DE19814001A1

DE19814001A1 - Fluorescent nucleic acid amplification assay, useful for detection of viral, bacterial, cellular, yeast or fungal nucleic acids

Info

Publication number: DE19814001A1
Application number: DE19814001A
Authority: DE
Inventors: Christoph Kessler; Gerd Haberhausen; Hans-Georg Batz; Henrik Orum
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-03-28
Filing date: 1998-03-28
Publication date: 1999-09-30

Abstract

An assay for a nucleic acid is new and comprises an amplification reaction using two non-overlapping primers, a polymerase with 5'-nuclease activity and a probe with reporter groups and quencher groups that binds a region other than that bound by the primers. The reaction generates products of less than 100 nucleotides. An assay for a nucleic acid is new and comprises generating amplification products with a length of less than 100 nucleotides using a first primer capable of binding to a first sequence (A) in one strand of the target nucleic acid and a second primer capable of binding to a second sequence (C') that is complementary to a non-overlapping sequence (C) that is 3' to sequence A. This is performed in the presence of a polymerase with 5'-nuclease activity and a probe capable of binding to a third sequence (B) located between sequences A and C, or its complement (B'), where the probe has a reporter group and a quencher group. The signal generated by the reporter group is then measured.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, bei dem eine Amplifikation eines Teilstückes dieser Nukleinsäuren vorgenommen wird und wobei dieses Teilstück im Hinblick auf seine Basensequenz bestimmte Bedingungen erfüllen muß, sowie ein Reagenzkit enthaltend zwei Primer und eine Sonde, die dieses Teilstück definieren.The invention relates to a method for the detection of nucleic acids, in which a Amplification of a portion of these nucleic acids is carried out and this Section must meet certain conditions with regard to its base sequence, as well a reagent kit containing two primers and a probe that define this section.

Eine der meist angewandten molekularbiologischen Techniken zum Nachweis von Nuklein säuren ist Hybridisierung mit sequenzspezifischen Sonden zum Nachweis homologer Nukleinsäure-Sequenzen. Der Nachweis von Nukleinsäure-Sequenzen ist von Bedeutung im Grundlagenbereich, jedoch von besonderer Bedeutung in verschiedenen Anwendungs feldern, z. B. in den Bereichen medizinische Diagnostik, forensische Diagnostik, Lebens mitteldiagnostik, Umweltdiagnostik, Pflanzenschutz und Tiermedizin.One of the most widely used molecular biological techniques for the detection of nuclein acids is hybridization with sequence-specific probes for the detection of homologous Nucleic acid sequences. The detection of nucleic acid sequences is important in Basic area, but of particular importance in various applications fields, e.g. B. in the fields of medical diagnostics, forensic diagnostics, life medium diagnostics, environmental diagnostics, plant protection and veterinary medicine.

Als Sonde werden dabei entweder kurze Oligonukleotide (DNA oder RNA) oder längere Polynukleotide (DNA oder RNA) verwendet. Dabei haben die kürzeren Sonden gegenüber den längeren Sonden den Vorteil größerer Sequenzselektivität, wegen des kürzeren Hybri disierungsbereichs aber den Nachteil geringerer Sensitivität. Eine verbesserte Sensitivität und Sequenzselektivität wird mit PNA-Sonden (Peptidnukleinsäuren, z. B. WO 92/20702) erreicht, da diese Sonden eine höhere Bindungsaffinität zu Nukleinsäuren haben (höherer Tm) und durch eine höhere Basendiskriminierung gekennzeichnet sind (ΔTm). Zusätzlich können Sonden zum Nukleinsäure-Nachweis Markierungsgruppen tragen, die entweder zum Fangen und/oder zur Detektion von Hybridkomplexen aus Sonde und nachzuweisender Nukleinsäure geeignet sind.Either short oligonucleotides (DNA or RNA) or longer ones are used as probes Polynucleotides (DNA or RNA) are used. The shorter probes face each other the longer probes have the advantage of greater sequence selectivity because of the shorter hybrid range but the disadvantage of lower sensitivity. An improved sensitivity and sequence selectivity with PNA probes (peptide nucleic acids, e.g. WO 92/20702) achieved because these probes have a higher binding affinity for nucleic acids (higher Tm) and are characterized by higher base discrimination (ΔTm). In addition can carry probes for the detection of nucleic acids that either for capturing and / or detecting hybrid complexes from the probe and to be detected Nucleic acid are suitable.

Zum Nukleinsäure-Nachweis durch Hybridisierung werden eine oder mehrere Sonden ent weder zur Hybridisierung in Lösung oder auf festen Trägern verwendet. Bei Nukleinsäure- Nachweisen in Lösung spricht man von homogenen Nachweisformaten, bei Nachweis auf festen Trägern und/oder vermittelt durch feste Träger von heterogenen Nachweisformaten. Bei den heterogenen Nachweisverfahren kann die nachzuweisende Nukleinsäure auf dem festen Träger vorgebunden sein. Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen mit einer Lösung, die die Sonde enthält (z. B. dot blot). Umgekehrt kann die Sonde auf dem festen Träger vorgebunden sein. Die Hybridisierung erfolgt durch Inkontaktbringen der ge bundenen Sonde mit einer Lösung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure enthält (z. B. reverse dot blot). Alternativ dazu kann der Komplex aus nachzuweisender Nuklein säure und Sonde erst in Lösung gebildet werden und die Bindung an den festen Träger erst anschließend erfolgen. Bei homogenen Testformaten werden z. B. Sondenpaare verwendet, die endständig energieübertragende Gruppen tragen und die über Co-Hybridisierung an die nachzuweisende Nukleinsäure in unmittelbaren Kontakt gebracht werden und dadurch ein Signal erzeugen. Alternativ dazu können auch Sonden verwendet werden, die nach Bindung an die nachzuweisende Nukleinsäure durch enzymatische 5'-Nukleaseaktivität in Lösung von einem gequenchten in einen ungequenchten Zustand überführt werden.One or more probes are ent for nucleic acid detection by hybridization not used for hybridization in solution or on solid supports. With nucleic acid Detection in solution is called a homogeneous detection format, upon detection solid carriers and / or mediated by solid carriers of heterogeneous detection formats. In the heterogeneous detection method, the nucleic acid to be detected can be on the fixed carrier be bound. The hybridization takes place by contacting with a solution containing the probe (e.g. dot blot). Conversely, the probe on the fixed carrier be bound. The hybridization takes place by contacting the ge bound probe with a solution containing the nucleic acid to be detected (e.g. reverse dot blot). Alternatively, the complex of nucleotides to be detected can be used acid and probe are only formed in solution and the bond to the solid support only then done. In the case of homogeneous test formats, e.g. B. pairs of probes used, that carry energy-transferring groups at the end and that to the via co-hybridization nucleic acid to be detected are brought into direct contact and thereby a Generate signal. Alternatively, probes can also be used, which are after binding to the nucleic acid to be detected by enzymatic 5'-nuclease activity in solution from a quenched to an unquenched state.

Der Nachweis von Nukleinsäuren durch alleinige Sonden-Hybridisierung hat nur begrenzte Sensitivität. So ist selbst mit empfindlichen Detektions-Markierungsgruppen wie ³²P, Digoxigenin, Biotin, Fluorescein, Ruthenium-Chelate, Fluorescein, Rhodamin oder AMCA allein nur eine Sensitivität in pg- bis fg-Bereich möglich. Zum empfindlichen Nukleinsäure- Nachweis gerade im medizinisch-diagnostischen Bereich sind jedoch hohe Sensitivitäten im ag-Bereich und eine hohe Nachweisspezifität notwendig. Dies gilt sowohl für den Nachweis von körperfremden Nukleinsäuren z. B. in Form von Infektionserregern, als auch für den Nachweis von der An- oder Abwesenheit oder Veränderung körpereigener Nukleinsäuren. Hohe Nachweissensitivität und Nachweisspezifität ist aber auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit.The detection of nucleic acids by probe hybridization alone has only limited sensitivity. Even with sensitive detection marker groups such as ³² P, digoxigenin, biotin, fluorescein, ruthenium chelates, fluorescein, rhodamine or AMCA, only sensitivity in the pg to fg range is possible. However, for sensitive nucleic acid detection, especially in the medical-diagnostic area, high sensitivities in the ag area and a high detection specificity are necessary. This applies both to the detection of foreign nucleic acids e.g. B. in the form of infectious agents, as well as for the detection of the presence or absence or change in the body's own nucleic acids. High detection sensitivity and specificity is also of great importance in the other application areas mentioned.

So müssen Infektionserreger wie z. B. HCV, HIV und HBV schon in wenigen Kopien nachgewiesen werden, um frühzeitig erfolgreiche medizinische Interventionsmaßnahmen, z. B. durch frühzeitige Arzneimittelbehandlung, ansetzen zu können. Für solch frühzeitige Nachweise von Infektionserregen ist der Nachweis von Nukleinsäure-Sequenzen der Infek tionserreger von Vorteil, da wegen der Verfügbarkeit von Nukleinsäure-Vervielfältigungs techniken (Nukleinsäure-Vermehrungsverfahren) ein empfindlicher Nachweis schon in einer frühen Infektionsphase (Latenzphase) möglich ist. Die Möglichkeit der gezielten Vermeh rung des nachzuweisenden Agens gibt es nur im Fall von Nukleinsäuren, nicht aber im Fall von immunologischen Nachweisverfahren. Bei diesen Verfahren ist eine Steigerung der nachzuweisenden Infektionserreger-spezifischen Partikel nur über die humorale Im munantwort über Bildung von entsprechenden Infektionserreger-spezifischen Antikörpern möglich; diese Immunantwort erfolgt jedoch erst nach Ablauf der Latenzzeit und ist eine Sekundärreaktion nach Infektion durch den Erreger. Daher hat der Nachweis über Nuklein- Säure-Hybridisierung den Vorteil, daß z. B. der Infektionserreger direkt nach Infektion und sehr empfindlich nachgewiesen werden kann.So infectious agents such. B. HCV, HIV and HBV already in a few copies proven to be successful at early medical intervention measures, e.g. B. by early drug treatment. For such early ones Detection of infectious agents is the detection of nucleic acid sequences of the infection tion pathogen is advantageous because of the availability of nucleic acid amplification techniques (nucleic acid amplification methods) a sensitive detection already in one early infection phase (latency phase) is possible. The possibility of targeted propagation The agent to be detected is only available in the case of nucleic acids, but not in the case of immunological detection methods. With these processes there is an increase in Infection-specific particles to be detected only via the humoral Im munesponse via the formation of corresponding infectious agent-specific antibodies possible; however, this immune response only takes place after the latency period has elapsed and is one Secondary reaction after infection by the pathogen. Therefore, the proof of nucleic Acid hybridization has the advantage that e.g. B. the infectious agent immediately after infection and can be detected very sensitively.

Der Erfolg von medizinischen Interventionsmaßnahmen ist jedoch auch davon abhängig, daß der Infektionserreger nicht nur frühzeitig mit hoher Sensitivität, sondern auch sehr spezifisch nachgewiesen werden kann. Zur gezielten Behandlung ist daher eine Unterschei dung zwischen verschiedenen Infektionserregern, wie z. B. HAV, HBV, HCV, HIV, ver schiedene Herpes-Viren, HPV, sowie die Unterscheidung einzelner Subtypen, wie z. B. Hw-1 und Hw-2, von Bedeutung. Dabei ist aber auch entscheidend, daß quantitative Aussagen gemacht werden können und keine falsch-positiven oder falsch-negativen Ergeb nisse erhalten werden, da solche falschen Ergebnisse u. U. gravierende therapeutische Kon sequenzen nach sich ziehen können. Dies setzt Richtigkeit und hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse voraus. Daher muß der Nukleinsäure-Nachweis nicht nur sehr sensitiv, sondern auch sehr spezifisch und reproduzierbar sein. Der spezifische und sensitive Nukleinsäure- Nachweis muß auch rasch erfolgen, damit eine gezielte Therapie umgehend erfolgen kann.However, the success of medical intervention measures also depends on that the infectious agent is not only early with high sensitivity, but also very can be specifically demonstrated. There is therefore a difference for targeted treatment between different infectious agents, such as. B. HAV, HBV, HCV, HIV, ver different herpes viruses, HPV, as well as the distinction of individual subtypes, such as e.g. B. Hw-1 and Hw-2, of importance. But it is also crucial that quantitative Statements can be made and no false positive or false negative results nisse are obtained because such incorrect results may U. serious therapeutic con can result in sequences. This implies correctness and high reproducibility Results ahead. Therefore, nucleic acid detection must not only be very sensitive, but also also be very specific and reproducible. The specific and sensitive nucleic acid Evidence must also be provided quickly so that targeted therapy can take place immediately.

Oftmals ist auch von Bedeutung, mehrere Infektionserreger wie z. B. HCV, HIV und HBV nebeneinander nachzuweisen, z. B. im Rahmen von Blutbanken-Screeningtests. Dies erfolgt bei derzeit gängigen Nukleinsäure-Nachweistests durch hintereinandergeschaltete Ein zelbestimmungen der nachzuweisenden Infektionserreger. Dies hat den Nachteil, daß mehrere Bestimmungen hintereinander durchgeführt werden müssen, was gerade beim Screening von großen Specimen-Stückzahlen nachteilig ist. Im Rahmen dieser Nuklein säure-Bestimmungen ist wünschenswert, sensitive und spezifische Testmöglichkeiten ver fügbar zu haben, die z. B. eine rasche parallele Bestimmung mehrerer Infektionserreger nebeneinander in einer einzigen Probe ermöglichen (Multiplex-Bestimmung).Often it is also important to have several infectious agents such as B. HCV, HIV and HBV to prove side by side, e.g. B. as part of blood bank screening tests. this happens in currently common nucleic acid detection tests by cascaded in individual provisions of the infectious agents to be detected. This has the disadvantage that several determinations have to be carried out one after the other, which is precisely the Screening large numbers of specimens is disadvantageous. As part of this nucleus Acid determinations are desirable, sensitive and specific test options to have available the z. B. a rapid parallel determination of several infectious agents enable side by side in a single sample (multiplex determination).

Beim Nachweis der An- oder Abwesenheit von körpereigener Nukleinsäure innerhalb be stimmter genomischer Loci und/oder deren Veränderungen, wie z. B. ererbte, spontane oder eine Mischung aus ererbten und spontanen Mutationen, Deletionen, Inversionen, Translokationen, Rearrangements oder Triplett-Expansionen in Form von spezifischen und/oder polymorphen Veränderungen, ist ebenfalls die Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren von Vorteil. Die Verfügbarkeit spezifischer und sensitiver Nukleinsäure-Nachweisverfahren ist jedoch nicht nur im medizinischen Sektor sondern auch in den anderen genannten Anwendungsbereichen von hoher Wichtigkeit. When detecting the presence or absence of the body's own nucleic acid within be tuned genomic loci and / or their changes, such as B. inherited, spontaneous or a mixture of inherited and spontaneous mutations, deletions, inversions, Translocations, rearrangements or triplet expansions in the form of specific and / or polymorphic changes, the availability is also more specific and sensitive nucleic acid detection method is an advantage. The availability more specific and sensitive nucleic acid detection method is not only in the medical sector but also of great importance in the other mentioned application areas.

Die bisherigen Testverfahren zum sensitiven und spezifischen Nachweis der An- oder Ab wesenheit von Nukleinsäuren basieren auf der kombinierten Durchführung von Nuklein säure-Vermehrungsreaktionen (Nukleinsäure-Vermehrung) und Nukleinsäure-Nachweis reaktionen (Detektion).The previous test procedures for the sensitive and specific detection of the arrival or departure The presence of nucleic acids is based on the combined implementation of nuclein acid amplification reactions (nucleic acid amplification) and nucleic acid detection reactions (detection).

