DE19802569A1 - New fragment of the lethal toxin from Clostridium bacterium, useful for treating cancer - Google Patents
New fragment of the lethal toxin from Clostridium bacterium, useful for treating cancerInfo
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Abstract
Description
Bei den verschiedensten Therapieansätzen werden unterschiedliche Toxine eingesetzt. Bei den Toxinen handelt es sich um Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen oder Pflanzen, die eine Giftwirkung auf den Organismus von Säugetieren und insbesondere des Menschen haben. Von bestimmten lebenden Bakterien werden die sogenannten Exotoxine, wie beispielsweise Cholera-, Diphtherie-, Tetanus-, Botulinus- oder Gasbrandtoxin abgesondert.With the most diverse therapeutic approaches different toxins used. The toxins are are metabolites of microorganisms or plants, which have a toxic effect on the organism of mammals and especially of humans. Of certain living Bacteria become the so-called exotoxins, such as Cholera, diphtheria, tetanus, botulinus or gas burn toxin secreted.
Die für die Therapie einsetzbaren Exotoxine wirken innerhalb der Zelle. Üblicherweise binden die Toxine zunächst an Rezeptoren an der Zelloberfläche, werden dann durch Endozytose aufgenommen und durchqueren eine intrazelluläre Membran, um das Zytosol in der Zelle zu erreichen. Im Zytosol rufen die Toxine dann die zytotoxischen Effekte hervor. Häufig stören die Toxine in dem Zytosol essentielle Stoffwechselwege. Die Störung tritt häufig bei der Proteinsynthese auf. Wenn Stoffwechselwege betroffen sind, die in jeder Zelle ablaufen, muß gewährleistet sein, daß bei der therapeutischen Anwendung das Toxin möglichst nur in die gewünschte Zielzelle gelangt, da anderenfalls die unerwünschten Nebenreaktionen überhand nehmen würden. The exotoxins that can be used for therapy work within the cell. The toxins usually bind first Receptors on the cell surface are then affected by endocytosis recorded and traversed an intracellular membrane to the Reach cytosol in the cell. The toxins call in the cytosol then the cytotoxic effects. The toxins often interfere essential metabolic pathways in the cytosol. The disturbance occurs often in protein synthesis. If metabolic pathways affected that occur in every cell must be guaranteed be that in the therapeutic application the toxin if possible only reaches the desired target cell, otherwise the undesirable side reactions would prevail.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fragment eines bakteriellen Exotoxins, nämlich des sogenannten lethalen Toxins (LT), das von Clostridium sordellii gebildet wird. Das lethale Toxin von Clostridium sordellii gehört zu der Familie der großen Clostridienzytotoxine, die morphologische Veränderungen in Zellinien hervorrufen. Diese gehen einher mit einer Zerstörung des Aktinzytoskeletts.The present invention relates to a fragment of a bacterial exotoxin, namely the so-called lethal toxin (LT), which is formed by Clostridium sordellii. The lethal Clostridium sordellii toxin belongs to the family of the large clostridial cytotoxins, the morphological changes in cell lines. These go hand in hand with one Destruction of the actin cytoskeleton.
