DE19811739A1 - Determination of efficacy of tumor therapy - Google Patents

Determination of efficacy of tumor therapy

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DE19811739A1
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Abstract

Determination of apoptotic products in serum samples from tumor patients is used to determine the efficacy of tumor therapy. An Independent claim is also included for determining apoptotic products in samples from tumor patients, where the concentration of apoptotic products in serum samples correlates with the efficacy of tumor therapy and thus serves to monitor the progress of therapy.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von apoptotischen Produkten in von Tumorpatienten entnommenen Proben, wobei die Konzentration der apoptoti­ schen Produkte in Serumproben mit der Effektivität der Tumortherapie korreliert wird und somit der Verlaufskontrolle der Therapie dient. Die Serumproben werden zu verschiedenen Zeitpunk­ ten entnommen und bestimmt. Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Ver­ fahren, bei dem die Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten be­ stimmt wird, um die Effektivität der Tumortherapie zu ermitteln. Des weiteren ist die Verwen­ dung eines Verfahrens zur Bestimmung apoptotischer Produkte in Serumproben von Tumorpa­ tienten zur Bestimmung der Effektivität der Tumortherapie Gegenstand der vorliegenden Erfin­ dung.The present invention relates to a method for the determination of apoptotic Products in samples taken from tumor patients, the concentration of apoptoti products in serum samples is correlated with the effectiveness of tumor therapy and thus serves to monitor the course of therapy. The serum samples are taken at different times taken and determined. In particular, the subject of the present invention is a ver drive, in which the concentration of nucleosomes in serum samples from tumor patients be is true to determine the effectiveness of tumor therapy. Furthermore is the use Development of a method for the determination of apoptotic products in serum samples from tumor pa The subject of the present invention was used to determine the effectiveness of tumor therapy dung.

Eine eukaryontische Zelle kann auf zwei grundsätzlich unterschiedlichen Wegen absterben. Ein Weg ist die Nekrose, ein Absterben der Zelle als Folge einer Schädigung, z. B. aufgrund einer unzureichenden Blutzufuhr und damit Unterversorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen, oder als Folge einer Vergiftung oder physikalischen Schädigung (mechanische Verletzung, Frost oder Hitze). Der andere Weg, der sogenannte programmierte Zelltod, ist von großer Bedeutung für die Entwicklung und Funktionsfähigkeit von Geweben, Organen und Organismen als Ganzes (J. Cohen, Advances in Immunology 50 (1991), 55-85). Die auf diese Weise abgestorbenen Zellen weisen im Zytoplasma mit Histonen assoziierte DNA-Fragmente als Mono- und Oligonu­ kleosome auf. Ein solches Erscheinungsbild wird auch bei einem induzierten Zelltod beobachtet, wie er z. B. durch ionisierende Strahlen (Yamada et al., Int. J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65) oder bestimmte monoklonale Antikörper, wie z. B. Anti-Fas (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169 (1989), 1747-1756) oder anti-APO-1 (Trauth et al., Science 245 (1989), 301-304) ausgelöst wird. Auch zytotoxische T-Zellen und Natural-Killer-Zellen bewirken einen solchen induzierten Zelltod mit dem beschriebenen Erscheinungsbild (Sanderson, Biol. Rev. 56 (1981), 153-197, S. Curnow et al., Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993), 149-155 und Berke, Immunol. Today 12 (1991), 396-399). Sie bewirken jedoch auch eine erhöhte Permeabilität der Plasmamembran, wie sie bei einer Nekrose beobachtet wird (Krähenbühl et al., Immunol. Today 12 (1991), 399-402). Die beschriebene Art des programmierten oder induzierten Zelltods wird als Apoptose (Wyllie et al., Int. Rev. of Cytol. 68 (1980), 251-301) bezeichnet. Sie ist charakterisiert durch bläschenförmige Ausstülpungen der Plasmamembran, Kondensation des Zytoplasmas und Aktivierung einer endogenen Endonuklease. Im Gegensatz zur Nekrose handelt es sich bei der Apoptose also um einen aktiven Prozeß der eukaryontischen Zelle. Er wird daher auch nicht bei einem Abtöten der Zellen durch Erhitzen, Einfrieren und Auftauen oder Lyse mit einem lytisch wirkenden Antikörper bewirkt (R. Duke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983), 6361-6365). Die bei der Apoptose aktivierte kalzium- und magnesiumabhängige Endonuklease spaltet den DNA-Doppelstrang in den leicht zugänglichen Linkerregionen zwischen den Nukleosomen in Mono- und Oligonukleosome. Die DNA in den Nukleosomen hingegen ist mit den Core-Histo­ nen H2A, H2B, H3 und H4 eng assoziiert und deshalb geschützt vor der Spaltung durch die En­ donuklease (Burgoyne et al., Biochem. J. 143 (1974), 67 und Stach et al., J. Neurochem. 33 (1979), 257). Daher ist nach Extraktion der DNA und Auftrennung im Agarosegel die für apop­ totische Zellen typische "DNA-Leiter" zu erkennen, ein Muster von DNA-Fragmenten mit einer Länge von ca. 180 Basenpaaren bzw. einem Vielfachen davon (Wyllie, Nature 284 (1980), 55-556 und J. Cohen, Advances in Immunology 50 (1991), 55-85). Die Plasmamembran der Zel­ len bleibt in diesem frühen Stadium der Apoptose intakt. Es kommt zur Anreicherung der Mono- und Oligonukleosomen im Zytoplasma der sterbenden Zelle (Duke et al., Lymphokine Research 5 (1986), 289-299).A eukaryotic cell can die in two fundamentally different ways. A Necrosis is gone, cell death as a result of damage, e.g. B. due to a insufficient blood supply and thus undersupply with oxygen and nutrients, or as Consequences of poisoning or physical damage (mechanical injury, frost or Heat). The other way, the so-called programmed cell death, is of great importance for the Development and functionality of tissues, organs and organisms as a whole (1991, J. Cohen, Advances in Immunology 50: 55-85). Those who died this way Cells have DNA fragments associated with histones in the cytoplasm as mono- and oligonu kleosome on. Such an appearance is also observed in induced cell death, how he z. B. by ionizing radiation (Yamada et al., Int. J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65) or certain monoclonal antibodies such as e.g. B. Anti-Fas (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169 (1989), 1747-1756) or anti-APO-1 (Trauth et al., Science 245 (1989), 301-304)  becomes. Cytotoxic T cells and natural killer cells also induce such Cell death with the described appearance (Sanderson, Biol. Rev. 56 (1981), 153-197, p. Curnow et al., Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993), 149-155 and Berke, Immunol. Today 12: 396-399 (1991). However, they also cause an increased permeability of the plasma membrane, as observed in necrosis (Krähenbühl et al., Immunol. Today 12 (1991), 399-402). The type of programmed or induced cell death described is called apoptosis (Wyllie et al., Int. Rev. of Cytol. 68 (1980), 251-301). It is characterized by vesicular protuberances of the plasma membrane, condensation of the cytoplasm and Activation of an endogenous endonuclease. In contrast to necrosis, it is the Apoptosis is an active process of the eukaryotic cell. He will therefore not be at killing the cells by heating, freezing and thawing or lysis with a lytic acting antibody (R. Duke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983), 6361-6365). The calcium and magnesium dependent endonuclease activated during apoptosis cleaves the DNA double strand in the easily accessible linker regions between the nucleosomes in Mono and oligonucleosomes. The DNA in the nucleosomes, however, is with the core histo Nene H2A, H2B, H3 and H4 closely associated and therefore protected against the cleavage by the En donuclease (Burgoyne et al., Biochem. J. 143 (1974), 67 and Stach et al., J. Neurochem. 33 (1979), 257). Therefore, after extraction of the DNA and separation in the agarose gel, the apop to recognize total cells typical "DNA ladder", a pattern of DNA fragments with a Length of approximately 180 base pairs or a multiple thereof (Wyllie, Nature 284 (1980), 55-556 and J. Cohen, Advances in Immunology 50 (1991), 55-85). The plasma membrane of the cell len remains intact at this early stage of apoptosis. There is an enrichment of the Mono- and oligonucleosomes in the cytoplasm of the dying cell (Duke et al., Lymphokine Research 5: 289-299 (1986).

