DE19813633C1

DE19813633C1 - Determining the probability of the occurrence of bone metastasis

Info

Publication number: DE19813633C1
Application number: DE1998113633
Authority: DE
Inventors: Markus Seibel; Ingo J Diel
Original assignee: Individual
Current assignee: Bio Rad Laboratories GmbH
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 1999-10-28
Anticipated expiration: 2018-03-28

Abstract

A method to determine the probability of a future occurrence of bone metastases in patents with primary carcinomas and, if appropriate, the necessity for prophylactic treatment, characterized by the perioperative determination of the amount of bone sialoprotein (BSP) and/or osteopontin (OPN) or their fragments or isoforms from one or more body fluids. Independent claims are also included for the following: (1) a method to improve the differentiation of multiple myeloma from healthy and osteoporotic patients, characterized by the determination of the amount of BSP and/or OPN or their fragments or isoforms from one or more body fluids; (2) a method to determine the response of patients with multiple myeloma to specific therapy or treatments, characterized by the determination of the amount of BSP and/or OPN or their fragments or isoforms from one or more body fluids; and (3) a method to predict the outcome of the disease and the survival of the patient with multiple myeloma, characterized by the determination of the amount of BSP and/or OPN or their fragments or isoforms from one or more body fluids.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des zukünftigen Auftretens von Knochenmetastasen bei Patienten mit primärem Mammakarzinom und gegebenenfalls der Notwendigkeit einer vorbeugenden Behand lung.The present invention relates to a method for Determination of the probability of future occurrence of bone metastases in patients with primary breast cancer and, if necessary, the need for preventive treatment lung.

Das Mammakarzinom gehört zu den häufigsten malignen Tumoren überhaupt. Nach neuesten Analysen der WHO ist damit zu rechnen, daß etwas mehr als 10% aller Frauen in der westlichen Welt im Verlauf ihres Lebens an einem Mammakarzinom erkranken. In der Altersgruppe zwischen 33 und 50 Jahren ist das Mammakarzinom die häufigste Todesursache bei Frauen. Der Tod wird in aller Regel durch die Metastasierung selbst verursacht. Es ist das Kennzeichen von Mammakarzinomen, daß sie aufgrund ihrer biologi schen Heterogenität und ihrer Neigung zu früher hämatogener Metastasierung prognostisch außerordentlich schwer einzuschätzen sind. Man muß davon ausgehen, daß die Todesrate unter den erkrankten Patientinnen zwischen 25 und 30% liegt. Diese Zahl konnte auch nicht durch den flächendeckenden Einsatz adjuvant systemischer Therapieverfahren gebessert werden. Das heißt, obwohl 95 bis 98% aller Patientinnen mit primärem Mammakarzinom adjuvant therapiert werden, wird die Überlebensrate um höchstens 10% gebessert.Breast cancer is one of the most common malignant tumors at all. According to the latest analyzes by the WHO, that just over 10% of all women in the western world in the Develop breast cancer over the course of her life. In the Age group between 33 and 50 years is breast cancer the leading cause of death in women. Death is in everyone Usually caused by the metastasis itself. It is that Characteristics of breast cancer that they biologi heterogeneity and their tendency to hematogenous earlier Metastasis is extremely difficult to predict are. One has to assume that the death rate among the sick patients is between 25 and 30%. This number could not be adjuvant due to the widespread use systemic therapy procedures can be improved. This means, although 95 to 98% of all patients with primary breast cancer be treated adjuvantly, the survival rate is at most 10% improved.

Mammakarzinome gehören zu den Tumoren, die außerordentlich häufig in den Knochen metastasieren (osteophil, osteotrop). Etwa 75% aller Patientinnen, die am Mammakarzinom versterben, weisen autoptisch Knochenmetastasen auf. Der beste Prognosefaktor für eine spätere Metastasierung (auch in den Knochen) ist derzeit der Status befallener axillärer Lymphknoten und der Nachweis disseminierter Tumorzellen im Knochenmark. Trotz zahlreicher Ansätze zur Erforschung von Prognosefaktoren für eine spätere Metastasierung in den Knochen ist es bisher nicht gelungen, einen geeigneten und zuverlässigen Marker zu etablieren.Breast cancers are among the tumors that are extraordinary often metastasize in the bones (osteophilic, osteotropic). Approximately 75% of all patients who die from breast cancer show autopsy of bone metastases. The best forecast factor for later metastasis (also in the bones) is present the status of affected axillary lymph nodes and the evidence disseminated tumor cells in the bone marrow. Despite numerous Approaches to research forecast factors for a later one Metastasis in the bones has so far not been possible to establish a suitable and reliable marker.