Die nachzuweisende Nukleinsäure wird dabei in einer für die Vermehrungsreaktionen zu gänglichen Form eingesetzt, z. B. in Form von unbehandeltem oder behandeltem Proben material und/oder Probenmaterial-Konzentrierung, z. B. durch Adsorption des unbehandel ten oder behandelten Probenmaterials an die Oberfläche eines festen Trägers und an schließende Resorption von diesem festen Träger. Solche festen Träger sind z. B. feste Trager mit glashaltigen Oberflächen. Durch diese festen Träger erfolgt keine substantielle Reinigung und/oder Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-Konzentrierung und ggf. Inaktivierung und/oder Eliminierung von Inhibi toren für die darauffolgenden Nukleinsäure-Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von Multiplex-Verfahren, in für die Nukleinsäure-Vermehrungs- und -Nachweis-Reaktionen zugänglichen Form möglich.The nucleic acid to be detected is added in one for the amplification reactions common form used, for. B. in the form of untreated or treated samples material and / or sample material concentration, e.g. B. by adsorption of the untreated th or treated sample material to the surface of a solid support and on closing absorption from this solid support. Such solid supports are e.g. B. fixed Carrier with glassy surfaces. These solid supports do not result in a substantial one Purification and / or isolation of the nucleic acids to be detected, but only one Sample material concentration and, if necessary, inactivation and / or elimination of inhibi gates for the subsequent nucleic acid amplification and detection reactions. By this solid support is also the provision of several nucleic acids to be detected, e.g. B. in the context of multiplexing, in for nucleic acid amplification and Detection reactions accessible form possible.

Andere Probenvorbereitungs-Verfahren enthalten gezielte Verfahrensschritte zur Nuklein säurespezifischen und/oder sequenzspezifischen Bindung der nachzuweisenden Nuklein säure, z. B. die Verwendung von festen Tragern mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungs gruppen und/oder Nukleinsäure-Fangsonden zur selektiven Bindung und Freisetzung der nachzuweisenden Nukleinsäure durch Nukleinsäure-spezifische Bindung und anschließende Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nach zuweisender Nukleinsäure. Bei dieser Art von festen Trägern sind Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen und/oder Nukleinsäure-Fangsonden an der Oberfläche der festen Träger notwendig. Daher sind zur Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren, z. B. im Rahmen von Multiplex-Verfahren, entweder mehrere feste Träger notwendig, was aufwendiger ist, oder feste Träger mit einer oder mehreren Bindungsgruppen und/oder mit multiplen oder mehreren Fangsonden. Multiple Fangsonden enthalten mehrere Bindungs sequenzen für mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Diese Träger mit mehreren Bindungsgruppen und/oder mehreren und/oder multiplen Fangsonden sind jedoch auf wendiger herzustellen. Ebenfalls sind die Reaktionsbedingungen zur gezielten Bindung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäuren an Träger mit mehreren Bindungsgruppen und/oder Fangsonden schwieriger einzustellen bzw. die Bindung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäurearten an eine Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppe oder an eine Fangsonde mit mehreren komplementären Hybridisierungssequenzen schwieriger einzu stellen.Other sample preparation procedures contain targeted procedural steps for nuclein acid-specific and / or sequence-specific binding of the nucleotides to be detected acid, e.g. B. the use of solid supports with nucleic acid specific binding groups and / or nucleic acid capture probes for the selective binding and release of the nucleic acid to be detected by nucleic acid-specific binding and subsequent Dissociation between binding group and / or carrier-bound capture probe and after assigning nucleic acid. These types of solid supports are nucleic acid specific Binding groups and / or nucleic acid capture probes on the surface of the solid support necessary. Therefore, to provide several nucleic acids to be detected, e.g. B. in the context of multiplexing, either several solid carriers necessary, what is more complex, or solid supports with one or more binding groups and / or with multiple or multiple capture probes. Multiple capture probes contain multiple bindings sequences for several nucleic acids to be detected. This carrier with several Binding groups and / or multiple and / or multiple capture probes are however on more maneuverable to manufacture. The reaction conditions for targeted binding are also several nucleic acids to be detected on supports with several binding groups and / or capture probes more difficult to set or the binding of several to be detected Nucleic acid types to a nucleic acid-specific binding group or to a Capture probe with multiple complementary hybridization sequences more difficult to insert put.

Die Vermehrung und der Nachweis der bereitgestellten nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt in heterogenen oder homogenen Nukleinsäure-Vermehrungs-Nachweisformaten. Die Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen und Detektionsreaktionen können entweder hinterein ander (heterogene Testverfahren) oder gleichzeitig (homogene Testverfahren) erfolgen. Als Vermehrungsreaktionen werden entweder targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungs reaktionen, targetabhängige Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen oder Signal- Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen verwendet. Die Verwendung von Detektions- Systemen zum Nachweis der vermehrten Nukleinsäuren erfolgt entweder über den Einbau von Nukleotiden und/der die Verwendung von markierten Primern oder markierten Sonden. Die verwendeten Detektionssysteme enthalten entweder direkte oder indirekte Detek tionsmarkierungen bzw. gekoppelte sekundäre und tertiäre Nachweiskomponenten. Die Detektion der vermehrten nachzuweisenden Nukleinsäuren kann jedoch auch durch spektroskopische oder physikalische Methoden erfolgen.The multiplication and the detection of the provided nucleic acids to be detected takes place in heterogeneous or homogeneous nucleic acid amplification detection formats. The Nucleic acid amplification reactions and detection reactions can either follow one another different (heterogeneous test methods) or simultaneous (homogeneous test methods). As Multiplication reactions are either target-specific nucleic acid amplification reactions, target-dependent signal nucleic acid amplification reactions or signal Nucleic acid amplification reactions used. The use of detection Systems for the detection of the increased nucleic acids are either implemented of nucleotides and / or the use of labeled primers or labeled probes. The detection systems used contain either direct or indirect detec tion markings or coupled secondary and tertiary detection components. The However, detection of the increased nucleic acids to be detected can also be carried out by spectroscopic or physical methods.

Die bisherigen Nukleinsäure-Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten Signal- Nukleinsäure-Vermehrungereaktionen haben den Nachteil geringer Sensitivität wegen der nicht-exponentiellen Signalvermehrung, erhöhten Störanfalligkeit durch stärkerer Tendenz zur Hintergrundsbildung durch die Vielzahl der Sondenkomponenten und der Bildung un spezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende Nukleinsäure selbst, sondern lediglich ein daran gekoppeltes Detektionssignal targetunabhängig vermehrt wird. Beispiele sind gekoppelte Signalkaskaden (z. B. SELF-Zyklus) oder signalgebende Sonden-Baum- oder -Bürstenstrukturen (z. B. branched DNA).The previous nucleic acid amplification detection methods with integrated signal Nucleic acid amplification reactions have the disadvantage of being less sensitive because of the non-exponential signal propagation, increased susceptibility to interference due to stronger tendency for background formation due to the large number of probe components and the formation un specific detection signals, because not the nucleic acid to be detected, but only a detection signal coupled to it is propagated independently of the target. Examples are coupled signal cascades (e.g. SELF cycle) or signaling probe tree or brush structures (e.g. branched DNA).

Die bisherigen Nukleinsäure-Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierten target abhängigen Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen sind wegen der exponentiellen Signalvermehrung zwar sensitiver als die reinen Signal-Nukleinsäure-Vermehrungsver fahren, haben aber wiederum den Nachteil der Bildung unspezifischer Detektionssignale, da nicht die nachzuweisende Nukleinsäure selbst, sondern lediglich ein davon in einer einleiten den targetabhängigen Primärrektion abgeleitetes Detektionssignal in Form eines Nuklein säure-Reportermoleküls Targetsequenz-unabhängig enzymatisch vermehrt wird. Beispiele sind die Qβ-Replikationsreaktion, bei der ein Qβ-Reportermolekül enzymatisch vermehrt wird, oder die Ligase-Kettenreaktion, bei der Teilstücke der Nukleinsäure-Reporter moleküle sequenzunabhängig enzymatisch verknüpft werden.The previous nucleic acid amplification detection methods with integrated target dependent signal nucleic acid amplification reactions are because of the exponential Signal propagation is more sensitive than the pure signal nucleic acid propagation ver drive, but again have the disadvantage of the formation of non-specific detection signals, because do not introduce the nucleic acid to be detected, but only introduce one of them into one the target-dependent primary reaction derived detection signal in the form of a nucleus acid reporter molecule target sequence-independently is increased enzymatically. Examples are the Qβ replication reaction in which a Qβ reporter molecule increases enzymatically is, or the ligase chain reaction, when the nucleic acid reporter cuts molecules are linked enzymatically independent of sequence.

Als Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte der bisher sensitivsten und spezifischsten ex ponentiellen targetspezifischen Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen wie z. B. PCR (US-A-4,683,202 bzw. EP-B-0 202 362), RT-PCR, SDA, NASBA (EP-A-0 329 822) oder TAM (WO 91/01384), wurden bisher jeweils einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte durch targetsequenzabhängige thermozyklische oder isotherme enzymatische Elongation gegenläufige Primer, die sequenzspezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind und an die Enden der Nukleinsäure-Vermehrungseinheit (Amplikon) der nachzuweisenden Desoxyribo- oder Ribo-Nukleinsäuren oder deren Komplemente binden und somit die Nukleinsäure-Veimehrungsprodukte begrenzen, erzeugt. Bei diesen Elongationsreaktionen werden alle 4 Basenspezifitäten eingebaut.As nucleic acid amplification products of the most sensitive and specific ex to date ponential target-specific nucleic acid amplification reactions such. B. PCR (US-A-4,683,202 or EP-B-0 202 362), RT-PCR, SDA, NASBA (EP-A-0 329 822) or TAM (WO 91/01384), single or double-stranded nucleic acid Propagation products through target sequence-dependent thermocyclic or isothermal enzymatic elongation opposing primers, which are sequence specific for the to be detected Are nucleic acid and at the ends of the nucleic acid amplification unit (amplicon) bind deoxyribo or ribo-nucleic acids to be detected or their complements and thus limit nucleic acid amplification products. With these Elongation reactions are built in all 4 base specificities.

Die genannten Nukleinsäure-Vermehrungs-Nachweisverfahren mit integrierter targetspe zifischer Nukleinsäure-Vermehrungsreaktion sind wegen Targetsequenz-abhängiger enzymatischer Nukleinsäure-Vermehrungszyklen am spezifischsten. Während lineare targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen, wie z. B. die Cycling-Probe- Reaktion, nur zu begrenzter Sensitivität führen, ergeben exponentielle targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsrektionen wie Elongations-basierte Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, RT-PCR, SDA) oder Transkriptions-basierte Reaktionen wie z. B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) oder Transcription Mediated Amplification (TAM) bisher die sensitivsten und spezifischsten Signale.The mentioned nucleic acid amplification detection methods with integrated targetspe Specific nucleic acid amplification reactions are more dependent on the target sequence most specific of enzymatic nucleic acid amplification cycles. While linear target-specific nucleic acid amplification reactions, such as. B. the cycling trial Response that only lead to limited sensitivity results in exponential target-specific Nucleic acid amplification reactions such as elongation-based reactions such as B. the Polymerase chain reaction (PCR, RT-PCR, SDA) or transcription-based reactions such as B. Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) or Transcription Mediated Amplification (TAM) so far the most sensitive and specific signals.

Mischformen zwischen targetabhängiger Signal-Nukleinsäure-Vermehrung und targetspe zifischer Nukleinsäure-Vermehrung, wie z. B. die Gap-filling Ligase-Kettenreaktion (gap filling LCR, WO 90/01069), haben zwar gegenüber der nicht-modifizierten LCR einen targetabhängigen Reaktionsschritt, dieser ist aber begrenzt auf limitierte Sequenzabschnitte bestehend aus lediglich 1 oder 2 Basenspezifitäten und damit limitierterer Target-Spezifität. Mixed forms between target-dependent signal nucleic acid amplification and targetspe zifischer nucleic acid amplification, such as. B. the gap-filling ligase chain reaction (gap filling LCR, WO 90/01069), have one compared to the unmodified LCR target-dependent reaction step, but this is limited to limited sequence sections consisting of only 1 or 2 base specificities and thus more limited target specificity.

Für den Nachweis der entstandenen Nukleinsäure stehen verschiedene Verfahren zur Ver fügung. Der Nachweis der gebildeten Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte über Fragment- oder Sequenz-Gelanalyse ist zeitaufwendig und nicht quantitativ. Der Nachweis über trägergebundene Dot-, Slot- oder Reverse-Dot-Blot-Verfahren ist ebenfalls zeitaufwendig und nicht quantitativ.Various methods are available for the detection of the nucleic acid formed addition. The detection of the nucleic acid amplification products formed via Fragment or sequence gel analysis is time consuming and not quantitative. Evidence of Carrier-bound dot, slot or reverse dot blot processes are also time-consuming and not quantitative.

Quantitative sensitive und spezifische Bestimmungen der nachzuweisenden Nukleinsäuren wurden bisher im Rahmen von heterogenen oder homogenen targetspezifischen expo nentiellen Nukleinsäure-Vermehrungs-Reaktionsformaten möglich, bei denen das Nuklein säure-Vermehrungsprodukt entweder durch eingebaute Label oder durch Hybridisierung während oder nach Amplifikation mit einer für die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement spezifischen Sonde in einem Teil des durch Elongation entstandenen Sequenzabschnitts abgefangen wird. Exponentielle Nukleinsäure-Vermehrungs- Reaktionsformate, bei denen eine Interkalation von Nukleinsäure-bindenden Farbstoffen erfolgt, sind zwar auch sensitiv, aber nicht sequenzspezifisch.Quantitative sensitive and specific determinations of the nucleic acids to be detected have been used in the context of heterogeneous or homogeneous target-specific expo nential nucleic acid amplification reaction formats possible in which the nucleic acid acid multiplication product either by built-in labels or by hybridization during or after amplification with a nucleic acid to be detected or its Complement specific probe in part of the elongation Sequence section is intercepted. Exponential nucleic acid amplification Reaction formats in which an intercalation of nucleic acid binding dyes are sensitive, but not sequence-specific.

Bei den heterogenen Reaktionsformaten wird das Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt z. B. entweder über eine Primer-Fangmodifikation oder durch eine immobilisierte Fangsonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure-Ver mehrungsprodukts ist, auf einen festen Träger gebunden und über Einbau eines detektions markierten Nukleotids, durch Hybridisierung mit einer detektionsmarkierten Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure-Vermehrungsprodukts ist, oder über eine Primer-Detektionsmodifikation nachgewiesen. In homogenen Reaktionsformaten erfolgte bisher der Nachweis z. B. über die Hybridisierung einer Sonde, die komplementär zu einem internen Sequenzabschnitt des Nukleinsäure-Vermehrungspro dukts ist und die einen gequenchten Fluoreszenz-Label trägt, wobei die Targetsequenz-ab hängige enzymatische Aufhebung der Quenchung durch die Primer-Elongations-bedingte Freisetzung des gequenchten Fluoreszenz-markierten Nukleotids erfolgt, oder über die An lagerung und/oder Interkalation eines detektierbaren Moleküls oder Gruppe.In the heterogeneous reaction formats, the nucleic acid amplification product e.g. B. either via a primer catch modification or by an immobilized Capture probe complementary to an internal sequence section of the nucleic acid ver Multiplication product is bound on a solid support and incorporating a detection labeled nucleotide, by hybridization with a detection-labeled probe, the complementary to an internal sequence section of the nucleic acid amplification product is detected, or via a primer detection modification. In homogeneous So far, reaction formats have been detected e.g. B. hybridization of a probe, which are complementary to an internal sequence section of the nucleic acid amplification pro is dukt and which carries a quenched fluorescence label, the target sequence-ab dependent enzymatic cancellation of the quench by the primer elongation-related The quenched fluorescence-labeled nucleotide is released, or via the An storage and / or intercalation of a detectable molecule or group.