Apoptotische Prozesse können bei Patienten mit malignen und benignen Tumoren beobachtet werden. So wird bei malignen Tumoren oft ein vermehrter Zellumsatz beobachtet, d. h. die Zell­ proliferationsrate- wie auch die Zelltodrate ist erhöht. Letztere ist Ausdruck massiven apoptoti­ schen Zelluntergangs. Geregelter, programmierter Abbau von DNA, Zellkern und Organellen, Verpackung des Zellinhaltes in "apoptotic bodies", sowie Phagozytose durch Makrophagen und Nachbarzellen sorgen für vollständiges Recycling ohne Rückstände. Ist dieses Entsorgungssy­ stem überlaste, gelangen zelluläre Bestandteile u. a. auch in den Blutkreislauf. So wurden in Se­ rum und Plasma von Patienten mit malignen Tumoren höhere DNA-Konzentrationen gefunden, wobei die DNA in der Zirkulation vornehmlich gebunden an Histone in Form von Mono- und Oligonukleosomen vorliegt.Apoptotic processes can be observed in patients with malignant and benign tumors become. Increased cell turnover is often observed in malignant tumors. H. the cell proliferation rate - as well as the cell death rate is increased. The latter is an expression of massive apoptoti cell end. Regulated, programmed breakdown of DNA, cell nucleus and organelles, Packaging of the cell contents in "apoptotic bodies", as well as phagocytosis by macrophages and Neighboring cells ensure complete recycling without residues. Is this disposal system  stem overload, cellular components and. a. also in the bloodstream. So in Se rum and plasma from patients with malignant tumors found higher DNA concentrations, the DNA in the circulation mainly bound to histones in the form of mono- and Oligonucleosomes.

Die Menge an apoptotischen Produkten, beispielsweise an Nukleosomen, im Serum kann kor­ reliert werden mit dem Ausmaß der malignen Erkrankung. Fortgeschrittene Erkrankungen wei­ sen z. B. eine erheblich höhere Konzentration von Serum-Nukleosomen auf. Bekannt ist des weiteren, daß durch Radiotherapie und durch verschiedene cytostatische Medikamente Apoptosis induziert wird.The amount of apoptotic products, for example nucleosomes, in the serum can be cor are related to the extent of the malignancy. Advanced diseases white sen z. B. a significantly higher concentration of serum nucleosomes. The is known further that by radiotherapy and by various cytostatic drugs apoptosis is induced.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Konzentration an apoptotischen Produkten im Serum von Tumorpatienten während der Radio- oder Chemotherapie als Marker für die Effizienz der Therapie verwendet werden kann. Und somit ist ein Verfahren zur Bestimmung von apopto­ tischen Produkten in von Tumorpatienten entnommenen Proben, wobei die Konzentration der apoptotischen Produkte in Serumproben mit der Effektivität der Tumortherapie korreliert wird und somit der Verlaufskontrolle der Therapie dient. Die Serumproben werden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und bestimmt. Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, bei dem die Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatien­ ten bestimmt wird, um die Effektivität der Tumortherapie zu ermitteln. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tu­ morpatienten bei dem man
Surprisingly, it was found that the concentration of apoptotic products in the serum of tumor patients during radio or chemotherapy can be used as a marker for the efficiency of the therapy. And thus is a method for the determination of apoptotic products in samples taken from tumor patients, the concentration of the apoptotic products in serum samples being correlated with the effectiveness of the tumor therapy and thus serving to monitor the progress of the therapy. The serum samples are taken and determined at different times. In particular, the present invention relates to a method in which the concentration of nucleosomes in serum samples from tumor patients is determined in order to determine the effectiveness of the tumor therapy. A method for determining the concentration of nucleosomes in serum samples from tumor patients is particularly preferred in which

  • a) das Serum eines Tumorpatienten mit einem Anti-Histon-Antikörper und einem Anti-DNA-Anti­ körper inkubiert, wobei einer der Antikörper vor oder nach dieser Inkubation an eine feste Phase gebunden wird und der andere Antikörper ein markierter Antikörper ist,a) the serum of a tumor patient with an anti-histone antibody and an anti-DNA anti body incubated, one of the antibodies before or after this incubation to a solid phase is bound and the other antibody is a labeled antibody,
  • b) feste und flüssige Phase trennt undb) separates solid and liquid phase and
  • c) die Markierung in einer der beiden Phasen bestimmt, um die Konzentration der Nukleoso­ men in Serumproben von Tumorpatienten zu ermitteln. Beispielsweise eignet sich für die Bestimmung der Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten der kommerziell erhältliche Cell Death Detection plus-ELISA der Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland.c) the marker is determined in one of the two phases in order to determine the concentration of the nucleosomes in serum samples from tumor patients. For example, the commercially available Cell Death Detection plus ELISA from Boehringer Mannheim GmbH, Germany, is suitable for determining the concentration of nucleosomes in serum samples from tumor patients.

Des weiteren ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines Verfahrens zur Bestimmung apoptotischer Produkte in Serumproben von Tumorpatienten zur Bestimmung der Effektivität der Tumortherapie. Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Cell Death Detection plus-ELISA Kits von Boehringer Mannheim zur Bestimmung apoptotischer Produkte in Serumproben von Tumorpatienten.The invention furthermore relates to the use of a method for determining apoptotic products in serum samples from tumor patients for determining the effectiveness of tumor therapy. It is particularly preferred to use the Cell Death Detection plus ELISA kit from Boehringer Mannheim for the determination of apoptotic products in serum samples from tumor patients.

Insbesondere wurde die Nukleosomen-Konzentration im Serum im Verlauf einer radio- oder chemotherapeutischen Behandlung von tumorösen Patienten beobachtet und mit dem klinischen Verlauf und Tumormarkern korreliert. Es traten sehr rasch nach Beginn der Therapie unter­ schiedlich stark erhöhte Konzentrationen von Nukleosomen im Serum auf, die im Therapiever­ lauf beobachtet wurden und insbesondere bei Radiato eine Therapieeffizienz frühzeitig anzuzei­ gen scheinen. Die Nukleosomen-Konzentration im Serum wurde beispielsweise bestimmt vor der Therapie, 3 Stunden, 6 Stunden, 1 Tag, 4 Tage, 7 Tage und wöchentlich nach Beginn der Therapie. Das Ansteigen der Konzentration der Nukleosomen im Serum, der Maximalwert, die Verzögerung des Absinkens und der Minimumwert der Konzentration wurde mit dem klinischen Verlauf korreliert.In particular, the nucleosome concentration in the serum was in the course of a radio or chemotherapy treatment of tumor patients and observed with the clinical Course and tumor markers correlated. They occurred very quickly after the start of therapy different strongly increased concentrations of nucleosomes in the serum, which in the therapy ver running were observed and therapy efficiency was to be indicated at an early stage, particularly with Radiato seem to. The nucleosome concentration in the serum was determined, for example, before Therapy, 3 hours, 6 hours, 1 day, 4 days, 7 days and weekly after the start of Therapy. The increase in the concentration of nucleosomes in serum, the maximum value that Delay in the decline and the minimum concentration was determined with the clinical Course correlated.

Es wurde eine Korrelation gefunden zwischen der pre- und posttherapeutischen Konzentration der Nukleosomen im Serum der Tumorpatienten. Bei Patienten mit einer hohen spontanen Apoptose wurden auch während der Therapie hohe Konzentrationswerte gefunden (7/16). Bei Patienten mit einer pretherapeutisch niedrigen Konzentration der Nukleosomen im Serum blieb der Wert auch niedrig (5/16) oder zeigte ein Ansteigen (4/16). Jedoch zeigte sich, daß die Maxi­ mal- Konzentration der Nukleosomen im Serum keinen Einfluß auf den klinischen Verlauf der Therapie bzw. der Krankheit bei den Tumorpatienten hat.A correlation was found between the pre- and post-therapeutic concentration the nucleosomes in the serum of tumor patients. In patients with a high spontaneous Apoptosis, high concentration values were also found during therapy (7/16). At Patients with a pretherapeutically low concentration of nucleosomes remained in the serum the value also low (5/16) or showed an increase (4/16). However, it turned out that the Maxi Mal concentration of the nucleosomes in serum has no influence on the clinical course of the Therapy or disease in the tumor patients.

Bei einem Rückgang des Tumors und einem positiven klinischen Verlauf konnte ein Absinken der Konzentration der Nukleosomen im Serum direkt nach dem Maximalwert auf ein sehr niedrigen Minimalwert beobachtet werden (6 von 7). Das späte Absinken und höhere Minimal­ werte (5 von 5) wurden beobachtet bei Patienten mit einem schlechten klinischen Verlauf oder sogar Tod.With a decrease in the tumor and a positive clinical course, a decrease could occur the concentration of the nucleosomes in the serum directly after the maximum value on a very low minimum value can be observed (6 of 7). The late sinking and higher minimal  scores (5 out of 5) were observed in patients with poor clinical course or even death.