Der normale Gewebeumsatz sowie bestimmte Erkrankungen des Kno chens und der Bindegewebe können durch die Messung makromoleku larer Bestandteile in Körperflüssigkeiten erkannt und in ihrem Verlauf kontrolliert werden. So kommen zum Beispiel für die Beurteilung der Knochenneubildung neben der alkalischen Gesamt phosphatase im Serum (AP) auch Parameter mit höherer Gewebespe zifität wie zum Beispiel die knochenspezifische AP (BAP), Osteocalcin (OC) oder Kollagenpropeptide (PINP, PICP) zum Einsatz. Die Knochenresorptionsrate läßt sich durch die Bestim mung von Calcium und Hydroxyprolin im Urin sowie der Pyridinium- Crosslinks in Urin und Serum erfassen. So gehen eine Reihe von metabolischen Osteopathien wie die Osteomalazie oder der Morbus Paget mit charakteristischen und diagnostisch wegweisenden Veränderungen dieser Makromoleküle einher. In der Regel werden diese Komponenten also derart gebraucht, daß eine Veränderung ihrer Konzentration in den Körperflüssigkeiten beim Menschen bestimmte Veränderungen im Metabolismus von Knochen oder Binde geweben indiziert.The normal tissue turnover as well as certain diseases of the kno chens and connective tissue can be measured by measuring macromolecules Larer components recognized in body fluids and in their Controlled course. So come for example Assessment of new bone formation in addition to the alkaline total serum phosphatase (AP) also parameters with higher tissue spike validity such as the bone-specific AP (BAP), Osteocalcin (OC) or collagen propeptides (PINP, PICP) for Commitment. The bone resorption rate can be determined by the Calcium and hydroxyproline in urine as well as pyridinium Record crosslinks in urine and serum. So go a number of metabolic osteopathies such as osteomalacia or disease Paget with characteristic and diagnostically groundbreaking Changes in these macromolecules go hand in hand. Usually will So these components are used in such a way that a change their concentration in human body fluids certain changes in the metabolism of bone or bandage tissue indexed.

Die Vorhersage oder aber frühzeitige Diagnose ossärer Metastasen ist wegen der therapeutischen Konsequenzen von großer klinischer Bedeutung. So kann die Entstehung von Knochenmetastasen durch die frühzeitige Therapie mit Bisphosphonaten zwar nicht völlig verhindert, in ihrer Häufigkeit, Schwere und Letalität jedoch deutlich gesenkt werden.The prediction or early diagnosis of osseous metastases is of great clinical importance because of the therapeutic consequences Meaning. This can result in the formation of bone metastases early therapy with bisphosphonates is not entirely prevented, however in frequency, severity and lethality be significantly reduced.

Serologische "Tumormarker" wie zum Beispiel CEA und CA 15-3 sind zwar bei der Verlaufsbeurteilung maligner Erkrankungen von großem Nutzen, besitzten jedoch keine Spezifität für den Knochen oder Bindegewebe. Im Gegensatz hierzu konnte gezeigt werden, daß die Serum- und Urinkonzentrationen bestimmter, aus dem Knochen stammender Makromoleküle bei einer bestehenden, d. h. bereits etablierten Metastasierung in den Knochen oder in den Bindegeweben deutlich verändert sind. So finden sich im Rahmen einer osteoplastischen Metastasierung eines Mamma- oder Prosta takarzinoms in Abhängigkeit von der Ausdehnung und Progredienz des Befundes diskret bis deutlich ausgeprägte Veränderungen der alkalischen Gesamtphosphatase (TAP) bzw. der knochenspezifischen AP (BAP) im Serum. Bei normocalcämischen Patienten mit ossärer Metastasierung finden sich häufig erhöhte Serum-Osteocalcin (OC)-Spiegel, die bei der Entwicklung einer metastatischen Hypercalcämie in den unteren Normbereich oder darunter absinken können. Bei Patientinnen mit manifesten Knochenmetastasen ist die Hydroxypyrolin (OHP)-Ausscheidung im Urin in der Regel vermehrt und wird daher als Index für den Behandlungserfolg einer Chemo- oder Hormontherapie herangezogen. Analog ist bei 80 bis 95% aller Tumorpatienten mit Knochenmetastasen eine vermehrte Ausscheidung der Pyridinium-Crosslinks zu sehen. BSP im Serum ist sowohl bei etablierten Knochenmetastasen als auch beim multiplen Myelom, einer weiteren malignen Knochenerkran kung, deutlich erhöht.Serological "tumor markers" such as CEA and CA 15-3 are when assessing the course of malignant diseases of of great benefit, but have no specificity for the bone or connective tissue. In contrast, it could be shown that the serum and urine concentrations of certain, from the Bone-derived macromolecules in an existing, i.e. H. already established metastasis in the bones or in the Connective tissues are significantly changed. So find yourself in the frame an osteoplastic metastasis of a breast or prostate Takarzinoma depending on the extent and progression of the findings discreet to marked changes in the total alkaline phosphatase (TAP) or bone-specific AP (BAP) in serum. In normocalcaemic patients with osseous Metastasis is often found in increased serum osteocalcin (OC) levels involved in the development of a metastatic Hypercalcaemia fall to or below the lower normal range can. In patients with manifest bone metastases the urinary hydroxypyrolin (OHP) excretion as a rule increases and is therefore used as an index for treatment success chemotherapy or hormone therapy. Analog is with 80 to 95% of all tumor patients with bone metastases have one see increased excretion of the pyridinium crosslinks. E.G in serum is both with established bone metastases as well multiple myeloma, another malignant bone crane kung, significantly increased.