Bei allen bisherigen quantitativen sensitiven und spezifischen heterogenen und homogenen targetspezifischen exponentiellen Nukleinsäure-Vermehrungs-Reaktionsformaten wurden bisher Nukleinsäure-Vermehrungseinheiten (Amplikons) verwendet, die neben den spezifischen Primer- und Sonden-Bindungssequenzen zusätzliche Sequenzen variabler Länge zwischen den flankierenden Primer-Bindungssequenzen und der internen Sonden- Bindungssequenz enthielten. Diese fünfgeteilte Amplikonstruktur resultierte in Amplikon längen größer als die Summe der Sequenzlängen der beiden flankierenden Primer und der internen Sonde zwischen vorzugsweise 100 und 1000 Basen(paaren). Optimierungen der Nukleinsäure-Vermehrungsreaktion durch verbesserte Enzymmischungen gingen bisher vielmehr hauptsächlich in Richtung längere Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte.For all previous quantitative sensitive and specific heterogeneous and homogeneous Target specific exponential nucleic acid amplification reaction formats have been developed Previously used nucleic acid amplification units (amplicons) in addition to specific primer and probe binding sequences additional sequences more variable Length between the flanking primer binding sequences and the internal probe Binding sequence included. This five-part amplicon structure resulted in amplicon lengths greater than the sum of the sequence lengths of the two flanking primers and the internal probe between preferably 100 and 1000 bases (pairs). Optimizations of Nucleic acid amplification reactions through improved enzyme mixtures have so far been successful rather mainly towards longer nucleic acid amplification products.

Kürzere Amplikonlängen wurden bisher lediglich zum Nachweis spezieller Sequenzen wie z. B. bei Triplett-Expansionen, für In-situ-Untersuchungen oder den Nachweis stark fragmentierter Nukleinsäuren im Rahmen der Altertumsforschung erzeugt. Diese kurzen Amplikon-Längen wurden jedoch in zeitaufwendigeren Gelformaten oder In-situ-Formaten detektiert, die durch mangelnde Sensitivität und/oder fehlende Quantifizierung gekenn zeichnet sind. Andere spezielle kurze Sequenzen wie Short Tandem Repeats, Short Interspersed Repetitive Elements Microsatellite Sequences oder HLA-spezifische Sequen zen wurden bisher lediglich als Primer- oder Sonden-Bindungssequenzen verwendet, bzw. in Kombination mit anderen Sequenzen.Shorter amplicon lengths have so far only been used to detect special sequences such as e.g. B. in triplet expansions, for in-situ investigations or the detection strong fragmented nucleic acids generated in the context of antiquity research. These short ones Amplicon lengths, however, were in more time-consuming gel formats or in-situ formats detected, which are characterized by lack of sensitivity and / or lack of quantification are drawn. Other special short sequences like Short Tandem Repeats, Short Interspersed Repetitive Elements Microsatellite Sequences or HLA-specific sequences So far, zen have only been used as primer or probe binding sequences, or in combination with other sequences.

Die fünfgeteilten Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte haben den Nachteil, daß sie neben den spezifisch Primer und Sonde bindenden Sequenzen noch zusätzliche Sequenzen be inhalten, die das Amplikon verlängern, und die die Gesamtspezifität im Hinblick auf die Spezifitäts-generierenden Primer- und Sonden-Bindungsreaktionen reduzieren.The five-part nucleic acid amplification products have the disadvantage that they are next to the specific primer and probe binding sequences be additional sequences content that lengthens the amplicon and that enhances overall specificity with respect to the Reduce specificity-generating primer and probe binding reactions.

Die bisher verwendeten längeren fünfteiligen Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte haben ferner den Nachteil längerer Primer-Elongationszeiten und damit längere Gesamt-Test zeiten. Die Sensitivität ist auch begrenzt durch Plateaueffekte der beteiligten Enzyme und Substrate, die bei längeren Amplikons früher erreicht werden. Ein weiterer Nachteil längerer Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte ist eine zunehmende Kompetition zwischen Amplikon- Gegenstrang und Detektor- oder Fangsonde und somit reduzierter Sensitivität. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Möglichkeit der unspezifischen Bindung bedingt durch die zusätzlichen Sequenzen mit der Folge eines erhöhten Hintergrunds und dadurch geringerer Sensitivität (geringeres Signal-Rausch-Verhältnis). Ein weiterer Nachteil bei der Bindung des Nukleinsäure-Vermehrungsprodukts an trägergebundene Fangsonden ist die sterische und kinetische Hinderung längerer Nukleinsäure-Moleküle; daher werden Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte bisheriger Länge vor der Bindung durch die Fangsonde vorzugsweise fragmentiert. Ein weiterer Nachteil ist die erhöhte Anfälligkeit gegenüber Fragmentierung innerhalb der Amplikonsequenz und dadurch Zerstörung der Nukleinsäure- Vermehrungseinheit; dies führt zu geringerer Reproduzierbarkeit. Ein weiterer Nachteil ist, daß längere Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte bei niedrigen Testtemperaturen von z. B. 37°C, die bei gängigen Nukleinsäure-Analysegeräten vorgegeben sind, weniger spezifisch hybridisieren, da eine größere Differenz zur Schmelztemperatur besteht. Ein weiterer Nach teil von fünfteiligen Nukleinsäure-Vermehrungsprodukten ist beim Nachweis mehrerer ver schiedener Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte, daß unterschiedliche Nukleinsäure-Ver mehrungslängen gebildet werden, die einen Multiplex-Nachweis erschweren.The longer five-part nucleic acid amplification products used so far have furthermore the disadvantage of longer primer elongation times and thus longer overall test times. The sensitivity is also limited by the plateau effects of the enzymes involved and Substrates that are reached earlier with longer amplicons. Another disadvantage longer Nucleic acid amplification products is an increasing competition between amplicon Counter strand and detector or trap probe and thus reduced sensitivity. Another The disadvantage is the increased possibility of non-specific binding due to the additional sequences with the consequence of an increased background and therefore less Sensitivity (lower signal-to-noise ratio). Another disadvantage of binding of the nucleic acid amplification product on carrier-bound capture probes is the steric one and kinetic hindrance of longer nucleic acid molecules; therefore nucleic acid Propagation products of previous length before binding by the capture probe preferably fragmented. Another disadvantage is the increased vulnerability to it Fragmentation within the amplicon sequence and thereby destruction of the nucleic acid Propagation unit; this leads to lower reproducibility. Another disadvantage is that longer nucleic acid amplification products at low test temperatures of e.g. B. 37 ° C, which are specified in common nucleic acid analyzers, less specific hybridize because there is a greater difference to the melting temperature. Another after Part of five-part nucleic acid amplification products is the detection of several ver different nucleic acid amplification products that different nucleic acid ver multiplication lengths are formed which make multiplex detection more difficult.

Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein alternatives Nachweisverfahren für Nuklein säuren bereitzustellen, welches Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Verfahren hat.The aim of the present invention was to provide an alternative detection method for nuclein Provide acids, which has advantages over the processes described so far.

Eine spezielle Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein targetabhängiges exponentielles Nukleinsäure-Vermehrungsverfahren zum hochsensitiven, hochspezifischen, reproduzier baren und quantifizierbaren Nachweis einer oder mehrerer einzelsträngiger oder doppel strängiger Nukleinsäuren bereitzustellen, welches insbesondere einen oder mehrere der genannten Nachteile vermeidet.A special object of the invention was a target-dependent exponential Nucleic acid amplification process for highly sensitive, highly specific, reproducible Detectable and quantifiable detection of one or more single or double strands to provide stranded nucleic acids, which in particular one or more of the avoids disadvantages mentioned.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung war, unter Erhalt der Gesamtspezifität die Auswahl der Primer- und Sondensequenzen so flexibel zu gestalten, daß eine Bestimmung mehrerer ver schiedener nachzuweisender Nukleinsäuren in einem vereinheitlichten Reaktionsformat unter Verwendung von vorzugsweise teilweise gleichen Primer- oder Sonden-Sequenzen möglich ist.Another object of the invention was to obtain the overall specificity while selecting the To design primer and probe sequences so flexibly that one determination of several ver different nucleic acids to be detected in a unified reaction format using preferably partially identical primer or probe sequences is possible.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure enthaltend die Schritte Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks dieser Nukleinsäure mit Hilfe zweier Primer, von denen einer an eine erste Bindesequenz (A) eines Strangs der Nukleinsäure binden kann und von denen der andere an eine zweite Bindese quenz (C'), die zu einer mit A nicht überlappenden, in 3'-Richtung von A gelegenen Sequenz C im wesentlichen komplementär ist, binden kann, in Anwesenheit einer Sonde mit einer Bindesequenz D, welche an die zwischen den Sequenzen A und C gelegene dritte Sequenz (B) oder das Komplement (B') davon binden kann, wobei diese Sonde eine Reportergruppe und eine Quenchergruppe enthält, unter Verwendung einer Polymerase mit 5'-Nukleaseaktivität und Nachweis der Nukleinsäure durch Messung eines Signals, welches durch die Freisetzung der Reportergruppe bedingt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Hilfe der Primer gebildeten Amplifikate eine Länge von weniger als 100 Nukleotide aufweisen.The invention relates to a method for the detection of a nucleic acid containing the steps of producing a plurality of amplificates of a section of these Nucleic acid using two primers, one of which binds to a first binding sequence (A) Can bind strands of nucleic acid and one of which the other to a second binding sequence (C ') leading to a 3' direction of A that does not overlap with A Sequence C is essentially complementary, can bind with in the presence of a probe a binding sequence D, which is connected to the third located between sequences A and C. Sequence (B) or the complement (B ') thereof can bind, this probe a Contains reporter group and a quencher group using a polymerase 5'-nuclease activity and detection of the nucleic acid by measuring a signal which is due to the release of the reporter group, characterized in that the with With the aid of the primers, amplicons formed a length of less than 100 nucleotides exhibit.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens.The invention also relates to a reagent kit for carrying out this method.

In Fig. 1 ist schematisch die in der vorliegenden Beschreibung verwendete Bezeichnungs weise für die Bereiche auf der nachzuweisenden Nukleinsäure gezeigt.In Fig. 1, the designation used in the present description for the regions on the nucleic acid to be detected is shown schematically.

In Fig. 2 ist die entsprechende Bezeichnungsweise für die intermediär gebildeten Verlänge rungsprodukte der Primer sowie die Amplifikate (Amplikons) gezeigt. Ebenfalls ist gezeigt, daß die Amplifikate ein oder mehrere weitere Bereiche Y aufweisen können, die außerhalb des Bereiches liegen, der die von der nachzuweisenden Nukleinsäure stammende Sequenz information enthält.In Fig. 2, the corresponding designation for the intermediately formed extension products of the primers and the amplicons (amplicons) is shown. It is also shown that the amplificates can have one or more further regions Y which lie outside the region which contains the information coming from the nucleic acid to be detected.

In Fig. 3 ist schematisch gezeigt, wie im Falle der vorliegenden Erfindung die Binde sequenzen der Primer und Sonde angeordnet sind. Es ergeben sich verschiedene Alterna tiven I bis VI, je nachdem, ob und wie die Bindesequenzen überlappen. Es ist jeweils nur ein Strang des Amplifikats gezeigt. Dieselbe Anordnung (nur komplementär) kann für einen zweiten Strang des Amplifikats erstellt werden. Für die intermediär gebildeten Ver längerungsprodukte ergibt sich ein ähnliches Bild. Als Fall V und VI ist der Fall gezeigt, daß die Sonde neben der Bindesequenz D noch weitere, nicht mit dem Amplifikat Basenpaarun gen ausbildende Bereiche X enthält, die gleich oder verschieden sein können. Zum Ver gleich ist der Fall des Standes der Technik als VII gezeigt; die Sequenzen Z repräsentieren die zusätzlichen Sequenzen der fünfteiligen Amplikons.In Fig. 3 is shown schematically how the binding sequences of the primer and probe are arranged in the case of the present invention. There are different alternatives I to VI, depending on whether and how the binding sequences overlap. Only one strand of the amplificate is shown in each case. The same arrangement (only complementary) can be created for a second strand of the amplificate. A similar picture emerges for the intermediate extension products. As cases V and VI, the case is shown that, in addition to the binding sequence D, the probe also contains further regions X which do not form base pairings with the amplificate, which may be the same or different. For comparison, the case of the prior art is shown as VII; the sequences Z represent the additional sequences of the five-part amplicons.

In Fig. 4 ist eine für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignete Region des HCV-Genoms gezeigt, sowie eine Sequenz, aus welcher die Primer- und Sonden-Sequenzen bevorzugt ausgewählt werden. Diese zweite Sequenz ist dem nicht humanpathogenen Virus HGBV-B entnommen. Bei den hieraus gewählten Primer- und Sondensequenzen handelt es sich daher um nicht für HCV spezifische Sequenzen (J. Med. Virol. 48: 60-67). FIG. 4 shows a region of the HCV genome which is particularly suitable for carrying out the method according to the invention, and a sequence from which the primer and probe sequences are preferably selected. This second sequence is taken from the non-human pathogenic virus HGBV-B. The primer and probe sequences selected from this are therefore sequences which are not specific for HCV (J. Med. Virol. 48: 60-67).

Nukleinsäuren, welche mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, können beliebigen Ursprungs sein, beispielsweise Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs oder von Hefen oder Pilzen. Proben, in denen die nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen oder deren Komplement enthalten sind, sind z. B. humane, tierische, bakterielle oder pflanzliche Flüssigkeiten, oder Flüssigkeiten aus Hefen oder Pilzen, Exkremente, Abstriche, Zellsuspensionen, Kulturen oder Gewebs-, Zell- oder Flüssigkeits-Punktionen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung vor. Damit das erfindungsgemäße Verfahren seine Vorteile voll entfalten kann, hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure eine Größe von mindestens 40 bp auf weist. Die Nukleinsäure kann jedoch auch eine durch Klonierung, Amplifikation, in-vitro- und in-vivo-Vermehrung hergestellte Nukleinsäure sein.Nucleic acids which are detected using the method according to the invention can be of any origin, for example nucleic acids viroid, viral, bacterial or cellular origin or from yeast or fungi. Samples in which the nucleic acid sequences to be detected or their complement are included, for. B. human, animal, bacterial or vegetable liquids, or liquids from yeast or fungi, excrement, smears, cell suspensions, cultures or tissue, cell or Fluid punctures. The nucleic acids are preferably in solution. So that method according to the invention can fully develop its advantages, it has proven to be expedient proven if the nucleic acid to be detected has a size of at least 40 bp points. However, the nucleic acid can also be obtained by cloning, amplification, nucleic acid produced in vitro and in vivo amplification.

Die nachzuweisende Nukleinsäure kann einzelsträngig (insbesondere bei RNA) oder doppelsträngig (insbesondere bei DNA) sein. Für den Fall doppelsträngiger Nukleinsäuren können beide Stränge vermehrt werden oder aber auch nur einer. Aus beiden Sorten von Nukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngige Amplifikate gebildet werden, wovon einer oder beide zum weiteren Nachweis verwendet werden können. Entsprechend wird die Sequenz der Sonde oder der Sonden ausgewählt.The nucleic acid to be detected can be single-stranded (in particular in the case of RNA) or be double-stranded (especially with DNA). In the case of double-stranded nucleic acids both strands can be propagated or just one. From both varieties of Nucleic acids can be formed from single- or double-stranded amplificates, of which one or both can be used for further verification. Accordingly, the Sequence of the probe or probes selected.

Der Probe oder einer Kontrollprobe können positive oder negative Kontrollnukleinsäuren oder Quantifizierungsstandards zugesetzt sein, die ähnlich oder gleich behandelt werden wie die nachzuweisenden Nukleinsäuren. Als Standards können beispielsweise interne oder externe heterologe oder homologe DNA- oder RNA-Standards, enthaltend Primer-Binde sequenzen homolog zu den Sequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäuren und heterolo gen Sonden-Bindesequenzen, verwendet werden. Umgekehrt ist aber auch die Verwendung von besonders im 3'-Priming-Bereich heterologen Primer-Bindesequenzen und homologen Sonden-Bindesequenzen möglich. Als Negativ-Kontrollen werden bevorzugt analoge Specimen eingesetzt, welche die nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplement nicht enthalten.The sample or a control sample can contain positive or negative control nucleic acids or quantification standards that are treated similarly or identically as added the nucleic acids to be detected. For example, internal or external heterologous or homologous DNA or RNA standards containing primer binding sequences homologous to the sequences of the nucleic acids to be detected and heterolo gene binding sequences can be used. The reverse is also the use of especially heterologous primer binding sequences and homologous in the 3'-priming range Probe binding sequences possible. Analog controls are preferred as negative controls Specimen used which the nucleic acids to be detected or their complement not included.

