DE19820663A1

DE19820663A1 - Recombinant antibodies

Info

Publication number: DE19820663A1
Application number: DE19820663A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Med Berchtold; Robert F A Dr Med Escher
Original assignee: ASAT AG Applied Science and Technology
Current assignee: ASAT AG Applied Science and Technology
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-05-08
Publication date: 1999-04-08

Description

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresequenzen, die für humane Autoantikörper gegen Blutplättchen-Membranproteine und für antiidioty pische Antikörper kodieren, neue Aminosäuresequenzen von humanen Antikörpern und deren Verwendung für die Diagnostik und Therapie von Krankheiten.The invention relates to new nucleic acid sequences for human Autoantibodies against platelet membrane proteins and for antiidioty encode antibodies, new amino acid sequences of human Antibodies and their use for the diagnosis and therapy of Diseases.

Autoimmun-thrombozytopenische Purpura (AITP) ist eine Immunkrankheit, die durch eine geringe Blutplättchenzahl bei normaler oder gesteigerter Megakaryozytopoiese definiert ist. Aufgrund des Vorhandenseins von Anti- Plättchen-Autoantikörpern findet eine verstärkte Zerstörung von Plättchen im reticuloendothelialen System (Milz, Leber, Knochenmark) statt. Diese Autoantikörper, die in etwa 75% der AITP Patienten nachgewiesen werden können, sind überwiegend gegen die Plättchenmembran-Glykoproteine (GP) IIb/IIIa und Ib/IX gerichtet. In einem einzigen Patienten können mehrere verschiedene Auto-Antikörper-Spezifitäten gefunden werden (vgl. z. B. Berchtold und Wenger, Blood 81 (1993), 1246-1250; Kiefel et al., Br. J. Haematol. 79 (1991), 256-262; McMillan et al., Blood 70 (1987), 1040 und Fujisawa et al., Blood 79 (1991); 1441). Die Charakterisierung von Bindeepitopen und die Ermittlung der pathogenetischen Signifikanz der Autoantikörper bleibt jedoch schwierig aufgrund der beschränkten Menge an Autoantikörpern, die aus AITP Patienten erhältlich sind. Unter Ver wendung der Hybridomatechnik konnten nur wenige humane monoklonale Antikörper aus Lymphozyten von AITP Patienten erhalten werden, die mit GPIIb/IIIa reagieren (Kunicki et al., Hum. Antibodies Hybridomas 1 (1990), 83-95). Autoimmune thrombocytopenic purpura (AITP) is an immune disease due to a low platelet count with normal or increased Megakaryocytopoiesis is defined. Due to the presence of anti Platelet autoantibodies find an increased destruction of platelets in the reticuloendothelial system (spleen, liver, bone marrow). This Autoantibodies detected in approximately 75% of AITP patients are predominantly against the platelet membrane glycoproteins (GP) IIb / IIIa and Ib / IX directed. Multiple patients can be in a single patient different auto-antibody specificities can be found (see e.g. Berchtold and Wenger, Blood 81 (1993), 1246-1250; Kiefel et al., Br. J. Haematol. 79: 256-262 (1991); McMillan et al., Blood 70 (1987), 1040 and Fujisawa et al., Blood 79 (1991); 1441). The characterization of Binding epitopes and the determination of the pathogenetic significance of the However, autoantibodies remain difficult due to the limited amount on autoantibodies available from AITP patients. Under Ver Only a few human monoclonals were able to use hybridoma technology Antibodies can be obtained from lymphocytes from AITP patients with GPIIb / IIIa react (Kunicki et al., Hum. Antibodies Hybridomas 1 (1990), 83-95).

Auch bei gesunden Personen wurde das Auftreten natürlicher Auto antikörper gegen verschiedene Selbstantigene berichtet, beispielsweise gegen intrazelluläre und zytoskelettale Komponenten humaner Plättchen (Guilbert et al., J. Immunol. 128 (1982), 2779-2787; Hurez et al., Eur. J. Immunol. 23 (1993), 783-789 und Pfueller et al., Clin. Exp. Immunol. 79 (1990), 367-373). Einige dieser im Serum gesunder Personen beobachteten Autoantikörper können auch gegen Plättchenmembranproteine gerichtet sein (Souberbielle, Eur. J. Haematol. 56 (1996), 178-180). Die Rolle dieser natürlichen Autoantikörper sowie ihre Beziehung zu Krankheits-assoziierten Autoantikörpern ist jedoch noch unbekannt.Even in healthy people, the appearance of natural auto antibodies against various self-antigens have been reported, for example against intracellular and cytoskeletal components of human platelets (Guilbert et al., J. Immunol. 128 (1982), 2779-2787; Hurez et al., Eur. J. Immunol. 23: 783-789 (1993) and Pfueller et al., Clin. Exp. Immunol. 79 (1990), 367-373). Some of these healthy people observed in the serum Autoantibodies can also be directed against platelet membrane proteins (Souberbielle, Eur. J. Haematol. 56 (1996), 178-180). The role of this natural autoantibodies as well as their relationship to disease-associated However, autoantibodies are still unknown.

Zur Behandlung von AITP können Corticosteroide eingesetzt werden. Etwa die Hälfte der Patienten reagiert auf eine Verabreichung von Prednison innerhalb von 4 Wochen, Langzeitremissionen werden jedoch nur selten gefunden. Bei Patienten, die starke Blutungen oder extrem geringe Plätt chenzahlen aufweisen, wird als Notfallbehandlung die Verabreichung hoher Dosen von intravenösem Immunglubolin (IVIgG) empfohlen. Nach dieser Behandlung folgt ein schneller, aber üblicherweise nur vorübergehender Anstieg der Plättchenzahl bei den meisten Patienten. Die Wirkmechanismen von Corticosteroiden sowie von IVIgG bei der Behandlung der AITP sind noch unbekannt. Durch Untersuchungen von Berchtold et al., (Blood 74 (1989), 2414-2417 und Berchtold und Wenger, Blood 81 (1993), 1246-1250) ist bekannt, daß die Bindung von Autoantikörpern an Plättchen-Glyko proteine durch antiidiotypische Antikörper in IVIgG gehemmt werden kann.Corticosteroids can be used to treat AITP. Approximately half of the patients respond to the administration of prednisone within 4 weeks, but long-term remissions are rare found. In patients who have heavy bleeding or extremely low platelets number, the administration becomes higher as an emergency treatment Doses of intravenous immunoglobulin (IVIgG) are recommended. After this Treatment follows a quick, but usually only temporary Platelet increase in most patients. The mechanisms of action of corticosteroids and IVIgG in the treatment of AITP still unknown. Studies by Berchtold et al., (Blood 74 (1989), 2414-2417 and Berchtold and Wenger, Blood 81 (1993), 1246-1250) is known to bind autoantibodies to platelet glyco proteins are inhibited by antiidiotypic antibodies in IVIgG can.

Das der vorliegenden Anmeldung zugrundeliegende Problem besteht darin, neue DNA Sequenzen zu identifizieren, welche für die Bindung von Auto antikörpern an GPIIb/IIIa verantwortlich sind. Auf diese Weise können neue pharmazeutische Präparate bereitgestellt werden, welche zur Verbesserung der Diagnose und Therapie von AITP eingesetzt werden können. The problem underlying the present application is identify new DNA sequences necessary for the binding of Auto antibodies to GPIIb / IIIa are responsible. This way, new ones pharmaceutical preparations are provided which are for improvement diagnosis and therapy of AITP can be used.

Die Identifizierung von Bindesequenzen aus Autoantikörpern gelang überraschenderweise nach Herstellung einer kombinatorischen Phagemid-Dis playbibliothek von schweren und leichten Ketten humaner Antikörper unter Verwendung peripherer zirkulierender B-Zellen eines gesunden humanen Spenders. Nach Präsentation humaner schwerer und leichter Antikörper Fab-Fragmente an der Oberfläche des filamentösen Phagen M13 konnten Phagen-Klone identifiziert werden, welche eine spezifische Bindung an GPIIb/IIIa zeigen.Binding sequences from autoantibodies were identified Surprisingly after the production of a combinatorial phagemid dis play library of heavy and light chains of human antibodies using peripheral circulating B cells of a healthy human donor. After presenting humane heavier and lighter Antibody Fab fragments on the surface of filamentous phage M13 were able to identify phage clones that have a specific binding show on GPIIb / IIIa.

Hierzu wurde die Phagemid-Bibliothek aufeinanderfolgend mit thrombasthe nischen Plättchen ohne GPIIb/IIIa (negative Selektion) und normalen Plättchen (positive Selektion) in Kontakt gebracht. Nach mehreren Runden der Selektion und Amplifikation durch Infektion von E.coli wurden 23 Klone erhalten, die an den GPIIb/IIIa Komplex binden können. Inhibierungsstudien unter Verwendung Pools monoklonaler Antikörper gegen GPIIb/IIIa ergaben zwei Gruppen von Klonen: Beide Gruppen wurden durch monoklonale Antikörper, die spezifisch für den GPIIb/IIIa Komplex waren, inhibiert, und eine Gruppe auch durch einen GPIIb spezifischen monoklonalen Antikörper. Diese Befunde wurden durch DNA-Analyse der Klone bestätigt, die das Vorhandensein von 2 unterschiedlichen Anti-GPIIb/IIIa Phagen-Klonen ergab. Diese Ergebnisse zeigen, daß 2 GPIIb/IIIa spezifische Phagen-Klone, d. h. Autoantikörper, aus dem Genom einer gesunden Person kloniert werden können und daß diese Klone Konformationsepitope des GPIIb/IIIa Komplexes erkennen können. Durch Inhibierungsstudien wurde weiterhin festgestellt, daß beide Phagen-Klone die Bindung von Plättchen-assoziierten Auto antikörpern aus Patienten mit AITP an gereinigtes GPIIb/IIIa hemmen und somit vermutlich AITP-assoziierte Epitope von GPIIb/IIIa erkennen. Da die Phagen-Klone die Antigenbindesequenzen natürlicher Autoantikörper enthalten, die aus dem Genom einer gesunden Person stammen, kann dieser Befund zu neuen Erkenntnissen über den Ursprung Plättchen-assoziierter Autoantikörper in AITP führen. To this end, the phagemid library was sequentially thrombastheized African platelets without GPIIb / IIIa (negative selection) and normal Plates (positive selection) brought into contact. After several rounds The selection and amplification by infection of E. coli were 23 clones obtained that can bind to the GPIIb / IIIa complex. Inhibition studies using pools of monoclonal antibodies to GPIIb / IIIa two groups of clones: both groups were identified by monoclonal Antibodies specific for the GPIIb / IIIa complex are inhibited, and a group also by a GPIIb specific monoclonal antibody. These findings were confirmed by DNA analysis of the clones that did Presence of 2 different anti-GPIIb / IIIa phage clones revealed. These results show that 2 GPIIb / IIIa specific phage clones, i.e. H. Autoantibodies to be cloned from the genome of a healthy person can and that these clones conformation epitopes of the GPIIb / IIIa complex can recognize. Inhibition studies also found that both phage clones bind to platelet-associated auto inhibit antibodies from patients with AITP to purified GPIIb / IIIa and thus presumably recognize AITP-associated epitopes of GPIIb / IIIa. Since the Phage clones the antigen binding sequences of natural autoantibodies contained in the genome of a healthy person, this can Findings on new knowledge about the origin of platelet-associated Run autoantibodies in AITP.