Beispiel 1example 1 Cell Death Detection plus-ELISACell Death Detection plus ELISA TestprinzipTest principle

Der Dell Death Detection plus-ELISA basiert auf dem quantitativen Sandwich-Enzym-Immunoas­ say-Prinzip. Es werden zwei monoklonale Maus-Antikörper, die gegen DNA und Histone ge­ richtet sind, verwandt. Der Test kann mit zytoplasmatischen Lysaten Kulturüberständen, Plasma, Serum und anderen Körperflüssigkeiten durchgeführt werden und erlaubt einen spezifischen Nachweis von Mono- und Oligonukleosomen. Die hier angeführte Beschreibung gilt für Mes­ sungen in flüssigen Medien:The Dell Death Detection plus ELISA is based on the quantitative sandwich enzyme immunoas say principle. Two mouse monoclonal antibodies directed against DNA and histones are used. The test can be performed with cytoplasmic lysates, culture supernatants, plasma, serum and other body fluids and allows specific detection of mono- and oligonucleosomes. The description given here applies to measurements in liquid media:

Protokollprotocol

Je 20 µl des zu testenden Materials werden in eine Vertiefung einer Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert. Es werden 80 µl eines Immunoreagens', bestehend aus bio­ tinylierten Anti-Histon-Antikörpern, Peroxidase-markierten Anti-DNA-Antikörpern und Inku­ bationspuffer, zugegeben, mit einer Adhäsivfolie bedeckt und für 2 Stunden auf einem MTP-Rüttler (500 rpm) inkubiert. Während dieser Inkubationszeit reagiert der Anti-Histon-Antikörper mit der Histon-Komponente der Nukleosomen und fixiert den Komplex mittels des Biotins an die Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatte. Außerdem bindet der Anti-DNA-Antikörper an die DNA-Komponente der Nukleosomen. Dabei werden sowohl ds- als auch ss-DNA erkannt. Nach Entfernen der noch ungebundenen Antikörper durch dreimaliges Waschen mit je 300-300 µl Inkubationspuffer werden die fixierten Komplexe mit 100 µl ABTS (2.2'-Azino-di(3-ethyl­ benzthiazolin-sulfonat)) inkubiert, die MTP mit einer Adhäsivfolie verschlossen und bei 250 rpm gerüttelt. Das Substrat reagiert mit der Peroxidase-Markierung der Anti-DNA-Antikörper und bewirkt eine zu diesen Antikörpern proportionale photometrisch bei d = 405 nm gegen die Sub­ stratlösung als Blank (Referenzwellenlänge d = 492 nm) quantifiziert. 20 µl each of the material to be tested are coated in a well of a streptavidin Pipetted microtiter plate (MTP). 80 µl of an immunoreagent, consisting of bio tinylated anti-histone antibodies, peroxidase-labeled anti-DNA antibodies and Inku Bationspuffer, added, covered with an adhesive film and for 2 hours on a MTP shaker (500 rpm) incubated. The anti-histone antibody reacts during this incubation period with the histone component of the nucleosomes and fixes the complex using the biotin the streptavidin-coated microtiter plate. The anti-DNA antibody also binds to the DNA component of the nucleosomes. Both ds and ss DNA are recognized. After Remove the still unbound antibodies by washing three times with 300-300 µl each The fixed complexes are incubated with 100 μl ABTS (2,2'-azino-di (3-ethyl benzthiazoline sulfonate)) incubated, the MTP sealed with an adhesive film and at 250 rpm shaken. The substrate reacts with the peroxidase label of the anti-DNA antibodies and causes a photometric proportional to these antibodies at d = 405 nm against the sub strat solution quantified as a blank (reference wavelength d = 492 nm).  

Es werden jeweils Duplikate der Probematerialien analysiert. Außerdem wird eine Negativkon­ trolle mitgeführt, die für die Berechnung des vom Herstellers empfohlenen Anreicherungsfaktors (s. u.) gedacht ist.Duplicates of the sample materials are analyzed. In addition, a negative con trolls carried along, for the calculation of the enrichment factor recommended by the manufacturer (see below).

Lösungensolutions

  • - Inkubationspuffer: PBS mit 1% RSA (BM order no. 238 040), 0,5% Tween 20 (BM order no. 1333 465) und 1 mM EDTA- Incubation buffer: PBS with 1% RSA (BM order no. 238 040), 0.5% Tween 20 (BM order no. 1333 465) and 1mM EDTA
  • - Anti-Histon-Biotin: Biotinylieren (Biotin Labeling Kit, BM, order no. 1418 165) eines Anti-Histon-Panels (BM, order no. 1492 519); Herstellen einer Lösung mit 50 mg/ml Anti-Histon-Biotin in Inkubationspuffer- Anti-histone biotin: biotinylation (Biotin Labeling Kit, BM, order no. 1418 165) one Anti-histone panels (BM, order no. 1492 519); Prepare a 50 mg / ml solution Anti-histone biotin in incubation buffer
  • - Anti-DNA-POD: Konjugieren von Anti-DNA (BM, order no. 1003 399) mit aktiviertem POD (BM, order no. 1428 861); Herstellen einer Lösung von 5 Units/ml Anti-DNA-POD in Inkubationspuffer- Anti-DNA-POD: conjugate anti-DNA (BM, order no. 1003 399) with activated POD (BM, order no. 1428 861); Prepare a solution of 5 units / ml anti-DNA-POD in Incubation buffer
  • - Immunoreagens: Vorsichtiges Homogenisieren von 1/20 Volumenanteilen Anti-Histon-Bio­ tin 1/20 Volumenanteilen Anit-DNA-POD und 18/20 Volumenanteilen Inkubationspuffer- Immunoreagent: Careful homogenization of 1/20 parts by volume of anti-histone bio tin 1/20 parts by volume of Anit-DNA-POD and 18/20 parts by volume of incubation buffer
  • - Substratpuffer: Gebrauchsfertige Lösung von BM (order no. 1204 530); alternativ Auflösen von 1047,5 mg citric acid, 62,5 mg Sodium perborate×3H2O, 9,77 mg CaCl2×2H2O, 1335 mg Na2HPO4×2H2O und Einrichten eines pH von 4,5 insgesamt 125 ml- Substrate buffer: ready-to-use solution from BM (order no. 1204 530); alternatively dissolving 1047.5 mg citric acid, 62.5 mg sodium perborate × 3H 2 O, 9.77 mg CaCl 2 × 2H 2 O, 1335 mg Na 2 HPO 4 × 2H 2 O and establishing a pH of 4.5 a total of 125 ml
  • - Substrat: ABTS-Tabletten (BM order no. 1204 521); Auflösen einer Tablette in 5 ml Sub­ stratpuffer- Substrate: ABTS tablets (BM order no. 1204 521); Dissolve one tablet in 5 ml sub strat buffer
  • - Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatte: SA-MTP (BM, order no. 1734 776)- Streptavidin-coated microtiter plate: SA-MTP (BM, order no. 1734 776)
  • - Adhäsiv-Folien: jede verfügbare Folie- Adhesive films: every available film
Spezifität der AntikörperSpecificity of the antibodies

Die Anti-Histon-Antikörper besitzen spezifische Affinität für die Histone H1, H2a, H2b, H3 und H4. Die Anti-DNA-Antikörper binden an ss- und ds-DNA. Es werden nukläre Nukleosomen eukaryonter Zellen erfaßt. Sowohl in Mitochondrien, prokaryoten Zellen, wie in Bakterien, als auch in Viren ist die DNA nicht mit Histonen assoziiert und liegt deshalb auch nicht in Nukleo­ somenform vor. Auch RNA ist nicht an Histone gebunden und entzieht sich somit der Detektion (Zellbiologiebuch). The anti-histone antibodies have specific affinity for the histones H1, H2a, H2b, H3 and H4. The anti-DNA antibodies bind to ss- and ds-DNA. Nuclear nucleosomes of eukaryotic cells are detected. In mitochondria, prokaryotic cells, as well as in bacteria, as well as in viruses, DNA is not associated with histones and is therefore not in nucleosome form. RNA is also not bound to histones and therefore cannot be detected ( cell biology book ).

Sensitivität des TestsSensitivity of the test

Der ELISA ist in der Lage, den DNA-Gehalt von 103 Zellen nachzuweisen.The ELISA is able to detect the DNA content of 10 3 cells.

Interpretationinterpretation

Der Hersteller empfiehlt nach Mittelung der gemessenen Duplikatswerte eine Interpretation der Nukleosomen-Konzentration der Probematerialien anhand des Anreicherungsfaktors (AF) gemäß folgender Formel:
After averaging the measured duplicate values, the manufacturer recommends an interpretation of the nucleosome concentration of the sample materials based on the enrichment factor (AF) according to the following formula:

AF (mU) = mU der Probe/mU der nicht behandelten Negativ-Probe.AF (mU) = mU of the sample / mU of the untreated negative sample.