Zusammenfassend bewirken also bereits vorhandene Knochenmetasta sen eine Erhöhung der Serum- und Urinkonzentrationen bekannter und neuartiger Knochenumsatzmarker.In summary, bone metastas that already exist result an increase in serum and urine concentrations known and novel bone turnover markers.

Anders verhält es sich bei Patienten, bei denen ein maligner Tumor diagnostiziert wurde und noch keine Fernmetastasen beste hen. Bei diesen Patienten gibt es bisher kein zuverlässiges Verfahren, welches erlaubt, zum Zeitpunkt der Diagnose des Primärtumors eine Aussage über die Wahrscheinlichkeit einer späteren Metastasierung zu treffen. Diese Vorhersage ist jedoch von großer Bedeutung, da sie zum einen die Gesamtprognose des Patienten beeinflußt und zum zweiten die Grundlage einer früh zeitigen und effektiven Therapie mit zytostatischen und knochen resorptionshemmenden Substanzen bilden könnte. It is different with patients who have a malignant Tumor was diagnosed and no distant metastases are best yet hen. So far there is no reliable one in these patients Procedure that allows, at the time of diagnosis of the Primary tumor a statement about the probability of one to meet later metastasis. However, this prediction is of great importance, because on the one hand it is the overall forecast of the Affected patient and secondly the basis of an early timely and effective therapy with cytostatic and bone could form absorption-inhibiting substances.

Die Erfindung hat sich somit die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zu entwickeln zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des zukünf tigen Auftretens von Knochenmetastasen bei Patienten mit primä rem Mammakarzinom und gegebenenfalls der Notwendigkeit einer vorbeugenden Behandlung.The object of the invention is therefore a method to develop to determine the probability of the future occurrence of bone metastases in patients with primary rem breast cancer and possibly the need for one preventive treatment.

Die grundlegenden Arbeiten der Gruppe um Castronovo und Bellah cene aus Liege, Belgien haben zeigen können, daß der immunhisto chemische Nachweis von Bone Sialoprotein im Primärtumor von Patientinnen mit Mammakarzinom retrospektiv mit einer Metasta sierung des Tumors in den Knochen assoziiert ist (vgl. Bellahce ne A., Kroll M., Liebens F., Castronovo V. [1996], "Bone sialo protein expression in primary human breast cancer is associated with bone metastases development", J. Bone Mineral Res. 11: 665- 670, und Bellahcene A., Merville M. P., Castronovo V. [1994], "Expression of bone sialoprotein, a bone matrix protein, in human brest cancer", Cancer Res. 54: 2823-2826).The basic work of the Castronovo and Bellah group cene from Liege, Belgium have shown that the immunohisto chemical detection of bone sialoprotein in the primary tumor of Patients with breast cancer retrospectively with a metasta tumor associated with the bone (see Bellahce ne A., Kroll M., Liebens F., Castronovo V. [1996], "Bone sialo protein expression in primary human breast cancer is associated with bone metastases development ", J. Bone Mineral Res. 11: 665- 670, and Bellahcene A., Merville M.P., Castronovo V. [1994], "Expression of bone sialoprotein, a bone matrix protein, in human brest cancer ", Cancer Res. 54: 2823-2826).

Es wurde jetzt gefunden, daß die Aufgabe zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des zukünftigen Auftretens von Knochenmeta stasen bei Patienten mit primärem Mammakarzinom und gegebenen falls der Notwendigkeit einer vorbeugenden Behandlung dadurch gelöst werden kann, indem der Gehalt an BSP (Bone Sialoprotein) und/oder OPN (Osteopontin) perioperativ im Serum bestimmt wird.It has now been found that the task of determining the Probability of future bone meta stasis in patients with primary breast cancer and given if the need for preventive treatment can be solved by the content of BSP (Bone Sialoprotein) and / or OPN (osteopontin) is determined perioperatively in the serum.

Perioperativ umfaßt vor allem den Zeitpunkt kurz vor bis kurz nach der Operation des Mammakarzinoms, wobei die Aussagen der Bestimmung am besten sind, wenn tatsächlich kurz vor der Opera tion der Gehalt an BSP und/oder OPN im Serum bestimmt wird. Hierbei sind folgende Situationen zu unterscheiden, die sämtlich einen Vorhersagewert für das spätere Auftreten von Knochenmeta stasen besitzen:
Perioperatively mainly includes the point in time shortly before to shortly after the operation of the breast cancer, the statements of the determination being best if the serum BSP and / or OPN content is actually determined shortly before the operation. A distinction must be made between the following situations, all of which have a predictive value for the later occurrence of bone metastases:

a) The pre- or immediately postoperative determination of the BSP and / or OPN in serum in patients diagnosed with Breast cancer allows the probability to be predicted the appearance of bone metastases to a later one Time. If these values are available, the postoperative Especially monitoring of the serum level of BSP and / or OPN valuable because of a sharp drop in serum levels and maintaining serum levels at a low level allow good forecast.
b) On the other hand, the serum level remains above the low norma len basic level, this suggests that either not that all primary breast cancer has been removed and / or already Bone metastases are present.
c) Does the serum level of BSP and / or OPN increase after one initial drop, this is an indication of nevertheless metastases and / or a relapse at the site of primary breast cancer. Then there should be further diagnos steps are taken and, if necessary, already very early with preventive treatment of the knots Chen metastases are started before these manifest or otherwise become diagnostically recognizable.