Darüber hinaus ist es unter Verwendung der erfindungsgemäßen Phagen-Klone möglich, rekombinante antiidiotypische Antikörper gegen Anti-GPIIb/IIIa Autoantikörper zu erzeugen, wobei die Anti-GPIIb/IIIa Phagen-Klone als Antigen verwendet werden. Die auf diese Weise erhältlichen rekombinanten antiidiotypischen Antikörper stellen eine interessante klinische Alternative zur Verwendung von IVIgG dar.In addition, it is using the invention Phage clones possible, recombinant anti-idiotypic antibodies against To produce anti-GPIIb / IIIa autoantibodies, the anti-GPIIb / IIIa Phage clones can be used as the antigen. The available in this way recombinant antiidiotypic antibodies represent an interesting one clinical alternative to the use of IVIgG.

Die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen der identifizier ten Phagen-Klone sind in den Sequenzprotokollen SEQ ID No. 1 bis 8 (Autoantikörper) bzw. SEQ ID No. 9 bis 18 (antiidiotypische Antikörper) dargestellt.The nucleotide and derived amino acid sequences of the identified Phage clones are shown in the sequence listing SEQ ID No. 1 to 8 (Autoantibodies) or SEQ ID No. 9 to 18 (anti-idiotypic antibodies) shown.

I. Autoantibodies

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für Autoantikörper kodieren. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Nukleinsäure, die für die schwere Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus:
A first aspect of the present invention relates to nucleic acids which code for autoantibodies. The invention thus relates to a nucleic acid which codes for the heavy chain of a human antibody, a functional derivative or a fragment thereof and which comprises a CDR3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
VLPFDPISMDV (I)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
ALGSWGGWDHYMDV (II)
coding nucleotide sequence,
(c) a nucleotide sequence which is suitable for an amino acid sequence of at least 80% and preferably at least 90% an amino acid sequence from (a) or (b) and
(d) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence an equivalent binding ability to GPIIb / IIIa coded.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt weiterhin vorzugsweise eine CDR1-Region ausgewählt aus
The nucleic acid according to the invention preferably further comprises a CDR1 region selected from

(a) one for the amino acid sequence:
GYSWR (III)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
SYAMH (IV)
coding nucleotide sequence and
(c) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence a homology of at least 80% and preferably at least 90% of an amino acid sequence from (a) or (b) encoded.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR2-Region ausgewählt:
The nucleic acid according to the invention preferably further comprises a CDR2 region selected:

(a) one for the amino acid sequence:
DISYSGSTKYKPSLRS (V)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
VISYDGSNKYYADSVKG (VI)
coding nucleotide sequence and
(c) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence a homology of at least 80% and preferably of at least 90% of an amino acid sequence from (a) or (b) encoded.

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für die leichte Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus:
A second aspect of the present invention is a nucleic acid encoding a human antibody light chain, a functional derivative or a fragment thereof and comprising a CDR3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
ATWDDGLNGPV (VII)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
AAWDDSLNGWV (VIII)
coding nucleotide sequence,
(c) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence a homology of at least 80% and preferably of at least 90% of an amino acid sequence from (a) or (b) encoded and
(d) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence an equivalent binding ability to GPIIb / IIIa coded.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR1-Region ausgewählt aus:
The nucleic acid according to the invention preferably further comprises a CDR1 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
SGSSSNIRSNPVS (IX)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
SGSSSNIGSNTVN (X)
coding nucleotide sequence and
(c) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence a homology of at least 80% and preferably of at least 90% of an amino acid sequence from (a) or (b) encoded.

Darüber hinaus umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure vorzugsweise weiterhin eine CDR2-Region ausgewählt aus:
In addition, the nucleic acid according to the invention preferably further comprises a CDR2 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
GSHQRPS (XI)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
SNNQRPS (XII)
coding nucleotide sequence and
(c) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence a homology of at least 80% and preferably at least 90% of an amino acid sequence from (a) or (b) encoded.

II. Antiidiotypic Antibodies

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für antiidiotypische Antikörper kodieren. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Nukleinsäure, die für die schwere Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert, und eine CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus:
A second aspect of the present invention relates to nucleic acids which code for anti-idiotypic antibodies. The invention thus relates to a nucleic acid which codes for the heavy chain of a human antibody, a functional derivative or a fragment thereof and which comprises a CDR3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
VRDLGYRVLSTFTFDI (XIII)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
DGRSGSYARFDGMDV (XIV)
coding nucleotide sequence,
(c) one for the amino acid sequence:
MGSSVVATYNAFDI (XV)
coding nucleotide sequence,
(d) one for the amino acid sequence:
DADGDGFSPYYFPY (XVI)
coding nucleotide sequence,
(e) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence a homology of at least 80% and preferably of at least 90% to an amino acid sequence from (a), (b), (c) or (d) encodes and
(f) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence an equivalent binding ability to autoantibodies against GPIIb / IIIa encoded.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt weiterhin vorzugsweise eine CDR1-Region ausgewählt aus: einer für die in Tab. 7 gezeigten Amino säuresequenzen N F A M S, S Y T M H oder D Y A L H, S H Y W S3 kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu einer der zuvor genannten Aminosäurese quenzen kodiert.The nucleic acid according to the invention preferably further comprises one CDR1 region selected from: one for the amino shown in Table 7 acid sequences N F A M S, S Y T M H or D Y A L H, S H Y W S3 coding nucleotide sequence and a nucleotide sequence necessary for a Amino acid sequence with at least 80% homology and preferably at least 90% of one of the aforementioned amino acids sequences encoded.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR2-Region ausgewählt aus einer für die in Tab. 7 gezeigten Aminosäure sequenzen
The nucleic acid according to the invention preferably further comprises a CDR2 region selected from one for the amino acid sequences shown in Table 7

G I S G G G L L T H Y A (D/N) S V K G, L I S Y D G S N K Y Y A D S V K G, G I S W D S T S I G Y A D S V K G
GISGGGLLTHYA (D / N) SVKG, LISYDGSNKYYADSVKG, GISWDSTSIGYADSVKG

oder
or

F I Y D G A R T R F N P S L R S
FIYDGARTRFNPSLRS

kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer der zuvor genannten Aminosäuresequenzen kodiert.coding nucleotide sequence and a nucleotide sequence, for an amino acid sequence with at least 80% homology and preferably at least 90% of any of the aforementioned Amino acid sequences encoded.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für die leichte Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus:
The present invention further provides a nucleic acid which codes for the light chain of a human antibody, a functional derivative or a fragment thereof and which comprises a CDR3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence
CSYVHSSTN (XVII)
coding nucleotide sequence,
(b) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence a homology of at least 80% and preferably encoded at least 90% to an amino acid sequence from (a) and
(c) a nucleotide sequence which corresponds to an amino acid sequence an equivalent binding ability to autoantibodies against GPIIb / IIIa encoded.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR1-Region ausgewählt aus einer für die in Tab. 7 gezeigte Aminosäurese quenz T G T S S A I G N Y N F V P kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homolo gie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zur der zuvor genannten Aminosäuresequenz kodiert.The nucleic acid according to the invention preferably further comprises one CDR1 region selected from one for the amino acid shown in Table 7 sequence T G T S S A I G N Y N F V P coding nucleotide sequence and a nucleotide sequence which is for an amino acid sequence with a homolo gie of at least 80% and preferably at least 90% of the previously encoded amino acid sequence.

Darüber hinaus umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure vorzugsweise weiterhin eine CDR2-Region ausgewählt aus einer für die in Tab. 7 gezeigte Aminosäuresequenz E G S K R P S kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu der zuvor genannten Aminosäuresequenz kodiert.In addition, the nucleic acid according to the invention preferably comprises furthermore a CDR2 region selected from one for the one shown in Table 7 Amino acid sequence E G S K R P S coding nucleotide sequence and one Nucleotide sequence which is for an amino acid sequence with a homology of at least 80% and preferably at least 90% to that previously encoded amino acid sequence.

Unter dem Begriff "funktionelles Derivat einer Kette eines humanen Antikörpers" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid zu verstehen, das mindestens eine CDR3-Region der schweren oder/und leichten Kette wie vorstehend definiert umfaßt und zusammen mit der jeweiligen komplementären Kette des humanen Antikörpers (oder einem Derivat einer solchen Kette) ein Antikörperderivat bilden kann, das eine äquivalente Erkennungsspezifität für ein Antigen wie der nicht derivatisierte Antikörper besitzt. Vorzugsweise weist ein derartiges Antikörperderivat eine Bindungskonstante von mindestens 10^-6 l/mol, vorzugsweise von minde stens 10^-8 l/mol für das jeweilige Antigen auf.The term "functional derivative of a chain of a human antibody" in the sense of the present invention is to be understood as a polypeptide which comprises at least one CDR3 region of the heavy and / or light chain as defined above and together with the respective complementary chain of the human antibody (or a derivative of such a chain) can form an antibody derivative that has an equivalent recognition specificity for an antigen as the underivatized antibody. Such an antibody derivative preferably has a binding constant of at least 10 ^-6 l / mol, preferably of at least 10 ^-8 l / mol, for the respective antigen.

Die Herstellung funktioneller Derivate von Ketten eines humanen Antikörpers kann beispielsweise durch Deletion, Substitution oder/und Insertion von Abschnitten des für das jeweilige Polypeptid kodierenden Gens durch re kombinante DNA-Techniken erfolgen.The production of functional derivatives of chains of a human antibody can for example by deletion, substitution and / or insertion of Portions of the gene coding for the respective polypeptide by re combined DNA techniques are done.

Besonders bevorzugte funktionelle Derivate von Antikörperketten oder Antikörper sind Einzelkettenantikörper, die beispielsweise aus den variablen Domänen der H- und L-Kette sowie gegebenenfalls einer konstanten Domäne zusammengesetzt sein können. Die Herstellung solcher Konstrukte ist bei Hoogenboom et al., Immunol. Rev. 130 (1992), 41-68; Barbas III, Methods: Companion Methods Enzymol. 2 (1991), 119 und Plückthun, Immunochemistry (1994), Marcel Dekker Inc., Kapitel 9, 210-235 beschrieben.Particularly preferred functional derivatives of antibody chains or Antibodies are single-chain antibodies, which for example consist of the variable Domains of the H and L chain and, if necessary, a constant one Domain can be composed. The manufacture of such constructs is in Hoogenboom et al., Immunol. Rev. 130 (1992), 41-68; Barbas III, Methods: Companion Methods Enzymol. 2 (1991), 119 and Plückthun, Immunochemistry (1994), Marcel Dekker Inc., Chapter 9, 210-235 described.

Unter dem Begriff "äquivalente Bindefähigkeit" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine gleiche Bindeaffinität oder/und Spezifität, d. h. Epi toperkennung wie in den konkret offenbarten Sequenzen zu verstehen.Under the term "equivalent binding ability" in the sense of the present Invention is an equal binding affinity and / or specificity, i. H. Epi to understand top recognition as in the specifically disclosed sequences.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält. Dieser Vektor kann ein prokaryontischer Vektor oder ein eukaryontischer Vektor sein. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind Plasmide, Cosmide und Bakteriophagen. Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Eddition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, in den Kapiteln 1 bis 4 ausführlich beschrieben. Vorzugsweise ist ein prokaryontischer Vektor ein Plasmid oder ein Phage.Another object of the present invention is a vector that contains at least one copy of a nucleic acid according to the invention. This vector can be a prokaryotic vector or a eukaryotic vector Be vector. Examples of prokaryotic vectors are plasmids, cosmids and bacteriophages. Such vectors are for example at Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, detailed in chapters 1 through 4 described. A prokaryotic vector is preferably a plasmid or a phage.