Vor der Vermehrung wird die Probe bevorzugt einem oder mehreren Vorbehandlungs schritten unterzogen, um die nachzuweisenden Nukleinsäuren in eine vermehrungsfähige Form zu bringen. In einem ersten optionalen Schritt findet eine Vorbehandlung der Probe (Specimen) statt, durch die die Probe in eine Form gebracht wird, aus der die nachzu weisende Nukleinsäure in eine für die Überführung der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung geeignete Form gebracht wird.Before the propagation, the sample is preferably one or more pretreatments subjected to steps to convert the nucleic acids to be detected into a reproducible Shape. In a first optional step, the sample is pretreated (Specimen) instead, by which the sample is brought into a form from which the pointing nucleic acid into one for the transfer of the pretreated sample into one for the Propagation appropriate form is brought.

Die Art der Vorbehandlung der Probe hängt von der Art der Probe und der Komplexität des biologischen Materials in der Probe ab. Bei humanen Körperflüssigkeiten wie z. B. Human- Blut erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform zunächst eine Abtrennung von Blut zellen bei der Erzeugung von Plasma, Serum oder Blutzellkonzentraten. Durch diesen Trennschritt wird durch die Probenvorbehandlung die Komplexität des biologischen Probenmaterials in den resultierenden Fraktionen deutlich reduziert, ohne daß eine sub stantielle Isolierung der nachzuweisenden Nukleinsäure erfolgt. Im Fall von Sputum oder Abstrichen erfolgt eine Probenvorbehandlung, z. B. durch Suspendieren des Sputums bzw. des Abstrichs, im Fall von Urin z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der er haltenen Fraktionen. Im Fall von Gewebspunktionen erfolgt eine Probenvorbehandlung z. B. durch Suspendierung und Behandlung mit einem Zellverbands-auflösenden Agens. Bei Cerebrosidal-Flüssigkeit erfolgt die Probenvorbehandlung z. B. durch Zentrifugation und Weiterverarbeitung der erhaltenen Fraktionen. Auch in diesen Fällen erfolgt durch die Probenvorbehandlung eine Reduktion der Komplexität des biologischen Probenmaterials.The type of pretreatment of the sample depends on the type of sample and the complexity of the biological material in the sample. With human body fluids such as B. Human In a preferred embodiment, blood is first separated from blood cells when generating plasma, serum or blood cell concentrates. Through this Separation step is the complexity of the biological by the sample pretreatment Sample material in the resulting fractions significantly reduced without a sub the nucleic acid to be detected is isolated. In the case of sputum or Smears are performed on a sample pretreatment, e.g. B. by suspending the sputum or the smear, in the case of urine z. B. by centrifugation and further processing of it holding fractions. In the case of tissue punctures, sample pretreatment is carried out e.g. B. by suspension and treatment with a cell-aggregating agent. At Cerebrosidal fluid is used for sample pretreatment e.g. B. by centrifugation and Further processing of the fractions obtained. In these cases, too Sample pretreatment reduces the complexity of the biological sample material.

Danach kann sich ein Schritt anschließen, in dem die nachzuweisende Nukleinsäure aus der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrung zugängliche Form überführt wird. Bei der Überführung der nachzuweisenden Nukleinsäure aus der vorbehandelten Probe in eine für die Vermehrungsreaktion zugängliche Form werden bevorzugt bekannte Methoden angewandt. In einer bevorzugten Ausführung erfolgt in einem ersten Reaktionsschritt eine Lysebehandlung der vorbehandelten Probe zur Freisetzung der nachzuweisenden Nuklein säure, z. B. durch Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxy ribonukleinsäuren durch Alkali. In einem zweiten Schritt wird die lysierte vorbehandelte Probe nach Zugabe von chaotropen Agentien, wie z. B. Guanidinium-Hydrochlorid oder Harnstoff, in An- oder Abwesenheit von löslichen Alkoholen, wie z. B. Isopropanol, an die Oberfläche eines festen Trägers und anschließende Resorption von diesem festen Träger konzentriert. Solche festen Träger sind z. B. feste Träger mit glashaltigen Oberflächen (z. B. Magnetpartikel, Glasvließe mit glashaltigen Oberflächen, Partikel, Mikrotiterplatten, Reaktionsgefäße, Dip-sticks oder miniaturisierte Reaktionskammern, die wiederum auch Teil von intergrierten Reaktionschips sein können). Durch diesen festen Träger erfolgt be vorzugt keine substantielle sequenzspezifische Reinigung und/oder Isolierung der nachzu weisenden Nukleinsäuren, sondern lediglich eine Probenmaterial-(Nuklein säuren-)Konzentrierung und ggf. Inaktivierung und/oder Eliminierung von Inhibitoren für die darauffolgenden Nukleinsäure-Vermehrungs- und Nachweisreaktionen. Durch diese festen Träger ist auch die Bereitstellung mehrerer nachzuweisender Nukleinsäure, z. B. im Rahmen von Multiplex-Verfahren, in für die Nukleinsäure-Vermehrungs- und -Nachweis- Reaktionen zugängliche Form möglich.This can be followed by a step in which the nucleic acid to be detected from the pretreated sample is converted into a form accessible for propagation. In the Transfer of the nucleic acid to be detected from the pretreated sample into a for the propagation reaction accessible form are preferably known methods applied. In a preferred embodiment, a is carried out in a first reaction step Lysis treatment of the pretreated sample to release the nucleotides to be detected acid, e.g. B. by proteinase K treatment at elevated temperatures or with deoxy ribonucleic acids by alkali. In a second step, the lysed is pretreated Sample after adding chaotropic agents, such as. B. guanidinium hydrochloride or Urea, in the presence or absence of soluble alcohols, such as. B. isopropanol to the Surface of a solid support and subsequent absorption of this solid support concentrated. Such solid supports are e.g. B. solid supports with glass-containing surfaces (e.g. magnetic particles, glass fleece with glass-containing surfaces, particles, microtiter plates, Reaction tubes, dip sticks or miniaturized reaction chambers, which in turn also Can be part of integrated reaction chips). Through this solid support be preferably no substantial sequence-specific purification and / or isolation of the pointing nucleic acids, but only a sample material (nucleotide acid) concentration and if necessary inactivation and / or elimination of inhibitors for the subsequent nucleic acid amplification and detection reactions. Through this fixed The carrier is also the provision of several nucleic acids to be detected, e.g. B. in Framework of multiplex processes in for nucleic acid amplification and detection Reaction accessible form possible.

In einer anderen Ausführung kann die Überführung der nachzuweisenden Nukleinsäure aus der vorbehandelten Probe nach Nukleinsäure-Freisetzung in einem ersten Schritt durch z. B. Proteinase K-Behandlung bei erhöhten Temperaturen oder bei Desoxyribonuklein säuren durch Alkali erfolgen. In einem zweiten Schritt wird die lysierte vorbehandelte Probe zur Bindung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit festen Trägern in Kontakt gebracht, die z. B. mit Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen und/oder Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure zur selektiven Bindung modifiziert sind, und anschließend die gebundene nachzuweisende Nukleinsäure durch Dissoziation zwischen Bindungsgruppe und/oder trägergebundener Fangsonde und nachzuweisender Nukleinsäure wieder eluiert. Beispiele für Nukleinsäure-spezifische Bindungsgruppen sind PNA-Homopyrimidin- Oligomere wie z. B. (T)₇-PNA oder Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Substanzen wie z. B. Nukleinsäure-Interkalatoren, Major groove-Binder oder Minor groove-Binder. Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind Nukleinsäure-Oligomere oder Nukleinsäure-Polymere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Weitere Beispiele für Fangsonden spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure sind PNA-Oligomere mit Bindungssequenzen für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren. Die Bindung der Nukleinsäure-spezifischen Bindungsgruppen oder der Fangsonden an den festen Träger kann mit oder ohne Zwischen schaltung von Abstandshaltern (Spacern) entweder kovalent oder über Bindungspaare wie z. B. Biotin:Streptavidin oder Ni:Chelat erfolgen.In another embodiment, the transfer of the nucleic acid to be detected from the pretreated sample after nucleic acid release in a first step by z. B. Proteinase K treatment at elevated temperatures or at deoxyribonucleic acids by alkali. In a second step, the lysed pretreated sample for binding the nucleic acid to be detected is brought into contact with solid supports which, for. B. with nucleic acid-specific binding groups and / or capture probes are modified specifically for the nucleic acid to be detected for selective binding, and then the bound nucleic acid to be detected is eluted again by dissociation between the binding group and / or carrier-bound capture probe and nucleic acid to be detected. Examples of nucleic acid-specific binding groups are PNA homopyrimidine oligomers such as. B. (T) ₇ -PNA or nucleic acid-binding low-molecular substances such as. B. nucleic acid intercalators, major groove binders or minor groove binders. Examples of capture probes specific for the nucleic acid to be detected are nucleic acid oligomers or nucleic acid polymers with binding sequences for one or more nucleic acids to be detected. Further examples of capture probes specific for the nucleic acid to be detected are PNA oligomers with binding sequences for one or more nucleic acids to be detected. The binding of the nucleic acid-specific binding groups or the capture probes to the solid support can be carried out with or without interposition of spacers either covalently or via binding pairs such as. B. Biotin: streptavidin or Ni: chelate.

Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäurensequenzen können linear oder zirkulär sein und können Sequenz-Modifikationen und/oder sonstige Modifikationen wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen-Analoga oder Äquivalente davon enthalten oder/und methyliert, gecappt, polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifiziert sein. Die zur Vermehrung eingesetzten Nukleinsäuren oder deren Komplement können natürlichen Ursprungs sein, fragmentiert, modifiziert oder enzymatisch, z. B. mit dem Enzym Uracil-Deglykosylase (ung), oder physikalisch vorbehandelt, vorvermehrt, oder chemisch, photochemisch oder enzymatisch erzeugt sein, z. B. durch chemische Oligonukleotidsynthese oder in-vitro-Replikation, in-vitro-Reverse Transkription oder in-vitro-Transkription. The nucleic acid sequences used for the amplification can be linear or circular and can sequence modifications and / or other modifications such as. B. natural or artificial nucleotide analogs or equivalents thereof or base analogs or Equivalents contain or / and methylated, capped, polyadenylated or otherwise Modified way. The nucleic acids used for the propagation or their Complement can be of natural origin, fragmented, modified or enzymatically, e.g. B. with the enzyme uracil deglycosylase (ung), or physically pretreated, propagated, or produced chemically, photochemically or enzymatically, e.g. B. by chemical oligonucleotide synthesis or in vitro replication, in vitro reverse Transcription or in vitro transcription.

In dem ersten essentiellen Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsäure amplifiziert. Im folgenden wird dieses Teil stück auch Amplikon genannt. Dieses enthält zwingend den Sequenzbereich zwischen den äußeren Enden der Bindesequenzen bzw. des Komplements davon der Primer (den Primer bindungsbereichen), und enthält den Bindebereich E der Sonde bzw. das Komplement da von. Gemaß der vorliegenden Erfindung ist das Amplikon (bevorzugt die Gesamtlänge der Sequenzen der Bereiche A, B und C) kürzer als 100 Nukleotide, besonders bevorzugt kürzer als 60 Nukleotide, jedoch bevorzugt länger als 40 Nukleotide. Dies bedeutet jedoch nicht, daß die Gesamtlänge der Amplifikate nicht doch größer sein kann, z. B. wenn die Primer zusätzlich Nukleotide aufweisen, die nicht innerhalb der Bindebereiche liegen. Es werden solche Vermehrungsmethoden eingesetzt, die eine Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement erlauben, die in der Bildung von Tripartite-Mini-Nukleinsäure-Vermehrungsprodukten münden [Mini Chain Reaction (MCR)]. Hierfür stehen prinzipiell alle Nukleinsäureamplifikationsverfahren zur Verfügung, die im Stand der Technik bekannt sind. Bevorzugt werden targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen verwendet. Besonders bevorzugt werden theoretisch exponentielle targetspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsreaktionen verwendet, bei denen eine antiparallele Replikation der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement erfolgt, wie z. B. Elongations-basierte Reaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR für Desoxyribonukleinsäuren, RT-PCR für Ribonukleinsäuren). In besonderer Weise bevorzugt werden thermozyklische exponentielle Elongations-basierte Nukleinsäure- Vermehrungsreaktionen wie z. B. die Polymerase-Kettenrektion verwendet. Die zur Vermehrung eingesetzten nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplement können in Form von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäuren oder Ribonukleinsäuren vorliegen. Ziel der Vermehrungsreaktionen ist die Herstellung einer Vielzahl von Amplifikaten eines Teilstücks der nachzuweisenden Nukleinsäure. Unter einem Amplifikat wird daher jede unter Verwendung von Sequenzinformation der Nukleinsäure hergestellte Molekülspezies verstanden. Insbesondere handelt es sich um Nukleinsäuren. Der Begriff "Amplifikate" beinhaltet sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren. Ein Amplifikat kann neben den die Sequenzinformationen der zugrunde liegenden Nukleinsäure enthaltenden Bereichen (Amplikon) außerhalb der voneinander wegweisenden Enden der Primerbindungsstellen noch weitere Bereiche enthalten, welche nicht in direkter Relation mit Sequenzen der zu amplifizierenden Nukleinsäure stehen. In the first essential process step of the process according to the invention, a Part of the nucleic acid to be detected amplified. The following is this part piece also called amplicon. This necessarily contains the sequence area between the outer ends of the binding sequences or the complement thereof the primer (the primer binding areas), and contains the binding area E of the probe or the complement there from. According to the present invention, the amplicon (preferably the total length of the Sequences of areas A, B and C) shorter than 100 nucleotides, particularly preferred shorter than 60 nucleotides, but preferably longer than 40 nucleotides. However, this means not that the total length of the amplificates cannot be longer, e.g. B. if the Primers additionally have nucleotides that are not within the binding areas. It such propagation methods are used that increase the allow to be detected nucleic acid sequence or its complement, which in the Formation of tripartite mini-nucleic acid amplification products [mini chain Reaction (MCR)]. In principle, all nucleic acid amplification methods are available for this Available that are known in the art. Target-specific are preferred Nucleic acid amplification reactions used. Theoretically are particularly preferred used exponential target-specific nucleic acid amplification reactions in which an antiparallel replication of the nucleic acid to be detected or its complement takes place such. B. elongation-based reactions such. B. the polymerase chain reaction (PCR for deoxyribonucleic acids, RT-PCR for ribonucleic acids). In a special way thermocyclic exponential elongation-based nucleic acid Propagation reactions such as B. uses the polymerase chain reaction. The for Multiplication nucleic acids to be detected or their complement can be used in the form of single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids or Ribonucleic acids are present. The aim of the propagation reactions is to produce one A large number of amplificates of a section of the nucleic acid to be detected. Under a Each is therefore amplified using sequence information of the nucleic acid understood molecular species understood. In particular, they are nucleic acids. The term "amplificates" includes both single-stranded and double-stranded Nucleic acids. An amplificate can be used in addition to the sequence information lying nucleic acid containing areas (amplicon) outside of each other pioneering ends of the primer binding sites still contain other areas, which are not directly related to sequences of the nucleic acid to be amplified.