Die Bestimmung von BSP und/oder OPN erfolgt vorzugsweise immuno logisch mit Hilfe von polyklonalen oder monoklonalen Antikör pern. Die polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können in an sich bekannter Weise zu Radio-Immuno-Assays (RIA) oder Enzym- Linked-Immunoassays (ELISA) oder Immuno-Lumineszenz-Assays eingesetzt werden. Die bisherigen Meßergebnisse wurden mit Hilfe eines von der Arbeitsgruppe des Erfinders entwickelten Radio immunoassays erzielt (Seibel M. J., Woitge H. W., Pecherstorfer M., Karmatschek M., Horn E., Ludwig M., Armbruster F. P., Ziegler R. [1996], "Serum immunoreactive bone sialoprotein as a new marker of bone turnover in metabolic and malignant bone disea se", J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 3289-3294 und Karmatschek M, Woitge H. W., Armbruster F. P., Ziegler R., Seibel M. J. [1997], "Improved purification of human bone sialoprotein and develop ment of a homologous radioimmunoassay", Clin. Chem. 43/11: 2076- 2082). Die klinischen Befunde zeigen, daß Patienten mit erhöhtem Knochenumsatz auch erhöhte Werte für Serum-BSP zeigen. Das gleiche gilt für Patientinnen mit etablierter Knochenmetastasie rung bei Mammakarzinom (Seibel et al. [1996], loc. cit.). Neu und diagnostisch wertvoll ist der Befund, daß bei perioperativer Bestimmung von BSP und/oder OPN wertvolle Aussagen gemacht werden können über die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des zukünftigen Auftretens von Knochenmetastasen bei Patienten mit primärem Mammakarzinom und gegebenenfalls der Notwendigkeit einer vorbeugenden Behandlung.The determination of BSP and / or OPN is preferably carried out immuno logically with the help of polyclonal or monoclonal antibodies pern. The polyclonal or monoclonal antibodies can be in in a manner known per se for radio immunoassays (RIA) or enzyme Linked immunoassays (ELISA) or immuno-luminescence assays be used. The previous measurement results were made with the help a radio developed by the inventor's group immunoassays achieved (Seibel M. J., Woitge H. W., Pecherstorfer M., Karmatschek M., Horn E., Ludwig M., Armbruster F. P., Ziegler R. [1996], "Serum immunoreactive bone sialoprotein as a new marker of bone turnover in metabolic and malignant bone disea se ", J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 3289-3294 and Karmatschek M, Woitge H. W., Armbruster F. P., Ziegler R., Seibel M. J. [1997], "Improved purification of human bone sialoprotein and develop ment of a homologous radioimmunoassay ", Clin. Chem. 43/11: 2076- 2082). The clinical findings show that patients with increased Bone turnover also show increased values for serum BSP. The the same applies to patients with established bone metastasis tion in breast cancer (Seibel et al. [1996], loc. cit.). New and diagnostically valuable is the finding that perioperative Determination of BSP and / or OPN made valuable statements can be about determining the likelihood of future occurrence of bone metastases in patients with primary breast cancer and, if necessary, the need preventive treatment.

Bone Sialoprotein (BSP) ist ein hochgradig glykosyliertes und phosphorylisiertes Protein mit einem apparenten Molekulargewicht von 70 bis 80 kDa (Proteincore: 34 kDa), das ungefähr 5 bis 10% der nicht-kollagenen, organischen Matrix des Knochens ausmacht (1-4). BSP wird in signifikanten Mengen in aktiven Osteoblasten, in geringerem Ausmaß auch in osteoklastenähnlichen Zellen und in Odontoblasten exprimiert. Im Vergleich zu anderen nicht-kollagenen Makromolekülen zeigt BSP eine relativ restrik tive Gewebeverteilung: das Protein oder seine mRNA wird unter physiologischen (gesunden) Bedingungen vor allem in minerali sierten Geweben wie Knochen oder Dentin sowie an der Grenzzone zwischen kalzifizierendem Knorpel und Knochen nachgewiesen. BSP ist außerdem in plancentaren Trophoblasten, in Thrombozyten sowie in bestimmten benignen, vor allem aber in maligenen Zellen von Mammakarzinomen immunohistochemisch nachweisbar (Bellahcene et al. [1994, 1996], loc. cit.).Bone sialoprotein (BSP) is a highly glycosylated and phosphorylized protein with an apparent molecular weight from 70 to 80 kDa (protein core: 34 kDa), which is approximately 5 to 10% of the non-collagenic, organic matrix of the bone (1-4). BSP is used in significant amounts in active osteoblasts, to a lesser extent also in osteoclast-like cells and expressed in odontoblasts. Compared to other Non-collagenic macromolecules show a relatively restricted BSP tive tissue distribution: the protein or its mRNA is under physiological (healthy) conditions especially in minerali tissue such as bone or dentin and at the border zone detected between calcifying cartilage and bone. E.G is also in plantar trophoblasts, in platelets as well as in certain benign, but especially in malignant cells detectable from breast cancer immunohistochemically (Bellahcene et al. [1994, 1996], loc. cit.).