Andererseits kann der Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z. B. ein Hefevektor, ein Insektenvektor (Baculovirus) oder ein Säugervektor (Plasmidvektor oder viraler Vektor). Beispiele für eukaryontische Vektoren sind bei Sambrook et al., supra, Kapitel 16 und Winnacker, Gene und Klone, Eine Einführung für die Gentechnologie (1985), VCH Verlagsgesellschaft insbesondere Kapitel 5, 8 und 10, beschrieben.On the other hand, the vector can also be a eukaryotic vector, e.g. B. a Yeast vector, an insect vector (baculovirus) or a mammalian vector (Plasmid vector or viral vector). Examples of eukaryotic vectors are in Sambrook et al., supra, Chapter 16 and Winnacker, genes and clones, An introduction to genetic engineering (1985), VCH publishing company especially chapters 5, 8 and 10.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure exprimiert, oder eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann eine prokaryontische Zelle (z. B. eine gram-negative Bakterienzelle, insbesondere E.coli) oder eine eukaryontische Zelle (z. B. eine Hefe-, Pflanzen- oder Säugerzelle) sein. Beispiele für geeignete Zellen und Verfahren zum Einführen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in derartige Zellen finden sich den obigen Literaturstellen.Yet another object of the present invention is a cell that expresses a nucleic acid according to the invention, or a cell which with a nucleic acid according to the invention or with one according to the invention Vector is transformed. The cell can be a prokaryotic cell (e.g. a gram-negative bacterial cell, especially E. coli) or a eukaryotic Cell (e.g. a yeast, plant or mammalian cell). examples for suitable cells and methods for introducing the invention Nucleic acid in such cells can be found in the above references.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert ist, insbesondere ein rekombinantes Polypeptid. Besonders bevorzugt enthält das Polypeptid die variable Domäne der H- oder/und L-Kette eines humanen Antikörpers.Another object of the present invention is a polypeptide that is encoded by a nucleic acid according to the invention, in particular a recombinant polypeptide. The polypeptide particularly preferably contains the variable domain of the H or / and L chain of a human antibody.

Besonders bevorzugt ist ein Polypeptid, das Antikörpereigenschaften aufweist und aus einer schweren Kette oder einem funktionellen Derivat davon sowie aus einer leichten Kette oder einem funktionellen Derivat davon als Untereinheiten aufgebaut ist. Das Polypeptid kann aus zwei separaten Ketten zusammengesetzt sein oder als Einzelkettenpolypeptid vorliegen.A polypeptide which has antibody properties is particularly preferred has and from a heavy chain or a functional derivative thereof and from a light chain or a functional derivative thereof is constructed as subunits. The polypeptide can consist of two separate ones Chains are composed or are present as a single chain polypeptide.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid, der gegen ein für die Erkennung des Antigens verantwortliche Region des Polypeptids gerichtet ist. Dieser Antikörper kann ein polyklonales Antiserum, ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers (z. B. ein Fab-, F(ab)₂-, Fab'- oder F(ab')₂ Fragment) sein. Vorzugsweise ist der Antikörper gegen die CDR3-Region der schweren oder/und leichten Antikörperkette des erfindungsgemäßen Polypeptids oder einen Bereich davon gerichtet. Derartige Antikörper können nach an sich bekannten Methoden durch Immunisierung eines Versuchstiers mit einem Peptid oder Polypeptid, welches eine erfindungsgemäße CDR3-Region enthält, und Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antikörper aus dem Versuchstier erhalten werden. Weiterhin können monoklonale Antikörper durch Fusion einer Antikörper-produzierenden B-Zelle des Versuchstiers mit einer Leukämiezelle nach der Methode von Köhler und Milstein oder einer Weiterentwicklung davon erhalten werden. Darüber hinaus können rekombinante Antikörper, die gegen die CDR3-Region des erfindungs gemäßen Polypeptids gerichtet sind, auch durch Musterung einer geeigneten Phagemid-Bibliothek, z. B. einer Phageimid-Bibliothek aus einem gesunden humanen Spender, erhalten werden, wobei als Antigen ein erfindungs gemäßes Polypeptid verwendet wird.Yet another object of the present invention is an antibody against a polypeptide according to the invention which is directed against a region of the polypeptide which is responsible for the recognition of the antigen. This antibody can be a polyclonal antiserum, a monoclonal antibody or a fragment of a polyclonal or monoclonal antibody (e.g. a Fab, F (ab) ₂ ,, Fab 'or F (ab') ₂ fragment). The antibody is preferably directed against the CDR3 region of the heavy and / or light antibody chain of the polypeptide according to the invention or a region thereof. Antibodies of this type can be obtained by methods known per se by immunizing a test animal with a peptide or polypeptide which contains a CDR3 region according to the invention and obtaining the resulting polyclonal antibodies from the test animal. Furthermore, monoclonal antibodies can be obtained by fusing an antibody-producing B cell of the experimental animal with a leukemia cell according to the Köhler and Milstein method or a further development thereof. In addition, recombinant antibodies which are directed against the CDR3 region of the polypeptide according to the invention can also be obtained by patterning a suitable phagemid library, e.g. B. a phageimide library from a healthy human donor can be obtained, an inventive polypeptide is used as the antigen.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, einen Antikörper oder eine Zelle wie zuvor genannt, als aktive Komponente, gegebenenfalls zusammen mit anderen aktiven Komponenten sowie pharmazeutisch üblichen Hilfs-, Zusatz- oder Trägerstoffe enthält.The invention also relates to a pharmaceutical composition which a nucleic acid, a vector, a polypeptide, an antibody or a Cell as mentioned above, as an active component, optionally together with other active components as well as pharmaceutically customary auxiliaries, Contains additives or carriers.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Herstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels eingesetzt werden. Beispiele für diagnostischen Anwendungen sind die Diagnose von AITP oder einer Prädisposition für AITP. Eine weitere bevorzugte diagnostische Anwendung ist die Überwachung des Krankheitsverlaufs bei AITP.The pharmaceutical composition can be used to produce a diagnostic or therapeutic agents are used. examples for diagnostic applications are the diagnosis of AITP or one Predisposition for AITP. Another preferred diagnostic application is monitoring the course of the disease in AITP.

Der Einsatz der pharmazeutischen Zusammensetzung als diagnostisches Mittel kann beispielsweise den Nachweis einer B-Zellsubpopulation umfassen, welche ein erfindungsgemäßen Polypeptid als Antikörper exprimiert. Der Nachweis dieses Antikörpers kann beispielsweise auf Nukleinsäureebene, z. B. durch einen Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assay gegebenenfalls mit vorgeschalteter Amplifikation erfolgen. Andererseits kann der Nachweis auch auf Proteinebene durch einen Immunoassay unter Verwendung von spezifisch mit dem Polypeptid reagierenden Antigenen oder Antikörpern erfolgen.The use of the pharmaceutical composition as a diagnostic Detection of a B cell subpopulation can be used, for example comprise which a polypeptide according to the invention as an antibody expressed. The detection of this antibody can, for example, on Nucleic acid level, e.g. B. by a nucleic acid hybridization assay if necessary with an upstream amplification. On the other hand detection can also be done at the protein level by an immunoassay Use of antigens which react specifically with the polypeptide or antibodies.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung auch auf therapeutischem Gebiet angewandt werden, insbesondere zur Prävention oder Therapie von AITP. Diese therapeutische Anwendung kann beispielsweise darauf beruhen, daß eine Stimulierung der Produktion von Anti-Autoantikörpern erfolgt. Hierzu kann beispielsweise das erfindungs gemäße Autoantikörper-Polypeptid einem Patienten verabreicht werden, wodurch die Bildung von antiidiotypischen Antikörpern hervorgerufen oder/und stimuliert wird. Diese Verabreichung kann dabei nach üblichen Immunisierungsprotokollen (Foxetal., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279 (1996), 1000-1008; Whittum-Hudson et al., Nat. Med. 2 (1996), 1116-1121; Jardieu, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 779-782) erfolgen. Andererseits kann die Expression von Antikörpergenen spezifisch durch Verabreichung geeigneter Antisense-Nukleinsäuren gehemmt werden. Das erfindungs gemäße antiidiotypische Antikörper-Polypeptid kann einem Patienten verabreicht werden, um eine direkte Hemmung der Autoantikörper-Aktivität zu erreichen.Furthermore, the pharmaceutical composition according to the invention also be used in the therapeutic field, in particular for Prevention or therapy of AITP. This therapeutic application can for example, based on the fact that stimulation of the production of Anti-autoantibodies occur. For this, for example, the invention appropriate autoantibody polypeptide are administered to a patient, causing the formation of anti-idiotypic antibodies or / and is stimulated. This administration can be done according to the usual Immunization protocols (Foxetal., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279 (1996), 1000-1008; Whittum-Hudson et al., Nat. Med. 2: 1116-1121 (1996); Jardieu, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 779-782). On the other hand can express antibody genes specifically by administration suitable antisense nucleic acids are inhibited. The invention appropriate antiidiotypic antibody polypeptide can be a patient administered to directly inhibit autoantibody activity to reach.

Untersuchungen der erfindungsgemäßen Autoantikörper-Polypeptide zeigten, daß diese überraschenderweise in der Lage sind, die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen zu hemmen. Die erfindungsgemäßen Auto antikörper-Polypeptide und antidiotypischen Antikörper-Polypeptide können daher gegebenenfalls in Kombination als Mittel zur Modulation der Blutgerinnung eingesetzt werden, insbesondere zur Verhinderung einer Thrombose, beispielsweise nach Herzinfarkten, Schlaganfällen oder bei venösen Thrombosen mit Lungenembolien oder Ischämien etc.Investigations of the autoantibody polypeptides according to the invention showed that these are surprisingly able to bind To inhibit fibrinogen on platelets. The car according to the invention antibody polypeptides and antidiotypic antibody polypeptides can therefore, if necessary, in combination as a means for modulating the Blood coagulation can be used, especially to prevent Thrombosis, for example after heart attacks, strokes or in venous thrombosis with pulmonary embolism or ischemia etc.

Bisher wurden für therapeutische Zwecke als Fibrinogenantagonisten murine monoklonale Antikörper, z. B. der monoklonale Antikörper 7E3 (vgl. z. B. US-Patent 5,440,020) oder Fragmente davon (z. B. das kommerziell erhältliche Fab Fragment ReoPro®) oder kurze synthetische Peptide eingesetzt. Murine monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente haben jedoch den Nachteil, daß sie bei der Behandlung von humanen Patienten aufgrund ihrer Immunogenität zu unerwünschten Nebenreaktionen führen, während kurze Peptide im allgemeinen sehr schnell abgebaut werden. Gegenüber diesen bekannten Mitteln haben die erfindungsgemäßen Polypeptide den Vorteil, daß sie aus Aminosäuresequenzen humanen Ursprungs bestehen und daher geringere unerwünschte Nebenwirkungen als entsprechende murine Antikörper oder Antikörperfragmente aufweisen, und daß sie aufgrund ihrer Größe nicht einem so schnellen Abbau wie Peptide unterliegen.So far, murine have been used for therapeutic purposes as fibrinogen antagonists monoclonal antibodies, e.g. B. the monoclonal antibody 7E3 (cf. e.g. U.S. Patent 5,440,020) or fragments thereof (e.g., the commercially available Fab Fragment ReoPro®) or short synthetic peptides. Murine monoclonal antibodies and antibody fragments do, however Disadvantage that they are in the treatment of human patients due to their Immunogenicity leads to undesirable side reactions, while brief Peptides are generally broken down very quickly. Towards this known agents, the polypeptides according to the invention have the advantage that they consist of amino acid sequences of human origin and therefore fewer undesirable side effects than corresponding murine Have antibodies or antibody fragments, and that because of their Size is not subject to degradation as rapidly as peptides.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer für ein Autoantikörper-Polyeptid kodieren den Nukleinsäure, eines dieser Nukleinsäure enthaltenden Vektors, einer mit der Nukleinsäure oder dem Vektor transformierten Zelle, eines von der Nukleinsäure kodierten Polypeptids oder einer pharmazeutischen Zusammen setzung, die eine oder mehrere der genannten Substanzen enthält, zur Herstellung eines Mittel für die Beeinflussung und insbesondere die Hemmung der Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen. Vorzugsweise wird das Mittel zur Modulation der Blutgerinnung eingesetzt, insbesondere für die Auflösung von Thromben oder/und für die Prävention der Thrombenbildung. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammen setzung kann nach bereits für murine Antikörper oder Antikörperfragmente etablierten Protokollen erfolgen.The invention thus relates to the use of an inventive Encode nucleic acid, especially one for an autoantibody polyeptide the nucleic acid, a vector containing this nucleic acid, one with the nucleic acid or the vector transformed cell, one of the Nucleic acid encoded polypeptide or a pharmaceutical compound setting that contains one or more of the substances mentioned Manufacture of an agent for influencing and in particular the Inhibition of fibrinogen binding to platelets. Preferably used the agent for modulating blood coagulation, especially for the Dissolution of thrombi and / or for the prevention of thrombus formation. The administration of the pharmaceutical compositions according to the invention can already be set for murine antibodies or antibody fragments established protocols.

