DE19811114C2

DE19811114C2 - Process for the defined production of multicellular spheroidal aggregates of living blood vessel wall cells

Info

Publication number: DE19811114C2
Application number: DE1998111114
Authority: DE
Inventors: Hellmut Augustin; Thomas Korff
Original assignee: Individual
Current assignee: AUGUSTIN, HELLMUT, DR. DR., 79108 FREIBURG, DE
Priority date: 1998-03-14
Filing date: 1998-03-14
Publication date: 2003-08-21
Anticipated expiration: 2018-03-15
Also published as: DE19811114A1

Description

State of the art

Das vaskuläre Endothel kleidet sämtliche Gefäße des Körpers als einzellige Zellschicht aus. Damit bilden Endothelzellen einerseits die strukturelle Grundlage und innere Wandaus kleidung der Blutgefäße, andererseits verfügen sie über vielfältige funktionelle und metabolische Eigenschaften, zu denen die Kontrolle des Vasotonus, die Regelung des Verkehrs zirkulierender Blutzellen, die Regelung der Blutgerinnung und das Wachstum neuer Blutgefäße gehört. Damit nehmen Endothelzellen im Wechselspiel mit den unter ihnen liegenden glatten Muskelzellen eine zentrale Rolle bei der Regelung kardiovaskulärer Funktionen ein.The vascular endothelium lines all of the body's vessels as a single-cell layer. Endothelial cells thus form the structural basis and inner wall on the one hand clothing of the blood vessels, on the other hand they have diverse functional and metabolic properties, including control of vasotonus, regulation of the Circulating blood cells, regulating blood clotting and the growth of new ones Heard blood vessels. Thus endothelial cells interact with those of them lying smooth muscle cells play a central role in regulating cardiovascular Functions.

Endothelzellen können enzymatisch aus ihrem Gewebeverband isoliert und in vitro unter Zellkulturbedingungen gezüchtet werden. Üblicherweise werden die Zellen dabei auf be handeltem Zellkulturplastik in speziellen Medien ausgesät. Die Zellen adhärieren am Plastik und bilden einen einschichtigen Zellrasen, der morphologische Ähnlichkeit mit der inneren Wandauskleidung von Gefäßen in vivo hat, aber eine ganze Reihe differenzierter Zell funktionen (wie z. B. die Expression des Differenzierungsantigens CD34) verloren hat.Endothelial cells can be enzymatically isolated from their tissue structure and in vitro under Cell culture conditions are grown. The cells are usually placed on be acted cell culture plastic sown in special media. The cells adhere to the plastic and form a single-layered cell lawn that morphologically resembles the inner one Wall lining of vessels in vivo has a whole range of differentiated cells functions (such as the expression of the differentiation antigen CD34) has lost.

In Suspension können Endothelzellen wie andere adhäsive Zellen auch in Abhängigkeit vom Zelltyp nur etwa 4 h bis 24 h in Kultur überleben (e. g., Re et al.: Inhibition of anchorage- dependent cell spreading triggers apoptosis in cultured human endothelial cells. J. Cell Biol. 127: 537-546, 1994). Zur Suspensionszellkultivierung adhäsiv wachsender Zellen wurden verschiedene dreidimensional wachsende Sphäroidmodelle entwickelt, bei denen Zellen entweder spontan multizelluläre Aggregate bilden (e. g., Sutherland: Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science 240: 177-184, 1988) oder auf der Oberfläche artifizieller Substrate (z. B. Cytodex beads, US Patent 4335215: Method of growing anchorage-dependent cells) oder unter Zuhilfenahme vernetzender Substanzen (z. B. Glukosaminoglykane [US-Patent 5624839: Method for culturing hepatocytes for formation of spheroids]) kultiviert werden.In suspension, endothelial cells like other adhesive cells can also become dependent of cell type only survive in culture for about 4 to 24 hours (e. g., Re et al .: Inhibition of anchorage- dependent cell spreading triggers apoptosis in cultured human endothelial cells. J. Cell Biol. 127: 537-546, 1994). Adhesively growing cells were used for the cultivation of suspension cells developed various three-dimensional spheroid models in which cells either spontaneously form multicellular aggregates (e. g., Sutherland: Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science 240: 177-184, 1988) or on the surface of artificial substrates (e.g. Cytodex beads, US Patent 4335215: Method of growing anchorage-dependent cells) or with the help of cross-linking Substances (e.g. glucosaminoglycans [US Patent 5624839: Method for culturing hepatocytes for formation of spheroids]) can be cultivated.