Neben seinen sauren Valenzen enthält BSP eine Arg-Gly-Aps (RGD) Aminosäuresequenz, die der Erkennung und Bindung von sogenannten Integrinen dient. Durch diese Eigenschaften vermittelt und verbessert BSP die Adhäsion von Osteoblasten und Osteoklasten an bestimmte natürliche und künstliche Oberflächen, an Kollagen Typ I oder auch an Calcium. In-vitro fördert BSP die Nukleation von Hydroxylapatit, dem Hauptbestandteil der mineralisierten Knochenmatrix. In-vivo verbessert und beschleunigt BSP die durch Osteoklasten vermittelte Knochenresorption (vgl. Ross F. P., Chappel J., Alvarez J. I. [1993], "Interactions between bone matrix proteins, osteopontin and bone sialoprotein and the osteocalst integrin α_v β₃ potentiate bone resorption", J. Biol. Chem. 268: 9901-9907; Fujisawa R., Nodasaka Y., Kuboki Y. [1995], "Further characterisation of the interaction between bone sialoprotein (BSP) and collagen", Calcif. Tissue Int. 56: 140-144; und Hunter G. K., Goldberg H. A. [1994], "Modulation of crystal formation by bone phosphoproteins: Role of glutamic acid-rich sequences in the nucleation of hydroxyapatite by bone sialoprotein", Biochem. J. 302: 175-179). Es wird daher gefol gert, daß BSP eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell- und Zell- Matrixinteraktion in mineralisierten oder mineralisierenden Geweben spielt, insbesondere bei der Interaktion zwischen Osteoklast und Matrix (Knochenresorption).In addition to its acidic valences, BSP contains an Arg-Gly-Aps (RGD) amino acid sequence, which is used for the recognition and binding of so-called integrins. Through these properties, BSP mediates and improves the adhesion of osteoblasts and osteoclasts to certain natural and artificial surfaces, to type I collagen or to calcium. In vitro, BSP promotes the nucleation of hydroxyapatite, the main component of the mineralized bone matrix. In vivo, BSP improves and accelerates bone resorption mediated by osteoclasts (cf. Ross FP, Chappel J., Alvarez JI [1993], "Interactions between bone matrix proteins, osteopontin and bone sialoprotein and the osteocalst integrin α _v β ₃ potentiate bone resorption ", J. Biol. Chem. 268: 9901-9907; Fujisawa R., Nodasaka Y., Kuboki Y. [1995]," Further characterization of the interaction between bone sialoprotein (BSP) and collagen ", Calcif. Tissue Int. 56: 140-144; and Hunter GK, Goldberg HA [1994], "Modulation of crystal formation by bone phosphoproteins: Role of glutamic acid-rich sequences in the nucleation of hydroxyapatite by bone sialoprotein", Biochem. J. 302: 175- 179). It is therefore concluded that BSP plays an important role in cell-cell and cell-matrix interaction in mineralized or mineralizing tissues, especially in the interaction between osteoclast and matrix (bone resorption).

Osteopontin ist ebenfalls ein komplex strukturiertes Glyko protein der Knochenmatrix, das nachweislich die Interaktion zwischen Osteoklasten und Matrix positiv beeinflußt. Gegen Osteopontin haben verschiedene Gruppen polyklonale Antikörper hergestellt.Osteopontin is also a complex structured glyco protein of the bone matrix that has been shown to interact between osteoclasts and matrix positively influenced. Against Osteopontin have different groups of polyclonal antibodies manufactured.

Osteopontin kommt potentiell die gleiche Rolle zu wie dem BSP.Osteopontin potentially has the same role as the BSP.

Für die klinische Situation beim Menschen sind damit zwei unterschiedliche Situationen zu unterscheiden:
There are two different situations for the clinical situation in humans:

1. Normal production of BSP or OPN in the bone and mineral tissues that contribute to normal serum levels of circu leading BSP.
2. Pathological production of BSP or OPN in malignant tissues ben, such as B. in cells of breast cancer (Bellahence 1994, 1996, loc. cit.). In this case, a large part comes from the BSP or OPN from the tumor circulating in the serum, while just a certain "background level" out of the bone comes from. This is especially the case if at the time diagnosis of breast cancer no bone metastases are present, d. H. assume a normal bone metabolism is.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die anliegenden Abbildungen und Tabellen näher erläutert. Im einzelnen findet sich hierin folgendes:The method according to the invention is described in the following Figures and tables explained in more detail. Finds in detail the following:

Fig. 1

Box/Whisker-Plot von präoperativen Serum-BSP-Spiegeln bei Patientinnen mit und ohne Knochenmetastasierung.Box / whisker plot of preoperative serum BSP levels Patients with and without bone metastasis.