Weiterhin wird die Erfindung durch nachfolgende Beispiele, Figuren und Sequenzprotokolle erläutert. Es zeigen:
SEQ ID No. 1 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs gemäßen Antikörpers (Phagemidklon PDG7), wobei Framework-Region (FR)1 von bp 1-90, Komplement bestimmende Region (CDR)1 von bp 91-105, FR2 von bp 106-147, CDR2 von bp 148-195, FR3 von bp 196-291, CDR3 von bp 292-324 und FR4 von bp 325-357 reicht,
SEQ ID No. 2 die Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID No. 1 darge stellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-30, CDR1 von A.S. 31-35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-65, FR3 von A.S. 66-97, CDR3 von A.S. 98-108 und FR4 von A.S. 109-119 reicht,
SEQ ID No. 3 die Nukleotidsequenz der L-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon PDG7), wobei FR1 von bp 1-60, CDR1 von bp 61-99, FR2 von bp 100-144, CDR2 von bp 145-165, FR3 von bp 166-261, CDR3 von bp 262-294 und FR4 von bp 295-333 reicht,
SEQ ID No. 4 die Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID No. 3 angege benen Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-20, CDR1 von A.S. 21-33, FR2 von A.S. 34-48, CDR2 von A.S. 49-55, FR3 von A.S. 56-87, CDR3 von A.S. 88-98 und FR4 von A.S. 99-11 reicht,
SEQ ID No. 5 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon PDG13), wobei FR1 von bp 1-90, CDR1 von bp 91-109, FR2 von bp 106-147, CDR2 von bp 148-198, FR3 von bp 199-294, CDR3 von bp 295-336 und FR4 von bp 337-369 reicht,
SEQ ID No. 6 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 5 dargestell ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-30, CDR1 von A.S. 31-35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99-112 und FR4 von A.S. 113-123 reicht,
SEQ ID No. 7 die Nukleotidsequenz der L-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon PGD13), wobei FR1 von bp 1-60, CDR1 von bp 61-99, FR2 von bp 100-144, CDR2 von bp 145-165, FR3 von bp 166-261, CDR3 von bp 262-294 und FR4 von bp 295-333 reicht,
SEQ ID No. 8 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 7 dargestell ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-20, CDR1 von A.S. 21-33, FR2 von A.S. 34-48, CDR2 von A.S. 49-55, FR3 von A.S. 56-87, CDR3 von A.S. 88-98 und FR4 von A.S. 99-111 reicht,
SEQ ID No. 9 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X 16), wobei FR1 von bp 1-90, CDR1 von bp 91-105, FR2 von bp 106-147, CDR2 von bp 148-198, FR3 von bp 199-288, CDR3 von bp 289-336 und FR4 von bp 337-369 reicht,
SEQ ID No. 10 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 9 dargestell ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-30, CDR1 von A.S. 31-35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-96, CDR3 von A.S. 97-112 und FR4 von A.S. 113-123 reicht,
SEQ ID No. 11 die Nukleotidsequenz der L-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X16), wobei FR1 von bp 1 bis 60, CDR1 von bp 61-102, FR2 von bp 103-147, CDR2 von 148-168, FR3 von bp 169-264, CDR3 von 265-291 und FR4 von bp 292-375 reicht,
SEQ ID No. 12 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 11 darge stellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-20, CDR1 von A.S. 21-34, FR2 von A.S. 35-49, CDR2 von A.S. 50-56, FR3 von A.S. 57-88, CDR3 von A.S. 89-97 und FR4 von A.S. 89-125 reicht,
SEQ ID No. 13 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X20), wobei FR1 von bp 1-90, CDR1 von bp 91-105, FR2 von bp 106-147, CDR2 von bp 148-195, FR3 von bp 196-291, CDR3 von bp 292-333 und FR4 von bp 334-366 reicht,
SEQ ID No. 14 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 13 dargestell ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-30, CDR1 von A.S. 31-35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-65, FR3 von A.S. 66-97, CDR3 von A.S. 98-111 und FR4 von A.S. 112-122 reicht,
SEQ ID No. 15 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X39), wobei FR1 von bp 1-90, CDR1 von bp 91-105, FR2 von bp 106-147, CDR2 von pb 148-198, FR3 von bp 199-294, CDR3 von bp 295-339 und FR4 von 340-372 reicht,
SEQ ID No. 16 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 15 dargestell ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1-30, CDR1 von A.S. 31-35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99-113 und FR4 von A.S. 114-124 reicht,
SEQ ID No. 17 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs gemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X40), wobei FR1 von bp 1-90, CDR1 von bp 91-105, FR2 von bp 106-147, CDR2 von bp 148-198, FR3 von bp 199-297, CDR3 von bp 298-339 und FR4 von bp 340-372 reicht und
SEQ ID No. 18 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 17 dargestell ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 30, CDR1 von A.S. 31-35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-99, CDR3 von A.S. 100-113 und FR4 von A.S. 114-124 reicht,The invention is further illustrated by the following examples, figures and sequence protocols. Show it:
SEQ ID No. 1 the nucleotide sequence of the H chain of an antibody according to the invention (phagemid clone PDG7), framework region (FR) 1 from bp 1-90, complement-determining region (CDR) 1 from bp 91-105, FR2 from bp 106-147, CDR2 from bp 148-195, FR3 from bp 196-291, CDR3 from bp 292-324 and FR4 from bp 325-357 are sufficient,
SEQ ID No. 2 the amino acid sequence to that in SEQ ID No. 1 represented nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-30, CDR1 from AS 31-35, FR2 from AS 36-49, CDR2 from AS 50-65, FR3 from AS 66-97, CDR3 from AS 98-108 and FR4 from AS 109-119 is enough
SEQ ID No. 3 shows the nucleotide sequence of the L chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone PDG7), FR1 from bp 1-60, CDR1 from bp 61-99, FR2 from bp 100-144, CDR2 from bp 145-165, FR3 from bp 166- 261, CDR3 from bp 262-294 and FR4 from bp 295-333 are sufficient,
SEQ ID No. 4 the amino acid sequence to that in SEQ ID No. 3 indicated nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-20, CDR1 from AS 21-33, FR2 from AS 34-48, CDR2 from AS 49-55, FR3 from AS 56-87, CDR3 from AS 88-98 and FR4 from AS 99-11 is sufficient
SEQ ID No. 5 shows the nucleotide sequence of the H chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone PDG13), FR1 from bp 1-90, CDR1 from bp 91-109, FR2 from bp 106-147, CDR2 from bp 148-198, FR3 from bp 199- 294, CDR3 from bp 295-336 and FR4 from bp 337-369,
SEQ ID No. 6 the amino acid sequence of the in SEQ ID No. 5 depicted nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-30, CDR1 from AS 31-35, FR2 from AS 36-49, CDR2 from AS 50-66, FR3 from AS 67-98, CDR3 from AS 99-112 and FR4 from AS 113-123 is enough
SEQ ID No. 7 shows the nucleotide sequence of the L chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone PGD13), FR1 from bp 1-60, CDR1 from bp 61-99, FR2 from bp 100-144, CDR2 from bp 145-165, FR3 from bp 166- 261, CDR3 from bp 262-294 and FR4 from bp 295-333 are sufficient,
SEQ ID No. 8 the amino acid sequence of the in SEQ ID No. 7 depicted nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-20, CDR1 from AS 21-33, FR2 from AS 34-48, CDR2 from AS 49-55, FR3 from AS 56-87, CDR3 from AS 88-98 and FR4 from AS 99-111 is sufficient
SEQ ID No. 9 shows the nucleotide sequence of the H chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone AI-X 16), FR1 from bp 1-90, CDR1 from bp 91-105, FR2 from bp 106-147, CDR2 from bp 148-198, FR3 from bp 199-288, CDR3 from bp 289-336 and FR4 from bp 337-369 are sufficient,
SEQ ID No. 10 the amino acid sequence of the in SEQ ID No. 9 depicted nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-30, CDR1 from AS 31-35, FR2 from AS 36-49, CDR2 from AS 50-66, FR3 from AS 67-96, CDR3 from AS 97-112 and FR4 from AS 113-123 is enough
SEQ ID No. 11 the nucleotide sequence of the L chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone AI-X16), FR1 from bp 1 to 60, CDR1 from bp 61-102, FR2 from bp 103-147, CDR2 from 148-168, FR3 from bp 169 -264, CDR3 from 265-291 and FR4 from bp 292-375 are sufficient,
SEQ ID No. 12 the amino acid sequence of the in SEQ ID No. 11 depicted nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-20, CDR1 from AS 21-34, FR2 from AS 35-49, CDR2 from AS 50-56, FR3 from AS 57-88, CDR3 from AS 89-97 and FR4 from AS 89-125 is enough
SEQ ID No. 13 the nucleotide sequence of the H chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone AI-X20), FR1 from bp 1-90, CDR1 from bp 91-105, FR2 from bp 106-147, CDR2 from bp 148-195, FR3 from bp 196-291, CDR3 from bp 292-333 and FR4 from bp 334-366 ranges,
SEQ ID No. 14 the amino acid sequence of the in SEQ ID No. 13 depicted nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-30, CDR1 from AS 31-35, FR2 from AS 36-49, CDR2 from AS 50-65, FR3 from AS 66-97, CDR3 from AS 98-111 and FR4 from AS 112-122 is enough
SEQ ID No. 15 the nucleotide sequence of the H chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone AI-X39), FR1 from bp 1-90, CDR1 from bp 91-105, FR2 from bp 106-147, CDR2 from pb 148-198, FR3 from bp 199-294, CDR3 from bp 295-339 and FR4 from 340-372 ranges,
SEQ ID No. 16 the amino acid sequence of the in SEQ ID No. 15 depicted nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1-30, CDR1 from AS 31-35, FR2 from AS 36-49, CDR2 from AS 50-66, FR3 from AS 67-98, CDR3 from AS 99-113 and FR4 from AS 114-124 is enough
SEQ ID No. 17 the nucleotide sequence of the H chain of a polypeptide according to the invention (phagemid clone AI-X40), FR1 from bp 1-90, CDR1 from bp 91-105, FR2 from bp 106-147, CDR2 from bp 148-198, FR3 from bp 199-297, CDR3 from bp 298-339 and FR4 from bp 340-372 ranges and
SEQ ID No. 18 the amino acid sequence of the in SEQ ID No. 17 depicted nucleotide sequence, wherein FR1 from AS 1 to 30, CDR1 from AS 31-35, FR2 from AS 36-49, CDR2 from AS 50-66, FR3 from AS 67-99, CDR3 from AS 100-113 and FR4 from AS 114-124 is enough

Fig. 1 die Hemmung der Bindung von Autoantikörper-Phabs (PDG-X) an GPIIb/IIIa durch Zusatz des antiidiotypischen Anti körper-Phab AI-X17. Fig. 1, the inhibition of the binding of autoantibody phabs (PDG-X) to GPIIb / IIIa by adding the anti-idiotypic anti-body Phab AI-X17.