Die spontane Bildung multizellulärer Sphäroide ohne künstliche Substrate wurde vor allen Dingen auf neoplastisch veränderte Zellen angewandt (Übersicht bei: Müller-Klieser: Three- dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273: C1109-C1123, 1997). Tumorzellsphäroide zeichnen sich dadurch aus, daß sie sich spontan bilden und in Suspension stabil sind. Diese Sphäroide haben jedoch keine Differenzierungseigenschaften und bilden ein nekrotisches Zentrum und einen äußeren Ring lebender Zellen. Nur wenigen Wissenschaftlern ist es gelungen, lebende Sphäroide nichttransformierter Zellen zu erstellen. Eine Reihe von Wissenschaftlern haben Sphäroide von Hepatozyten im Hinblick auf die Entwicklung von extrakorporalen Ersatzlebern untersucht (Naruse et al.: Comparisons of porcine hepatocyte spheroids and single hepatocytes in the non-woven fabric bioartificial liver module. Int. J. Artif. Organs 19: 605-609, 1996). Die US Patente 5496722 (Method for producing non-neoplastic, three dimensional, mammalian tissue and cell aggregates under microgravity culture conditions and the products produced therefrom) und 5155034 (Three-dimensional cell to tissue assembly process) beschreiben Verfahren zur Produktion von Sphäroiden nichttransformierter Zellen, die jedoch den aufwendigen Einsatz von Bioreaktoren und Experimente unter Mikrogravitationsbedingungen erfordern. Spezische Zellkulturbedingungen, die den apoptotischen Zelltod nichttrans formierter Zellen in Sphäroiden verhindern, sind in diesen Arbeiten nicht beschrieben, weshalb davon auszugehen ist, daß unter diesen Bedingungen generierte Zellsphäroide entweder nicht stabil sind oder ein nekrotisches Zentrum haben.Above all, the spontaneous formation of multicellular spheroids without artificial substrates was Things applied to neoplastic cells (overview from: Müller-Klieser: Three- dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. At the. J. Physiol. 273: C1109-C1123, 1997). Tumor cell spheroids are characterized by the fact that they are Form spontaneously and are stable in suspension. However, these spheroids have none Differentiation properties and form a necrotic center and an outer ring living cells. Few scientists have succeeded in living spheroids to create non-transformed cells. A number of scientists have spheroids of hepatocytes with a view to developing extracorporeal replacement liver (Naruse et al .: Comparisons of porcine hepatocyte spheroids and single hepatocytes in the non-woven fabric bioartificial liver module. Int. J. Artif. Organs 19: 605-609, 1996). The US Patents 5496722 (Method for producing non-neoplastic, three dimensional, mammalian tissue and cell aggregates under microgravity culture conditions and the products produced therefrom) and 5155034 (Three-dimensional cell to tissue assembly process) Process for the production of spheroids of untransformed cells, but the complex use of bioreactors and experiments under microgravity conditions require. Specific cell culture conditions that do not cause apoptotic cell death prevent formed cells in spheroids are not described in this work, which is why it can be assumed that cell spheroids generated under these conditions are either not stable or have a necrotic center.

Die Erstellung multizellulärer Sphäroide erfolgt in der Regel durch Kultivierung der Zellen auf nichtadhäsiven Substraten (z. B. Agar). Die zufälligen Zellkontakte, die durch Schütteln des Zellkulturgefäßes provoziert werden können, ermöglichen die Aggregation von Zellen und die Bildung von Sphäroiden. Unter diesen Bedingungen produzierte Zellsphäroide sind (a) ausgesprochen heterogen in ihrer Größe und ihrer Beschaffenheit, da die zur Aggregation führenden Zellkontakte randomisiert erfolgen, (b) mechanischem Stress ausgesetzt und (c) üblicherweise von einer erheblichen Menge verunreinigender Einzelzellen und untergehenden toten Zellen kontaminiert, die sich nicht an der Sphäroidbildung beteiligt haben.Multicellular spheroids are usually created by culturing the cells on non-adhesive substrates (e.g. agar). The random cell contacts caused by shaking of the cell culture vessel can be provoked, enable the aggregation of cells and the formation of spheroids. Cell spheroids produced under these conditions are (a) extremely heterogeneous in size and nature, because of the aggregation leading cell contacts are randomized, (b) exposed to mechanical stress and (c) usually from a significant amount of contaminating single cells and sinking contaminated dead cells that did not participate in spheroid formation.