Fig. 2

Kaplan-Meyer-Analyse stratifiziert nach Log-Rank-Test: Wahr scheinlichkeit des Auftretens von KM nach einer medianen Ver laufsbeobachtung von 24 Monaten bei Patientinnen mit einem Serum-BSP-Wert unter und über 24 ng/mL zum Zeitpunkt der Primär diagnose eines malignen Mammakarzinoms.Kaplan-Meyer analysis stratified according to log-rank test: true Probability of occurrence of KM after a median ver 24-month running observation in patients with a Serum BSP value below and above 24 ng / mL at the time of primary diagnosis of malignant breast cancer.

Table 1

Charakterisierung des untersuchten Kollektivs von 388 Frauen mit primärem Mammakarzinom zum Zeitpunkt der Diagnose. Die Tabelle unterscheidet Patientengruppen mit Serum-BSP-Werten über und unter 24 ng/mL (errechneter Cut-off). Die Beziehungen zwi schen Serum-BSP-Wert und etablierten Prognoseparametern wurde mit dem Chi-Quadrat-Test berechnet.Characterization of the examined group of 388 women with primary breast cancer at the time of diagnosis. The Table differentiates between patient groups with serum BSP values and below 24 ng / mL (calculated cut-off). The relationships between serum BSP value and established prognostic parameters calculated with the chi-square test.

Table 2

Auflistung der Patientinnen mit erfolgter Metastasierung im Zeitraum von median 24 Monaten nach Primärbehandlung des Mamma karzinoms (Operation).List of patients with metastasis in the Median period of 24 months after primary breast treatment carcinoma (surgery).

Abkürzungen in Zeile 1: ID = Identifikationsnummer
Meno = pre: prämenopausal, post: postmenopausal
T = Tumorstadium 1-4
N = Lymphknotenstatus
ER = Östrogenrezeptor
PR = Progesteronrezeptor
Grad = histologisches Grading
Meta = Metastasierungsort (o: Knochen, v + o: Leber/Lunge und Knochen, v: Leber und Lunge)
Wert = BSP-Spiegel im SerumAbbreviations in line 1: ID = identification number
Meno = pre: premenopausal, post: postmenopausal
T = tumor stage 1-4
N = lymph node status
ER = estrogen receptor
PR = progesterone receptor
Degree = histological grading
Meta = site of metastasis (o: bone, v + o: liver / lung and bone, v: liver and lung)
Value = BSP level in the serum

Die Patientinnen in Zeile 1-14 erfuhren eine rein ossäre Meta stasierung (nur Knochen); die folgenden 5 Patientinnen zeigten eine kombinierte ossäre und viszerale (Leber/Lunge) Metastasie rung, während die Patientinnen in Zeile 20-28 eine rein viszera le Metastasierung (Leber/Lunge) erlitten.The patients in lines 1-14 experienced a purely osseous meta stasis (bone only); the following 5 patients showed a combined osseous and visceral (liver / lung) metastasis tion, while the patients in lines 20-28 have a purely visceral le metastasis (liver / lungs) suffered.

Table 3

Übersicht der medianen Serum-BSP-Werte in den unterschiedlichen Patientengruppen einschließlich von Patientinnen mit nicht- malignen Tumoren der Mamma.Overview of the median serum BSP values in the different Patient groups including patients with non- malignant tumors of the breast.

Diese Daten wurde aus der folgenden Studienpopulation gewonnen:This data was obtained from the following study population:

Seit Januar 1995 wurde bei allen konsekutiven Patientinnen, die zur Therapie eines primären Mammakarzinoms in der Universitäts frauenklinik aufgenommen wurden, präoperativ Vollblut entnommen. Im gleichen Zeitraum wurde bei 30 Patientinnen mit benignen Mammatumoren in gleicher Weise verfahren. Bei allen Patientinnen mit malignen Tumoren wurde zum Ausschluß einer Fernmetastasie rung im Anschluß an die Operation eine Knochenszintigraphie, ein Oberbauchsonogramm und eine Röntgenaufnahme des Thorax durchgeführt. Sämtliche in die vorliegende Untersuchung einge schlossenen Patientinnen waren zum Zeitpunkt der Primäroperation frei von irgendwelchen Metastasen.Since January 1995, all consecutive patients who have for the treatment of primary breast cancer in the university gynecological clinic, whole blood was taken preoperatively. In the same period 30 patients were benign Proceed in the same way for breast tumors. For all patients with malignant tumors was the exclusion of distant metastasis bone scintigraphy after the operation, an upper abdomen sonogram and a chest x-ray carried out. All included in the present investigation closed patients were at the time of the primary surgery free of any metastases.

