DE19757950A1 - Screening of all possible oligonucleotides in a library - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft neuartige Oligonukleotide, ihre Herstellung und ihre Verwendung. Wesentlicher Bestandteil der Erfindung ist ein neuartiges Screening-System zur Isolierung von Oligonukleotiden aus Bibliotheken. Anwendungsgebiete sind die pharmazeutische Industrie und die Medizin.The invention relates to novel oligonucleotides, their Manufacture and its use. Essential part of the Invention is a novel screening system for isolation of oligonucleotides from libraries. Areas of application are the pharmaceutical industry and medicine.
Die Arzneimittelforschung befindet sich gegenwärtig in einer Umbruchphase, in der rasch fortschreitende Erkenntnisse im Bereich der molekularen Genetik/Zellbiologie genutzt werden, um neuartige Wege bei der chemischen Synthese neuer pharmazeutisch aktiver Verbindungen zu beschreiten. Die Kosten zur Schaffung einer neuen chemischen Verbindung auf der Basis des "klassischen" Ansatzes, d. h. durch Variation bekannter pharmakologischer Leitstrukturen, betragen ca. $ 7,500.-. Dieser Ansatz des zwar systematischen, jedoch nur teilweise rationalen "Drug Designs" wird zunehmend ersetzt durch Synthese der nach dem Zufallsprinzip synthetisierten Stoffe in "kombinatorischen" Bibliotheken. Dieser Ansatz stellt eine intellektuelle Inversion der synthetischen Chemie der vergangenen 70 Jahre dar und resultiert aus Bemühungen der Pharmaindustrie zur Produktion neuer Wirkstoffe mit hoher Kosteneffizienz. Das Konzept dabei ist der Ersatz kostenintensiver individualisierter Synthesen einzelner Verbindungen durch kombinatorische Synthese zur Erniedrigung von Personaleinsatz und Kosten.Drug research is currently in one Transition phase, in which rapidly progressing knowledge in Field of molecular genetics / cell biology used to novel ways in chemical synthesis of new pharmaceutical active connections. The cost of creation a new chemical compound based on the "classic" approach, i. H. by variation of known ones pharmacological lead structures are approximately $ 7,500. This approach of the systematic, but only partially rational "drug designs" are increasingly being replaced by synthesis of the substances synthesized at random in "combinatorial" libraries. This approach represents one intellectual inversion of the synthetic chemistry of the past 70 years and results from efforts of Pharmaceutical industry for the production of new active ingredients with high Cost efficiency. The concept here is the replacement costly individualized syntheses of individuals Combinatorial synthesis compounds for degradation of human resources and costs.
Neue Methoden zur Generierung nahezu unbeschränkter molekularer Vielfalt durch kombinatorische Synthese chemischer Verbindungen ermöglichen die Erstellung von Bibliotheken mit ca. 106-1012 unterschiedlichen Molekülen, die aus den 4 Bausteinen (U, C, G und A bestehen, die in unterschiedlichen Sequenzen zusammengefügt sind. Die Synthese erfolgt nach dem Zufallsprinzip und hat deutliche Parallelen mit der Evolution in der Natur bei der Herausbildung optimal effektiver Strukturen aus wenigen Bausteinen in Form biologisch aktiver Moleküle, wie Nukleinsäuren, Proteine und Kohlenhydrate.New methods for generating almost unlimited molecular diversity through combinatorial synthesis of chemical compounds enable the creation of libraries with approx. 10 6 -10 12 different molecules, which consist of the 4 building blocks (U, C, G and A, which are assembled in different sequences The synthesis takes place at random and has clear parallels with evolution in nature in the formation of optimally effective structures from a few building blocks in the form of biologically active molecules such as nucleic acids, proteins and carbohydrates.
Der zentrale Aspekt bei der Entwicklung pharmazeutisch wirksamer Moleküle ist, daß nach deren Synthese in kombinatorischen Bibliotheken die gewünschten effektiven Wirkstoff-Kandidaten aus dem komplexen Gemisch identifiziert und die Sequenz der Bausteine ermittelt werden muß, um diese in großen Mengen gezielt zu synthetisieren, um pharmakologische Prüfungen durchzuführen. Daher erfordert die Synthese eines neuen pharmazeutischen Wirkstoffs zunächst das Screening sehr hoher Zahlen unterschiedlicher Moleküle in Bibliotheken.The central aspect in pharmaceutical development effective molecules is that after their synthesis in combinatorial libraries the desired effective ones Drug candidates identified from the complex mixture and the sequence of the building blocks must be determined in order to specifically synthesize large amounts to pharmacological Carry out tests. Therefore, the synthesis requires one new screening agent high numbers of different molecules in libraries.