Bevorzugt kommen gerade solche Sequenzen einer Länge von mehr als 15 Nukleotiden nicht auf der nachzuweisenden Nukleinsäure oder ihrem Komplement vor und können mit dieser nicht durch direkte Basenpaarung hybridisieren. Amplifikate können somit entweder mit der nachzuweisenden Nukleinsäure selbst oder mit deren Komplement hybridisieren. Amplifikate sind beispielsweise auch die Produkte einer asymmetrischen Amplifikation, d. h. einer Amplifikation, bei der die beiden Stränge in unterschiedlicher Menge gebildet werden (z. B. durch Einsatz unterschiedlicher Mengen an Primern) oder einer der beiden Stränge wieder zerstört wird (z. B. durch RNase).Such sequences with a length of more than 15 nucleotides are preferred not on the nucleic acid to be detected or its complement and can with this does not hybridize by direct base pairing. Amplificates can either hybridize with the nucleic acid to be detected itself or with its complement. Amplificates are, for example, the products of asymmetric amplification, i.e. H. an amplification in which the two strands are formed in different amounts (e.g. by using different amounts of primers) or one of the two strands is destroyed again (e.g. by RNase).

Unter einem Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül verstanden, welches über Basenpaarungen an eine Nukleinsäure T oder deren Komplement binden kann und welches, bevorzugt enzymatisch, verlängert werden kann. Bevorzugt sind Oligo nukleotide, die an ihrem 3'-Ende unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsäure oder einem Komplement hiervon als Templatnukleinsäure verlängert werden können. Als Primer können monovalente oder multivalente oder monofunktionelle oder multifunktionelle Agentien eingesetzt werden, die eine Nukleinsäure-abhängige Elongation zulassen. Diese Agentien können auch aus verschiedenen Molekülarten zusammengesetzt sein, z. B. Chimären aus PNA und Nukleotid(en) oder aus Protein/Peptid und Nukleotid(en). Bevor zugt können als Primer Oligomere oder Polymere einer Bindelänge von zwischen 9 und 30 nt, besonders bevorzugt zwischen 11 und 22 nt verwendet werden, die an die nachzu weisende Nukleinsäure T oder deren Komplement antiparallel binden und die als ein von mehreren Reaktionspartnern für eine enzymatische Replikation der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement wirken. Besonders bevorzugt werden als Primer Oligomere verwendet, die nach Zugabe eines Vermehrungsreagenzes durch Anlagerung zumindest eines Teils des Primers an die nachzuweisende Nukleinsäure oder deren Komplement eine gerichtete Replikation einer oder beider Stränge der nachzuweisenden Nukleinsäure oder deren Komplement initiiert. Ein Beispiel für einen besonders bevorzugten Primer ist ein Desoxyribooligonukleotid mit einem freien 3'-Hydroxyl-Ende.A primer in the sense of the present invention is understood to be a molecule which can bind to a nucleic acid T or its complement via base pairings and which, preferably enzymatically, can be extended. Oligo are preferred nucleotides at their 3 'end using the nucleic acid to be detected or a complement thereof can be extended as template nucleic acid. As Primers can be monovalent or multivalent or monofunctional or multifunctional Agents are used that allow nucleic acid-dependent elongation. This Agents can also be composed of different types of molecules, e.g. B. Chimeras from PNA and nucleotide (s) or from protein / peptide and nucleotide (s). Before can act as primers oligomers or polymers with a bond length of between 9 and 30 nt, particularly preferably between 11 and 22 nt, which are used after the bind pointing nucleic acid T or its complement antiparallel and which as one of several reaction partners for an enzymatic replication of the Nucleic acid or its complement act. Are particularly preferred as primers Oligomers used after the addition of a multiplying reagent by attachment at least part of the primer to the nucleic acid to be detected or its Complement a directed replication of one or both strands of the one to be detected Initiated nucleic acid or its complement. An example of a particularly preferred one Primer is a deoxyribooligonucleotide with a free 3'-hydroxyl end.

Die als Primer eingesetzten Agentien können prinzipiell weitere Gruppen enthalten, wie z. B. Markierungen. Bevorzugt enthalten die Primer keine Modifikation, die später zur Detektion oder zur Immobilisierung der Amplifikate eingesetzt würde. Erforderlich ist nur, daß die Primer die geforderten Bindeeigenschaften zur nachzuweisenden Nukleinsäure bzw. ihrem Komplement haben und verlängerbar sind. The agents used as primers can in principle contain further groups, such as. B. Markings. The primers preferably do not contain any modification which is used later for detection or would be used to immobilize the amplificates. It is only necessary that the Primer the required binding properties to the nucleic acid to be detected or their Have complement and are renewable.

Unter einer Sonde wird ein Molekül verstanden, welches aufgrund von Basen-Basen- Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren hybridisieren kann und welches mit Hilfe der 5'- Nuclease-Aktivität der Taq-Polymerase, Tth-Polymerase oder anderer Polymerasen mit 5'- Nuclease-Aktivität oder clonierte, mutierte oder chimäre Polymerasen mit 5'-Nuclease- Aktivität stückweise abgebaut werden kann. Bevorzugte Sonden sind daher Oligodesoxyribonukleotide. Die Länge einer Sonde beträgt, bezogen auf die Bindesequenz D, bevorzugt zwischen 9 und 30 Basen. Die Sonde weist bevorzugt an unterschiedlichen Nukleotiden eine Reportergruppe, die Licht einer Wellenlänge absorbieren kann, und einen Quencher, der die eingestrahlte und von der Reportergruppe absorbierte Energie ganz oder teilweise übernehmen kann, so daß eine Emission von Licht durch die Reportergruppe unterdrückt wird, auf Details für die Herstellung einer solchen Sonde sowie die generellen Bedingungen für die Durchführung eines Nachweisverfahrens aufgrund dieses Prinzips sind in WO 92/22638, US-A- 5,210,015 sowie EP-A-0 699 768 beschrieben. Auf die Offenbarung dieser Patentanmeldungen sowie ihrer Äquivalente wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.A probe is understood to be a molecule which is based on base-base Can hybridize interactions with nucleic acids and which with the help of the 5'- Nuclease activity of Taq polymerase, Tth polymerase or other polymerases with 5'- Nuclease activity or cloned, mutated or chimeric polymerases with 5'-nuclease Activity can be broken down piece by piece. Preferred probes are therefore Oligodeoxyribonucleotides. The length of a probe is based on the binding sequence D, preferably between 9 and 30 bases. The probe preferably points to different ones Nucleotides a reporter group that can absorb light of one wavelength and one Quencher, the whole of the radiated energy and absorbed by the reporter group can partially take over so that an emission of light by the reporter group is suppressed on details for the manufacture of such a probe as well as the general Conditions for carrying out a verification procedure based on this principle are in WO 92/22638, US-A-5,210,015 and EP-A-0 699 768. On the Disclosure of these patent applications and their equivalents is hereby expressly made Referred.

Unter einer Bindesequenz wird bevorzugt die Sequenz von Basen verstanden, die zwischen den äußersten, mit einer bestimmten Nukleinsäure, einem Primer oder einer Sonde über Basen-Basen-Wechselwirkung bindenden Basen einer bestimmten Nukleinsäure, einem Primer oder einer Sonde liegt, einschließlich dieser äußersten Basen.A binding sequence is preferably understood to mean the sequence of bases which are between the outermost, with a certain nucleic acid, a primer or a probe Base-base interaction binding bases of a certain nucleic acid, a Primer or probe, including these outermost bases.

Die als Sonde eingesetzten Agentien können eine oder mehrere Bindesequenzen D für eine oder mehrere nachzuweisende Nukleinsäuren oder deren Komplement, insbesondere jedoch für einen Strang des Amplifikats enthalten und können Sequenz-Modifikationen, end ständige und/oder interne Sequenzergänzungen und/oder sonstige Modifikationen wie z. B. natürliche oder artifizielle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon, nicht funktio nelle Nukleotidanaloga oder Äquivalente davon oder Basen-Analoga oder Äquivalente da von enthalten oder methyliert, gecappt oder polyadenyliert oder in sonstiger Weise modifi ziert sein, solange die Bindung an einen Strang des Amplifikats möglich ist, und ein Abbau durch eine 5'-Nuklease möglich ist. Die Reportergruppe liegt bevorzugt in 5'-Richtung von der Quenchergruppe in einer Entfernung, die ein effektives Quenchen noch erlaubt.The agents used as a probe can contain one or more binding sequences D for one or several nucleic acids to be detected or their complement, in particular however for one strand of the amplificate and can contain sequence modifications, end permanent and / or internal sequence additions and / or other modifications such as e.g. B. natural or artificial nucleotide analogs or equivalents thereof, not functio nelle nucleotide analogs or equivalents thereof or base analogs or equivalents there of contained or methylated, capped or polyadenylated or otherwise modified be decorated as long as binding to a strand of the amplificate is possible, and degradation is possible with a 5 'nuclease. The reporter group is preferably in the 5 'direction of the quencher group at a distance that still allows effective quenching.

In der vorliegenden Erfindung wird das Teilstück der Nukleinsäure, von welchem eine Viel zahl von Amplifikaten hergestellt werden soll, so ausgewählt, daß es drei Bereiche A, B und C enthält. Die Bereiche A und C sind Bereiche, die so gewählt werden, daß der eine Primer die Sequenz A als Bindesequenz benutzen kann und das Komplement des Bereiches C als Bindesequenz für den anderen Primer dienen kann. Unter einem Komplement wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine zu einer bestimmten anderen Nukleinsäure, z. B. einem Sequenzbereich z. B. eines Amplifikats oder der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz verstanden.In the present invention, the portion of the nucleic acid, one of which is a lot Number of amplicons to be produced, selected so that there are three areas A, B and C contains. The areas A and C are areas that are selected so that the one primer can use sequence A as a binding sequence and the complement of region C as Binding sequence can serve for the other primer. A complement is in the sense of the present invention to a certain other nucleic acid, e.g. B. one Sequence area z. B. an amplificate or the nucleic acid to be detected in understood essential complementary nucleic acid or nucleic acid sequence.

Im wesentlichen komplementär bedeutet, daß die Basenpaarungen so gewählt sind, daß (für den Fall, daß eine Hybridisierung mit einer anderen Nukleinsäure, z. B. einer Sonde oder einem Primer) eine Hybridisierung unter den Testbedingungen noch erfolgen kann bzw. (für den Fall eines Verlängerungsprodukts eines Primers im Verhältnis zu dem eingesetzten Templat) die Nukleinsäure aufgrund einer Primerverlängerungsreaktion unter Verwendung der entsprechenden Nukleinsäure gebildet werden konnte. Im wesentlichen komplementär bedeutet daher oft, daß unter stringenten Bedingungen mehr als 90% der Basen der be trachteten Nukleinsäure bzw. Sequenz mit der bestimmten Nukleinsäure bzw. Sequenz Basenpaarungen ausbilden.Essentially complementary means that the base pairings are chosen such that (for the case that hybridization with another nucleic acid, e.g. B. a probe or a primer) a hybridization can still take place under the test conditions or (for the case of an extension product of a primer in relation to the one used Template) using the nucleic acid due to a primer extension reaction the corresponding nucleic acid could be formed. Essentially complementary therefore often means that under stringent conditions more than 90% of the bases of the be sought nucleic acid or sequence with the particular nucleic acid or sequence Form base pairings.

Die Bereiche A und C sind erfindungsgemäß bevorzugt so lang, daß Bedingungen gefunden werden können, bei denen Primer einer entsprechenden Länge mit den Basen in diesen Be reichen hybridisieren können. Daher sind die Bereiche bevorzugt länger als 8, besonders bevorzugt länger als 12 Nukleotide. Auch bezüglich der Obergrenze der Länge der Bereiche A und C ergeben sich im Sinne der Erfindung bevorzugte Bereiche. Die Bereiche A und C sind jeweils bevorzugt kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 20 Nukleotide. Die Länge der Bereiche wird in einem besonderen Aspekt der Erfindung dadurch nach oben begrenzt, daß die Primer in für die nachzuweisende Nukleinsäure unspezifischer Weise daran hybridisieren können sollen. Daher ist die besonders bevorzugte Länge der Binde sequenzen A und C 12 bis 20 Nukleotide. Die Bereiche A und C auf der nachzuweisenden Nukleinsäure überlappen nicht miteinander.The areas A and C according to the invention are preferably so long that conditions are found can be in which primers of a corresponding length with the bases in these Be can hybridize rich. Therefore, the ranges are preferably longer than 8, especially preferably longer than 12 nucleotides. Also regarding the upper limit of the length of the areas A and C result in preferred ranges in the sense of the invention. The areas A and C are each preferably less than 30, particularly preferably less than 20 nucleotides. The In a particular aspect of the invention, the length of the regions is thereby increased limited that the primers in a manner unspecific for the nucleic acid to be detected should be able to hybridize to it. Hence the most preferred length of the napkin sequences A and C 12 to 20 nucleotides. The areas A and C on the demonstrable Nucleic acids do not overlap.

Im Sinne der Erfindung enthalten das Teilstück der nachzuweisenden Nukleinsäure (welches dem Amplikon entspricht) und somit die hieraus gebildeten Amplifikate eine zwischen den Bereichen A und C gelegene Sequenz B (Fig. 1 bis 3). Diese Sequenz hat eine Länge von ein oder mehr Nukleotiden, bevorzugt mehr als 4, besonders bevorzugt mehr als 8 Nukleo tide. Nach oben hin ist die Länge der Sequenz B durch die geforderte Gesamtlänge des Amplifikats begrenzt. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Sequenz B keine Nukleotide, die nicht der Bindesequenz der Sonde zugehören. Bevorzugt ist die Sequenz B daher kleiner als 30, besonders bevorzugt kleiner als 15 Nukleotide. Die Sequenz B hat bevorzugt eine Länge von zwischen 4 und 30 Nukleotiden. Besonders bevorzugt ist die Länge der Sequenz B zwischen 8 und 15 Nukleotiden. Diese Sequenz oder das Komplement davon dienen im Sinne der Erfindung mit zur Bindung der Sonde. Die Länge der Sonde wird so gewählt, daß eine Hybridisierung mit dem Amplifikat möglich ist. Die Sequenz der Sonde wird so gewählt, daß sie eine Bindesequenz D enthält, welche durch die mit dem Amplikon Basen-Basen-Wechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde, insbesondere den zwischen den äußersten mit korrespondierenden Basen des Amplikons Basenwechselwirkung ausbildenden Nukleotide der Sonde definiert ist. Bevorzugt ist die Sonde im wesentlichen komplementär zu den Nukleotiden der Bindesequenz E des Amplifikats. Die Bindesequenz D bzw. D' kann zu dem Amplifikat zu 100% komplementär sein, aber auch Mismatche zwischen den äußeren Enden der Bindesequenz aufweisen. Die Sonde kann neben der Bindesequenz weitere Gruppen oder Reste oder auch Nukleinsäure bindende Bereiche enthalten (Fig. 3, V, VI).For the purposes of the invention, the section of the nucleic acid to be detected (which corresponds to the amplicon) and thus the amplificates formed therefrom contain a sequence B located between regions A and C ( FIGS. 1 to 3). This sequence has a length of one or more nucleotides, preferably more than 4, particularly preferably more than 8 nucleotides. The length of sequence B is limited at the top by the required total length of the amplificate. In a preferred embodiment, sequence B contains no nucleotides that do not belong to the binding sequence of the probe. Sequence B is therefore preferably less than 30, particularly preferably less than 15 nucleotides. Sequence B preferably has a length of between 4 and 30 nucleotides. The length of the sequence B is particularly preferably between 8 and 15 nucleotides. For the purposes of the invention, this sequence or the complement thereof also serves to bind the probe. The length of the probe is chosen so that hybridization with the amplificate is possible. The sequence of the probe is selected such that it contains a binding sequence D which is defined by the nucleotides of the probe which form base-base interaction with the amplicon, in particular the nucleotides of the probe which form base interaction between the outermost bases with corresponding bases of the amplicon. The probe is preferably essentially complementary to the nucleotides of the binding sequence E of the amplificate. The binding sequence D or D 'can be 100% complementary to the amplificate, but can also have mismatches between the outer ends of the binding sequence. In addition to the binding sequence, the probe can contain further groups or residues or also nucleic acid-binding regions ( FIG. 3, V, VI).