Fig. 2 die Bindung von Autoantikörper-Phabs an unbehandelte und EDTA-behandelte Blutplättchen, Fig. 2 shows the binding of autoantibody Phabs of untreated and EDTA-treated blood platelets,

Fig. 3 die Hemmung der Fibrinogenbindung an GPIIb/IIIa durch Autoantikörper-Phabs, Fig. 3 shows the inhibition of fibrinogen binding to GPIIb / IIIa by autoantibody Phabs

Fig. 4-6 die Hemmung der Bindung von Autoantikörper-Phabs an GPIIb/IIIa durch den Antikörper 7E3 und das Antikörper fragment ReoPro®. Fig. 4-6, the inhibition of the binding of autoantibody Phabs to GPIIb / IIIa by the antibody 7E3 and the antibody fragment ReoPro®.

Examples 1. Identification of autoantibody sequences 1.1. Obtaining autoantibodies

Autoantikörper von 12 Patienten mit AITP (8 mit primärer AITP, 3 mit AITP assoziiert mit SLE, 1 mit AITP assoziiert mit Sjögren's Syndrom) wurden durch Inkubation von Patientenplasma über Nacht mit gereinigtem GPIIb/IIIa bei 4°C und anschließende Elution in 0,2 mol/l Glycin und 0,15 mol/l NaCl pH 2,5 für 15 min bei Raumtemperatur erhalten. Nach Zentrifugation für 30 min bei 100.000 g wurde der Überstand mit 1 mol/l Tris-HCl neutralisiert und über Nacht gegen Tris-gepufferte Salzlösung (TBS) dialysiert. Autoantibodies from 12 patients with AITP (8 with primary AITP, 3 with AITP associated with SLE, 1 associated with AITP with Sjögren's syndrome) by incubating patient plasma overnight with purified GPIIb / IIIa at 4 ° C and subsequent elution in 0.2 mol / l glycine and 0.15 mol / l NaCl Obtain pH 2.5 for 15 min at room temperature. After centrifugation for 30 min at 100,000 g, the supernatant was neutralized with 1 mol / l Tris-HCl and dialyzed overnight against Tris-buffered saline (TBS).

Zum Zeitpunkt der Plasmaentnahme waren alle Patienten thrombozytope nisch (Plättchenzahl < 150×10⁹/l) und hatten normale oder vergrößerte Megakaryozyten im Knochenmark und waren frei von anderen nachweisba ren Formen der Immunthrombozytopenie.At the time of plasma withdrawal, all patients were thrombocytopenic (platelet count <150 × 10 ⁹ / l) and had normal or enlarged megakaryocytes in the bone marrow and were free of other detectable forms of immune thrombocytopenia.

1.2. Obtaining purified antigens

Als Antigene wurden gereinigtes GPIIb/IIIa, ein zytoplasmatisches Fragment von GPIIIa (Aminosäuren 721-744) und ein extrazelluläres Fragment von GPIIIa (Aminosäuren 468-690) verwendet (Beardsley, Blut 59 (1989), 47-51 und Phillips et al., Methods Enzymol. 215 (1992), 244-263).Purified GPIIb / IIIa, a cytoplasmic fragment, were used as antigens of GPIIIa (amino acids 721-744) and an extracellular fragment of GPIIIa (amino acids 468-690) used (Beardsley, Blut 59 (1989), 47-51 and Phillips et al., Methods Enzymol. 215: 244-263 (1992).

1.3. Obtaining platelets for panning and immunoblotting

Aus EDTA-antikoagulierten Blutproben gesunder humander Spender wurde Plättchen-angereichertes Plasma durch differenzielle Zentrifugation hergestellt. Die Plättchen wurden durch Zentrifugation bei 2000 g für 15 min isoliert, sechsmal in Zitronensäurepuffer (pH 6,2) mit 50 mmol/l Natriumcitrat, 100 mmol/l NaCl und 125 mmol/l Dextrose gewaschen und schließlich im gleichen Puffer resuspendiert.Healthy human donors were made from EDTA-anticoagulated blood samples Platelet-enriched plasma by differential centrifugation manufactured. The platelets were centrifuged at 2000 g for Isolated for 15 min, six times in citric acid buffer (pH 6.2) at 50 mmol / l Sodium citrate, 100 mmol / l NaCl and 125 mmol / l dextrose washed and finally resuspended in the same buffer.

Thrombasthenische Plättchen wurden aus einem 14 Jahre alten, an Thrombasthenie Glanzmann Typ I erkrankten Jungen unter Verwendung des gleichen Anreicherungsprotokolls erhalten.Thrombasthenic platelets were made from a 14 year old Thrombasthenia Glanzmann type I diseased boy using the received the same enrichment protocol.

1.4. Monoclonal antibodies

Es wurden murine monoklonale Antikörper verwendet, welche die kom plexierte Form von GPIIb/IIIa erkennen, sowie Antikörper, die selektiv GPIIb oder GPIIIa erkennen. Diese Antikörper wurden mit üblichen Immunisie rungsprotokollen unter Verwendung der entsprechenden Antigene gewonnen und sind nicht AITP-assoziiert. Die Gewinnung solcher Antikörper ist bei Kouns et al. (J. Biol. Chem. 267 (1992), 18844-18851), Steiner et al. (Biochim. Biophys. Acta 1119 (1992), 12-21) und Häring et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 4837-4841) beschrieben.Murine monoclonal antibodies were used, which the com recognize plexed form of GPIIb / IIIa, as well as antibodies that selectively GPIIb or recognize GPIIIa. These antibodies were immunized with usual protocols using the appropriate antigens won and are not associated with AITP. Obtaining such antibodies is in Kouns et al. (1992, J. Biol. Chem. 267, 18844-18851), Steiner et al. (Biochim. Biophys. Acta 1119 (1992), 12-21) and Haering et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 4837-4841).

1.5. Phagemid library

Eine kombinatorische Fab-Bibliothek wurde nach der von Vogel et al. (Eur. J. Immunol. 24 (1994), 1200-1207) beschriebenen Methode hergestellt, wobei periphere Blutlymphozyten aus einem gesunden präimmunisierten humanen Spender verwendet wurden. Alle Enzyme und Oligonukleotide wurden von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland) mit Ausnahme der Taq Polymerase (Perkin Elmer, NJ, USA) bezogen. Die Primer für die PCR-Amplifikation der H-und L-Ketten der Fab-Moleküle, der VCSM 13 Helferphage und der Escherichia coli Stamm XL-Blue wurden von Stratacyte (La Jolla, CA, USA) bezogen. Das Phagemid pComb3 wurde vom Scripps Research Institute (La Jolla, CA, USA) bezogen. Die Klonierung, die Transformation in XL-Blue-Zellen und die Herstellung von Phabs erfolgte wie von Barbas III und Lerner, Methods: Companion Methods Enzymol. 2 (1991), 119) beschrieben. Die Phabs wurden mit 4% (w/v) Polyethylen glykol 8000 und 3% (w/v) NaCl präzipitiert und in PBS pH 7,4 resuspen diert. Die resultierende Expressionsbibliothek enthält 1×10⁷ Spezifitäten.A combinatorial Fab library was developed according to the method described by Vogel et al. (Eur. J. Immunol. 24 (1994), 1200-1207), using peripheral blood lymphocytes from a healthy preimmunized human donor. All enzymes and oligonucleotides were obtained from Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany) with the exception of Taq polymerase (Perkin Elmer, NJ, USA). The primers for the PCR amplification of the H and L chains of the Fab molecules, the VCSM 13 helper phage and the Escherichia coli strain XL-Blue were obtained from Stratacyte (La Jolla, CA, USA). The phagemid pComb3 was obtained from the Scripps Research Institute (La Jolla, CA, USA). The cloning, the transformation into XL blue cells and the production of phabs were carried out as described by Barbas III and Lerner, Methods: Companion Methods Enzymol. 2 (1991), 119). The phabs were precipitated with 4% (w / v) polyethylene glycol 8000 and 3% (w / v) NaCl and resuspended in PBS pH 7.4. The resulting expression library contains 1 × 10 ⁷ specificities.

1.6. Isolation of GPIIb / IIIa-specific phabs

GPIIb/IIIa-spezifische Phabs wurden durch insgesamt 5 Runden einer Affinitätsselektion ("Panning") hergestellt. Nach Präabsorption (negative Selektion) mit 5×10⁷ thrombasthenischen Plättchen wurden die Phabs mit 10⁸ normalen Plättchen für 45 min inkubiert (positive Selektion). Gebundene Phabs wurden dann mit 0,05 mol/l Natriumcitrat pH 2,5 eluiert und mit 1 mol/l Tris-Puffer neutralisiert. Nach jeder "Panning"-Runde wurde die Anreicherung von GPIIb/IIIa spezifischen Phabs durch Titration der Phagenkolonie-bildenden Einheiten verfolgt. Nach fünf Selektionsrunden wurde eine Anreicherung der eluierten Phabs um den Faktor von mehr als 100 gefunden.GPIIb / IIIa-specific phabs were prepared by a total of 5 rounds of affinity selection ("panning"). After pre-absorption (negative selection) with 5 × 10 ⁷ thrombasthenic platelets, the phabs were incubated with 10 ⁸ normal platelets for 45 min (positive selection). Bound phabs were then eluted with 0.05 mol / l sodium citrate pH 2.5 and neutralized with 1 mol / l Tris buffer. After each round of panning, the enrichment of GPIIb / IIIa-specific phabs was followed by titration of the phage colony-forming units. After five rounds of selection, an enrichment of the eluted phabs by a factor of more than 100 was found.

Der nach der vierten Selektionsrunde erhaltene Pool von Phabs wurde näher auf seine GPIIb/IIIa Spezifität analysiert. Hierzu wurden 40 Phab-Klone zufällig ausgewählt und ihre Bindespezifität in einem Immunodot-Assay ermittelt. 1 µl normale und thrombasthenische Plättchen (10⁹ ml) sowie gereinigtes GPIIb/IIIa (500 µg/ml) wurden auf Nitrozellulosestreifen (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) getropft. Die Streifen wurden in TBS mit 0,15% Casein (TBS-Casein) blockiert und dann über Nacht mit den in TBS-Casein verdünnten Phabs inkubiert. Nach drei Waschungen mit TBS-0,1% Tween 20 (TBS-Tween) wurden die gebundenen Phabs mit 4-Chlor-1-α naphthol (Merck, Darmstadt, Deutschland) nach Inkubation mit Mee rettichperoxidase-konjugiertem polyklonalem Kaninchen-Anti-Phage-Anti körper (Vogel et al., supra) verdünnt 1 : 1000 in TBS-Casein nach gewiesen.The pool of phabs obtained after the fourth round of selection was analyzed in more detail for its GPIIb / IIIa specificity. For this purpose, 40 Phab clones were selected at random and their binding specificity was determined in an immunodot assay. 1 ul normal and thrombasthenic platelets (10 ⁹ ml) and purified GPIIb / IIIa (500 ug / ml) were dropped on nitrocellulose strips (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). The strips were blocked in TBS with 0.15% casein (TBS-casein) and then incubated overnight with the phabs diluted in TBS-casein. After three washes with TBS-0.1% Tween 20 (TBS-Tween), the bound phabs were treated with 4-chloro-1-α naphthol (Merck, Darmstadt, Germany) after incubation with horseradish peroxidase-conjugated polyclonal rabbit anti-phage Antibodies (Vogel et al., Supra) diluted 1: 1000 in TBS-casein.