Das lethale Toxin ist eine Glucosyltransferase, die UDP-Glucose als Co-Substrat zur Modifikation von GTPasen mit niedrigem Molekulargewicht verwendet. LT modifiziert selektiv Rac und Rap sowie Ras. Ras ist der Prototyp einer Unterfamilie der Superfamilie der GTPasen mit niedrigem Molekulargewicht. LT modifiziert und inaktiviert Ras durch Glycosylierung eines essentiellen Threoninrestes (35). Durch die Glycosylierung wird Ras inaktiviert, was zu einer Inhibierung des EGF (Epidermal Growth Factor) stimulierten MAP-Kinaseweges führt.The lethal toxin is a glucosyltransferase, UDP-glucose as a co-substrate for the modification of low-GTPases Molecular weight used. LT selectively modifies rac and rap and Ras. Ras is the prototype of a subfamily of the Super family of low molecular weight GTPases. LT modifies and inactivates Ras by glycosylation of a essential threonine residue (35). Through the glycosylation Ras inactivates, which inhibits EGF (epidermal Growth Factor) stimulates MAP kinase pathway.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein biologisch aktives Fragment des lethalen Toxins von Clostridium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID-Nr. 1 oder eine hierzu homologe Sequenz aufweist, wobei die Homologie zu der Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID- Nr. 1 wenigstens 80% beträgt.The present invention therefore relates to a biological active fragment of the lethal toxin from Clostridium, the characterized in that it follows the amino acid sequence Sequence ID no. 1 or has a sequence homologous to it, where the homology to the amino acid sequence according to sequence ID No. 1 is at least 80%.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das biologisch aktive Fragment des lethalen Toxins die Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID-Nr. 1 auf. In a particularly preferred embodiment, this biologically active fragment of lethal toxin Amino acid sequence according to sequence ID no. 1 on.
Darüber hinaus kann das biologisch aktive Fragment noch am N- und/oder C-Terminus weitere Sequenzen aufweisen. Bevorzugt ist jedoch, wenn das Fragment keine weiteren Sequenzen aufweist, die von Clostridium-DNA abgeleitet sind.In addition, the biologically active fragment can still be on the N and / or C-terminus have further sequences. Is preferred however, if the fragment has no further sequences, derived from Clostridium DNA.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Abwandlungen und Variationen des bevorzugt eingesetzten Fragments des lethalen Toxins. Die beanspruchten Fragmente weisen eine Homologie zu der in Seq.-ID-Nr. 1 angegebenen Aminosäuresequenz von wenigstens 80% auf. Eine Homologie von 80% bedeutet, daß jeweils 80% der Aminosäuren an der jeweiligen Position der angegebenen Sequenz entsprechen, wohingegen 20% der Aminosäuren unterschiedlich sein können. Die essentiellen Bereiche des Proteinfragments müssen dabei unverändert bleiben, jedoch ist es möglich, daß Aminosäuren in den nicht biologisch aktiven Bereichen ausgetauscht werden können, wobei bevorzugt die Aminosäuren durch ähnliche Aminosäuren ausgetauscht werden. Die Ähnlichkeit wird bedingt durch die Seitenketten, insbesondere durch die Polarität und die Ladung der Seitenketten.The present invention also relates to modifications and variations of the preferred fragment of the lethal toxin. The claimed fragments have one Homology to that in SEQ ID NO. 1 given amino acid sequence from at least 80%. A homology of 80% means that 80% each of the amino acids at the respective position of the given sequence, whereas 20% of the Amino acids can be different. The essential Areas of the protein fragment must remain unchanged, however, it is possible that amino acids in the non-biological active areas can be exchanged, with preference the amino acids are replaced by similar amino acids. The similarity is due to the side chains, especially by the polarity and the charge of the Side chains.
Die erfindungsgemäßen Fragmente können bevorzugterweise in Immuntoxinen Verwendung finden. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher Immuntoxine, die erfindungsgemäß ein biologisch aktives Fragment und eine Zellbindungskomponente aufweisen.The fragments according to the invention can preferably be in Find immunotoxins use. In another aspect The present invention therefore relates to immunotoxins which according to the invention a biologically active fragment and a Have cell binding component.
Die Zellbindungskomponente kann ein Antikörper oder ein Teil davon (variable Regionen) sein, der spezifisch an eine Zielzelle bindet. Alternativ hierzu kann die Zellbindungskomponente ein Ligand sein, der spezifisch an einen Rezeptor der Zielzelle binden kann.The cell binding component can be an antibody or a part of these (variable regions) that are specific to one Target cell binds. Alternatively, the Cell binding component to be a ligand that is specific to one Receptor of the target cell can bind.
Bei den Zielzellen handelt es sich bevorzugt um Tumorzellen.The target cells are preferably tumor cells.