Abhängig von der Länge des Bereiches B und der Länge der Bindesequenz D bzw. D' lassen sich unterschiedliche Fallgestaltungen treffen. In einem ersten Fall ist die Binde sequenz D oder D' länger als der Bereich B bzw. B' des Amplikons. In diesem Fall reicht die Bindesequenz D bzw. D' in einen oder beide Bereiche A bzw. A' und C bzw. C' des Amplikons hinein. Diese Fälle sind in Fig. 3, II bis IV gezeigt. In diesen Fällen enthält das Amplifikat zwischen den voneinander wegweisenden Enden der Bereiche A und C keine Nukleotide, die nicht der Bindesequenz E oder den Bindesequenzen der Primer zugehören. Die Bindesequenz D der Sonde überlappt in Fig. 3, II und III mit einer der beiden Binde sequenzen der Primer.Depending on the length of area B and the length of the binding sequence D or D ', different case configurations can be made. In a first case, the binding sequence D or D 'is longer than the region B or B' of the amplicon. In this case, the binding sequence D or D 'extends into one or both regions A or A' and C or C 'of the amplicon. These cases are shown in Fig. 3, II to IV. In these cases, the amplificate between the mutually pointing ends of regions A and C contains no nucleotides which do not belong to the binding sequence E or the binding sequences of the primers. The binding sequence D of the probe overlaps in Fig. 3, II and III with one of the two binding sequences of the primers.

In einem weiteren Fall entspricht die Länge des Bereiches B der Länge des Bereiches D, so daß die Bindesequenz der Sonde nicht mit den Bindesequenzen der Primer überlappt (Fig. 3, I). Bevorzugt im Sinne der Erfindung überlappt der Bereich D bzw. D' nicht mit dem in 5'-Richtung gelegenen Bereich A' A', C oder C'.In another case, the length of area B corresponds to the length of area D, so that the binding sequence of the probe does not overlap with the binding sequences of the primers ( FIG. 3, I). Preferably in the sense of the invention, the area D or D 'does not overlap with the area A' A ', C or C' in the 5 'direction.

Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet in einer bevorzugten Ausführungsform die Bildung von dreiteiligen Mini-Amplikons (Tripartite-Mini-Amplikon), die neben den Primer und Sonde bindenden Sequenzen keine zusätzlichen Sequenzen aufweisen und somit die Nachteile bei Bildung von längeren Nukleinsäure-Vermehrungsprodukten vermeiden, wobei andererseits die Spezifität des gesamten Amplifikationsformats durch Bindung der Primer, durch Bindung der Sonde und durch Ablauf der targetabhängigen enzymatischen Elongationsreaktion mit allen 4 Nukleotid- bzw. Basenspezifitäten oder natürlicher oder artifizieller Analoga, Isomere oder Äquivalente davon aber sichergestellt wird. Das er findungsgemäße Vermehrungsverfahren wird daher auch als Mini-Chain-Reaction (MCR) bezeichnet.In a preferred embodiment, the method according to the invention includes Formation of three-part mini amplicons (tripartite mini amplicon) next to the primer and probe binding sequences have no additional sequences and thus the Avoid disadvantages in the formation of longer nucleic acid amplification products, whereby on the other hand the specificity of the entire amplification format by binding the primers, by binding the probe and by running the target-dependent enzymatic Elongation reaction with all 4 nucleotide or base specificities or natural or artificial analogs, isomers or equivalents thereof is ensured. That he propagation process according to the invention is therefore also referred to as a mini-chain reaction (MCR) designated.

Die Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsänresequenzen oder deren Komplement erfolgt, wenn im folgenden nichts anderes ausgesagt ist, unter Befolgung der dem Fachmann bekannten Reaktionsschritte und Reaktionsbedingungen. Ein Unterschied zu den her kömmlichen Verfahren ist der Einsatz der speziell ausgewählten Primer und Sondens equenzen, welche die Bildung und Vermehrung des Mini-Tripartite-Amplikons erlauben. Wesentlich im Sinne der Erfindung ist die Zugabe von einem oder mehrerer Primer, die an die Primer-Bindesequenzen der nachzuweisenden Nukleinsäure, des Tripartite-Mini-Ampli kons beziehungsweise deren Komplemente binden.The multiplication of the nucleic acid sequences to be detected or their complement If nothing else is stated below, this is done in accordance with the expert known reaction steps and reaction conditions. A difference to the ago The conventional method is the use of specially selected primers and probes sequences that allow the formation and multiplication of the mini tripartite amplicon. Essential in the sense of the invention is the addition of one or more primers which are the primer binding sequences of the nucleic acid to be detected, the tripartite mini-ampli bind cons or their complements.

Allgemein üblich ist die Zugabe zur Vermehrung befähigender Vermehrungsreagentien. Be vorzugt können als Vermehrungsreagentien enzymatisch aktive Komponenten (z. B. Enzyme) in Kombination mit Elongationssubstraten und geeignete Hilfsreagentien (wie Puffer) verwendet werden. Bevorzugte Elongationssubstrate sind Nukleinsäurebau steine oder natürliche oder artifizielle Analoga oder Isomere oder Äquivalente davon. Als Elongationssubstrate werden Agentien eingesetzt, die zum Aufbau eines Gegenstrangs der nachzuweisenden Nukleinsäure geeignet sind. Bevorzugt werden als Elongationssubstrate Nukleotide eingesetzt. Bevorzugte Nukleotide sind dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP, dITP, iso-dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP und ATP, GTP, CTP, UTP und/oder ITP, deazaGTP, iso-GTP, iso-CTP.It is common to add multiplying reagents that are capable of multiplying. Be enzymatic active components can be preferred as propagation reagents (e.g. enzymes) in combination with elongation substrates and suitable auxiliary reagents (like buffers) can be used. Preferred elongation substrates are nucleic acid construction stone or natural or artificial analogues or isomers or equivalents thereof. As Elongation substrates are used to build a counter strand of the agents nucleic acid to be detected are suitable. Preferred elongation substrates are Nucleotides used. Preferred nucleotides are dATP, dGTP, dCTP, dTTP and / or dUTP, dITP, iso-dGTP, iso-dCTP, deaza-dGTP and ATP, GTP, CTP, UTP and / or ITP, deazaGTP, iso-GTP, iso-CTP.

Besonders bevorzugt werden im Fall der PCR als Nukleinsäure-Vermehrungsreagentien Mischungen aus meta- oder thermostabilen enzymatischen DNA-Polymerase-Aktivitäten und Mischungen von Desoxyribo- und/oder Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagenzien verwendet, z. B. T.aq.-DNA Polymerase in Kombination mit dATP, dGTP, dCTP, dTTP und/oder dUTP und Hilfsreagentien wie z. B. Salze und ggf. Detergentien. Besonders be vorzugt werden im Fall der RT-PCR als Vermehrungsreagentien Mischungen, Komplexe oder Domänen aus thermostabilen enzymatischen Reverse Transkriptase- und DNA- Polymerase-Aktivitäten und Mischungen von Desoxyribo- und Ribonukleotiden und geeignete Hilfsreagentien verwendet, z. B. Mischungen aus AMV oder Mo-MLV-Reverse Transkriptase.In the case of PCR, nucleic acid amplification reagents are particularly preferred Mixtures of meta- or thermostable enzymatic DNA polymerase activities and mixtures of deoxyribo- and / or ribonucleotides and suitable auxiliary reagents used, e.g. B. T.aq.-DNA polymerase in combination with dATP, dGTP, dCTP, dTTP and / or dUTP and auxiliary reagents such as e.g. B. salts and optionally detergents. Especially be In the case of RT-PCR, mixtures and complexes are preferred as multiplication reagents or domains from thermostable enzymatic reverse transcriptase and DNA Polymerase activities and mixtures of deoxyribo- and ribonucleotides and suitable auxiliary reagents are used, e.g. B. Mixtures of AMV or Mo-MLV reverse Transcriptase.

Bei den thermozyklischen Vermehrungsreaktionen (z. B. PCR, RT-PCR) werden 2- oder 3- phasige Zyklen durchgeführt, bevorzugt 2-phasige Zyklen. Bei den 2-phasigen Zyklen wird die Strangtrennung der Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte bei hoher Temperatur, bevor zugt 85°C-95°C, durchgeführt, das gemeinsame Primer- und Sonden-Annealing und Primer-Elongation bei Temperaturen nahe dem Schmelzpunkt zwischen Primer und Elongationsgegenstrang bzw. Primer und Sonde und Elongationsgegenstrang, bevorzugt zwischen 48°C und 72°C. Die Strangtrennung erfolgt durch Energiezufuhr und/oder enzymatisch, bevorzugt durch erhöhte Temperatur, Mikrowellen oder das Anlegen einer Spannung über eine Mikroelektrode, besonders bevorzugt durch erhöhte Temperatur. Es werden bis zu 80 Thermozyklen durchgeführt, bevorzugt bis zu 60 Zyklen. Es wird bis zu 4 Stunden inkubiert, bevorzugt 30-120 Minuten. Die Vermehrungsreaktion kann in Reaktionsgefäßen, Kapillaren oder miniaturisierten Reaktionskammern erfolgen, die auch Teil eines integrierten Reaktionschips sein können. Die Fluoreszenzmessung erfolgt während der Amplifikationsreaktion kontinuierlich oder innerhalb kurzer Zeitintervalle, bevorzugt mehrfach während eines Temperaturcyclus, besonders bevorzugt 3fach oder öfters während eines Temperaturcyclus. Die Vermehrungsreaktion kann eine interne Kontrolle und/oder Kalibrator enthalten. Die Kontrolle kann auch extern durch eine zusätzliche Vermehrungsreaktion erfolgen.In the thermocyclic multiplication reactions (e.g. PCR, RT-PCR) 2- or 3- phase cycles carried out, preferably 2-phase cycles. With the 2-phase cycles the strand separation of the nucleic acid amplification products at high temperature before pulls 85 ° C-95 ° C, performed the common primer and probe annealing and Primer elongation at temperatures close to the melting point between primer and Elongation counter strand or primer and probe and elongation counter strand, preferred between 48 ° C and 72 ° C. The strand separation takes place by supplying energy and / or enzymatically, preferably by elevated temperature, microwaves or the application of a Voltage across a microelectrode, particularly preferably through elevated temperature. It up to 80 thermal cycles are carried out, preferably up to 60 cycles. It will be up to 4 Incubated for hours, preferably 30-120 minutes. The propagation reaction can in Reaction vessels, capillaries or miniaturized reaction chambers are also made Can be part of an integrated reaction chip. The fluorescence measurement is carried out continuously or within short time intervals during the amplification reaction, preferably several times during a temperature cycle, particularly preferably three times or often during a temperature cycle. The propagation reaction can be internal Control and / or calibrator included. Control can also be carried out externally additional propagation reaction take place.

Bei Verwendung von dUTP anstelle von oder in Erganzung zu dTTP wird durch die DNA- Polymerase-Aktivität dUMP anstelle von dTMP in die vermehrte Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement eingebaut. Dies erlaubt durch Inkubation mit der Enzymaktivität Uracil- Deglycosylase, bevorzugt mit einer thermolabilen Ausführungsform der Enzymaktivität, bei der die Renaturierung nach thermischer Denaturierung der Enzymaktivität langsamer erfolgt, die Fragmentierung des Vermehrungsprodukts und somit seiner Eigenschaft als Nukleinsäure-Vermehrungseinheit. Die Inkubation des UMP-haltigen Vermehrungsprodukts kann im Anschluß an die Nukleinsäure-Vermehrungs- und Nachweisreaktion (Sterilisierung) und/oder vor einer erneuten Nukleinsäure-Vermehrungsreaktion (Carry over-Prävention) erfolgen. When using dUTP instead of or in addition to dTTP, the DNA Polymerase activity dUMP instead of dTMP in the increased nucleic acid sequence or their complement built in. This allows by incubation with the enzyme activity uracil Deglycosylase, preferably with a thermolabile embodiment of the enzyme activity which slows down the renaturation after thermal denaturation of the enzyme activity takes place, the fragmentation of the propagation product and thus its property as Nucleic acid amplification unit. The incubation of the multiplication product containing UMP following the nucleic acid amplification and detection reaction (sterilization) and / or before a new nucleic acid multiplication reaction (carry over prevention) respectively.

Alternativ können auch Psoralen und/oder Isopsoralen und Derivate davon und Bestrahlung mit UV-Licht zur funktionellen Inaktivierung des Nukleinsäure-VermehrungsprodukLs ver wendet werden.Alternatively, psoralen and / or isopsoral and derivatives thereof and radiation with UV light for the functional inactivation of the nucleic acid amplification product be applied.

Der Nachweis der Bildung der Amplifikate erfolgt mit der Sonde, die an die Binde sequenz B des Amplikons zu einem Hybrid bindet. Die wirkt als Substrat zur Freisetzung einer Reportergruppe aus ihr. Die Enden der Bindesequenz der Sonde liegen zwischen den äußeren Enden der Primer-Bindesequenzen. Die Sonde ist somit hybridisierbar mit einem Strang des Amplifikats.The detection of the formation of the amplificates is done with the probe attached to the bandage sequence B of the amplicon binds to a hybrid. It acts as a substrate for release a reporter group from her. The ends of the probe binding sequence lie between the outer ends of the primer binding sequences. The probe can thus be hybridized with a Strand of amplicon.

Die Bindung der Sonde kann unter Benutzung bekannter Bedingungen geschehen. Denn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Hames und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution-Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug ge nommen. Zu den bekannten Methoden gehört auch die chemische Synthese von modifizier ten und unmodifizierten Oligonukleotiden und die Auswahl von Hybridisierungsbedingun gen, durch welche eine Spezifität erreicht werden kann, die unter anderem vom Ausmaß der Homologie zwischen den zu hybridisierenden Nukleinsäuren, deren GC-Gehalt und deren Länge abhängt.The probe can be bound using known conditions. Because at the method according to the invention is a special embodiment of the So-called hybridization tests, the basic features of which are known to the person skilled in the art of nucleic acid diagnostics are known. So far not experimental details in the following are carried out in full on "Nucleic acid hybridization", publisher B.D. Hames and S.J. Higgins, IRL Press, 1986, e.g. B. in Chapter 1 (Hybridization Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridization) and 4 (Quantitative Filter Hybridization), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, and Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, reference ge taken. The known methods also include the chemical synthesis of modified and unmodified oligonucleotides and the selection of hybridization conditions through which a specificity can be achieved, which depends, among other things, on the extent of the Homology between the nucleic acids to be hybridized, their GC content and their Length depends.

Die Sonde wird im erfindungsgemäßen Verfahren entweder vor oder während der Amplifikationsreaktion zugegeben, bevorzugt in Form einer Lösung, gewünschtenfalls zusammen mit den Primern. Dabei werden Reagenzbedingungen eingestellt, die eine Hybridisierung der Sonde mit einem Amplifikat erlauben.The probe is in the method according to the invention either before or during the Amplification reaction added, preferably in the form of a solution, if desired together with the primers. Reagent conditions are set, one Allow hybridization of the probe with an amplificate.

Die Bindung zwischen der vermehrten Nukleinsäuresequenz des Amplikons und/oder dessen Komplement und der Sonde erfolgt während der Amplifikation, so daß das Enzym bei der Verlängerung eines Primers die Sonde von ihrem 5'-Ende her abbauen kann. hierdurch wird die Reportergruppe freigesetzt, bevorzugt in Form von Mononukleosidbausteinen. Dadurch wird der Quenchprozess unterbunden und die Reportergruppe kann Licht emittieren, welches als Signal gemessen wird und als Zeichen für die Anwesenheit der Nukleinsäure verwendet wird.The binding between the amplified nucleic acid sequence of the amplicon and / or its complement and the probe takes place during the amplification, so that the enzyme when extending a primer, the probe can be dismantled from its 5 'end. this releases the reporter group, preferably in the form of Mononucleoside building blocks. This prevents the quench process and the Reporter group can emit light, which is measured as a signal and as a sign is used for the presence of the nucleic acid.