Beispiel 2Example 2 Modifikation und StandardisierungModification and standardization AnreicherungsfaktorEnrichment factor

Auf der Grundlage des Anreicherungsfaktors (AF) ist zwar eine Vergleichbarkeit der Werte in­ nerhalb eines Tests, jedoch nicht zweier an verschiedenen Tagen durchgeführter Tests gegeben (s. u.).On the basis of the enrichment factor (AF) it is possible to compare the values in given within one test, but not two tests carried out on different days (see below).

StandardkurveStandard curve

Deshalb wird eine Standardkurve mit hoch apoptotischen Material als Interpretationsbasis her­ angezogen:A standard curve with highly apoptotic material is therefore used as the basis for interpretation dressed:

Durch Inkubation von EDTA-Vollblut dreier gesunder Blutspender über 24 Stunden wird massiv Apoptose induziert. Nach Zentrifugation wird das Plasma lyophilisiert und bei 4°C gelagert. Bei Resuspension zu verschiedenen Zeitpunkten werden reproduzierbare Maximalwerte im oberen Meßbereich des Photometers bei einer optischen Dichte (OD) von 2500 mE erzielt; es liegt eine gute Langzeit-Stabilität sowie eine lineares Verdünnungsverhalten im gesamten Bereich von 0 bis 2500 mE vor. Eine Vergleichbarkeit sowohl innerhalb eines Tests, als auch zwischen meh­ reren Testansätzen ist gewährleistet. The incubation of whole EDTA blood from three healthy blood donors over 24 hours becomes massive Induced apoptosis. After centrifugation, the plasma is lyophilized and stored at 4 ° C. At Resuspension at different times become reproducible maximum values in the upper Measuring range of the photometer achieved with an optical density (OD) of 2500 mE; there is one good long-term stability and a linear dilution behavior in the entire range of 0 up to 2500 mE. Comparability both within a test and between several Other test approaches are guaranteed.  

MeßzeitMeasuring time

Das Pipettieren einer kompletten Mikrotiterplatte (96 wells) von Hand benötigt ca. 90 Sekunden mit einer Multipette. Beim letzten Pipettierschritt führt dies zu einer Differenzen bezüglich der Inkubationszeit des ABTS-Substrats zwischen dem ersten und letzten well von 15% (bei einer Farbentwicklungszeit von 10 Minuten). Um eine vertretbare Meßungenauigkeitsgrenze von 5% nicht zu überschreiten und die Gesamt-Testzeit niedrig zu halten, wird deshalb ABTS-Inkubati­ onszeit auf 30 Minuten festgelegt.Pipetting a complete microtiter plate (96 wells) by hand takes approx. 90 seconds with a multipette. In the last pipetting step, this leads to a difference in the Incubation time of the ABTS substrate between the first and last well of 15% (at a Color development time of 10 minutes). Around a reasonable measurement inaccuracy limit of 5% ABTS incubation is therefore not to be exceeded and to keep the total test time low on time set to 30 minutes.

VerdünnungenDilutions

Als höchster Standardwert wird die 1 : 24-Verdünnung des Standardmaterials mit Inkubationspuf­ fer (s. o.) verwendet, die nach 30 min die geforderten 2500 mE erreicht. Die weiteren Verdün­ nungsschritte (1 : 24, 1 : 32, 1 : 48, 1 : 64, 1 : 96, nur Inkubationspuffer) ergeben eine lineare Diluti­ onskurve, die einer Ursprungsgerade entspricht.The highest standard value is the 1:24 dilution of the standard material with incubation puff fer (see above), which reaches the required 2500 mE after 30 min. The further dilutions Steps (1:24, 1:32, 1:48, 1:64, 1:96, incubation buffer only) result in a linear dilution on curve that corresponds to a straight line of origin.

MeßeinheitUnit of measurement

Möglicherweise sind Nukleosomen unterschiedlich zugänglich für die Bindung von Antikörpern, abhängig von der Form, in der sie vorliegen: als Mono- oder Oligonukleosomen, letztere mit oder ohne Tertiärstruktur. Die Menge gebundener und POD- markierter Anti-DNA-Antikörper entspricht somit nicht unbedingt der exakten Nukleosomen-Konzentration im Probematerial.Nucleosomes may be accessible differently for the binding of antibodies, depending on the form in which they are present: as mono- or oligonucleosomes, the latter with or without a tertiary structure. The amount of bound and POD-labeled anti-DNA antibodies does not necessarily correspond to the exact nucleosome concentration in the sample material.

Deshalb wird von einer absoluten Konzentrationsangabe abgesehen und eine Skalierung mit sog. AUs (Arbitrary Units) eingeführt. 1000 AU werden dem höchsten Standardwert (2500 mE nach 30 min) gleichgesetzt; die Skalierung erfolgt linear, d. h. 500 AU sind etwa 1250 mE, 100 AU etwa 250 mE usw.Therefore, an absolute concentration is not specified and scaling with so-called AUs (arbitrary units) introduced. 1000 AU are the highest standard value (2500 mE after 30 min) equated; scaling is linear, i. H. 500 AU is about 1250 mE, 100 AU about 250 mE etc.

Damit wird der Unkenntnis über das Verhältnis von Mono- zu Oligonukleosomen und dem da­ durch bedingten, veränderten Verhalten der Antikörper Rechnung getragen, gleichzeitig jedoch die Vergleichbarkeit zwischen den Tests gesteigert. This is the ignorance of the relationship between mono- and oligonucleosomes and there accounted for by conditional, changed behavior of the antibodies, but at the same time comparability between tests increased.  

Beispiel 3Example 3 Präanalytische StandardisierungPreanalytical standardization Matrixmatrix

Bei den vorliegenden Untersuchungen wird als Matrix Serum verwandt. Hämolyse, verursacht durch unsachgemäße Blutentnahme (zu langes Stauen) oder durch nicht adäquate Lagerung der Blutprobe bzw. deren Transport ins Labor (Aussetzen von Wärme oder Schütteln, zu lange Ver­ zögerung des Transports) kann zu falsch positiven Testergebnissen führen. Die Zentrifugation erfolgt deshalb in einem Zeitraum von 1-2 Stunden nach Entnahme für 15 min. bei 3000 U/min.In the present investigations, serum is used as the matrix. Hemolysis due to improper blood collection (too long stowage) or inadequate storage of the Blood sample or its transport to the laboratory (exposure to heat or shaking, too long ver delay in transport) can lead to false positive test results. The centrifugation therefore takes place within a period of 1-2 hours after removal for 15 min. at 3000 rpm.

Stabilisierungstabilization

Durch Zugabe von 10 mM EDTA (pH 8) direkt nach dem Abseren werden CA2+- und MG2- ab­ hängige Endonukleasen, z. B. DNase I, und im Sauren tätige Endonukleasen, wie DNase II mit einem Aktivitäts-Optimum bei pH 4,5 inhibiert. Somit wird einer möglichen Abspaltung von Ansatzstellen der Anti-DNA-Antikörper und einer Abnahme der Meßwerte vorgebeugt.By adding 10 mM EDTA (pH 8) directly after the serum CA 2+ - and MG 2 - from dependent endonucleases, z. B. DNase I, and acidic endonucleases, such as DNase II with an optimum activity at pH 4.5 inhibited. This prevents possible splitting off of the anti-DNA antibodies and a decrease in the measured values.

  • - EDTA-Lösung: Herstellen einer Lösung mit 100 mM EDTA in TRIS-Puffer, Einstellen eines pH von 8,0- EDTA solution: Prepare a solution with 100 mM EDTA in TRIS buffer, adjust one pH of 8.0
  • - Serum-EDTA-Gemisch: 1/10 Volumenanteil 100 mM EDTA wird mit 9/10 Volumenanteilen Serum gemischt und mit Vortex homogenisiert.- Serum-EDTA mixture: 1/10 part by volume 100 mM EDTA is mixed with 9/10 parts by volume Mixed serum and homogenized with vortex.

Nach EDTA-Zugabe kann das Serum über mehrere Stunden bei 4°C bis zwischengelagert wer­ den.After adding EDTA, the serum can be stored at 4 ° C for several hours the.