Seit einigen Jahren wird insbesondere der Klasse der Oligonukleotide große Chancen eingeräumt, sich zu einer neuen Generation von "sanften", d. h. hochspezifischen und weitgehend nebenwirkungsfreien Therapeutika zu entwickeln. Dazu sind zunächst innovative Ansätze für die Durchführung kombinatorischer Synthesen erforderlich, für die Selektion gewünschter Oligos in hochempfindlichen molekularbiologischen Testsystemen (Primär-Sreening) und für die dazu erforderlichen Systeme zur Datenverarbeitung, und für biologische Prüfsysteme im Versuchstier (Sekundär-Screening).For some years now, the class of Oligonucleotides gave great chances to find a new one Generation of "gentle", d. H. highly specific and largely to develop side effects-free therapeutic agents. To do this initially innovative approaches to implementation combinatorial syntheses required for selection desired oligos in highly sensitive molecular biological Test systems (primary screening) and for the necessary Systems for data processing and for biological test systems in the test animal (secondary screening).
Bisher war die Verfügbarkeit empfindlicher und spezifischer biologischer Testsysteme zur Selektion geeigneter pharmazeutischer Wirkstoffe limitiert.So far, availability has been more sensitive and specific biological test systems for the selection of suitable ones active pharmaceutical ingredients limited.
Neuerdings erlauben jedoch zunehmende Kenntnisse der molekularen Ursachen von zahlreichen humanen Krankheiten die Erstellung von Prüfsystemen für das primäre Screening komplexer Oligo-Bibliotheken in vitro. In Kombination mit der transgenen Technologie ist es möglich, Modelle für bisher unbehandelte menschliche Krankheiten mit hoher Fidelität in der Maus zu rekonstruieren, in denen die im Primer-Sreening identifizierten Wirkstoff-Kandidaten im Tierversuch auf ihr therapeutisches Spektrum überprüft werden können. Diesem Ansatz liegt die Erkenntnis zugrunde, daß in vielen Fällen eine Krankheit (a) durch ein zelluläres oder virales Protein Verursacht wird, das am falschen Ort zur falschen Zeit in falscher Konzentration produziert wird, oder (b) durch ein abnormes Protein verursacht wird, dessen modifizierte Struktur (die Sequenz der Aminosäure-Bausteine) auf eine Mutation im kodierenden Gen im Erbmaterial zurückgeführt werden kann (z. B. Krebsgene = Onkogene).Recently, however, increasing knowledge of molecular causes of numerous human diseases Creation of test systems for primary screening complex Oligo libraries in vitro. In combination with the transgenic Technology makes it possible to create models for previously untreated human diseases with high fidelity in the mouse too reconstruct in which the primer screening identified drug candidates in animal experiments on it therapeutic spectrum can be checked. This approach is based on the knowledge that in many cases a Disease (a) from a cellular or viral protein Is caused in the wrong place at the wrong time in wrong concentration is produced, or (b) by a abnormal protein is caused, its modified structure (the sequence of the amino acid building blocks) for a mutation in coding gene can be traced in the genetic material (e.g. Cancer genes = oncogenes).
Es darf angenommen werden, daß aufgrund der großen strukturellen Vielfalt es innerhalb der Bibliothek Mitglieder gibt, die hochaffin an ein gegebenes Zielprotein binden und damit auch seine biologische Funktion inhibieren. Entsprechende Ergebnisse wurden in den letzten Jahren publiziert und sind in Fachkreisen bekannt. Die bislang verfolgten Strategien zur Identifizierung der wenigen in den Bibliotheken vorhandenen hochaffinen Binder sind aufwendig und erfolgen bei der bekannten "Selex-Methode" über direkte Isolierung des gebundenen Oligonukleotids mit anschließender PCR- Amplifikation. Häufige Fehlerquellen sind bekanntermaßen die Identifizierung von "Falsch-Positionen".It can be assumed that due to the large structural diversity there within the library members that are highly affine to a given target protein and thus also inhibiting its biological function. Appropriate Results have been published in recent years and are in Known to specialist circles. The strategies pursued so far for Identification of the few that exist in the libraries high affinity binders are complex and take place at the known "Selex method" via direct isolation of the bound oligonucleotide with subsequent PCR Amplification. Common sources of error are known to be Identification of "wrong positions".