Die Charakteristika der Patientinnen mit Mammakarzinom sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die histopathologischen, biochemi schen und klinischen Prognosefaktoren wurden nach standardisier ten Verfahren erhoben und waren im einzelnen:The characteristics of the patients with breast cancer are in Table 1 compiled. The histopathological, biochemical and clinical prognostic factors were standardized according to ten procedures and were:

Tumor size

T1 = 0-2 cm im Durchmesser
T2 = < 2-5 cm im Durchmesser
T3 = < 5 cm im Durchmesser
T4 = alle Tumoren mit InfiltrationT1 = 0-2 cm in diameter
T2 = <2-5 cm in diameter
T3 = <5 cm in diameter
T4 = all tumors with infiltration

Lymph node status

N0 = keine metastatisch befallenen Lymphknoten (LK) nachweisbar
N+ = metastatisch befallene LK nachweisbarN0 = no metastatic lymph nodes detectable
N + = metastatic LK detectable

Estrogen and progesterone receptor

Positiver (ER pos/PR pos) bzw. negativer (ER neg/PR neg) Nach weis der resp. Rezeptoren im Tumorgewebe mittels Dextran-coated charcoal und Scatchard-Anlayse. Ein positiver Nachweis bestand ab einer Konzentration von < 20 fmol/mg zytosolischem Protein.Positive (ER pos / PR pos) or negative (ER neg / PR neg) after knows the resp. Receptors in tumor tissue using dextran-coated charcoal and scatchard analysis. There was positive evidence from a concentration of <20 fmol / mg cytosolic protein.

Menopause status

Premenopausal (pre) = Frauen mit regelmäßigem Menstruations zyklus zum Zeitpunkt der Primärdiagnose
Postmenopausal (post) = Frauen ohne Menstruationszyklus zum Zeitpunkt der PrimärdiagnosePremenopausal (pre) = women with a regular menstrual cycle at the time of primary diagnosis
Postmenopausal (post) = women without a menstrual cycle at the time of primary diagnosis

Grading

Histologische Einstufung der Differenzierung des Primärtumors
G I und G II = gut differenzierte Tumoren
G III = schlecht differenzierte TumorenHistological classification of the differentiation of the primary tumor
GI and G II = well differentiated tumors
G III = poorly differentiated tumors

S phase

Anteil der in. Zellteilung befindlichen Zellen als Maß der Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors.Proportion of cells in cell division as a measure of Growth rate of a tumor.

Alle Patientinnen wurden operiert und anschließend mittels Polychemo- und Hormontherapie behandelt. Alle Patientinnen wurden in dreimonatigen Abständen in der Universitätsfrauen klinik erneut untersucht und hinsichtlich des Auftretens von Metastasierung abgeklärt. Bis auf die klinische Befragung (Anam nese) und Untersuchung wurden die einzelnen Untersuchungen risikoadaptiert in unterschiedlichen Intervallen von 3 bis 12 Monaten durchgeführt (Knochenszintigraphie, Oberbauchsonogramm, Röntgenaufnahme des Thorax). Bei 28 von 388 Patientinnen wurde innerhalb einer medianen Beobachtungszeit von 24 Monaten mittels Knochenszintigraphie, Oberbauchsonogramm und Thorax-Röntgen aufnahme eine Metastasierung in den Knochen, in der Viszera oder in beiden Lokalisationen diagnostiziert (s. Tabelle 2). All patients were operated on and then by means of Polychemotherapy and hormone therapy treated. All patients have been in university women at three-month intervals clinic examined again and with regard to the occurrence of Metastasis clarified. Except for the clinical questioning (anam nese) and examination were the individual investigations risk-adjusted at different intervals from 3 to 12 Months (bone scintigraphy, upper abdominal sonogram, Chest x-ray). In 28 out of 388 patients within a median observation period of 24 months using Bone scintigraphy, upper abdominal sonogram and chest x-ray Metastasis in the bones, in the viscera or diagnosed in both locations (see Table 2).

Bestimmung von Bone Sialoprotein (BSP) und Osteopontin (OPN) im Serum:
Die Konzentrationen von BSP und OPN im Serum und anderen Körper flüssigkeiten wurden mittels immunologischer und biochemischer Methoden bei allen Patientinnen bestimmt. Hierzu wurde Vollblut aus der Kubitalvene gewonnen, das Serum nach standardisierten Methoden per Zentrifugation gewonnen und bis zur Analyse tiefge froren. Ebenso wurde Spontanurin vor der Operation gewonnen und tiefgekühlt asserviert.Determination of Bone Sialoprotein (BSP) and Osteopontin (OPN) in Serum:
The concentrations of BSP and OPN in serum and other body fluids were determined in all patients using immunological and biochemical methods. To do this, whole blood was obtained from the cubital vein, the serum was obtained by centrifugation using standardized methods and frozen until analysis. Spontaneous urine was also obtained before the operation and preserved frozen.