Stabilitätstability

Je 200 µl des mit EDTA behandelten Serums werden in Greiner-Gefrierröhrchen (2 ml) gefüllt und bei -20°C eingefroren. Bei dieser Temperatur ist das Serum bis zu 6 Monaten haltbar. Für eventuelle Nachmessungen werden 3 Röhrchen desselben Serums, für Bestimmung anderer Pa­ rameter 2 unbehandelte Serumröhrchen bei -20°C eingefroren. 200 µl of the serum treated with EDTA are filled into Greiner freezer tubes (2 ml) and frozen at -20 ° C. At this temperature, the serum is stable for up to 6 months. For possible re-measurements are made of 3 tubes of the same serum, for determination of different Pa Freeze 2 untreated serum tubes at -20 ° C.  

TestvorbereitungTest preparation

Nach Auftauen ist auf Angleichen an die Zimmertemperatur und sorgsame Homogenisierung des Probenmaterials zu achten, wobei keine Unterschiede zwischen Zentrifugation und Verwendung eines Vortex bestehen.After thawing, adjust to room temperature and carefully homogenize the Ensure sample material with no difference between centrifugation and use of a vortex.

Die Serumproben werden 1 : 4 mit Inkubationspuffer verdünnt (20 µl Serum, 60 µl Inkubati­ onspuffer), gevortext und anschließend in den Test eingesetzt. Das restliche Serum wird verwor­ fen, da die Meßwerte bei mehrmaligem Einfrieren ansteigen können.The serum samples are diluted 1: 4 with incubation buffer (20 µl serum, 60 µl incubation onspuffer), vortexed and then used in the test. The rest of the serum is discarded fen, as the readings can increase with repeated freezing.

Verdünnungen mit Inkubationspuffer, die schon vor dem Einfrieren angesetzt werden, führen bei Standardmaterial wie auch bei Serum zu niedrigeren Meßergebnissen. Im Vergleich mit der Standardkurve läßt sich bei Verdünnungen des Serums eine parallele Dilutionsgerade beobach­ ten.Dilutions with incubation buffer, which are prepared before freezing, lead to Standard material as well as serum for lower measurement results. In comparison with the Standard curve, a parallel line of dilution can be observed when diluting the serum ten.

PatientenPatient

Bei unseren Untersuchungen kamen insgesamt Seren von 363 Probanden zur Auswertung. Da­ von waren 303 Seren von Patienten, die im Zeitraum vom August 1996 bis zum Dezember 1997 im Klinikum Großhadern in Behandlung waren, sowie 60 Gesunden.In our investigations, sera from 363 subjects were evaluated. There of were 303 sera from patients who were in the period from August 1996 to December 1997 were treated in the Großhadern hospital and 60 healthy people.

Gesunde PersonenHealthy people

60 Probanden wurden auf ihre klinische und klinisch-chemische Gesundheit überprüft. Das ge­ schah durch Erhebung einer Anamnese, eines Fragebogens sowie der Parameter CRP, Kreatinin, GGT, Transaminasen und des Blutbilds. Die Altersverteilung reichte von 20 bis 60 Jahre mit einem Mittelwert von . . ., es nahmen 32 Frauen (53%) und 28 Männer (47%) an der Studie teil.60 subjects were examined for their clinical and clinical-chemical health. The ge was done by taking a medical history, a questionnaire and the parameters CRP, creatinine, GGT, transaminases and blood count. The age distribution ranged from 20 to 60 years an average of. . ., 32 women (53%) and 28 men (47%) participated in the study.

Patienten mit entzündlichen ErkrankungenPatients with inflammatory diseases

50 der Patienten litten an akut entzündlichen Erkrankungen, die nach Wertlagen des C-reaktiven Proteins in fünf verschiedene Kategorien eingeteilt wurden (I: CRP<1 ng/mL, II: 1 ng/mL<CRP<5 ng/mL, III: 5 ng/mL<CRP<10 ng/mL, IV: 10 ng/mL<CRP<20 ng/mL, V: 20 ng/mL<CRP). 50 of the patients suffered from acute inflammatory diseases, which according to the values of the C-reactive Proteins were divided into five different categories (I: CRP <1 ng / mL, II: 1 ng / mL <CRP <5 ng / mL, III: 5 ng / mL <CRP <10 ng / mL, IV: 10 ng / mL <CRP <20 ng / mL, V: 20 ng / mL <CRP).  

Patienten mit soliden TumorenPatients with solid tumors

Wir untersuchten 253 Patienten mit soliden Tumoren; darunter fielen 69 Ovarialtumore, 53 Mammatumore, 53 Colon-Carcinome, 41 Bronchial-Carcinome und 37 andere gastrointestinale Carcinome. Blutproben wurden jeweils vor der operativen Primärtherapie oder vor Chemo- bzw. Radiotherapie entnommen, um die spontane Zelltodrate und somit Nukleosomen-Freisetzung zu erhalten.We examined 253 patients with solid tumors; 69 ovarian tumors, 53 Mammary tumors, 53 colon carcinomas, 41 bronchial carcinomas and 37 other gastrointestinal Carcinomas. Blood samples were taken before surgical primary therapy or before chemotherapy or Radiotherapy taken to increase the spontaneous cell death rate and thus nucleosome release receive.

VerlaufsbeobachtungFollow-up

Von diesen wurden zudem 15 Patienten unter sowohl primärer als auch sekundärer Radiotherapie (6 mit BC, 4 mit Lymphom, 4 mit HNO-CA, 1 mit Colon-CA) und 16 Patienten unter Che­ motherapie (6 mit Lymphomen, 6 mit Colon-CA, 2 mit Pankreas-CA, 2 mit Sarkomen) im Ver­ lauf beobachtet.Of these, 15 were also treated with both primary and secondary radiotherapy (6 with BC, 4 with lymphoma, 4 with ENT-CA, 1 with Colon-CA) and 16 patients under Che motherapy (6 with lymphoma, 6 with colon CA, 2 with pancreas CA, 2 with sarcoma) in the ver run observed.

Bei ersteren wurden Blutentnahmen vor Bestrahlung, 3, 6, 24 und 72 Stunden sowie eine Woche nach Beginn der Radiation und zudem vor Beginn der jeweils ersten wöchentlichen Bestrah­ lungseinheit vorgenommen. Da das Therapieschema der meisten Patienten eine tägliche Be­ strahlung vorsah, ist zu berücksichtigen, daß nach der 4. Messung eine erneute Therapieeinheit erfolgte.In the former, blood samples were taken before radiation, 3, 6, 24 and 72 hours and one week after the start of the radiation and also before the start of the first weekly radiation unit. Since most patients' regimen is a daily regimen radiation, it should be taken into account that after the 4th measurement a new therapy unit took place.

Den Patienten unter Chemotherapie wurde vor Therapie, ein Tag, 3 Tage und eine Woche nach der ersten Dosisgabe, außerdem wöchentlich oder vor Beginn der nächsten Therapieeinheit. Die Patienten waren aufgeklärt und stimmten der Einbeziehung in eine Studie zu.Patients on chemotherapy were given therapy one day, three days and one week after the first dose, also weekly or before the next therapy session begins. The Patients were informed and agreed to be included in a study.

Beispiel 5Example 5 Methodische ErgebnisseMethodological results Matrixmatrix

Wir testeten parallel Serum und Plasma derselben Probanden (n = 10), davon waren 4 Gesunde, 4 Tumorpatienten und 2 Patienten mit akut entzündlichen Erkrankungen. Wie von Steinmann, So­ rensen und Fournie für freie DNA beschrieben 30,25,26, fanden auch wir im Serum meist höhere Konzentrationen an Nukleosomen als im Plasma (n = 9). Bei einem Patienten mit extrem hohen CRP-Werten über 45 ng/ml waren die Meßergebnisse im Serum und Plasma gleichermaßen hoch.We tested the serum and plasma of the same subjects in parallel (n = 10), of whom 4 were healthy, 4 were tumor patients and 2 were patients with acute inflammatory diseases. As described by Steinmann, So rensen and Fournie for free DNA 30 , 25 , 26 , we found mostly higher concentrations of nucleosomes in serum than in plasma (n = 9). In a patient with extremely high CRP values above 45 ng / ml, the measurement results in serum and plasma were equally high.

Stabilitätstability

Diese Serum- und Plasma-Proben wurden mit und ohne Zusatz von 10 mM EDTA (pH 8) bei 25°C, 4°C, -20°C und -80°C über einen Zeitraum von 3 Wochen gelagert. Die beste Stabilität wurde bei Serum beobachtet, das unmittelbar nach Zentrifugation mit 10 mM EDTA (pH 8) ver­ setzt und bei einer Temperatur -20°C oder -80°C gelagert wurde.These serum and plasma samples were taken with and without the addition of 10 mM EDTA (pH 8) Store at 25 ° C, 4 ° C, -20 ° C and -80 ° C for a period of 3 weeks. The best stability was observed in serum which was ver. immediately after centrifugation with 10 mM EDTA (pH 8) sets and was stored at a temperature of -20 ° C or -80 ° C.