Das Ziel dieses Vorhabens ist die Entwicklung neuartiger, maßgeschneiderter und selektiv wirkender Arzneimittel aus Bibliotheken heraus, die infolge hoch-affiner Bindung an pathogen wirkende Proteine identifiziert werden. Dadurch soll die normale Funktion dieser Proteine in Zielzellen blockiert werden, damit auf diesem Wege die Krankheitsursache kausal eliminiert wird.The goal of this project is the development of new, tailored and selective drugs Libraries out as a result of high affinity to pathogenic proteins are identified. This is supposed to blocks the normal function of these proteins in target cells become causal in this way is eliminated.
Die Erfindung wird gemäß dem Patentanspruch realisiert.The invention is implemented according to the patent claim.
Erfindungsgemäß werden Oligonukleotide (Oligos) eingesetzt, die in kombinatorischen Bibliotheken aus Nukleotid-Bausteinen synthetisiert werden. Die Bausteine sind entweder Ribonukleotide, Desoxyribonukleotide oder in der Natur nicht vorkommende Bausteine, insbesondere mit Modifikationen an der 2'-Gruppe der Ribose wie Methyl oder Allyl.According to the invention, oligonucleotides (oligos) are used which in combinatorial libraries from nucleotide building blocks be synthesized. The building blocks are either Ribonucleotides, deoxyribonucleotides or not in nature occurring modules, in particular with modifications to the 2'-group of the ribose such as methyl or allyl.
Oligonukleotide, die aus den vier definierten Bausteinen U, C, G und A bestehen, die in variabler linearer Sequenz miteinander verknüpft sind, werden in kombinatorischen Bibliotheken als verwandte Verbindungen mit unterschiedlichen Sequenzen und mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften durch Festphasensynthese generiert.Oligonucleotides consisting of the four defined building blocks U, C, G and A consist of each other in a variable linear sequence are linked in combinatorial libraries as related compounds with different sequences and with different physico-chemical properties Solid phase synthesis generated.
Gewünschte, aus Gründen der Screening-Verfahrens fluoreszent markierte Oligos als Wirkstoff-Kandidaten werden aus kombinatorischen Bibliotheken durch ihre Fähigkeit zur hoch affinen Bindung an pathogene zelluläre Proteine als molekulare Targets in Festphase identifiziert. Diese Untersuchungen werden in Arrays miniaturisierter Reaktionsgefäße (Volumina: 1-5 ul) auf Silizium-Biochips durchgeführte in denen das gewünschte Zielprotein immobilisiert vorliegt und mit Oligos in Bibliotheken (Multiplizität: 106-1012 verschiedene Moleküle mit unterschiedlicher Sequenz) in Festphase reagieren kann (Abb. 1).Desired oligos labeled as active substance candidates for reasons of screening methods are identified from combinatorial libraries by their ability to bind to pathogenic cellular proteins with high affinity as molecular targets in solid phase. These investigations are carried out in arrays of miniaturized reaction vessels (volumes: 1-5 ul) on silicon biochips in which the desired target protein is immobilized and can react with oligos in libraries (multiplicity: 10 6 -10 12 different molecules with different sequences) in the solid phase ( Fig. 1).
Die Entstehung stabiler Komplexe zwischen Zielprotein und einzelnen Oligo-Molekülspezies (den potentiellen Wirkstoff- Kandidaten) wird die Auslesung durch automatierte Fluoreszenz- Detektion mittels wellenoptischer Systeme nach Laser-Anregung verfolgt (Abb. 1) Durch hochempfindliches Hochdurchsatz- Screening auf Biochips werden Bibliotheken und Sub-Bibliotheken analysiert (Primär-Sreening) und die Sequenzen aktiver Wirkstoff-Kandidaten identifiziert. Nach gezielter Synthese von Oligos mit der im primären Screening identifizierten Sequenz werden Wirkungsprüfungen in Zellkulturen und in Modellen menschlicher Krankheiten in transgenen Mäusen durchgeführt (Sekundär-Screening).The formation of stable complexes between the target protein and individual oligo molecule species (the potential drug candidates) is followed by automated fluorescence detection using wave-optical systems after laser excitation ( Fig. 1) . Libraries and sub -Libraries analyzed (primary screening) and the sequences of active drug candidates identified. After specific synthesis of oligos with the sequence identified in the primary screening, efficacy tests are carried out in cell cultures and in models of human diseases in transgenic mice (secondary screening).