problem

Die bestehenden Verfahren zur Herstellung multizellulärer Sphäroide haben folgende Nachteile: Sie wurden zur Produktion dreidimensionaler Tumorzellsphäroide entwickelt und sind nach dem derzeitigen Kenntnisstand nicht geeignet zur Herstellung stabiler dreidimensionaler Sphäroide von Endothelzellen. Zwar haben Pepper et al. (Pepper et al.: Chondrocytes inhibit endothelial sprout formation in vitro: evidence for involvement of a transforming growth factor-beta. J. Cell. Physiol. 146: 170-179) und Lichtenbeld et al. (Lichtenbeld et al.: Tumor spheroid-induced vesicle formation on endothelial cells is associated with procoagulant properties. J. Cell Sci. 106: 657-662, 1993) initiale Experimente zur Bildung endothelialer Sphäroide durchgeführt, doch wurden in diesen Experimenten Zellen lediglich über wenige Stunden in Sphäroiden kultiviert und dann in Kollagengele eingebettet. Die in diesen Arbeiten beschrieben Endothelzellaggregate sind per se nicht stabil und haben wie oben beschrieben überdies den Nachteil, daß es sich um randomisierte Sphäroide mit nicht definierten Eigenschaften (Größe, Differenzierungszustand) handelt. Allen etablierten Verfahren zur Produktion von Sphäroiden ist gemein, daß die Bildung von Zellaggregaten randomisiert erfolgt und die Größe der entstehenden Sphäroide daher nicht kontrolliert werden kann. Schließlich ist ein erheblicher Nachteil der derzeitigen Techniken, daß sie sich fast ausschließlich auf neoplastisch transformierte Zellen anwenden lassen, da für das Überleben von nichttransformierten Zellen in Sphäroiden erforderliche Wachstums faktoren nicht charakterisiert sind. The existing processes for producing multicellular spheroids have the following Disadvantages: They were developed for the production of three-dimensional tumor cell spheroids are, according to the current state of knowledge, not suitable for producing more stable three-dimensional spheroids of endothelial cells. Although Pepper et al. (Pepper et al .: Chondrocytes inhibit endothelial sprout formation in vitro: evidence for involvement of a transforming growth factor-beta. J. Cell. Physiol. 146: 170-179) and Lichtenbeld et al. (Lichtenbeld et al .: Tumor spheroid-induced vesicle formation on endothelial cells is associated with procoagulant properties. J. Cell Sci. 106: 657-662, 1993) initial experiments to form endothelial spheroids, but in these experiments Cells only cultured in spheroids for a few hours and then in collagen gels embedded. The endothelial cell aggregates described in this work are not stable per se and, as described above, also have the disadvantage that they are randomized Spheroids with undefined properties (size, differentiation state). all established process for the production of spheroids is common that the formation of Cell aggregates are randomized and therefore the size of the spheroids formed is not can be controlled. Finally, a major disadvantage of current techniques, that they can be applied almost exclusively to neoplastic transformed cells because growth required for the survival of untransformed cells in spheroids factors are not characterized.

Der im Patentanspruch angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein Verfahren zur definierten Herstellung stabiler dreidimensionaler, multizellulärer Sphäroide von Gefäßwandzellen (Endothelzellen) zu entwickeln.The invention specified in the claim is based on the problem of a method for the defined production of stable three-dimensional, multicellular spheroids from To develop vascular wall cells (endothelial cells).

solution

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Patentanspruch dadurch gelöst, daß einer definierten Zahl isolierter Gefäßwandzellen (Endothelzellen) dadurch die Aggregation zu multizellulären Sphäroiden ermöglicht wird, daß sie als einzelne suspendierte Zellen in Gegenwart von geeignetem Zellkulturmedium unter Zusatz einer viskoelastischen Substanz und geeigneter Wachstumsfaktoren in geeignete Zellkulturgefäße gegeben werden. Unter diesen Bedingungen aggregieren die Zellen innerhalb von 10 h zu annähernd runden Sphäroiden, die je nach Verwendungszweck unter fortdauernder Zugabe von Wachstumsfaktoren zur Differenzierung gebracht und über mindestens 6 Wochen kultiviert werden können.This object is achieved in accordance with the invention by isolating a defined number Vascular wall cells (endothelial cells) thereby aggregate into multicellular spheroids is enabled to act as single suspended cells in the presence of appropriate Cell culture medium with the addition of a viscoelastic substance and more suitable Growth factors are placed in suitable cell culture vessels. Under these Conditions aggregate the cells into approximately round spheroids within 10 h depending on the intended use with continuous addition of growth factors for Differentiation can be brought and cultivated for at least 6 weeks.