Weitere MatricesMore matrices

Auch im Urin eines gesunden Probanden wurden Nukleosomen detektiert. Bei einem Moleku­ largewicht von . . . eines Mononukleosoms und einer Nierengängigkeit bis zu einer Molekular­ größe von . . . ist das Auftreten von Nukleosomen im Urin durchaus physiologisch.Nucleosomes were also detected in the urine of a healthy subject. With a molecule lar weight of. . . of a mononucleosome and renal mobility up to a molecular size of . . . the appearance of nucleosomes in the urine is quite physiological.

TagesprofilDaily profile

Um eine zirkadiane Rhythmik auszuschließen, wurden bei einem gesunden Probanden mehrere Blutentnahmen in 2 stündlichem Abstand während eines Tages entnommen. Im Verlauf traten keine über den VK hinausgehenden Schwankungen (10%) der gemessenen Werte auf.To rule out a circadian rhythm, several were used in a healthy subject Blood samples taken every two hours during a day. During the course no fluctuations (10%) of the measured values beyond the VK.

PräanalytikPreanalytics Einfluß der HämolyseInfluence of hemolysis

Leichte Hämolyse wurde in einer Vollblutprobe durch kurzes Schütteln und Wärmeexposition (37°C) über 4 Stunden induziert. Nach Abseren wurde damit ein gesundes, apoptosearmes Serum titriert. Schon bei einer Zugabe von 1 µl Hämolysat/250 µl Serum war ein Anstieg des Meßsignals zu erkennen, das mit zunehmender Hämolysatmenge stetig zunahm.Slight hemolysis was demonstrated in a whole blood sample by brief shaking and heat exposure (37 ° C) over 4 hours. After Abseren became a healthy, low apoptosis serum titrated. Even with the addition of 1 µl hemolysate / 250 µl serum there was an increase in To recognize measurement signal that increased steadily with increasing amount of hemolysate.

Einfluß des ZentrifugierzeitpunktesInfluence of the time of centrifugation

Nach Blutentnahme wurden Vollblutproben unter verschiedenen Lagerungsbedingungen (37°C, 25°C, 4°C) für 0, 2, 4 und 6 Stunden vor der Zentrifugation aufbewahrt. Danach wurden sie mit EDTA (s. o.) versetzt oder unbehandelt eingefroren. Je größer der Zeitraum wurde, desto höhere Werte wurden im Serum gemessen. Verschiedene Temperaturen scheinen dagegen keinen Ein­ fluß zu haben.Whole blood samples were taken under different storage conditions (37 ° C, 25 ° C, 4 ° C) for 0, 2, 4 and 6 hours before centrifugation. After that they were with EDTA (see above) mixed or frozen untreated. The longer the period, the higher  Values were measured in the serum. Different temperatures, however, do not seem to be an on to have flow.

Einfluß des Zeitpunktes der EDTA-ZugabeInfluence of the time of EDTA addition

Nach Zentrifugation wurden Seren bei 37°C, 25°C und 4°C gelagert, ehe ihnen nach 0, 2, 4, 6 oder 8 Stunden 10 mM EDTA (pH 8) zugegeben wurde. Danach wurden sie unverzüglich bei - 20°C eingefroren.After centrifugation, sera were stored at 37 ° C, 25 ° C and 4 ° C, before 0, 2, 4, 6 or 10mM EDTA (pH 8) was added for 8 hours. After that, they were immediately - Frozen at 20 ° C.

Je später EDTA dem Serum zugesetzt wurde, desto niedrigere Signale wurden im Serum erhal­ ten. Während der Abfall in den ersten zwei Stunden zwischen 8 und 12% pro Stunde betrug, nahmen die Werte zwischen der 2. und 8. Stunde linear ab, pro Stunde um etwa 6%, so daß nach 8 Stunden nur noch die Hälfte des ursprünglichen Meßsignals detektiert werden konnte. Später flachte die Kurve ab. Ausnahmen waren sehr niedrige oder über dem Meßbereich liegende Werte, die konstant blieben. Die Temperatur hatte keinen wesentlichen Einfluß.The later EDTA was added to the serum, the lower signals were obtained in the serum While the drop in the first two hours was between 8 and 12% per hour, the values decreased linearly between the 2nd and 8th hour, by about 6% per hour, so that after 8 hours only half of the original measurement signal could be detected. Later flattened the curve. Exceptions were very low or above the measuring range Values that remained constant. The temperature had no significant influence.

Einfluß des EinfrierzeitpunktesInfluence of the time of freezing

Seren wurden nach Zentrifugation und sofortiger Zugabe von 10 mM EDTA bei 37°C, 25°C und 4°C für 0, 2, 4 und 6 Stunden aufbewahrt, ehe sie bei -20°C tiefgefroren wurden. Weder Zeit noch Temperatur nahmen Einfluß auf die erhaltenen Meßsignale.Sera were obtained after centrifugation and immediate addition of 10 mM EDTA at 37 ° C, 25 ° C and Store at 4 ° C for 0, 2, 4, and 6 hours before freezing at -20 ° C. Neither time temperature also had an influence on the measurement signals obtained.

Langzeitstabilität des ProbenmaterialsLong-term stability of the sample material

Die Langzeitstabilität wurde bei drei bei -20°C eingefrorenen Seren mit niedriger (x = 50 AU), mittelhohen (x = 300 AU) und hohen (x = 500 AU) Testresultaten nach 1, 2, 3, 4 und 6 Monaten überprüft. Bei allen drei Seren wurden stabile Meßsignale erhalten mit einem VK von 4,2%-9,2%.Long-term stability was lower with three sera frozen at -20 ° C (x = 50 AU), medium-high (x = 300 AU) and high (x = 500 AU) test results after 1, 2, 3, 4 and 6 months checked. With all three sera stable measurement signals were obtained with a CV of 4.2% -9.2%.

Qualitätskriterien des TestsQuality criteria of the test ImpräzisionImprecision

Zur Beurteilung der Meßungenauigkeit wurden die Variationskoeffizienten zweier Serenpools ermittelt. Abhängig von den Werten der optischen Dichte (OD) bewegte sich der Intra-Assay-VK (n = 10) zwischen 3,0 (x = 327 RU, 882 mE) und 4,1% (x = 235 RU, 473 mE), wobei höhere ODs mit einer niedrigeren Impräzision einher gingen.The variation coefficients of two sera pools were used to assess the measurement inaccuracy determined. The intra-assay CV moved depending on the values of the optical density (OD)  (n = 10) between 3.0 (x = 327 RU, 882 mE) and 4.1% (x = 235 RU, 473 mE), with higher ODs was accompanied by a lower precision.

Analytische SpezifitätAnalytical specificity

Können auch Nukleosome, freie DNA, Histone, Anti-Histon- oder Anti-DNA-Antikörper allein oder zusammen störende Veränderungen der OD hervorrufen? Dieser Frage wurde durch ein Titrationsexperiment nachgegangen, bei dem nicht-biotinylierte Anti-Histon-Antikörpern in un­ terschiedlichen Konzentrationen dem Standard-Immunoreagens mit biotinylierten Anti-Histon-Anti­ körpern zugegeben wurde. Das mit zunehmender Konzentration schnell abnehmende Signal, wies auf einen kompetetiven Verdrängungswettkampf der mit und ohne Biotin versehenen Anti-Histon-Antikörper hin, die asymptomatische Annäherung an die LDD auf die Abwesenheit wei­ terer Störgrößen. Ein Meßsignal ist also an die Komplexbildung von biotinylierten Anti-Histon-Anti­ körpern, Nukleosomen und Peroxidase-markierten DNA-Antikörper gebunden.Can also nucleosomes, free DNA, histones, anti-histone or anti-DNA antibodies alone or together cause disruptive changes in OD? This question was answered by a Titration experiment followed, in which non-biotinylated anti-histone antibodies in un different concentrations of the standard immunoreagent with biotinylated anti-histone anti body was added. The rapidly decreasing signal with increasing concentration, pointed to a competitive displacement competition of those with and without biotin Anti-histone antibodies that asymptomatically approach the LDD to the absence more disturbances. A measurement signal is therefore due to the complex formation of biotinylated anti-histone anti bodies, nucleosomes and peroxidase-labeled DNA antibodies bound.