Zum Nachweis von BSP wurden verschiedene bioimmunochemische Assays verwandt. Zum einen wurde ein bereits publiziertes Radio immunoassay unter Verwendung eines polyklonalen anti-humanes- BSP-Antiserum eingesetzt (Karmatschek et al. [1997]). Hierbei werden 100 µl der Serums bzw. des BSP-Standards mit 100 µl Tracer (125 Jod-markiertes BSP, 1,5 ng/ml) und 100 µl des Hühner-anti-BSP-Antiserums gemischt und für 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Anschließend werden 100 µl Esel-anti-Huhn-Antiserum (1 : 15) als zweiter Antikörper hinzugegeben, erneut für 2 Stunden bei 4°C inkubiert und zuletzt der gebundene BSP-Huhn-Esel- Antikörper-Komplex für 10 Minuten bei 2000 × g abzentrifugiert. Nach verschiedenen Waschschritten wird die im Pellet enthaltene Radioaktivität gemessen. Die unbekannte Konzentration in der Probe kann dann anhand einer Standardkurve mit bekannten Konzen trationen von BSP errechnet werden. In Analogie hierzu wird OPN in menschlichen Serumproben gemessen, wobei an die Stelle des BSP jetzt das OPN tritt, an die Stelle der anti-BSP-Antisera dagegen spezifische anti-OPN-Sera treten. Das Meßverfahren ist ansonsten identisch.Various bioimmunochemicals have been used to detect BSP Related assays. On the one hand, there was an already published radio immunoassay using a polyclonal anti-human BSP antiserum used (Karmatschek et al. [1997]). Here 100 µl of the serum or the BSP standard with 100 µl Tracer (125 iodine-labeled BSP, 1.5 ng / ml) and 100 µl des Chicken anti-BSP antiserum mixed and for 24 hours at 4 ° C incubated. Then 100 ul donkey anti-chicken antiserum (1:15) added as second antibody, again for 2 hours incubated at 4 ° C and finally the bound BSP chicken donkey Antibody complex centrifuged for 10 minutes at 2000 × g. After various washing steps, the pellet contains Radioactivity measured. The unknown concentration in the Sample can then be made using a standard curve with known concentrations of BSP can be calculated. Analogously to this, OPN measured in human serum samples, replacing the BSP now the OPN takes the place of the anti-BSP antisera on the other hand, specific anti-OPN sera occur. The measuring method is otherwise identical.

Aus den Abbildungen und Tabellen können folgende Schlußfolgerun gen gezogen werden:The following conclusions can be drawn from the figures and tables pulled:

Fig. 1

Die präoperativ, d. h. im Mittel 2 Jahre vor der eigentlichen Metastasierung gemessenen Serumwerte von BSP sind bei Patien tinnen mit später erfolgender Metastasierung in den Knochen zum präoperativen Zeitpunkt signifakt höher als bei solchen, die innerhalb von 24 bis 30 Monaten keine Metastasierung in den Knochen aufweisen.The preoperative, d. H. on average 2 years before the actual one Metastasis measured serum levels of BSP are in patients with later metastasis in the bones preoperative time significantly higher than for those who no metastasis to the patient within 24 to 30 months Have bones.

Fig. 2

Anhand der Kaplan-Meyer-Kurve läßt sich für präoperative BSP- Werte < 24 ng/mL ein relatives Risiko von 94.07 für die spätere Metastasierung des Tumors in den Knochen errechnen. Der Unter schied zu Patienten mit Werten < 24 ng/mL ist hochsignifikant (p = < 0.001).The Kaplan-Meyer curve can be used for preoperative BSP Values <24 ng / mL a relative risk of 94.07 for the later Calculate metastasis of the tumor in the bones. The sub difference to patients with values <24 ng / mL is highly significant (p = <0.001).

Table 1

Es besteht eine signifikante Beziehung zwischen Serum-BSP-Werten und Tumorgröße (T1-4), ansonsten jedoch keine Beziehung zu irgendwelchen anderen konventionellen Risikoparametern des Mammakarzinoms.There is a significant relationship between serum BSP values and tumor size (T1-4), but otherwise unrelated to any other conventional risk parameters of the Breast cancer.

Table 2

zeigt die Ergebnisse individuell.shows the results individually.

Table 3

faßt die Ergebnisse im Median pro untersuchter Gruppe zusammen und zeigt, daß Patienten mit ossärer Metastasierung die höchsten präoperativen BSP-Werte aufwiesen.summarizes the results in median for each group examined and shows that patients with osseous metastasis have the highest had preoperative GNP values.

Zusammenfassend läßt sich somit feststellen, daß das neue Verfahren erstmals die Möglichkeit eröffnet, spezifisch, sensi tiv, schnell, einfach und preiswert die Wahrscheinlichkeit des zukünftigen Auftretens von Knochenmetastasen bei Patienten mit primärem Mammakarzinom zu bestimmen und danach gegebenenfalls sehr viel früher und effizienter mit der vorbeugenden Behandlung zu beginnen. Dies erhöht die Lebenserwartung bei erhöhter Lebensqualität der Patienten. In summary, it can be said that the new Process opens up the possibility for the first time, specifically, sensi tiv, fast, easy and inexpensive the probability of future occurrence of bone metastases in patients with to determine primary breast cancer and then if necessary much earlier and more efficiently with preventive treatment to start. This increases life expectancy when increased Quality of life of patients.

Tabelle 1 Table 1

Charakterisierung der Studienpopulation Characterization of the study population

Tabelle 2 Table 2

Tabelle 3 Table 3

Claims

1. A method for determining the probability of the future occurrence of bone metastases in patients with primary breast cancer and possibly the need for preventive treatment, characterized in that the content of BSP (bone sialoprotein) and / or OPN (osteopontin) is determined perioperatively in the serum becomes.

2. The method according to claim 1, characterized in that the level of BSP and / or OPN in the serum postoperatively is monitored.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the content of BSP and / or OPN immunologically with the help determined by polyclonal or monoclonal antibodies becomes.