DE19755101A1 - Plants with increased phytochrome expression - Google Patents

Plants with increased phytochrome expression

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pflanze, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Phytochrom überexprimiert. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanze, die Phytochrom-B dadurch überexprimiert, daß ein Phytochrom-B-Gen in die Pflanze eingeführt oder darin aktiviert wird. Ferner betrifft die Erfindung Pflan­ zenteile, Samen und/oder Pflanzenzellen, die wie die Pflanze durch eine Phyto­ chromüberexpression gekennzeichnet sind. Die Erfindung betrifft außerdem die Ver­ wendung eines und/oder mehrerer Phytochromgene für die Herstellung von Pflan­ zen, die Phytochrom überexprimieren. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze, die Phytochrom überexprimiert, oder von Pflanzenteilen, Samen und/oder Zellen, die Phytochrom überexprimieren. Schließlich betrifft die Er­ findung einen Vektor, der ein Phytochromgen enthält, das für eine Aminosäurese­ quenz kodiert, deren N-Terminus hydrophob ist.The present invention relates to a plant which is characterized that it over-expresses phytochrome. In particular, the present invention relates a plant overexpressing phytochrome B by a phytochrome B gene introduced or activated in the plant. Furthermore, the invention relates Pflan parts, seeds and / or plant cells that are like the plant by a phyto chromium overexpression are characterized. The invention also relates to Ver use of one and / or more phytochrome genes for the production of Pflan zen overexpressing phytochrome. The invention further relates to a method for Production of a plant overexpressing phytochrome or plant parts, Seeds and / or cells overexpressing phytochrome. Finally, He find a vector containing a phytochrome gene coding for an amino acid encoded sequence whose N-terminus is hydrophobic.

Die Entwicklung von Pflanzen wird vom Keim bis zur Blütenbildung vielfältig durch Licht gesteuert. So wird Keimung und Ergrünung durch Licht ausgelöst. Pflanzen können in ihren grünen Geweben die Energie des Sonnenlichts nutzen, um Kohlen­ dioxid (CO2) in energiereiche organische Verbindungen umzuwandeln. Dieser Prozeß bei dem zunächst Zuckermoleküle entstehen, wird als Photosynthese bezeichnet. Ein großer Teil der photosynthetisch gespeicherten Energie wird von der Pflanze für das Wachstum und andere Stoffwechselvorgänge genutzt, ein gewisser Teil kann jedoch auch in Speicherorganen konserviert werden.The development of plants is controlled in many ways from the germ to flower formation by light. So germination and greening is triggered by light. In their green tissues, plants can use the energy of sunlight to convert carbon dioxide (CO 2 ) into high-energy organic compounds. This process, which initially produces sugar molecules, is called photosynthesis. A large part of the photosynthetically stored energy is used by the plant for growth and other metabolic processes, but a certain part can also be conserved in storage organs.

Da Pflanzen auf Licht als Energiequelle unbedingt angewiesen sind, wird ihre Entwicklung vom Umweltfaktor Licht so gesteuert, daß sie das Licht optimal nut­ zen können. Beispielsweise bilden Keimlinge erst die für die Photosynthese wichtigen Strukturen aus, wenn sie ans Licht kommen. Bis zu diesem Zeitpunkt wachsen sie auf Kosten ihrer Reservestoffe bevorzugt in die Länge, um das Licht möglichst schnell zu erreichen. Auch adulte Pflanzen nutzen unter Schattenbe­ dingungen einen Großteil ihrer Energie für das Streckungswachstum des Sten­ gels, um dem Schatten zu entkommen. Since plants are absolutely dependent on light as an energy source, their Development of the environmental factor light controlled so that they optimally use the light zen. For example, seedlings only form the ones for photosynthesis important structures when they come to light. Up to this point of time grow at the expense of their reserve materials preferably in length to the light reach as fast as possible. Adult plants also use under shadow a large part of their energy for the stretching growth of the Sten gels to escape the shadow.  

Die Wahrnehmung des Lichts erfolgt durch Chromoproteine, die als Photorezep­ toren dienen. Pflanzen besitzen drei verschiedene Photorezeptorsysteme, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen absorbieren. Eines davon ist das Photore­ zeptorsystem Phytochrom, das im Rotlichtbereich des Spektrums absorbiert.The perception of light is made by chromoproteins, which act as a photoreceptor serve gates. Plants have three different photoreceptor systems, the Absorb light of different wavelengths. One of these is the Photore phytochrome receptor system that absorbs in the red light area of the spectrum.