Lowest Detection DosisLowest detection dose

Die niedrigste zu detektierende Konzentration wurde aus dem Mittelwert (n = 20)+3x Stan­ dardabweichung des Blank bei 16 RU/38 mE errechnet.The lowest concentration to be detected was determined from the mean (n = 20) + 3x Stan The standard deviation of the blank is calculated at 16 RU / 38 mE.

TestmodifikationenTest modifications Anreicherungsfaktor und StandardkurveEnrichment factor and standard curve

Eine Vergleichbarkeit der Test war anhand des empfohlenen Anreicherungsfaktors (AF) nicht möglich, da die Interassay-Impräzision bei sehr niedrigen ODs in der Größenordnung des als Basiswert verwendeten Blanks erwartungsgemäß höher liegt und Werte bis zu 46,0% erreichte. Bei einer gemessenen OD von 1000 mE, erhält man z. B. bei einem Basiswert A von 20 einen AF von 50, bei einem Basiswert B von 30 einen AF von 33, was in Test A einer OD von 660 ent­ spräche. Eine bessere Test-Vergleichbarkeit und eine direktere Methode der Quantifizierung konnte durch die oben beschriebene Etablierung einer Standardkurve erreicht werden. Damit wurde eine Interassay-Impräzision von weniger als 10% erzielt. The test was not comparable based on the recommended enrichment factor (AF) possible because the interassay precision at very low ODs is of the order of magnitude As expected, the basic value of the blank used was higher and reached values of up to 46.0%. With a measured OD of 1000 mE, one obtains e.g. B. with a base value A of 20 an AF of 50, with a base value B of 30 an AF of 33, which corresponds to an OD of 660 in test A. talk. Better test comparability and a more direct method of quantification could be achieved by establishing a standard curve as described above. In order to an interassay accuracy of less than 10% was achieved.  

MeßzeitMeasuring time

Durch die Festlegung der Inkubationszeit mit ABTS auf 30 min wurde sowohl der Intraassay-VK als auch der Interassay-VK verbessert. Hing ersterer v.a. von den zeitlichen Verzögerungen beim Pipettieren ab, ist letzteres wohl auf den Ausgleich von leichten Materialfehlern zurückzuführen, die nach längerer Inkubationszeit weniger ins Gewicht fallen.By setting the incubation time with ABTS to 30 min, both the intra-assay VK as well as the Interassay-VK improved. Hung the former above all of the time delays in Pipetting off, the latter is probably due to the compensation of slight material defects, which are less significant after a longer incubation period.

MeßeinheitUnit of measurement

Auch die Einführung der neuen Meßeinheit AU (Arbitrary Units) steigerte die Testvergleichbar­ keit: Während die Intraassay-Impräzision (n = 10) konstant war: 3,3%/3,0% (x = 882 mE/327 AU) und 4,0%/4,1% (x = 480 mE/181 AU), verbesserte sich die Inter-Assay-Impräzision (n = 14) von 15,3% auf 8,6% (x = 1007 mE/455 AU) und von 17,0% auf 13,5% (x = 473 mE/235 RU).The introduction of the new measuring unit AU (arbitrary units) also increased the test comparably speed: While the intraassay precision (n = 10) was constant: 3.3% / 3.0% (x = 882 mE / 327 AU) and 4.0% / 4.1% (x = 480 mE / 181 AU), the inter-assay precision (n = 14) improved 15.3% to 8.6% (x = 1007 ME / 455 AU) and from 17.0% to 13.5% (x = 473 ME / 235 RU).

Beispiel 6Example 6 Klinische ErgebnisseClinical outcomes WerteverteilungDistribution of values Gesunde ProbandenHealthy subjects

Die Werteverteilung zeigte bei allen klinisch und klinisch-chemisch gesunden Probanden nied­ rige ODs unter 100 RU (ca. 250 mE). Dabei konnten keine Unterschiede bezüglich des Alters, Geschlechts, Lebensgewohnheiten (z. B. Rauchen, Alkohol) der Probanden festgestellt werden. (vgl. 31)The distribution of values showed low ODs below 100 RU (approx. 250 mE) in all clinically and clinically and chemically healthy subjects. No differences regarding the age, gender, lifestyle (e.g. smoking, alcohol) of the test persons could be determined. (see 31 )

Patienten mit soliden TumorenPatients with solid tumors

Bei Patienten mit verschiedensten soliden Tumoren ist, unabhängig von der Lokalisation, eine große Bandbreite an Werten vorzufinden. Das entspricht vorangegangenen Studien, die bei soli­ den Tumoren unterschiedliche Apoptose-Raten beschrieben bzw. unterschiedliche Konzentra­ tionen von freier DNA im Plasma und Serum fanden 27,31-35.A wide range of values can be found in patients with various solid tumors, regardless of their location. This corresponds to previous studies, which described different apoptosis rates or found different concentrations of free DNA in plasma and serum in solid tumors 27,31-35 .

Es folgen noch nach Messung der restlichen Seren:
After the remaining sera have been measured:

  • - Absolute Zahlen- Absolute numbers
  • - Signifikanz- significance
Patienten mit entzündlichen ErkrankungenPatients with inflammatory diseases

Bei Patienten mit akuten entzündlichen Erkrankungen sahen wir in allen nach dem CRP-Wert eingeteilten Gruppen ein breites Spektrum an Wertlagen. Dennoch ist eine Tendenz zu höheren Nukleosomen-Konzentrationen im Serum bei höheren CRP-Werten zu sehen.In patients with acute inflammatory diseases, we all looked for the CRP value divided groups a wide range of values. Nevertheless, there is a tendency towards higher Nucleosome concentrations in the serum can be seen at higher CRP values.

  • - Signifikanz fehlt noch- Significance is still missing
VerlaufsbeobachtungFollow-up

Patienten mit entzündlichen Erkrankungen: Im Verlauf ist eine Korrelation mit dem CRP und klinischen Befunden (objektivierbar z. B. durch Sonographie) zu beobachten.Patients with inflammatory diseases: In the course is a correlation with the CRP and clinical findings (objectifiable e.g. by sonography).

Beispiel: Die Patientin S.F. entwickelte aufgrund eines sich entzündenden Pigtail-Kathe­ ters eine Cholangitis bei Cholestase. Nach Katheterrevision und antibiotischer Behand­ lung wurde parallel ein Absinken des CRP, ein Rückgang der Entzündungszeichen sowie der Serum-Nukleosomen-Konzentration beobachtet.Example: The patient S.F. developed due to an igniting pigtail cathe cholangitis in cholestasis. After catheter revision and antibiotic treatment In parallel, a decrease in CRP, a decrease in signs of inflammation as well the serum nucleosome concentration was observed.

Patienten unter Chemotherapie: Der Verlauf unter Chemotherapie ist nur individuell und mit Kenntnis der klinischen Hintergründe beurteilbar. Charakteristisch für die meisten der beobach­ teten Patienten ist ein steiler Anstieg der Nukleosomen-Konzentration im Serum mit je nach Me­ dikament unterschiedlicher Latenz (24-48 Stunden) nach Beginn der Therapie. Im weiteren Verlauf sinken die Werte oft wieder ab. Infektionen oder andere Nebenwirkungen können eine zeitweilige Erhöhung der Nukleosomen-Konzentration hervorrufen und die Beurteilung des Verlaufs erschweren (vgl. auch Fournie 27).Patients under chemotherapy: The course under chemotherapy can only be assessed individually and with knowledge of the clinical background. Characteristic for most of the observed patients is a steep increase in the nucleosome concentration in the serum with different latency depending on the drug (24-48 hours) after the start of therapy. In the further course the values often decrease again. Infections or other side effects can cause a temporary increase in the nucleosome concentration and make it difficult to assess the course (see also Fournie 27 ).

Beispiel: Bei Patient H.P., der wegen eines metastasierten Pankreaskarzinoms behandelt wurde, stieg nach Beginn eines Zyklus' mit 5-Fluoruracil/Folinsäure die Nukleo­ somen-Konzentration im Serum steil an und fiel danach langsam ab. Wegen klinisch progre­ dienter Verschlechterung wurde ein neues Therapieschema mit Gemcitabine angesetzt. Auch hier zeigte sich zunächst ein Peak, die Erkrankung schritt jedoch fort, wie auch am stetigen Anstieg des CEA zu ersehen ist. Example: In patient H.P., who is treated for metastatic pancreatic cancer the nucleo increased after the start of a cycle with 5-fluorouracil / folinic acid some concentration in the serum rose steeply and then slowly decreased. Because of clinical progre In view of the deterioration, a new therapy regimen with gemcitabine was set up. Here, too, there was initially a peak, but the disease progressed, as on steady rise in the CEA can be seen.  