Als weiteren Bereich können die erfindungsgemäßen Immuntoxine ein Transportsystem oder einen Translokationsbereich aufweisen, der es ermöglicht, daß das Toxin in das Zytosol der Zelle eingebracht wird. Erfindungsgemäß wird besonders das Transportsystem des Pseudomonas Exotoxin A oder des Diphtherietoxins bevorzugt eingesetzt. In einer anderen bevorzugt eingesetzten Ausführungsform wird das Transportsystem des C2-Toxin bevorzugt eingesetzt, das in der deutschen Patentanmeldung 197 35 105.0 näher beschrieben ist. Das C2- Transportsystem beinhaltet die N-terminale C2I-Domäne des C2- Toxins von C.botulinum als Interaktionsdomäne. The immunotoxins according to the invention can be used as a further area have a transport system or a translocation area, which allows the toxin to enter the cytosol of the cell is introduced. According to the invention this is particularly so Transport system of the Pseudomonas Exotoxin A or the Diphtheria toxin is preferably used. In another preferred embodiment is the transport system preferred of the C2 toxin used in the German Patent application 197 35 105.0 is described in more detail. The C2 Transport system contains the N-terminal C2I domain of the C2 C. botulinum toxins as an interaction domain.
Die vorliegende Erfindung betrifft also die Verwendung eines erfindungsgemäßen Fragments als Toxin, das zur Abtötung spezifischer Zellen eingesetzt werden kann.The present invention thus relates to the use of a Fragment according to the invention as a toxin that is used to kill specific cells can be used.
Die erfindungsgemäßen Immuntoxine weisen also in bevorzugter Ausführungsform wenigstens drei Bereiche auf. Der erste Bereich ist der Zellbindungsbereich. Mit Hilfe des Zellbindungsbereiches dockt das Immunotoxin an die Zielzelle an. Bei den natürlich vorkommenden Immuntoxinen bindet dieser Bereich üblicherweise an einen Rezeptor der Zielzelle. Beim Pseudomonas Exotoxin A bindet dieser Bereich beispielsweise an den α2-Makroglubolinrezeptor. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei der Zellbindungskomponente um einen Antikörper oder ein Antikörperfragment handeln, das an eine bestimmte Struktur an der Zelloberfläche bindet. Es ist nicht erforderlich, daß der gesamte Antikörper beim Immuntoxin vorhanden ist. Ausreichend können beispielsweise die Fv- Fragmente sein, die die variablen Regionen aus den Fab- Fragmenten eines Antikörpers darstellen.The immunotoxins according to the invention therefore have more preference Embodiment at least three areas. The first area is the cell binding area. With the help of Cell binding area docks the immunotoxin to the target cell on. This binds to the naturally occurring immunotoxins Area usually to a receptor of the target cell. At the Pseudomonas Exotoxin A binds to this area, for example the α2 macrogluboline receptor. As part of the present Invention can be in the cell binding component Antibody or an antibody fragment acting on a certain structure binds to the cell surface. It is not required that the entire antibody in the immunotoxin is available. For example, the Fv Be fragments that contain the variable regions from the Fab Represent fragments of an antibody.
Alternativ hierzu kann die Zellbindungskomponente ein Ligand sein, der an einen Rezeptor auf der Zelle bindet. Liganden können beispielsweise Zytokine wie Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktor usw. sein, die an die hierfür spezifischen Rezeptoren binden. Da üblicherweise eine möglichst hohe Zellspezifität für die Immuntoxine gewünscht wird, werden erfindungsgemäß bevorzugt solche Liganden eingesetzt, die an Rezeptoren binden, die sich nur oder zumindest überwiegend auf den Zielzellen finden.Alternatively, the cell binding component can be a ligand that binds to a receptor on the cell. Ligands For example, cytokines such as interferons, interleukins, Tumor necrosis factor, etc., which are specific to this Bind receptors. As usually as high as possible Cell specificity for which immunotoxins are desired preferably used such ligands according to the invention which are Bind receptors that are only or at least predominantly find the target cells.