Die Bindung von Phabs an Plättchen und gereinigtes GPIIb/IIIa wurde auch nach Denaturierung der Proteine durch Erhitzen (70°C) oder durch Säurebehandlung (pH 2 mit 0,5 N HCl) vor dem Auftropfen getestet.The binding of phabs to platelets and purified GPIIb / IIIa was also improved after denaturing the proteins by heating (70 ° C) or by Acid treatment (pH 2 with 0.5 N HCl) tested before dropping.

Von den 40 zufällig ausgewählten Klonen reagierten 23 (57,5%) mit GPIIb/IIIa, während 17 keine Bindung zeigten. Nach Denaturierung des Antigens durch Hitze oder pH 2 vor der Inkubation wurde keine Bindung von Anti-GPIIb/IIIa an Phabs beobachtet, wodurch gezeigt wird, daß intaktes GPIIb/IIIa für die Phab-Bindung notwendig ist. Fab-Bestimmung an negativen Phabs zeigte keine Fab-Moleküle bei 15 Klonen (88%). Die zwei Fab positiven Klone ohne Bindung an GPIIb/IIIa könnten eine geringe Bindeaffini tät für GPIIb/IIIa aufweisen. Of the 40 randomly selected clones, 23 (57.5%) reacted GPIIb / IIIa, while 17 showed no binding. After denaturing the No antigen was bound by heat or pH 2 before incubation Anti-GPIIb / IIIa observed on phabs, showing that intact GPIIb / IIIa is necessary for Phab binding. Fab determination on negative Phabs showed no Fab molecules in 15 clones (88%). The two Fab positive clones without binding to GPIIb / IIIa could have a low binding affinity for GPIIb / IIIa.

1.7. Fab analysis

Zum Test der positiven Phabs auf kappa (κ), lambda (λ) und Fd-Ketten wurden die Anti-GPIIb/IIIa Phabs auf Nitrozellulose getropft. Die Filter wurden 4 Stunden lang mit Peroxidase-markiertem Maus-anti-Human-λ-, -κ- (The Binding Site Limited, Birmingham, England) und -Fd-Antikörper (aus der Myelomazellinie HP6045, ATCC1757, Rockville, MD, USA) verdünnt 1 : 1000 in TBS-Casein inkubiert und mit Chemielumineszenz (ECL, Amersham, Schweiz, Zürich, Schweiz) entwickelt. Ein Test von 15 zufällig ausgewählten Anti-GPIIb/IIIa Fab-Klonen auf κ, λ und Fd-Ketten ergab das Vorhandensein einer Fd-Kette in 12 Klonen (80%) und der λ-Kette in allen Klonen.For testing the positive phabs on kappa (κ), lambda (λ) and Fd chains the anti-GPIIb / IIIa phabs were dropped onto nitrocellulose. The filters were treated with peroxidase-labeled mouse anti-human-λ-, -κ- (The Binding Site Limited, Birmingham, England) and -Fd antibodies (from the Myeloma cell line HP6045, ATCC1757, Rockville, MD, USA) Incubated 1: 1000 in TBS casein and with chemiluminescence (ECL, Amersham, Switzerland, Zurich, Switzerland). A test of 15 randomly Selected anti-GPIIb / IIIa Fab clones on κ, λ and Fd chains gave this Presence of an Fd chain in 12 clones (80%) and the λ chain in all Clone.

Eine quantitative Bestimmung der Fab-Bindung an GPIIb/IIIa auf Plättchen erfolgt durch Präinkubation gepoolter Phabs mit Plättchen in verschiedenen Konzentrationen. Der Überstand wurde dann durch ein Immunodotverfahren analysiert. Dabei wurde festgestellt, daß 1 bis 3×10⁴ Phabs pro Plättchen binden. Dies weist darauf hin, daß ungefähr 10 bis 50% der GPIIb/IIIa Moleküle pro Plättchen durch Phabs besetzt werden können.The Fab binding to GPIIb / IIIa on platelets is quantified by preincubating pooled phabs with platelets in various concentrations. The supernatant was then analyzed by an immunodot method. It was found that 1 to 3 × 10 ⁴ phabs bind per plate. This indicates that about 10 to 50% of the GPIIb / IIIa molecules per plate can be occupied by phabs.

1.8. Characterization of the phab binding epitopes

Die Epitopspezifität von Phabs wurde durch einen Inhibitiontest unter Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper (siehe Punkt 4) bestimmt. 1 µl aufgetaute normale und thrombasthenische Plättchen (10⁹/ml), gereinigtes GPIIb/IIIa (500 µg/ml), ein Peptidfragment von GPIIIa (Aminosäuren 468-690, 500 µg/ml) und der cytoplasmatische Abschnitt von GPIIb/IIIa (500 µg/ml) wurden jeweils in Doppelansätzen auf Nitrozel lulosestreifen aufgetropft. Nach der Blockierung wurden die Phab-Klone (0,4 µg/ml Fab) über Nacht mit oder ohne monoklonalen Antikörper (1 µg/ml) inkubiert. Die gebundenen Phabs wurden durch Peroxidase markierten Anti-PHage-Antikörper und 4-Chlor-1-α-naphthol nachgewiesen. The epitope specificity of Phabs was determined by an inhibition test using various monoclonal antibodies (see point 4). 1 µl thawed normal and thrombasthenic platelets (10 ⁹ / ml), purified GPIIb / IIIa (500 µg / ml), a peptide fragment of GPIIIa (amino acids 468-690, 500 µg / ml) and the cytoplasmic section of GPIIb / IIIa (500 µg / ml) were added in duplicate to nitrocellulose strips. After blocking, the Phab clones (0.4 µg / ml Fab) were incubated overnight with or without monoclonal antibody (1 µg / ml). The bound phabs were detected by peroxidase-labeled anti-PHage antibody and 4-chloro-1-α-naphthol.

Bei diesen Untersuchungen wurden 2 Gruppen von Phabklonen identifiziert. Gruppe A (5 Klone) wurde mäßig durch einen Pool aller Antikörper, aber stark durch GPIIb/IIIa-Komplex-spezifische Antikörper inhibiert. Anti-GPIIb Antikörper hatten keinen Effekt. Gruppe B (10 Klone) wurde vollständig durch den Pool aller Antikörper, aber weniger durch den komplexspezifi schen Antikörper und auch durch den IIb spezifischen Antikörper inhibiert. Keine Gruppe zeigte Reaktion mit GPIIIa spezifischen Antikörpern. Gleiche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Plättchen oder gereinigtem GPIIb/IIIa als Antigen erhalten. Es wurde keine Phab-Bindung an das cytoplasmatische Peptid oder das extrazelluläre Fragment von GPIIIa gefunden.Two groups of phabclones were identified in these studies. Group A (5 clones) was moderated by a pool of all antibodies, however strongly inhibited by GPIIb / IIIa complex-specific antibodies. Anti-GPIIb Antibodies had no effect. Group B (10 clones) became complete by the pool of all antibodies, but less by the complex-specific antibodies and also inhibited by the IIb-specific antibody. No group showed a reaction with GPIIIa specific antibodies. Same Results were obtained using platelets or cleaned Obtained GPIIb / IIIa as an antigen. There was no phab binding to that cytoplasmic peptide or the extracellular fragment of GPIIIa found.

Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in Tabelle 1 gezeigt. A summary of these results is shown in Table 1.

1.9. Inhibition studies

Die Blockierung der Bindung von Autoantikörpern aus Patienten an GPIIb/IIIa durch die gefundenen anti-GPIIb/IIIa Phabs wurde durch Inhibierungsunter suchungen ermittelt. Hierzu wurden zwei der wie zuvor beschrieben identifi zierten Phabklone (PDG 16, PDG3 1) verwendet.Blocking the binding of autoantibodies from patients to GPIIb / IIIa by the anti-GPIIb / IIIa phabs found was inhibited by searches determined. For this purpose, two of the ones described above were identified graced phab clones (PDG 16, PDG3 1) used.

Serielle Verdünnungen von 1 : 3 bis 1 : 1000 der eluierten Autoantikörper aus Patienten wurden auf die Bindung an gereinigtes GPIIb/IIIa analysiert. Hierzu wurde ein Immunodotassay durchgeführt. 100 ng gereinigtes GPIIb/IIIa wurde in jeweils dreifachen Ansätzen auf Nitrozellulosestreifen getropft und die Filter mit TBS-Casein blockiert. Zur Blockierung der AITP Autoanti körper-Bindung an GPIIb/IIIa durch Phabs wurden die Streifen 1 h lang mit 10¹¹ Phabs und anschließend 4 h lang mit AITP Autoantikörpern in variablen Verdünnungen inkubiert. Gebundene Autoantikörper wurden durch Peroxidase-markierten Anti-human-IgG-Fc Antikörper und ECL nach gewiesen.Serial dilutions of 1: 3 to 1: 1000 of the eluted autoantibodies from patients were analyzed for binding to purified GPIIb / IIIa. For this an immunodotassay was carried out. 100 ng of purified GPIIb / IIIa was added in triplicate to nitrocellulose strips and the filters were blocked with TBS-casein. To block AITP autoantibody binding to GPIIb / IIIa by phabs, the strips were incubated with 10 ¹¹ phabs for 1 h and then with AITP autoantibodies in variable dilutions for 4 h. Bound autoantibodies were detected by peroxidase-labeled anti-human-IgG-Fc antibodies and ECL.

Die Bindung von Autoantikörpern aus 8 AITP Patienten wurde durch Anti-GPIIb/IIIa Phabs inhibiert. Der Inhibierungsbereich war 10 bis 46%, 32 bis 60% und 20 bis 67% für PTG1 6, PTG31 bzw. den Pool der beiden Phabs. Die Bindung von Autoantikörpern aus 4 AITP Patienten wurde durch diese Phabs nicht verändert. In beiden Gruppen waren Autoantikörper von Patienten mit primärer und krankheitsassoziierter AITP.Binding of autoantibodies from 8 AITP patients was achieved by Anti-GPIIb / IIIa phabs inhibited. The inhibition range was 10 to 46%, 32 to 60% and 20 to 67% for PTG1 6, PTG31 and the pool of the two phabs. The binding of autoantibodies from 4 AITP patients was achieved by this Phabs haven't changed. Autoantibodies were found in both groups Patients with primary and disease-related AITP.

Eine Zusammenfassung der erhaltenen Ergebnisse ist in Tabelle 2 gezeigt. A summary of the results obtained is shown in Table 2.

Tabelle 2 Table 2

1.10. DNA sequence analysis

Plasmid DNA wurde aus vier Phabklonen der Gruppe A und 4 Klonen der Gruppe mit dem Nukleobond® AX Reinigungskit PC 20 (Macherey-Nagel AG, Oensingen, Schweiz) gereinigt. Plasmid DNA was obtained from four group A phab clones and four clones of Group with the nucleobond® AX cleaning kit PC 20 (Macherey-Nagel AG, Oensingen, Switzerland) cleaned.