Wesentlicher Bestandteil der Erfindung ist das Screening- Verfahren. Aufbau und Screening der Oligonukleotid-Bibliotheken werden am Beispiel von 20meren gezeigt. Es beginnt mit einer Bibliothek, die sämtliche 16meren Oligonukleotide enthält, also 416 Mitglieder hat. "Random" Oligonukleotidsequenzen (16mer) aus den 4 Bausteinen G, A, T, C ergeben eine Bibliothek mit 416 Mitgliedern. An die 16-Oligonukleotide werden nun in definierter Sequenz 4 weitere Bausteine angehängt. Es entstehen 256 "Subbibliotheken" mit bekannter Endsequenz in Position 17, 18, 19 und 20. Die Gesamtbibliothek enthält 256 × 416 Oligonukleotide. Danach erfolgt ein Screening der 256 Bibliotheken, die den Winner (Hochaffines Oligo) enthält. Damit sind die Positionen 17 bis 20 des Winners identifiziert. Jetzt werden 256 Subbibliotheken von Position 13 bis 16 synthetisiert und gescreent, um die Winner-Sequenzen in diesen Positionen zu ermitteln.The screening method is an essential part of the invention. The structure and screening of the oligonucleotide libraries are shown using the example of 20mer. It starts with a library that contains all 16-mer oligonucleotides, ie 4 16 members. "Random" oligonucleotide sequences (16mer) from the 4 building blocks G, A, T, C result in a library with 416 members. Four further building blocks are now added to the 16 oligonucleotides in a defined sequence. 256 "sublibraries" with a known end sequence in positions 17, 18, 19 and 20 are produced. The total library contains 256 × 4 16 oligonucleotides. The 256 libraries containing the winner (high affinity oligo) are then screened. Positions 17 to 20 of the winner are identified. Now 256 sublibraries from positions 13 to 16 are synthesized and screened to determine the winner sequences in these positions.
Wiederholungen der Prozedur für Positionen 9 bis 12, 5 bis 8 und 1 bis 4 ergeben die Gesamtsequenz des Winners.Repeat the procedure for positions 9 to 12, 5 to 8 and 1 through 4 give the overall sequence of the winner.
Als molekulare Targets werden zunächst ein Wachstumsfaktor (human Epidermal Growth Factor hEGF), die Interaktionsdomäne SH2 der humanen Zellzyklus-Proteine Cyclin D1 und CDK4, und ein virales Protein (Herpes Simplex [HSV] DNA-Polymerase) eingesetzt, deren funktionelle Aktivitäten durch spezifisch bindende Oligos blockiert werden sollen. Dabei sollen Oligos identifiziert werden, die als potentielle Target-spezifische Arzneimittel eingesetzt werden können. Wirkungsprüfungen erfolgen u. a. in geeigneten Zellkultursystemen und in transgenen Mausmodellen für humane Krankheiten. Parallel werden gezielt synthetisierte Oligos als Ribozyme eingesetzt, um die Biosynthese von EGF, Cyclin D1, CDK4 selektiv auf der mRNA- Ebene selektiv zu blockieren. Die Nukleotidsequenz der Ribozyme ergibt sich aus bekannten genomischen DNA-Basensequenzen der Gene, die für die gewählten Zielproteine kodieren.First, molecular targets become a growth factor (human epidermal growth factor hEGF), the interaction domain SH2 of the human cell cycle proteins Cyclin D1 and CDK4, and a viral protein (Herpes Simplex [HSV] DNA polymerase) used, whose functional activities by specific binding oligos are to be blocked. In doing so, oligos identified as potential target-specific Medicines can be used. Impact tests done u. a. in suitable cell culture systems and in transgenic mouse models for human diseases. Be parallel specifically synthesized oligos used as ribozymes to Biosynthesis of EGF, cyclin D1, CDK4 selectively on the mRNA Selectively block level. The nucleotide sequence of the ribozymes results from known genomic DNA base sequences of the Genes that code for the selected target proteins.