Das erfindungsgemäße Fragment des lethalen Toxins kann besonders vorteilhaft bei Tumoren verwendet werden, da das Toxinfragment zelleigene Enzyme inaktiviert, die bei der Krebsbildung außer Kontrolle geraten sind. Die Ras-Gene gehören zu den Onkogenen und werden besonders stark in Tumorzellen exprimiert. Wenn also die aufgrund des Tumors übermäßig stark exprimierten Ras-Genprodukte wieder inaktiviert werden können, ermöglicht diese eine effektive Tumortherapie.The lethal toxin fragment of the invention can can be used particularly advantageously in tumors because the Toxin fragment inactivates cell-specific enzymes, which in the Cancer has gotten out of control. The Ras genes belong to the oncogenes and become particularly strong in tumor cells expressed. So if the tumor is excessively strong expressed Ras gene products can be inactivated again, this enables effective tumor therapy.
Gegenüber dem unveränderten lethalen Toxin weisen die erfindungsgemäßen Fragmente den Vorteil auf, daß sie kleiner sind. Kleinere Proteine können aber von den Zielzellen leichter aufgenommen werden und die toxische Wirkung kann sich daher besser im Zytosol der Zielzelle entfalten.Compared to the unchanged lethal toxin, the Fragments according to the invention have the advantage that they are smaller are. However, smaller proteins are easier for the target cells to get can be ingested and the toxic effects may increase develop better in the cytosol of the target cell.
Bei der Therapie mit Immuntoxinen hat sich die Bildung von Antikörpern gegen das Toxin als Problem herausgestellt. Da erfindungsgemäß nur ein Fragment des Holotoxins eingesetzt wird, ist die Gefahr der Bildung von (neutralisierenden) Antikörpern verringert.With therapy with immunotoxins, the formation of Antibodies to the toxin were identified as a problem. There According to the invention, only a fragment of the holotoxin is used is the danger of the formation of (neutralizing) Antibodies decreased.
Überraschenderweise wurde auch herausgefunden, daß die erfindungsgemäßen Toxinfragmente eine höhere Aktivität aufweisen als das unveränderte Holotoxin.Surprisingly, it was also found that the toxin fragments according to the invention have a higher activity exhibit as the unchanged holotoxin.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend beschriebenen Beispiele näher erläutert.The present invention is illustrated by the following described examples explained in more detail.
Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion wurden zwei Fragmente des lethalen Toxins von C.sordellii, Stamm 6018 amplifiziert. Einmal wurde das erfindungsgemäße Fragment mit den Aminosäuren 1 bis 546. Weiterhin wurde als Vergleich das Fragment mit den Aminosäuren 1 bis 517 durch Verkürzung des erstgenannten Fragments hergestellt.With the help of the polymerase chain reaction, two fragments of lethal toxin from C.sordellii, strain 6018. Once the fragment according to the invention with the amino acids 1 to 546. Furthermore, the fragment was compared with the Amino acids 1 to 517 by shortening the former Fragments made.
Die Amplifikation der Fragmente wurde mit Hilfe des PCR-Systems
2400 von Perkin Elmer gemäß den Vorschriften des Herstellers
durchgeführt, wobei das Primerpaar CS1C/CS1N eingesetzt wurde.
Die Primer hatten folgende Sequenzen:
The fragments were amplified using the Perkin Elmer 2400 PCR system according to the manufacturer's instructions, using the primer pair CS1C / CS1N. The primers had the following sequences:
Die Reaktion wurde mit 300 nmol Primern, 250 ng chromosomaler DNA in einem Gesamtvolumen von 100 µl in 30 Zyklen durchgeführt (Denaturierung, 94°C, 10 Sek.; Annealing, 48°C, 30 Sek.; Verlängerung, 68°C, 3 Min.). Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mit den Restriktionsenzymen BglII/BamHI verdaut und in den Expressionsvektor pGEX2T kloniert.The reaction was chromosomal with 300 nmol primers, 250 ng DNA in a total volume of 100 ul performed in 30 cycles (Denaturation, 94 ° C, 10 seconds; Annealing, 48 ° C, 30 seconds; Extension, 68 ° C, 3 min.). The amplified DNA fragments were digested with the restriction enzymes BglII / BamHI and in cloned the expression vector pGEX2T.