Zur Produktion größendefinierter Sphäroide von Endothelzellen wird eine definierte Zahl suspendierter Einzelzellen (z. B. zwischen 500 und 3000 Zellen) in geeignetem Zellkultur medium in die Vertiefung eines geeigneten Zellkulturgefäßes (z. B. nichtadhäsive 96- Napfplatte mit rundem Boden oder eine ähnliche Platte mit rundem Boden) gegeben. Die Zugabe einer viskoelastisch-wirkenden Substanz (z. B. 0,3% Methylzellulose) reduziert die Sedimentationsgeschwindigkeit und beseitigt die bestehende Restadhäsivität des Plastiks. Die Zellen sind in geeignetem Zellkulturmedium suspendiert (z. B. Dulbecco's MEM unter Zusatz von 10% fötalem Kälberserum). Die zu Boden sinkenden Zellen konzentrieren sich in der Vertiefung des Napfes und organisieren sich spontan zu multizellulären Sphäroiden. An dieser Organisation sind nahezu 100% der eingesetzten Zellen beteiligt. In multiplen Näpfen produzierte Endothelzellsphäroide haben somit weitgehend identische physische und biologische Eigenschaften.A defined number is used to produce size-defined spheroids of endothelial cells suspended single cells (e.g. between 500 and 3000 cells) in a suitable cell culture medium into the well of a suitable cell culture vessel (e.g. non-adhesive 96- Plate with round bottom or a similar plate with round bottom). The Adding a viscoelastic substance (e.g. 0.3% methyl cellulose) reduces the Sedimentation speed and eliminates the existing residual adhesive of the plastic. The cells are suspended in a suitable cell culture medium (e.g. Dulbecco's MEM under Addition of 10% fetal calf serum). The sinking cells are concentrated in the deepening of the bowl and spontaneously organize themselves into multicellular spheroids. On this organization is involved in almost 100% of the cells used. In multiple bowls Endothelial cell spheroids produced thus have largely identical physical and biological properties.

Unter diesen Bedingungen produzierte Endothelzellsphäroide bilden zunächst undifferen zierte Zellaggregate, in denen es bereits innerhalb der ersten 24 h nach Bildung vor allen Dingen im Inneren der Sphäroide zu manifestem Tod von Zellen durch Einsetzen apop totischen Zelltodes kommt. Dieses unerwünschte Phänomen kann durch den Zusatz geeigneter, als Überlebensfaktoren (Survivalfaktoren) undifferenzierter Endothelzellen wirkender Wachstumsfaktoren weitestgehend verhindert werden. Im Rahmen der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde ermittelt, daß sich zu diesem Zweck vor allen Dingen Moleküle aus der Familie der VEGF-Wachstumsfaktoren (z. B. 100 ng/ml VEGF) und der Familie der FGF-Wachstumsfaktoren (z. B. 30 ng/ml bFGF) und insbesondere eine Kombination dieser beiden Faktoren eignet.Endothelial cell spheroids produced under these conditions initially form undifferentiated graced cell aggregates, in which there were already all within the first 24 h after formation Things inside the spheroids lead to manifest death of cells by inserting apop total cell death is coming. This undesirable phenomenon can be caused by the addition suitable, undifferentiated endothelial cells as survival factors acting growth factors are largely prevented. As part of development The present invention has been found to be primarily for this purpose Molecules from the family of VEGF growth factors (e.g. 100 ng / ml VEGF) and Family of FGF growth factors (e.g. 30 ng / ml bFGF) and especially one Combination of these two factors is suitable.

Advantages of the invention

Mit dem in dieser Erfindung vorgestellten Verfahren ist es möglich, beliebige Mengen endothelialer Sphäroide mit spezifischen Eigenschaften (Größe, Differenzierungszustand) zu generieren. Das Verfahren gestattet die rasche Produktion größendefinierter Endothelzell sphäroide ohne über Standardzellkulturanforderungen hinausgehende größere technische Aufwendungen (z. B. Bioreaktoren). Es werden keine zusätzlichen künstlichen Matrices oder Substrate zur Bildung eingesetzt (z. B. Microcarrier und andere Polymere), wodurch sich die produzierten Sphäroide sehr gut zum Transfer in den menschlichen Körper eignen. Der beschriebene Einsatz der Überlebensfaktoren VEGF und bFGF stabilisiert die Sphäroide, indem es den apoptotischen Zelltod undifferenzierter, nicht elongierter zentral gelegener Zellen verhindert. Darüber hinaus fördert die beschriebene Kultivierung von Endothelzellen in stabilen Sphäroiden unter Zusatz des genannten Überlebensfaktors VEGF deren Differenzierung, was sich beispielsweise in einer Induktion der Expression von CD34 in den oberflächlich lokalisierten Endothelzellen der Sphäroide artikuliert. CD34 ist ein Differen zierungsantigen von Endothelzellen, dessen Expression bei zweidimensionaler In-vitro- Kultivierung auf Zellkulturplastik rasch herunterreguliert wird und dann auch nicht wieder durch Wachstumsfaktorstimulation induziert werden kann.With the method presented in this invention, it is possible to add any amount endothelial spheroids with specific properties (size, differentiation state) to generate. The process allows the rapid production of size-defined endothelial cells spheroids without larger technical requirements that go beyond standard cell culture requirements Expenses (e.g. bioreactors). There are no additional artificial matrices or Substrates used for the formation (e.g. microcarrier and other polymers), whereby the produced spheroids are very suitable for transfer into the human body. The described use of the survival factors VEGF and bFGF stabilizes the spheroids, by reducing the apoptotic cell death of undifferentiated, non-elongated, centrally located Cells prevented. In addition, the described cultivation of endothelial cells in stable spheroids with the addition of the survival factor VEGF mentioned Differentiation, which is, for example, an induction of the expression of CD34 in the articulated superficially localized endothelial cells of the spheroids. CD34 is a difference ornamental antigen of endothelial cells, the expression of which in two-dimensional in vitro Cultivation on cell culture plastic is quickly down-regulated and then not again can be induced by growth factor stimulation.

