in that
in a second process step, a gene-specific polymerase chain reaction follows, in which the exon 2 of the cationic trysinogen is amplified,
the PCR product is purified in a third process step,
in a fourth method step those primers are used which are complementary to the second DNA strand,
in a fifth method step, the detection of hybridization by acrylamide gel electrophoresis or a comparable method follows.
DE19823079A 1998-05-22 1998-05-22 A method to detect mutations associated with pancreatitis Ceased DE19823079A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19823079A DE19823079A1 (en) 1998-05-22 1998-05-22 A method to detect mutations associated with pancreatitis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19823079A DE19823079A1 (en) 1998-05-22 1998-05-22 A method to detect mutations associated with pancreatitis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19823079A1 true DE19823079A1 (en) 1999-11-25

Family

ID=7868705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19823079A Ceased DE19823079A1 (en) 1998-05-22 1998-05-22 A method to detect mutations associated with pancreatitis

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE19823079A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1556519B1 (en) * 2002-10-29 2011-01-05 Advanta Canada Inc. Assay for imidazolinone resistance mutations in brassica species

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Multiple mutations of the trypsinogen-A gene in two German families with hereditary pancreatitis. V.Keim, N.Teich, A.Reich, J.Moessner, Meeting of the American Pancratic Association, Chicago, Illi-nois, USA, November 6-8, 1997, Pancreas 15 (4), 1997, 440 *
Mutations in the cationic trypsinogen gene are as-sociated with recurrent acute and chronic pancrea-titis. M.C.Gorry, D.Gabbaizedeh, W.Furey, L.K.Jr. Gates, R.A.Preston, C.E.Aston, Y.Zhang, C.Ulrich, *
Mutations of the cationic trypsinogen in heredita-ry pancreatitis. N.Teich, J.Moessner, V.Keim, Hu- man Mutation 12 (1), 1998, 39-43 *
Trypsinogen mutations of exons 2 and 3 in heredi- tary and chronic-alcoholic pancreatitis. V.Keim, N.Teich, A.Reich, J.Moessner, Digestive Disease Week and the 99th Annual Meeting of the American Gastroenterological Association, New Orleans, Louisiana, USA, May 16-22, 1998. Gastroenterology 114 (4 Part 2) A473, G1925 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1556519B1 (en) * 2002-10-29 2011-01-05 Advanta Canada Inc. Assay for imidazolinone resistance mutations in brassica species

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69616478T2 (en) Evidence of genetic predisposition to periodontal diseases
DE68929299T3 (en) Multiple genomic DNA amplification to detect a deletion
DE69838984T2 (en) RISK ASSESSMENT FOR CHRONIC RESPIRATORY DISEASES AND APPLICATIONS
DE69233657T2 (en) Three microsatellite repeat polymorphic DNA markers with high information density
DE69715669T2 (en) DETECTION OF A GENETIC PREPOSITION FOR DIABETIC RETINOPATHY WITH THE RISK OF THE LOSS OF VISION
DE69608682T2 (en) METHOD FOR DIAGNOSIS OF SCHIZOPHRENIA
DE983381T1 (en) PREDICTION OF CORONARY ARTERIAL DISEASE
DE69523586T2 (en) SCREENING METHOD FOR DISEASE CROHN BY USE OF TNF MICROSATELLITE ALLELS
DE69131101T2 (en) METHOD FOR AMPLIFICATING HLA CLASS I NUCLEIC ACIDS
DE69503885T2 (en) COMMONLY USED GENETIC MARKERS FOR DIAGNOSTICS OF ALZHEIMER'S DISEASE, METHOD AND DIAGNOSTIC REAGENT SET
DE69835509T2 (en) METHOD FOR DETERMINING THE CARDIOVASCULAR STATUS AND COMPOSITIONS FOR ITS USE
Ma et al. Genetic contribution of the tumor necrosis factor region in guillain‐barré syndrome
WO2007042165A1 (en) Method for diagnosing thromboembolic disorders and coronary heart diseases
DE19823079A1 (en) A method to detect mutations associated with pancreatitis
DE60216570T2 (en) METHOD FOR DETECTING ALZHEIMER DISEASE
DE69506704T2 (en) METHOD AND SAMPLES FOR DETECTING MARKERS ASSOCIATED WITH THE LOCUS OF INFANTILE SPINALAMYOTROPHIES
DE69330604T2 (en) METHOD AND SYSTEM FOR MOLECULAR BIOLOGICAL DIAGNOSIS
DE10037769A1 (en) Diagnosis of diseases associated with CD24
DE60028009T2 (en) METHOD FOR DIAGNOSIS AND SCREENING OF BARRENESS IN MEN
Cruz‐Martínez et al. GAA trinucleotide repeat expansion in variant Friedreich's ataxia families
Sessa et al. Atypical hereditary neuropathy with liability to pressure palsies (HNPP): the value of direct DNA diagnosis.
DE69838278T2 (en) METHOD FOR DIGANOSIS AND DETERMINATION OF THE PREFERENCE POSITION OF BIPOLAR VITAMIN DISEASES
DE19909878C2 (en) New sequence variants of the human MSH6 mismatch repair gene and their use
DE19955024C2 (en) Diagnostic Kit
DE3751114T2 (en) DMD PROBE.

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8131 Rejection