Patienten unter Radiotherapie: Durch massive Apoptose-Induktion tritt zu Beginn der Radiothe­ rapie zumeist eine rapide Erhöhung der Serum-Nukleosomen-Konzentration auf. Die Latenzzeit ist kürzer als bei Chemotherapie. Außerdem fällt bei einigen Patienten nach 3 oder 6 Stunden ein zwischenzeitlicher Abfall der Nukleosomen-Konzentration im Serum auf, ehe sie danach rasch ansteigt. Im Verlauf ist, manchmal nach anhaltend hohen Werten, bei vielen ein Abfall zu beob­ achten, der mit nachgewiesener Tumorregression verbunden ist.Patients under radiotherapy: Through massive apoptosis induction occurs at the beginning of the radiothe therapy usually a rapid increase in the serum nucleosome concentration. The latency is shorter than with chemotherapy. In addition, some patients think after 3 or 6 hours intermittent drop in the nucleosome concentration in the serum before it rapidly afterwards increases. Over the course of time, sometimes after persistently high values, a drop is observed in many attention that is associated with proven tumor regression.

Beispiel: Bei E.K., einem Patienten mit einem metastasierten Bronchial-Carcinom, kam es zu Beginn der Bestrahlungstherapie schon am ersten Tag nach einem Abfall zu einem deutlichen und schnellen Anstieg der Serum-Nukleosomen-Konzentration. Erst nach einigen Wochen gingen die Werte zurück, zeitgleich mit einer ratiologisch nachgewie­ senen Regression des Tumors. Aufgrund eines Perikadergusses stieg die Nukleo­ somen-Konzentration am 40. Tag leicht an, um dann nochmals abzufallen. Mit Auftreten von multiplen Metastasen (wie gesichert) und eines malignen Pleuragusses (zyto, hist + ?) wurden wieder höhere Nukleosomen-Konzentrationen im Serum gemessen. Der Tumor­ marker CYFRA 21-1 zeigt einen dazu korrelierenden Verlauf.Example: In E.K., a patient with a metastatic bronchial carcinoma, came at the beginning of radiation therapy, the first day after a drop, one significant and rapid increase in serum nucleosome concentration. Only after The values decreased in a few weeks, at the same time as a ratiologically verified regression of the tumor. The nucleo increased due to a pericade cast somen concentration slightly on the 40th day, only to drop again. With occurrence of multiple metastases (as secured) and malignant pleural effusion (zyto, hist +?) higher nucleosome concentrations in the serum were again measured. The tumor marker CYFRA 21-1 shows a correlating course.

Testtest

Intra- und Inter-Assay-Impräzision lagen jeweils unter 10% (3,0%-4,1%) bzw. unter 15% (8,6%-13,5%) und erfüllten die Kriterien eines Hand-Assays ???. Um eine Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Testansätzen untereinander zu ermöglichen wurde auf den empfohlenen Anrei­ cherungsfaktor verzichtet und eine Standardkurve mit einer neuen Meßeinheit eingeführt sowie die Meßzeit standardisiert. Die analytische Spezifität konnte durch einen Titrationsversuch ge­ zeigt werden.Intra- and inter-assay imprecision were respectively below 10% (3.0% -4.1%) and below 15% (8.6% -13.5%) and met the criteria of a hand assay ?? ? . In order to enable comparability between different test approaches, the recommended enrichment factor was dispensed with, a standard curve with a new measuring unit was introduced and the measuring time was standardized. The analytical specificity could be demonstrated by a titration test.

Matrixmatrix

Nukleosomen waren in verschiedenen Medien (Plasma, Serum, Urin) nachweisbar. Wie schon in anderen Studien für freie DNA 25,26,30 erhielten auch wir für Nukleosomen stärkere Signale im Serum als im Plasma. Dafür können mehrere mögliche Gründe herangezogen werden:
Nucleosomes were detectable in different media (plasma, serum, urine). As in other studies for free DNA 25,26,30 , we also received stronger signals for nucleosomes in serum than in plasma. There are several possible reasons for this:

  • 1. Durch den Vorgang der Genehmigung könnte im Serum vor der Zentrifugation a) zusätzlich Apoptose induziert (Streßsituation für eigentlich alle Blutzellen), b) vermehrt DNA freige­ setzt werden 25.1. The approval process could also a) induce apoptosis in the serum prior to centrifugation (stress situation for all blood cells), b) more DNA could be released 25 .
  • 2. Die dem Plasma ohnehin zugesetzten Chelatoren könnten die Ca2+- und Mg2+-abhängige Endonuklease in ihrer Aktivität inhibieren, die Aufspaltung in Oligo- bzw. Mononucleotide sowie die Freilegung von DNA für die Bindung der Antikörper behindern.2. The chelators added to the plasma in any case could inhibit the activity of the Ca 2+ and Mg 2+ -dependent endonuclease, hinder the splitting into oligo- or mononucleotides and the exposure of DNA for the binding of the antibodies.
  • 3. Plasmaproteine könnten mit den Nukleosomen wechselwirken und ihr Vorhandensein mas­ kieren.3. Plasma proteins could interact with the nucleosomes and their presence mas kieren.

Für die Verwendung von Serum als Matrix sprachen die sehr gute Stabilität nach Zugabe von 10 mM EDTA (pH 8) und die deutlichen Meßsignale bei einem guten Diskriminationsvermögen zwischen gesunden, apoptosearmen und apoptosereichen Seren bei Erkrankungen unterschiedli­ cher Genese.The very good stability after the addition of 10 spoke in favor of the use of serum as a matrix mM EDTA (pH 8) and the clear measurement signals with good discrimination ability difference between healthy, low-apoptosis and high-apoptosis sera in diseases genesis.

Sämtliche Tumormarker werden im klinischen Alltag außerdem auf Serumbasis gemessen. Im Hinblick auf eine mögliche, zukünftige, routinemäßige Anwendung und Automatisierung des Tests schien es angebracht, die Untersuchungen deshalb mit Serum durchzuführen.All tumor markers are also measured on a serum basis in everyday clinical practice. in the With regard to a possible, future, routine application and automation of the It seemed appropriate to carry out the tests with serum.

PräanalytikPreanalytics

Die Behandlung des Serums wurde von der Blutentnahme, Lagerung und Transport, Zentrifuga­ tion, Zugabe von EDTA, Langzeitlagerung, bis zur Testdurchführung standardisiert. Mögliche Störeinflüsse (Hämolyse durch Schütteln oder Wärmeexposition) wurden untersucht. Somit wurden die Grundlagen für ein valide Testanwendung gelegt.Treatment of the serum was from blood collection, storage and transportation, centrifuga tion, addition of EDTA, long-term storage, standardized until the test is carried out. Possible Interferences (hemolysis by shaking or heat exposure) were examined. Consequently the foundations for a valid test application were laid.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bestimmung von apoptotischen Produkten in von Tumorpatienten entnom­ menen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der apoptotischen Produkte in Serumproben mit der Effektivität der Tumortherapie korreliert wird und somit der Ver­ laufskontrolle der Therapie dient.1. A method for determining apoptotic products in samples taken from tumor patients, characterized in that the concentration of the apoptotic products in serum samples is correlated with the effectiveness of the tumor therapy and thus serves to monitor the course of the therapy. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Serumproben zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und bestimmt werden.2. The method according to claim 1, characterized in that serum samples at different Times can be taken and determined. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Nukleosomen in Serumproben von Tumorpatienten bestimmt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the concentration of Nucleosomes in serum samples from tumor patients is determined. 4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) das Serum eines Tumorpatienten mit einem Anti-Histon-Antikörper und einem Anti-DNA-Antikörper inkubiert, wobei einer der Antikörper vor oder nach dieser Inkubation an eine feste Phase gebunden wird und der andere Antikörper ein markierter Antikörper ist,
  • b) feste und flüssige Phase trennt und
  • c) die Markierung in einer der beiden Phasen bestimmt, um die Konzentration der Nu­ kleosomen in Serumproben von Tumorpatienten zu ermitteln.
4. The method according to claim 3, characterized in that one
  • a) the serum of a tumor patient is incubated with an anti-histone antibody and an anti-DNA antibody, one of the antibodies being bound to a solid phase before or after this incubation and the other antibody being a labeled antibody,
  • b) separates solid and liquid phase and
  • c) the marker is determined in one of the two phases in order to determine the concentration of the nucleosomes in serum samples from tumor patients.
5. Verwendung eines Verfahrens zur Bestimmung apoptotischer Produkte in Serumproben von Tumorpatienten zur Bestimmung der Effektivität der Tumortherapie.5. Using a method for the determination of apoptotic products in serum samples from Tumor patients to determine the effectiveness of tumor therapy.
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