Der neue Ansatz zur selektiven chemotherapeutischen Behandlung von Krankheiten beruht darauf, daß das pathogene Protein in seiner Funktion spezifisch durch den pharmakologischen Wirkstoff blockiert wird, z. B. infolge hoch-affiner Bindung eines spezifischen Oligos. Der molekulare Test zur Identifizierung von Wirkstoff-Kandidaten ergibt sich aus deren Fähigkeit zur hoch-affinen Bindung an das Zielprotein (Primär- Screening), das an der Oberfläche von Reaktionsgefäßen immobilisiert ist und mit fluoreszent markierten Oligos reagiert. Gebundene Oligos werden fluorimetrisch detektiert (Abb. 1). Nach dem Screening von Bibliotheken und nachfolgendem reiterativen Screening von Sub-Bibliotheken wird die Sequenz des bindenden "Gewinner"-Oligos entschlüsselt.The new approach to the selective chemotherapeutic treatment of diseases is based on the fact that the function of the pathogenic protein is specifically blocked by the pharmacological agent, e.g. B. due to high affinity binding of a specific oligo. The molecular test for the identification of drug candidates results from their ability to bind to the target protein (primary screening), which is immobilized on the surface of reaction vessels and reacts with fluorescently labeled oligos. Bound oligos are detected fluorimetrically ( Fig. 1). After screening of libraries and subsequent reiterative screening of sub-libraries, the sequence of the binding "winner" oligos is decoded.
Die Selektion gewünschter Oligos aus Bibliotheken erfolgt in miniaturisierten Reaktionsgefäßen, die auf Silizium-Chips (Biochips) lithographisch hergestellt werden. Die Prozessierung von Flüssigkeiten (Pipettierung von Lösungen, Waschungen, usw.) erfolgt durch neue Liquid Handling-Robotersysteme. Die Laser- Anregung fluoreszenter Moleküle in Reaktionsgefäßen erfolgt auf Biochips mit integrierten mikrooptischen Wellenleiterstrukturen (Abb. 1). Eine solche Array-Anregung ist bisher noch nicht beschrieben worden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist elegant, einfach und indirekt, d. h. die Isolierung und anschließende Identifizierung des hochaffinen Oligonukleotids ist nicht nötig. Vielmehr werden durch Screening von Subbibliotheken und terativer Annäherung bzw. Ausschluß der Nichtbinder auf direkte Weise die Sequenz der hochaffinen Oligonukleotide indirekt identifiziert.The selection of desired oligos from libraries takes place in miniaturized reaction vessels, which are lithographically produced on silicon chips (biochips). The processing of liquids (pipetting of solutions, washes, etc.) is carried out using new liquid handling robot systems. The laser excitation of fluorescent molecules in reaction vessels takes place on biochips with integrated micro-optical waveguide structures ( Fig. 1). Such an array excitation has not yet been described. The method according to the invention is elegant, simple and indirect, ie the isolation and subsequent identification of the high affinity oligonucleotide is not necessary. Rather, the sequence of the high-affinity oligonucleotides is identified indirectly by screening sub-libraries and teratively approaching or excluding the non-binders.
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in Syntheseautomaten. Durch Mischen der modifizierten oder nicht modifizierten Bausteine (in der Regel 4), entsteht so bei einem 20mer- Oligonukleotid eine Sequenz von 420 Oligonukleotiden. Die Vorgehensweise ist dem Fachmann bekannt.The oligonucleotides are synthesized in automatic synthesizers. Mixing the modified or unmodified building blocks (usually 4) results in a sequence of 4 20 oligonucleotides in the case of a 20-mer oligonucleotide. The procedure is known to the person skilled in the art.
Die Schritte des Screening sind nachfolgend schematisch dargestellt. The steps of the screening are schematic below shown.
Screening der 256 Bibliotheken ergibt eine Bibliothek, die den Winner (Hochaffines Oligo) enthält. Damit sind die Positionen 17 bis 20 des Winners identifiziert. Jetzt werden 256 Subbibliotheken von Pos. 13 bis 16 synthetisiert und gescreent um die Winner-Sequenzen in diesen Positionen zu ermitteln.Screening the 256 libraries reveals a library that is the winner (High affinity oligo) contains. Positions 17 to 20 of the winner are now identified. Now 256 sub-libraries from pos. 13 to 16 are synthesized and screened to determine the winner sequences in these positions.
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