Die Nukleinsäuresequenzierung erfolgte auf einen ABI373A Sequenziersy stem unter Verwendung eines PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit. Die Primer wurden von Microsynth, Balgach, Schweiz bezogen. Zur Sequenzierung der H Kette wurden folgende Primer ver wendet: Chγ1 (5'-CGC TGT GCC CCC AGA GGT-3') und PCH (5'-GGC CGC AAA TTC TAT TTC AAG G-3'). Zur Sequenzierung der L-Kette wurden folgende Primer verwendet: Cλ (5'-GAG ACA CAC CAG TGT GGC-3'), Ck (5'-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3') und PCL(5'-CTA AAC TAG CTA GTC TCC-3'). Die von der DNA Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit der GenEMBL-Genbank verglichen und Stammlinien VH und Vλ Familien zugeordnet.Nucleic acid sequencing was carried out on an ABI373A sequencing system stem using a PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle sequencing kit. The primers were from Microsynth, Balgach, Switzerland based. The following primers were used to sequence the H chain uses: Chγ1 (5'-CGC TGT GCC CCC AGA GGT-3 ') and PCH (5'-GGC CGC AAA TTC TAT TTC AAG G-3 '). Sequencing of the L chain was carried out following primers used: Cλ (5'-GAG ACA CAC CAG TGT GGC-3 '), Ck (5'-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3 ') and PCL (5'-CTA AAC TAG CTA GTC TCC-3 '). The amino acid sequences derived from the DNA sequence were compared with the GenEMBL library and stem lines VH and Vλ Assigned to families.

Die VH und Vλ Nukleotidsequenzen der 4 Phabklone jeder Gruppe (Gruppe A: PDG7, PDG8, PDG10, PDG16; Gruppe B: PDG13, PDG17, PDG31, PTG37) wurden durch automatisierte Sequenzierung analysiert und mit bekannten Stammlinien-Gensequenzen verglichen (Tabellen 3 und 4). Innerhalb jeder Gruppe war 100% Homologie in den abgeleiteten Amino säuresequenzen der H- und L-Ketten. Im Gegensatz dazu war die Homologie zwischen Gruppe A und B nur 36,9% für die H-Kette und 81,9% für die L-Ketten-Aminosäurensequenzen.The VH and Vλ nucleotide sequences of the 4 phabclones of each group (group A: PDG7, PDG8, PDG10, PDG16; Group B: PDG13, PDG17, PDG31, PTG37) were analyzed by automated sequencing and with known stem line gene sequences compared (Tables 3 and 4). Within each group there was 100% homology in the deduced amino acid sequences of the H and L chains. In contrast to that was the homology between groups A and B only 36.9% for the H chain and 81.9% for the L chain amino acid sequences.

In der H-Kette zeigen Klone der Gruppe A den höchsten Grad an Sequenzi dentität mit dem Stammliniengen VH4.11 der V_H4 Familie (Sanz, et al. EMBO J. 8 (1989), 3741-3748). Es gab 7 Aminosäureunterschiede in der Frameworkregion (FR) und 8 in der Komplement-bestimmenden Region (CDR). Klone der Gruppe B unterschieden sich von der am meisten homolo gen Stammliniensequenz 1.9III der V_H3-Familie (Berman et al., EMBO J. 7 (1988), 727-738) durch vier Aminosäuren in FR und eine in CDR.In the H chain clones show the group A the highest degree of Sequenzi DENTITY with the Stammliniengen VH4.11 the V _H 4 family (Sanz, et al. EMBO J. 8 (1989), 3741-3748). There were 7 amino acid differences in the framework region (FR) and 8 in the complement-determining region (CDR). Group B clones differed from the most homologous stem line sequence 1.9III of the V _H 3 family (Berman et al., EMBO J. 7 (1988), 727-738) by four amino acids in FR and one in CDR.

In der L-Kette zeigten die Klone der Gruppe A und B die höchste Homologie zu der Stammliniengensequenz der DPL2 der V_λ I Familie (Williams und Winter, Eur. J. Immunol. 323 (1993), 1456). Es gab neun Aminosäureun terschiede in FR und zehn in CDR für Klone der Gruppe A und einen in FR und zwei in CDR für Klone der Gruppe B. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefaßt. In the L-chain clones of group A and B showed the highest homology to the Stammliniengensequenz the DPL2 the V _λ I family (Williams and Winter, Eur. J. Immunol. 323 (1993), 1456). There were nine amino acid differences in FR and ten in CDR for group A clones and one in FR and two in CDR for group B clones. The results obtained are summarized in Tables 3 and 4.

Tabelle 4 zeigt die Zuordnung von Klonen der Gruppe A und B zu bekannten Stammlinien V-Gensequenzen nach der Aminosäurehomologie Table 4 shows the assignment of clones of groups A and B to known stem lines V gene sequences according to the amino acid homology

2. Identification of anti-idiotypic antibody sequences

Nach der in Beispiel 1 angegebenen Methode wurden durch die Phagemid technik Sequenzen für antiidiotypische Antikörper identifiziert. Dabei wurde der in Beispiel 1 selektionierte Klon PDG16 als Antigen verwendet. Eine negative Vorselektion fand nicht statt.According to the method given in Example 1, the phagemid technical sequences for anti-idiotypic antibodies identified. It was the clone PDG16 selected in Example 1 is used as the antigen. A negative preselection did not take place.

Es wurde ein Pool von kombinatorischen Phab-Bibliotheken, die Spezifitäten einer nichtimmunen und einer mit roten Blutzellen immobilisierten Bibliothek peripherer B-Lymphozyten und einer nichtimmunen Bibliothek von B-Lymphozyten aus Tonsillen verwendet.There has been a pool of combinatorial phab libraries that have specificities a nonimmune and a library immobilized with red blood cells peripheral B lymphocytes and a non-immune library of B-lymphocytes from tonsils used.

Der nach der vierten Panningrunde erhaltene Pool von Phabs wurde analysiert. Hierzu wurden 40 Phab-Klone zufällig ausgewählt und ihre Bindespezifität ermittelt. 25 der ausgewählten Klone reagierten mit Anti-GPIIb/IIIa-Phab. Diese antiidiotypischen Phab-Klone gehörten zu zwei Gruppen: Gruppe I (drei Klone) zeigte eine Reaktion ausschließlich mit Autoantikörper-Phab-Klonen der Gruppe A (PDG 7, 8, 10 und 16), während die Phab-Klone der Gruppe II (insgesamt 22 Klone) sowohl mit Phab-Klonen der Gruppen A und B, mit murinen monoklonalen Anti-GPIIb/IIIa-Antikörpern, mitgereinigtem Serumimmunglobulin (IVIgG) oder F(ab')₂ Fragmenten davon und mit Anti-IgE-Fab reagieren. 14 Phab-Klone (Gruppe III) reagierten mit keiner der genannten Substanzen. Ein Phab-Klon der Gruppe IV reagierte nur mit Anti-GPIIb/IIIa Antikörpern. Die Ergebnisse dieser Spezifitätsunter suchungen sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.The pool of phabs obtained after the fourth round of panning was analyzed. For this purpose, 40 Phab clones were selected at random and their binding specificity was determined. 25 of the selected clones reacted with anti-GPIIb / IIIa phab. These anti-idiotypic phab clones belonged to two groups: group I (three clones) showed a reaction only with autoantibody phab clones from group A (PDG 7, 8, 10 and 16), while the phab clones from group II (total 22 clones) react both with group A and B phab clones, with murine monoclonal anti-GPIIb / IIIa antibodies, with purified serum immunoglobulin (IVIgG) or F (ab ') ₂ fragments thereof and with anti-IgE Fab. 14 Phab clones (group III) did not react with any of the substances mentioned. A group IV phab clone reacted only with anti-GPIIb / IIIa antibodies. The results of these specificity studies are summarized in Table 5.

Eine DNA-Sequenzanalyse von Phab-Klonen der Gruppe I (AI-X16, 17 und 24) zeigte in den für die schwere Kette kodierenden Sequenzen eine bis auf eine Aminosäure in der CDR2 Region vollständige Identität und in den für die leichte Kette kodierenden Sequenzen eine vollständige Identität. Ein Vergleich mit bekannten Stammlinien-Gensequenzen zeigte ca. 85% Homologie zur H-Ketten-Sequenz VH3 und ca. 90% Homologie zur Sequenz der L-Kettenfamilie V-λII. Von den Phab-Klonen der Gruppen II, III und IV wurde eine DNA-Sequenzanalyse des H-Kettengens jeweils an einem Vertreter durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Sequenzanalyse und des Vergleichs mit bekannten Stammlinien-Gensequenzen ist in den Tabellen 6 und 7 zusammengefaßt.DNA sequence analysis of group I phab clones (AI-X16, 17 and 24) showed one up to in the sequences coding for the heavy chain an amino acid in the CDR2 region full identity and in the for the light chain coding sequences have full identity. A Comparison with known stem line gene sequences showed approx. 85% Homology to the H chain sequence VH3 and approx. 90% homology to the sequence the L chain family V-λII. Group II, III and IV Phab clones DNA sequence analysis of the H chain gene was carried out on each Representative carried out. The results of this sequence analysis and the Comparison with known stem line gene sequences is in Table 6 and 7 summarized.

Das Ergebnis einer Inhibitionsuntersuchung ist in Fig. 1 dargestellt. Es wurde gefunden, daß der Phab AI-X17 (Gruppe I) die Bindung von Auto antikörper-Phabs der Gruppe A (PDG-X) an das Glykoprotein IIb/IIIa hemmen kann. The result of an inhibition study is shown in FIG. 1. It has been found that the Phab AI-X17 (Group I) can inhibit the binding of Group A autoantibody phabs (PDG-X) to the glycoprotein IIb / IIIa.

3. Influence of autoantibody polypeptides on the binding of Fibrinogen on platelets 3.1 methods Analysis of Fab binding to EDTA-pretreated platelets

Ein an Blutplättchen reiches Plasma wurde 30 min mit 10 mM EDTA inkubiert. Biotinylierte PDG-B und PDG-A Polypeptide wurden zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bindung von PDG-A und PDG-B an Blutplättchen wurden mittels durchflußzytometrischer Analyse unter Verwendung von Phycoerythrin-markiertem Streptavidin gemessen.Platelet-rich plasma was exposed to 10 mM EDTA for 30 min incubated. Biotinylated PDG-B and PDG-A polypeptides were added and incubated for 1 h at room temperature. The binding of PDG-A and Platelet PDG-B were determined by flow cytometric analysis measured using phycoerythrin-labeled streptavidin.

Aggregation experiments

An Blutplättchen reiches Plasma (250×10⁹/l) wurde frisch hergestellt und unter 5% CO₂ gehalten. Das Plasma wurde durch unterschiedliche Verdünnungen an ADP (maximale Konzentration 410 µM) in Abwesenheit oder in Gegenwart von PDG-A oder PDG-B (maximale Menge 10 µg Fab) aktiviert. Die Aggregation wurde in einem Aggregometer Rodell 300BD-5 (Baxter AG, Düdingen, CH) gemessen. In weiteren Experimenten wurde nach Zugabe von PDG-A oder PDG-B polyklonales Anti-Fab-Antiserum zu den aktivierten Plättchen gegeben.Platelet-rich plasma (250 × 10 ⁹ / l) was freshly prepared and kept under 5% CO ₂ . The plasma was activated by different dilutions of ADP (maximum concentration 410 µM) in the absence or in the presence of PDG-A or PDG-B (maximum amount 10 µg Fab). The aggregation was measured in a Rodell 300BD-5 aggregometer (Baxter AG, Düdingen, CH). In further experiments, polyclonal anti-Fab antiserum was added to the activated platelets after addition of PDG-A or PDG-B.