Bei Verwendung mehrerer Sonden oder multifunktionaler Sonden oder Sonden, die mehrere Bindesequenzen für Amplifikate verschiedener nachzuweisenden Nukleinsäuren oder deren Komplemente aufweisen, können mehrere unterschiedliche Amplifikate oder deren Komplemente gebunden werden. Dabei erlaubt die Bildung von Tripartite-Mini-Amplikons bevorzugt ähnlicher Länge, besonders bevorzugt solcher Tripartite-Mini-Amplikons gleicher Länge, bei der Nukleinsäurevermehrung die Einstellung vereinheitlichter Inkubationsbe dingungen für die Bildung der unterschiedlichen Bindekomplexe. Dies erlaubt den parallelen und/oder sequentiellen Nachweis mehrerer Nukleinsäuresequenzen im Rahmen von Multiplex-Verfahren. Unter einem Multiplex-Amplifikationsverfahren wird meist ein Verfahren verstanden, bei dem entweder unterschiedliche Sequenzen auf einer Nukleinsäure (z. B. unterschiedliche Regionen eines Gens) oder aber unterschiedliche Sequenzen auf unterschiedlichen Nukleinsäuren, z. B. aus unterschiedlichen Organismen, z. B. unterschied lichen Viren, gleichzeitig in einer Amplifikationsmischung vermehrt werden. Solche Ver fahren stellen hohe Anforderungen an die Reaktionsbedingungen, da für eine zuverlässige Auswertung die Amplifikationen für die unterschiedlichen Sequenzen eine ähnliche Amplifi kations-Effizienz haben müssen. Einen der Einflußfaktoren für unterschiedliche Effizienz auszuräumen, ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dazu unterscheiden sich die Ampliconlängen bevorzugt um nicht mehr als 20%, besonders bevorzugt um nicht mehr als 5 Nukleotide.When using multiple probes or multifunctional probes or probes that have multiple Binding sequences for amplificates of different nucleic acids to be detected or their Complements can have several different amplificates or their Complements are bound. The formation of tripartite mini amplicons is possible preferably of similar length, particularly preferably of such tripartite mini amplicons of the same Length, the setting of unified incubation areas for nucleic acid amplification conditions for the formation of the different binding complexes. This allows the parallel and / or sequential detection of several nucleic acid sequences in the context of Multiplex process. A multiplex amplification method is usually a Process understood in which either different sequences on a nucleic acid (e.g. different regions of a gene) or different sequences different nucleic acids, e.g. B. from different organisms, e.g. B. difference Lichen viruses, can be propagated simultaneously in an amplification mixture. Such ver driving place high demands on the reaction conditions, because for a reliable Evaluation of the amplifications for the different sequences a similar amplifi cation efficiency. One of the factors influencing different efficiency clearing out is the subject of the present invention. The differ Amplicon lengths preferably by no more than 20%, particularly preferably by no more than 5 nucleotides.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Multiplexverfahrens werden Amplicons der verschiedenen Sequenzen hergestellt und anschließend die Summe der ge bildeten Amplicons bestimmt. Dabei wird bevorzugt ein Nachweisverfahren eingesetzt, bei dem eine Markierung für alle Nachweise verwendet werden kann; so können beispielsweise alle Sonden für die einzelnen Amplifikate gleich markiert sein, z. B. mit dem gleichen Ruthenium-Komplex. Dieses Vorgehen ist insbesondere für Tests in Proben aus Blutbanken vorteilhaft, da es bei der weiteren Verwendbarkeit der Proben für Blutspenden nicht auf die Art einer Infektion ankommt, sondern die Probe schon dann nicht mehr als Blutspende material in Frage kommt, wenn irgendeine getestete Infektion (z. B. HIV oder HBV) vor liegt. In a special embodiment of the multiplex method according to the invention Amplicons of the different sequences and then the sum of the ge formed amplicons determined. A detection method is preferably used for which a marker can be used for all evidence; for example all probes for the individual amplicons must be marked identically, e.g. B. with the same Ruthenium complex. This procedure is particularly useful for tests in blood bank samples advantageous because it does not affect the further usability of the samples for blood donation Type of infection arrives, but then the sample is no longer a blood donation material comes into question if any infection tested (e.g. HIV or HBV) occurs lies.

Bei den Multiplex-Amplifikationsverfahren unterscheidet man zwischen echten und unechten Multiplex-Verfahren. Bei unechten Verfahren werden die Primer aus stark kon servierten Regionen der Analytnukleinsäuren ausgewählt, derart, daß mit dem einen Set von (2) Primern alle nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen amplifiziert werden. Bei echten Multiplex-Verfahren wird ein Gemisch von mehr als 2 Primern eingesetzt, von denen mindestens 2 eine unterschiedliche Selektivität haben. Einer oder mehrere der Primer können für alle oder ein Unterset von nachzuweisenden Nukleinsäuren spezifisch sein. Dieses Verfahren ist insbesondere dann vorzuziehen, wenn wenig verwandte Sequenzen nebeneinander amplifiziert werden sollen.A distinction is made between real and spurious multiplexing. In spurious procedures, the primers are made of strongly con served regions of the analyte nucleic acids selected such that with the one set of (2) primers all nucleic acid sequences to be detected are amplified. With real ones Multiplexing uses a mixture of more than 2 primers, of which at least 2 have a different selectivity. One or more of the primers can be specific for all or a subset of nucleic acids to be detected. This method is particularly preferable when there are little related sequences should be amplified side by side.

Mit Multiplex-Verfahren können verschiedenste Kombinationen von nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen nebeneinander amplifiziert werden, z. B. verschiedene Subtypen eines Virus oder Bakterien verschiedener Genera oder Spezies.Multiplex methods can be used to create a wide variety of combinations Nucleic acid sequences are amplified side by side, e.g. B. different subtypes a virus or bacteria of different genera or species.

Der Nachweis der freigesetzten Reportergruppe kann in für den Fachmann bekannten Verfahren, insbesondere in verschiedenen Ausführungsformen erfolgen, bevorzugt basierend auf Fluoreszenzmessungen.The detection of the reporter group released can be found in those known to the person skilled in the art Methods, in particular in different embodiments, are preferably based on fluorescence measurements.

Im Fall der gequenchten Fluoreszenzmarkierungen erfolgt eine Fluoreszenzaktivierung durch Dequenching nach Bindung der Detektions-Sonde an das entstehende Tripartite- Mini-Amplikon und 5'-nukleolytischer Abbau und Freisetzung des Fluoreszenzfarbstoff modifizierten Nukleotids. Die Messung der resultierenden Fluoreszenzsignale erfolgt jeweils bevorzugt durch Real time-Messungen. In einer besonderen Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektorsonden Fluorescein und Rhodamin oder Derivate davon als Fluoreszenz- und Quencher-Komponenten verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden bei den gequenchten Detektorsonden Ruthenium- oder Rhenium-Chelate und Quinone oder Derivate davon als Elektrochemilumineszenz- und Quencher-Komponenten verwendet.In the case of the quenched fluorescent labels, fluorescence activation takes place by dequenching after binding the detection probe to the resulting tripartite Mini-amplicon and 5'-nucleolytic degradation and release of the fluorescent dye modified nucleotide. The resulting fluorescence signals are measured in each case preferably by real time measurements. In a special embodiment the quenched detector probes fluorescein and rhodamine or derivatives thereof as Fluorescence and Quencher components used. In another embodiment are used in the quenched detector probes ruthenium or rhenium chelates and Quinones or derivatives thereof as electrochemiluminescent and quencher components used.

Besonders bevorzugt im Sinne dieses ersten Aspekts der Erfindung sind solche Aus führungsformen, bei denen mindestens eine der Bindesequenzen der Primer und der Sonde nicht für die nachzuweisende Nukleinsäure spezifisch ist. Spezifisch im Sinne der Erfindung ist eine Sequenz dann, wenn sie aufgrund einer fortlaufenden Sequenz von Nukleobasen prinzipiell in der Lage wäre, unter stringenten Bedingungen nur mit einer Sequenz auf der nachzuweisenden Nukleinsäure, nicht jedoch mit Nukleinsäuren anderer, nicht nachzu weisender Organismen oder Spezies oder Gruppen von Organismen zu binden. Bevorzugt ist eine Sequenz dann nicht für eine Sequenz spezifisch, wenn sie unter den Bedingungen, welche für die Durchführung des Nachweises eingestellt werden, mit anderen Nukleinsäuren hybridisiert.Such Aus are particularly preferred in the sense of this first aspect of the invention embodiments in which at least one of the binding sequences of the primer and the probe is not specific for the nucleic acid to be detected. Specific in the sense of the invention is a sequence if it is due to a continuous sequence of nucleobases would be able in principle under stringent conditions with only one sequence on the nucleic acid to be detected, but not with nucleic acids of others, not to be detected binding organisms or species or groups of organisms. Prefers a sequence is not specific to a sequence if it is under the conditions which are set to carry out the detection with other nucleic acids hybridizes.

Homologien zu anderen Genomen (Sequenzen) lassen sich mit Hilfe einer definierten Aus gangssequenz identifizieren. Verwendet wird eine z. B. über das Internet für jeden zugäng liche Suchmaschine mit Namen "BLAST" (Basis Local Alignment Search Tool) (Homepage-Addresse: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/<).Homologies to other genomes (sequences) can be determined with the help of a defined Aus identify gear sequence. A z is used. B. accessible to everyone via the Internet search engine called "BLAST" (Basis Local Alignment Search Tool) (Homepage address: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ <).

Diese ermöglicht den Zugriff auf diverse andere Sequenz- und Proteindatenbanken, von denen als am wesentlichsten zu benennen sind:
GenBank, EMBL, DDJB, PDB, PIR und Swiss-Prot.This enables access to various other sequence and protein databases, the most important of which are:
GenBank, EMBL, DDJB, PDB, PIR and Swiss-Prot.

Es werden auch BLASTN-Verfahren gemäß Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403- 410 im Rahmen von UWGCG Suchverfahren verwendet.BLASTN methods according to Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403- 410 used in the context of UWGCG search procedures.

Die Suchverfahren werden auch auf Sequenzdatenbanken wie z. B. die EMBL- Sequenzdatenbanken, bevorzugt auch virale Sequenzdatenbanken wie z. B. em-vrl angewandt.The search methods are also based on sequence databases such. B. the EMBL Sequence databases, preferably also viral sequence databases such as B. em-vrl applied.

Das Blast-Programm bietet dem Anwender zahlreiche Anpassungsmöglichkeiten, um eine individuelle Suche ausführen zu können, d. h. solche Sequenzen zu identifizieren, die für einen oder mehrere Analyten spezifisch sind, oder die eben nicht spezifisch sind, d. h. auch in anderen Organismen vorkommen oder nicht. Hierzu wird auch verwiesen auf Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, David J. Lipman (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 403-410. Erstaunlicherweise ergibt sich nämlich die Selektivität des Nachweisverfahrens nicht allein aus der Selektivität der einzelnen Primer für ein spezifisches Target, sondern aus der kumulierten Selektivität des Gesamtsystems. So können sogar zwei Primer oder zwei Primer und eine Sonde, einzeln völlig unselektiv sein, d. h. einzeln mit einer Vielzahl von Targets hybridisieren; dadurch, daß sich die Selektivitä ten der einzelnen Primer und Sonde (nur) in der nachzuweisenden Nukleinsaure überlagern, ist eine Gesamtspezifität gegeben. Dadurch, daß man auf die Selektivität der Primer aber bei der Auswahl der zu amplifizierenden und nachzuweisenden Nukleinsäure nicht so sehr fest gelegt ist, ist es viel besser möglich, für unterschiedliche Targets kurze Amplicons zu lokalisieren, die in ihrer Länge vollständig oder weitgehend (d. h. über 95%) überein stimmen. Dies macht Simultan-Amplifikationen und -Hybridisierungen (wie im Falle von Nukleinsäuresondenarrays) besser realisierbar und reproduzierbar.The Blast program offers the user numerous customization options to a to be able to carry out an individual search, d. H. identify those sequences that are relevant for one or more analytes are specific or are not specific, d. H. also occur in other organisms or not. Please also refer to Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, David J. Lipman (1990). basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 403-410. Surprisingly, it follows the selectivity of the detection method not only from the selectivity of the individual primers for a specific target, but from the cumulative selectivity of the overall system. So even two primers or two primers and a probe, individually, can be completely unselective, d. H. hybridize individually with a variety of targets; in that the selectivity overlay the individual primers and probes (only) in the nucleic acid to be detected, there is an overall specificity. By focusing on the selectivity of the primers the choice of the nucleic acid to be amplified and detected is not so strong it is much better possible to add short amplicons for different targets localize that are fully or largely (i.e., over 95%) long in length voices. This makes simultaneous amplifications and hybridizations (as in the case of Nucleic acid probe arrays) can be better realized and reproduced.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens. Dieses enthält die Primer und bevorzugt auch eine Nachweissonde. Es kann jedoch auch weitere Reagenzien, wie Puffer und Enzyme, z. B. eine Polymerase, enthalten.The invention also relates to a reagent kit for carrying out this method. This contains the primers and preferably also a detection probe. However, it can also other reagents, such as buffers and enzymes, e.g. B. contain a polymerase.

Bevorzugt binden die Primer an die Bindesequenzen A bzw. C', wie oben beschrieben, und die Sonde an einen zwischen den Enden der Bindesequenzen A und C' gelegenen Bereich B oder das Komplement davon.The primers preferably bind to the binding sequences A or C ', as described above, and the probe to an area B located between the ends of the binding sequences A and C ' or the complement of it.

Auch bei der Verwendung von mindestens einer Sequenz aus den 3 Sequenzbereichen der beiden Primer und der Sonde, die nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure ist, bleibt die Gesamtspezifität des Nachweisverfahrens erhalten. Ist eine der Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, sondern bindet auch an andere Nukleinsäuren, kann kein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsäure gebildet werden, da die zweite Primerbindungssequenz fehlt. Unspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte auf der anderen Nukleinsäure werden nicht detektiert, da die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist auch die zweite Primersequenz nicht spezifisch für die nachzuweisende Nukleinsäure, kann nur dann ein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt auf der anderen Nukleinsäure gebildet werden, wenn beide Primerbindungssequenzen in der gleichen Nukleinsäure-Vermehrungseinheit sind. Dieses Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt wird ebenfalls nicht detektiert, da die spezifische Bindungssequenz für die Sonde fehlt. Ist die Sondensequenz nicht spezifisch für die nach zuweisende Nukleinsäure, jedoch die beiden Primer spezifisch, werden keine Nukleinsäure- Vermehrungsprodukte der anderen Nukleinsäure gebildet. Ist zusätzlich zur Sondensequenz auch eine der beiden Primersequenzen nicht spezifisch für die nachzuweisende Nuklein säure, kann wiederum kein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet werden. Unspezifische Nukleinsäure-Vermehrungsprodukte der ande ren Nukleinsäure, die möglicherweise gebildet werden, enthalten andere Sequenzen im Sondenbindungsbereich und werden daher nicht detektiert. Sind alle drei Bindungssequen zen für die beiden Primer und die Sonde nicht spezifisch für die nachzuweisende Nuklein säure, wird kein Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt gebildet, wenn mindestens eine der beiden Primersequenzen nicht in einer Nukleinsäure-Vermehrungseinheit der anderen Nukleinsäure liegt. Liegt die Sondensequenz nicht in der Nukleinsäure-Vermehrungseinheit der beiden Primersequenzen für die andere Nukleinsäure, kann zwar ein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet, aber nicht detektiert werden. Der einzige Fall, daß ein spezifisches Nukleinsäure-Vermehrungsprodukt der anderen Nukleinsäure gebildet und detektiert werden kann, ist, wenn alle drei Sequenzen innerhalb eines Nukleinsäure-Vermehrungsbereichs liegen. Dies kann jedoch durch ent sprechende Sequenzauswahl der Nukleinsäure-Vermehrungseinheit vermieden werden, z. B. indem die Primerhybridisierungsstellen nicht gleichzeitig aus demselben Locus desselben nicht nachzuweisenden Organismus gewählt werden.Even when using at least one sequence from the 3 sequence areas of the two primers and the probe, which is not specific for the nucleic acid to be detected, the overall specificity of the verification procedure is retained. Is one of the primer sequences not specific for the nucleic acid to be detected, but also binds to others Nucleic acids, no specific nucleic acid amplification product on the other Nucleic acid are formed because the second primer binding sequence is missing. Nonspecific Nucleic acid amplification products on the other nucleic acid are not detected, because the specific binding sequence for the probe is missing. Is also the second primer sequence not specific for the nucleic acid to be detected, can only be a specific one Nucleic acid amplification product can be formed on the other nucleic acid if both primer binding sequences are in the same nucleic acid amplification unit. This nucleic acid amplification product is also not detected because of the specific Binding sequence for the probe is missing. The probe sequence is not specific for the post assigning nucleic acid, but the two primers specific, are not nucleic acid Multiplication products of the other nucleic acid are formed. Is in addition to the probe sequence also one of the two primer sequences is not specific for the nucleotide to be detected acid, again cannot be a specific nucleic acid amplification product of the other Nucleic acid are formed. Nonspecific nucleic acid amplification products of the other Ren nucleic acid that may be formed contain other sequences in the Probe binding area and are therefore not detected. Are all three binding sequences zen for the two primers and the probe not specific for the nucleotide to be detected acid, no nucleic acid amplification product is formed if at least one of the two primer sequences are not in one nucleic acid amplification unit of the other Nucleic acid. If the probe sequence is not in the nucleic acid amplification unit of the two primer sequences for the other nucleic acid can be a specific one Nucleic acid amplification product of the other nucleic acid formed, but not detected become. The only case that a specific nucleic acid amplification product of other nucleic acid can be formed and detected if all three sequences are within a nucleic acid amplification range. However, this can be done through ent speaking sequence selection of the nucleic acid amplification unit can be avoided, for. B. in that the primer hybridization sites are not from the same locus at the same time organism that cannot be detected.