Für die C-terminale Deletionsvariante 1-517 wurde zusätzlich mit den Restriktionsenzymen SpeI/EcoRI verdaut. Die verkürzten Fragmente wurden mit DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment aufgefüllt und religiert.For the C-terminal deletion variant 1-517, additional digested with the restriction enzymes SpeI / EcoRI. The shortened Fragments were made using DNA polymerase I, Klenow fragment replenished and religated.
Nach Sequenzierung wurde die DNA-Sequenz des Fragmentes 1-546 bestimmt. Dabei wurde folgende DNA-Sequenz ermittelt: After sequencing, the DNA sequence of fragment 1-546 certainly. The following DNA sequence was determined:
Es wurde die Glucosyltransferase-Aktivität des Holoenzyms verglichen mit der des erfindungsgemäßen Fragments (AS 1-546) und mit der des am C-Terminus deletierten Fragments mit den Aminosäuren 1-517. It showed the glucosyltransferase activity of the holoenzyme compared to that of the fragment according to the invention (AS 1-546) and with that of the fragment deleted at the C-terminus with the Amino acids 1-517.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 1 dargestellt. Hierzu wurde jeweils 1 µg Ras mit dem Holoenzym (schwarz ausgefülltes Dreieck [▲]), gereinigtem N-terminalen Toxinfragment mit den Aminosäuren 1-546, dargestellt als schwarz ausgefülltes Quadrat [∎], und Deletionsfragment mit den Aminosäuren 1-517 (schwarz ausgefüllte Kreise [⚫]) inkubiert. Eingesetzt wurden jeweils 1 nM des Toxins. Die Inkubation erfolgte in Gegenwart von UDP-[14C]-Glucose (10 µM) für die angegebene Zeit. Dann wurden die markierten Proteine mit SDS PAGE und Phosphorbilddarstellung analysiert. Fig. 1 zeigt, daß das erfindungsgemäße Fragment eine höhere Aktivität aufweist als das Holotoxin. Die Aktivität ist bei dem weiterdeletierten Fragment (1-517) nahezu vollständig verlorengegangen. The results of this experiment are shown in Fig. 1. For this purpose, 1 µg Ras with the holoenzyme (black filled triangle [▲]), purified N-terminal toxin fragment with amino acids 1-546, shown as a black filled square [∎], and deletion fragment with amino acids 1-517 (black filled Circles [⚫]) incubated. 1 nM of the toxin was used in each case. The incubation was carried out in the presence of UDP- [ 14 C] glucose (10 μM) for the stated time. The labeled proteins were then analyzed using SDS PAGE and phosphor imaging. Fig. 1 shows that fragment of the invention has a higher activity than the holotoxin. The activity is almost completely lost in the further deletated fragment (1-517).
Claims (11)
- a) ein Fragment gemäß einem der Ansprüche 1-3 und
- b) eine Zellbindungskomponente
aufweist.
- a) a fragment according to any one of claims 1-3 and
- b) a cell binding component
having.
- c) ein Transportsystem
aufweist.
- c) a transport system
having.
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|---|---|---|---|
| DE19802569A DE19802569A1 (en) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | New fragment of the lethal toxin from Clostridium bacterium, useful for treating cancer |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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| DE19802569A1 true DE19802569A1 (en) | 1999-09-09 |
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Family Applications (1)
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| DE19802569A Ceased DE19802569A1 (en) | 1998-01-23 | 1998-01-23 | New fragment of the lethal toxin from Clostridium bacterium, useful for treating cancer |
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| DE (1) | DE19802569A1 (en) |
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1998
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