Fibrinogen binding test

Vertiefungen von ELISA-Platten wurden mit 0,5 µg/ml GPIIb/IIIa beschichtet und mit 3,5% Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Salzlösung blockiert. Dann wurde Fibrinogen (Kabi Diagnostics, Stockholm, Schweden) in unter schiedlichen Konzentrationen (maximal 0,08 µg/ml) in Abwesenheit oder in Gegenwart von PDG-A, PDG-B oder Anti-IgE Fab zur Kontrolle zugegeben (maximale Konzentrationen 23 µg/ml). Das gebundene Fibrinogen wurde mit Ratten-Anti-Humanfibrogen-Antikörper, biotinyliertem Maus-Anti-Ratten-Anti körper und einem Konjugat aus Streptavidin und biotinylierter Meerret tichperoxidase (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Dübendorf, CH) unter Verwendung eines ELISA-Easy-Ablesegeräts (EAR340AT, SLT-Instruments, Österreich) bei 405 nm gemessen.Wells of ELISA plates were coated with 0.5 µg / ml GPIIb / IIIa and blocked with 3.5% bovine serum albumin in Tris-buffered saline. Then fibrinogen (Kabi Diagnostics, Stockholm, Sweden) was in under different concentrations (maximum 0.08 µg / ml) in the absence or in Presence of PDG-A, PDG-B or anti-IgE Fab added for control (maximum concentrations 23 µg / ml). The bound fibrinogen was with Rat anti-human fibrogen antibody, biotinylated mouse anti-rat anti body and a conjugate of streptavidin and biotinylated meerret tichperoxidase (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Dübendorf, CH) using an ELISA Easy reader (EAR340AT, SLT-Instruments, Austria) measured at 405 nm.

Competition assay using the 7E3 monoclonal antibody and the antibody fragment ReoProo®

An Plättchen reiches Plasma (230×10⁹/l) wurde für 1,5 h mit PDG-B oder PDG-A (200 bzw. 400 µg/ml) mit oder ohne dem murinen monoklonalen Antikörper 7E3 oder dessen Fab-Fragment ReoPro® (Gesamtmenge an Fab im Bereich von 1014 bis 1010) inkubiert. Nach Fixieren mit einem gleichen Volumen an 1% Paraformaldehyd wurde die Bindung von PDG-B und PDG-A an Plättchen mittels durchflußzytometrischer Analyse unter Verwendung von Phycoerythrin-markiertem Streptavidin gemessen.Platelet-rich plasma (230 × 10 ⁹ / l) was treated for 1.5 h with PDG-B or PDG-A (200 or 400 µg / ml) with or without the murine monoclonal antibody 7E3 or its Fab fragment ReoPro® (Total amount of Fab in the range of 1014 to 1010) incubated. After fixation with an equal volume of 1% paraformaldehyde, the binding of PDG-B and PDG-A to platelets was measured by flow cytometric analysis using phycoerythrin-labeled streptavidin.

3.2 results

Die getesteten rekombinanten Anti-GPIIb/IIIa Fab Autoantikörperfragmente zeigen keine Bindung an Blutplättchen, die mit 10 mM EDTA vorbehandelt worden waren. Dies zeigt, daß die Autoantikörperfragmente nur ein in seiner Konformation intaktes Antigen erkennen (Fig. 2).The recombinant anti-GPIIb / IIIa Fab autoantibody fragments tested showed no binding to platelets which had been pretreated with 10 mM EDTA. This shows that the autoantibody fragments recognize only an antigen that is intact in its conformation ( FIG. 2).

In Aggregationexperimenten, bei denen an Plättchen angereichertes Plasma verwendet wurde, zeigten PDG-A oder PDG-B keine Hemmung der Aggregation. In einem Fibrinogenbindetest, bei dem die Fibrinogenkonzen tration 10⁴ bis 10⁶ mal geringer als in Serum ist, wurde die Fibrinogenbin dung durch PDG-A und PDG-B vollständig gehämmt (Fig. 3). Bei Ver wendung von Anti-IgE Fab als Kontrolle, das durch ein ähnliches Anreiche rungsprotokoll erhalten wurde, trat keine Hemmung auf. Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl PDG-A als auch PDG-B eine starke Wechselwirkung mit der Fibrinogenbindestelle auf GPIIb/IIIa zeigen.In aggregation experiments using platelet-enriched plasma, PDG-A or PDG-B showed no inhibition of aggregation. In a fibrinogen binding test in which the fibrinogen concentration is 10 ⁴ to 10 ⁶ times lower than in serum, the fibrinogen binding was completely inhibited by PDG-A and PDG-B ( FIG. 3). No inhibition occurred when anti-IgE Fab was used as a control obtained by a similar enrichment protocol. These results show that both PDG-A and PDG-B show strong interaction with the fibrinogen binding site on GPIIb / IIIa.

In Untersuchungen mit dem murinen monoklonalen Anti-GPIIb/IIIa Antikörper 7E3 und dessen kommerziell erhältlichen Fab-Fragment ReoPro®, die beide die Fibrinogenbindung an aktiviertes GPIIb/IIIa hemmen, wurde eine selektive und vollständige Hemmung der PDG-B Bindung an Blutplättchen gefunden (Fig. 4 bis 6). In Gegensatz dazu wurde die Bindung von PDG-A an Blutplättchen weder durch 7E3 noch durch ReoPro® signifikant gehemmt. In studies with the murine monoclonal anti-GPIIb / IIIa antibody 7E3 and its commercially available Fab fragment ReoPro®, both of which inhibit fibrinogen binding to activated GPIIb / IIIa, a selective and complete inhibition of PDG-B binding to platelets was found ( Fig . 4 to 6). In contrast, the binding of PDG-A to platelets was not significantly inhibited by either 7E3 or ReoPro®.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Nucleic acid encoding the heavy chain of a human antibody, a functional derivative or a fragment thereof and comprising a CDR3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
VLPFDPISMDV (1)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
ALGSWGGWDHYMDV (II)
coding nucleotide sequence,
(c) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a) or (b) and
(d) a nucleotide sequence coding for an amino acid sequence with an equivalent binding ability to GPIIb / IIIa.

2. The nucleic acid according to claim 1, further comprising a CDR1 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
GYSWR (III)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
SYAMH (IV)
coding nucleotide sequence, and
(c) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a), or (b).

3. Nucleic acid according to one of claims 1 or 2, further comprising a CDR2 region selected from

(a) one for the amino acid sequence:
DISYSGSTKYKPSLRS (V)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
VISYDGSNKYYADSVKG (VI)
coding nucleotide sequence and
(c) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a) or (b).

4. Nucleic acid encoding the light chain of a human antibody, a functional derivative or a fragment thereof and comprising a CDR 3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
ATWDDGLNGPV (VII)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
AAWDDSLNGWV (VIII)
coding nucleotide sequence,
(c) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a) or (b), and
(d) a nucleotide sequence coding for an amino acid sequence with an equivalent binding ability to GPIIb / IIIa.

5. The nucleic acid according to claim 4, further comprising a CDR1 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
SGSSSNIRSNPVS (IX)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
SGSSSNIGSNTVN (X)
coding nucleotide sequence, and
(c) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a) or (b).

6. Nucleic acid according to one of claims 4 or 5, further comprising a CDR2 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
GSHQRPS (XI)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
SNNQRPS (XIII)
coding nucleotide sequence, and
(c) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a) or (b).

7. Nucleic acid encoding the heavy chain of a human antibody, a functional derivative or a fragment thereof and comprising a CDR3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
VRDLGYRVLSTFTFDI (XIV)
coding nucleotide sequence,
(b) one for the amino acid sequence:
DGRSGSYARFDGMDV (XV)
coding nucleotide sequence,
(c) one for the amino acid sequence:
MGSSVVATYNAFDI (XVI)
coding nucleotide sequence,
(d) one for the amino acid sequence:
DADGDGFSPYYFPY (XVII)
coding nucleotide sequence,
(e) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a), (b), (c) or (d) and
(f) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with an equivalent binding ability to autoantibodies against GPIIb / IIIa.

8. The nucleic acid of claim 7, further comprising a CDR1 or / and CDR2 region selected from one for that in Tab. 7 amino acid sequences shown or at least 80% homolo gene coding for the amino acid sequence.

9. A nucleic acid encoding a human antibody light chain, a functional derivative or a fragment thereof and comprising a CDR 3 region selected from:

(a) one for the amino acid sequence:
CSYVHSSTN (XVIII)
coding nucleotide sequence,
(b) a nucleotide sequence which codes for an amino acid sequence with a homology of at least 80% to an amino acid sequence from (a), and
(c) a nucleotide sequence coding for an amino acid sequence with an equivalent binding ability to autoantibodies against GPIIb / IIIa.

10. The nucleic acid of claim 9, further comprising a CDR1 or / and CDR2 region selected from one for that in Tab. 7 amino acid sequences shown or at least 80% homolo gene coding for the amino acid sequence.

11. Vector, characterized in that it

(a) contains at least one copy of a nucleic acid according to one of claims 1 to 3 or / and at least one copy of a nucleic acid according to one of claims 4 to 6 or
(b) contains at least one copy of a nucleic acid according to claim 7 or 8 or / and at least one copy of a nucleic acid according to claim 9 or 10.

12. Cell, characterized in that it

(a) a nucleic acid according to one of claims 1 to 3 or / and a nucleic acid according to one of claims 4 to 6 or
(b) expressing a nucleic acid according to claim 7 or 8 or / and a nucleic acid according to claim 9 or 10.

13. polypeptide, characterized in that it

(a) of a nucleic acid according to one of claims 1 to 3 or / and a nucleic acid according to one of claims 4 to 6 or
(b) is encoded by a nucleic acid according to claim 7 or 8 or / and a nucleic acid according to claim 9 or 10.

14. The polypeptide according to claim 13, characterized, that it is the variable domain of the H chain and / or the variable Domain of the L chain of a human antibody.

15. The polypeptide according to claim 14, characterized, that it is both the variable domain of the H chain and the variable Domain of the L chain includes.

16. Polypeptide according to one of claims 13 to 15, characterized, that it is linked to a labeling group or a toxin.

17. Antibody against a polypeptide according to any one of claims 13 to 16.

18. Antibody according to claim 17, characterized, that he is against the CDR3 region of heavy or / and light Antibody chain of the polypeptide is directed.

19. Pharmaceutical composition, which as an active component Nucleic acid according to one of claims 1 to 10, a vector according to Claim 11, a cell according to Claim 12, a polypeptide according to one of claims 13 to 16 or an antibody according to any one of Claims 17 or 18, optionally together with others active components and pharmaceutically customary auxiliary, Contains additives or carriers.

20. Use of a nucleic acid according to one of claims 1 to 10 a vector according to claim 11, a cell according to claim 12, of a polypeptide according to any one of claims 13 to 16, one Antibody according to claim 17 or 18 or a pharmaceutical A composition according to claim 19 for the manufacture of an agent for the diagnosis or for the treatment or prevention of AITP.

21. Use of a nucleic acid according to one of claims 1 to 10, a vector according to claim 11, a cell according to claim 12, of a polypeptide according to any one of claims 13 to 16 or one Pharmaceutical composition according to claim 19 for Preparation of an agent for influencing the binding of fibrino on platelets.

22. Use according to claim 21 for the preparation of an agent for the Modulation of blood clotting, especially for the dissolution of Thrombi or / and for the prevention of thrombus formation.