Das Verfahren ist erfinderisch, da es (1) ein von dem für Tumorzellen und einzelnen nichttransformierten Zellen etablierten Stand der Technik abweichendes Verfahren zur Herstellung von Sphäroiden beschreibt, (2) das ermittelte Verhalten von Endothelzellen in Sphäroiden im Hinblick auf ihr Überleben und ihre Differenzierung im Vergleich zu Sphäroiden anderer Zellpopulationen überraschend ist und nicht zu erwarten war, (3) die ermittelten Wachstumsfaktorzusätze die entstehenden Sphäroide stabilisieren, und (4) erstmalig ein Verfahren zur größendefinierten Herstellung von Sphäroiden entwickelt wurde.The method is inventive because it is (1) one of those for tumor cells and individuals Non-transformed cells have established a different method for the prior art Production of spheroids describes (2) the behavior of endothelial cells in Spheroids in terms of survival and differentiation compared to spheroids other cell populations is surprising and was not to be expected (3) Growth factor additives stabilize the resulting spheroids, and (4) for the first time Process for the size-defined production of spheroids was developed.

Aus den spezifischen Eigenschaften und geschilderten Vorzügen der beschriebenen endothelialen Sphäroide ergibt sich auch die Nutzanwendung der Erfindung und der daraus resultierende gewerbliche Nutzen: Mit dem beschriebenen Verfahren produzierte Sphäroide von Blutgefäßwandzellen können zum auto- oder heterologen Transfer dieser Zellen in den menschlichen Körper verwendet werden. Dies ist vor allen Dingen im Hinblick auf blutgefäß regenerative Prozesse (z. B. kardiale Ischämie nach Infarkt, Stimulation der Angiogenese) und zur Reintegration genetisch veränderter Endothelzellen in den menschlichen Körper von Bedeutung. Schließlich kann der Produktionsprozeß der Sphäroidherstellung dahingehend modifiziert werden, andere für den In-vivo-Transfer gewünschte Substanzen oder Zellen in die sich bildenden Endothelzellsphäroide zu inkorporieren, wodurch deren Nutzanwendung noch erweitert wird.From the specific properties and described advantages of the described endothelial spheroids also results in the useful application of the invention and the use thereof resulting commercial benefits: spheroids produced with the described process of blood vessel wall cells can be used for the auto- or heterologous transfer of these cells into the human body can be used. This is especially with regard to blood vessels regenerative processes (e.g. cardiac ischemia after infarction, stimulation of angiogenesis) and for the reintegration of genetically modified endothelial cells into the human body of Importance. Finally, the spheroid manufacturing process can do this modified, other substances or cells desired for in vivo transfer into the Incorporate endothelial cell spheroids, thereby making their use even more difficult is expanded.

Claims

Process for the defined production of multicellular, three-dimensional aggregates (spheroids) of living blood vessel wall cells (endothelial cells), characterized in that

a) endothelial cells or endothelial progenitor cells isolated from the tissue, the circulation or the bone marrow are cultivated in vitro under defined conditions,
b) the production of size-defined endothelial spheroids is carried out by sowing a defined number of individual, suspended endothelial cells in non-adhesive round-bottom cell culture vessels,
c) aggregate endothelial cells under these conditions and organize themselves differentially,
d) the production of endothelial spheroids with the addition of an inert viscoelastic substance for the cells methyl cellulose and
e) as a cell differentiation and survival-controlling substance, a member of the family of VEGF or FGF growth factors is added.