In einer weiteren Ausführungsform findet die Herstellung der Amplifikate unter Einsatz von Nukleotiden, besonders bevorzugt Mononukleotiden, welche jeweils zu A, B, C und/oder T komplementär sind, statt. Bevorzugt enthält der Bereich B bzw. B' der nachzuweisenden Nukleinsäure alle 4 natürlichen Nukleobasen.In a further embodiment, the amplicons are produced using Nucleotides, particularly preferably mononucleotides, which each form A, B, C and / or T. are complementary instead. Region B or B 'preferably contains those to be detected Nucleic acid all 4 natural nucleobases.

Ein technischer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß bei Mehr fachbestimmungen einer Probe ein hoher Grad an Übereinstimmung der Meßwerte erreicht wird.A technical advantage of the method according to the invention is that at more technical determinations of a sample achieved a high degree of agreement of the measured values becomes.

Im folgenden sollen die beiden Aspekte der vorliegenden Erfindung anhand eines Nach weises für HCV beschrieben werden. Die Nukleinsäuresequenz von HCV ist beispielsweise in EP-B-0 318 216 beschrieben. In Fig. 4 ist ein Ausschnitt aus einem HCV-Genom gezeigt, welches Grundlage des beispielhaft gezeigten Verfahrens ist. Die Sequenz aus HGBV-B, die der HCV-Sequenz entspricht und aus der die Sequenzen für die Primer und Probes entnommen sind, sind ebenfalls in Fig. 4 gezeigt.In the following, the two aspects of the present invention will be described using evidence for HCV. The nucleic acid sequence of HCV is described for example in EP-B-0 318 216. In Fig. 4 a detail of an HCV genome is shown, which is based on the method exemplified in FIG. The sequence from HGBV-B, which corresponds to the HCV sequence and from which the sequences for the primers and probes are taken, are also shown in FIG. 4.

Der Nachweis von HCV-RNA ist überraschenderweise trotz der kurzen vermehrten Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure auch spezifisch und reproduzierbar in positiven HCV-Plasmaproben möglich, in denen die HCV-RNA nicht sequenzspezifisch vorgereinigt wurde, sondern direkt aus lysierten und über Glasoberflächen aufkonzentrierten Plasma proben eingesetzt wurde. HCV-negative Plasmaproben ergeben kein Signal. Dies ist inso fern überraschend, da das HCV-RNA-Genom sehr labil ist gegenüber Fragmentierung in Plasma-Lysaten. Mit z. B. HIV-Plasmaproben, HBV-Serumproben, Chlamydiaproben aus Urin oder Human-DNA-Proben aus Vollblut, die-ebenfalls über Glasoberflächen auf konzentriert wurden, wird mit den eingesetzten Primern und Sonden ebenfalls kein Signal erhalten.The detection of HCV-RNA is surprisingly prolific despite the short one Sequence of the nucleic acid to be detected also specifically and reproducibly in positive HCV plasma samples are possible in which the HCV RNA is not pre-purified in a sequence-specific manner but directly from lysed and concentrated plasma over glass surfaces samples was used. HCV-negative plasma samples give no signal. This is inso far surprising, since the HCV RNA genome is very labile to fragmentation in Plasma lysates. With z. B. HIV plasma samples, HBV serum samples, Chlamydia samples from Urine or human DNA samples from whole blood, which are also placed on glass surfaces were also concentrated, no signal is generated with the primers and probes used receive.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um einen oder mehrere der für den Stand der Technik geschilderten Nachteile zu vermeiden oder um einen oder mehrere der folgenden Vorteile zu realisieren. Die PCR-Zyklen können sehr viel kürzer sein. Die Gesamtzeit der Nachweisverfahren kann dadurch verkürzt werden. Die Sensitivität des Nachweises kann erhöht werden, da weniger Kompetition/Verdrängung zwischen dem kurzen Gegenstrang des Amplikons und der Detektorsonde stattfinden kann. Die Spezifität des Nachweises wird erhöht, da der relative Anteil der internen Detektorregion gegenüber der gesamten Amplikonlänge erhöht wird. Die Differenzierbarkeit von Subtypen kann er höht werden. Der Nachweishintergrund kann gesenkt werden, da kurze Amplika weniger Potential für unspezifische Hybridisierung mit sich bringen. Aus diesem Grund kann das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht werden. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse kann er höht werden, da kleinere Targetregionen auf RNA-Genomen weniger sensitiv für RNA-Ab bau sind. Die Möglichkeiten zur Ausbildung von Sekundärstrukturen werden reduziert.The inventive method can be used to one or more of the for to avoid the disadvantages outlined above or by one or more to realize the following advantages. The PCR cycles can be much shorter. The This can shorten the total time of the verification procedure. The sensitivity of the Evidence can be increased because there is less competition / displacement between the short counter strand of the amplicon and the detector probe can take place. The specificity of detection is increased because the relative proportion to the internal detector region the entire amplicon length is increased. He can differentiate between subtypes be raised. The detection background can be reduced because short amplicons are less Bring potential for unspecific hybridization. Because of this, it can Signal-to-noise ratio can be increased. He can reproduce the results be increased, since smaller target regions on RNA genomes are less sensitive to RNA Ab are under construction. The possibilities for the formation of secondary structures are reduced.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:The invention is illustrated by the following examples:

General

Alle verwendeten Oligonukleotide sind linear und einzelsträngig.All oligonucleotides used are linear and single-stranded.

example 1 Detection of HCV from human blood a) Sample preparation

Die RNA-Isolierung aus Plasma erfolgte anhand folgenden Probenvorbereitungs protokolls:
RNA was isolated from plasma using the following sample preparation protocol:

1. Mix plasma (420 µl) with 80 µl Proteinase K (25 mg / ml) and for a few seconds vortex.
2. Add 500 µl lysis buffer (incl. 1 µg carrier RNA (polyA) / ml): 5.4 M Guanidinium thiocyanate; 10mM urea- 10mM Tris-HCl; 20% Triton X 100; pH 4.4.
3. Vortex and then shake at RT for 10 min.
4. Add 500 µl isopropanol-MGP (6 mg magnetic glass particles in Isopro panol).
5. Vortex and then shake at RT for 20 min.
6. Magnetic separation of the MGPs.
7. Remove and discard the supernatant.
8. Add 750 µl wash buffer: 20 mM NaCl; 20 mM Tris-HCl pH 7.5; 70% ethanol.
9. Resuspend MGPs on vortex and re-magnetic separation.
10. Repeat the washing process a total of 5 times.
11. Add 100 µl of DEMC water for elution.
12. Shake at 80 ° C for 15 min.
13. Magnetic separation.
14. Insert 10 µl of the eluate into the RT-PCR

b) Cloning and preparation of the RNA standard

Der Wildtypstandard "pHCV-wt" wurde zunächst durch Amplifikation eines Abschnitts des HCV-Genoms mit den Primern KY80 (5'-gcagaaagcgtctagccatggcgt-3', SEQ.ID.NO.1) und KY78 (5'-ctcgcaagcaccctatcaggcagt-3', SEQ.ID.NO.2) gewonnen und das Amplikon anschließend über eine sog. "blunt-end"-Klonierung in den Vektor pBluescript SK+ kloniert. Nach Vermehrung der bakteriellen Zellen wurde das Plasmid isoliert, durch restriktionsenzymatischen Verdau linearisiert und über eine in-vitro-Transkription das entsprechende RNA-Fragment gewonnen und aufgereinigt.The wild-type standard "pHCV-wt" was first amplified by a section of the HCV genome with the primers KY80 (5'-gcagaaagcgtctagccatggcgt-3 ', SEQ.ID.NO.1) and KY78 (5'-ctcgcaagcaccctatcaggcagt-3 ', SEQ.ID.NO.2) and the amplicon then via a so-called "blunt-end" cloning into the vector pBluescript SK + cloned. After the bacterial cells had grown, the plasmid was isolated by restriction enzymatic digestion linearized and via an in vitro transcription corresponding RNA fragment obtained and purified.

Die Quantifizierung der RNA erfolgte über photometrische Messung der Absorption bei 260 nm.The RNA was quantified by photometric measurement of the absorption 260 nm.

Alle hier beschriebenen molekularbiologischen Verfahren können einschlägigen Methodik- Büchern entnommen werden (e.g. Maniatis et al.; Ausubel et al.).All of the molecular biological processes described here can be Books (e.g. Maniatis et al .; Ausubel et al.).

c) RT-PCR assay

Die Amplifikation erfolgte analog zu dem in EP-A-0 699 768 beschriebenen Verfahren. Weitere Details zur Konstruktion von Sonden für fluorogen markierte Sonden für das TaqMan™-Verfahren sind in der Produktbeschreibung für die Geräte TaqMan™ LS-50B und ABI Prism 7700 von Perkin Elmer beschrieben. Die Versuche wurden vorgenommen mit folgenden Primer- und Sondensequenzen:
forward Primer: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 390 und 417, reverse Primer: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 421 und 448, Sonde: ausgewählt aus der Sequenz zwischen den Positionen 408 und 440, alle bezogen auf die HGBV-B Sequenz aus der Sequenz HG22304 erhältlich aus der EMBL-Datenbank em vrl, oder aus Proc. Natl. Acad. Sci USA 1995, 92, 3401-3405 und/oder aus J. Virlo. 69: 5621-5630. Die in Fig. 4 gezeigte Sequenz entspricht den Positionen 390 bis 448 dieser Sequenz, so daß die Primer- und Sondenpositionen direkt umrechenbar sind.The amplification was carried out analogously to the method described in EP-A-0 699 768. Further details on the construction of probes for fluorogenously labeled probes for the TaqMan ™ method are described in the product description for the TaqMan ™ LS-50B and ABI Prism 7700 from Perkin Elmer. The tests were carried out with the following primer and probe sequences:
forward primer: selected from the sequence between positions 390 and 417, reverse primer: selected from the sequence between positions 421 and 448, probe: selected from the sequence between positions 408 and 440, all based on the HGBV-B sequence the sequence HG22304 available from the EMBL database em vrl, or from Proc. Natl. Acad. Sci USA 1995, 92, 3401-3405 and / or from J. Virlo. 69: 5621-5630. The sequence shown in FIG. 4 corresponds to positions 390 to 448 of this sequence, so that the primer and probe positions can be converted directly.

Bevorzugte Primer-/Sonden-Kombinationen ergeben sich folgendermaßen:
forward-Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, und 392-408,
reverse Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 427-448, 427-447, 427-446, 428-448, 428-447, 428-446, 429-448 und 429-447,
Sonde ausgewählt aus einer der Sequenzen: 408-436, 408-435, 408-434, 408-433, 408- 432, 408-431, 408-430, 408-429, 408-428, 409-436, 409-435, 409-434, 409-433, 409-432, 409-431, 409-430, 409-429, 409-428, 410-436, 410-435, 410-434, 410-433, 410-432, 410- 431, 410-430, 410-429, und 410-428, oder, bevorzugt:
forward-Primer: Sequenz von 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, und 392- 408,
reverse Primer: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 423-448, 423-447, 423-446, 423-445, 423-444,
Sonde: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432, 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409-429, 409-428, 408-433, 408- 432, 408-431, 408-430, 408-429, und 408-428 oder, besonders bevorzugt:
forward Primer: Sequenz von 390-406, 391-406, und 392-406,
reverse Primer ausgewählt aus einer der Sequenzen: 423-448, 423-447, 423-446, 423-445, 423-444,
Sonde: ausgewählt aus einer der Sequenzen: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432, 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409-429, 409-428, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, und 408-428.Preferred primer / probe combinations result as follows:
forward primer selected from one of the sequences: 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, and 392-408,
reverse primer selected from one of the sequences: 427-448, 427-447, 427-446, 428-448, 428-447, 428-446, 429-448 and 429-447,
Probe selected from one of the sequences: 408-436, 408-435, 408-434, 408-433, 408- 432, 408-431, 408-430, 408-429, 408-428, 409-436, 409-435 , 409-434, 409-433, 409-432, 409-431, 409-430, 409-429, 409-428, 410-436, 410-435, 410-434, 410-433, 410-432, 410 - 431, 410-430, 410-429, and 410-428, or, preferably:
forward primer: sequence of 390-406, 390-408, 391-406, 391-408, 392-406, and 392-408,
reverse primer: selected from one of the sequences: 423-448, 423-447, 423-446, 423-445, 423-444,
Probe: selected from one of the sequences: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432, 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409- 429, 409-428, 408-433, 408- 432, 408-431, 408-430, 408-429, and 408-428 or, particularly preferably:
forward primer: sequence of 390-406, 391-406, and 392-406,
reverse primer selected from one of the sequences: 423-448, 423-447, 423-446, 423-445, 423-444,
Probe: selected from one of the sequences: 409-433, 409-432, 409-431, 410-433, 410- 432, 410-431, 410-430, 410-429, 410-428, 409-430, 409- 429, 409-428, 408-433, 408-432, 408-431, 408-430, 408-429, and 408-428.

Claims

1. A method for the detection of a nucleic acid comprising the steps

- Production of a large number of amplificates of a section of this nucleic acid with the aid of two primers, one of which can bind to a first binding sequence (A) of a strand of the nucleic acid and of which the other to a second binding sequence (C ') which leads to one with A non-overlapping sequence C located in the 3 'direction of A is essentially complementary, in the presence of a probe with a binding sequence D which is linked to the third sequence (B) or the complement (B ') of which, this probe contains a reporter group and a quencher group, using a polymerase with 5'-nuclease activity and
Detection of the nucleic acid by measuring a signal which is caused by the release of the reporter group,
characterized in that the amplificates formed with the aid of the primers have a length of less than 100 nucleotides.

2. The method according to claim 1, characterized in that the binding sequence D of Probe does not overlap with one of the primer binding sequences.

3. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that at least one of the binding sequences is not for the nucleic acid to be detected is specific.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the total length of the binding sequences from that of the binding sequence of the probe groundbreaking part of the binding sequence of the one primer up to that of the Binding sequence of the sample-pointing part of the other primer is less than 60 nucleotides.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the probe through both a fluorescence quencher and a fluorescent color fabric is marked.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that at least one of the primers is not specific for the nucleic acid to be detected.

7. The method according to claim 6, characterized in that two of the primers are not for the nucleic acid to be detected are specific.

8. The method according to any one of claims 6 and 7, characterized in that the Probe is not specific for the nucleic acid to be detected.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that nucleotides complementary to A, B, C and T were used in the amplification become.