Phytochrome sind Chromoproteine, die aus einem 124 kDa großen Proteinanteil und einem langgestreckten Tetrapyrrolsystem als Chromophor bestehen (Ken­ drick und Kronenberg, 1986). Phytochrome werden im Dunkeln in der sogenann­ ten Pr-Form synthetisiert, die physiologisch inaktiv ist. Durch Absorption von Licht der Wellenlänge 660 nm gehen sie in die physiologisch aktive Pfr-Form über, die eine Vielzahl von Funktionen in der Pflanze kontrolliert. Charakteri­ stisch für die Phytochrome ist, daß sie durch Bestrahlung mit Dunkelrotlicht wie­ der in die Pr-Form konvertiert werden können. Zu den Phytochrom-abhängigen physiologischen Prozessen zählen:
Phytochromes are chromoproteins consisting of a 124 kDa protein portion and an elongated tetrapyrrole system as a chromophore (Ken Drick and Kronenberg, 1986). Phytochromes are synthesized in the dark in the so-called Pr-form, which is physiologically inactive. By absorbing light of 660 nm wavelength, they move into the physiologically active Pfr form, which controls a variety of functions in the plant. Characteristic of the phytochromes is that they can be converted into the Pr form by irradiation with dark red light like that. Phytochrome-dependent physiological processes include:

  • - Bildung von Proteinen, die an der Photosyntheseleistung der Pflanzen be­ teiligt sind.- Formation of proteins that contribute to the photosynthetic performance of plants are involved.
  • - Verkürzung der Internodien als Anpassung der Pflanzen an Schattenbedin­ gungen. (Unter Schattenbedingungen wird der Rotlichtanteil des Sonnen­ lichts vom Blätterdach absorbiert, das weniger stark absorbierte Dunkelrot­ licht bewirkt eine Konversion von Pfr zur inaktiven Pr-Form, was in einer Internodienstreckung resultiert.)- Shortening of the internodes as adaptation of the plants to Schattenbedin conditions. (Under shadow conditions, the red light portion of the sun light absorbed by the canopy, the less strongly absorbed dark red light causes a conversion of Pfr to inactive Pr-form, resulting in a Internode extension results.)
  • - Bildung von Anthocyanen- Formation of anthocyanins
  • - Induktion von Blüten- oder Knollenbildung- Induction of flower or tuber formation
  • - Verzögerung der Seneszenz- Delay of senescence

Die Klonierung und Sequenzierung des ersten Phytochromgens gelang erstmals 1985 (Hershey et al., 1985). Es handelte sich um das in im Dunkeln gewachse­ nen Keimlingen besonders abundant vorliegende Phytochrom A aus Hafer. Auf­ grund einer Fülle von physiologischen Untersuchungen wurde die Existenz weite­ rer Phytochrome vermutet, deren Isolierung wegen ihrer geringen Menge jedoch sehr schwierig war. Erst durch molekulare Techniken gelang der eindeutige Nachweis weiterer Phytochrome. Die molekulare Identifikation distinkter Phyto­ chromgene (PhyA, PhyB, PhyC) erfolgte 1989 durch Sequenzierung verschiede­ ner cDNAs aus Arabidopsis thaliana (Sharrock und Quail, 1989), die durch die Publikation der Gene PhyD und PhyE 1993 ergänzt wurde (Clack et al., 1993). PhyA, PhyB, PhyC und PhyE sind in ca. 50% ihrer Aminosäurepositionen iden­ tisch, PhyD ist mit 70% Aminosäureidentität näher zu PhyB als zu den anderen Phytochromen verwandt. Das Vorkommen distinkter Phytochromgene konnte da­ nach auch in anderen Pflanzen nachgewiesen werden. So gibt es in der Kartoffel ein Phytochromgen, das zu 76% identisch zu PhyA aus Arabidopsis ist, und demnach als Typ A klassifiziert wurde (Heyer, 1992). Auch ein zu PhyB aus Ara­ bidopsis homologes Gens konnte aus der Kartoffel isoliert werden (Heyer, 1992). Dennoch kann man vom Vorkommen der fünf verschiedenen Phytochrome in Arabidopsis nicht auf die Zusammensetzung der Phytochromfamilie in anderen Pflanzen schließen. In der der Kartoffel nah verwandten Tomate wurde ein Phytochromgen gefunden, dessen Sequenz sich nicht in die Klassen A bis E ein­ gruppieren läßt (Pratt et al., 1997). Daher wird es als PhyF bezeichnet.The cloning and sequencing of the first phytochrome gene succeeded for the first time 1985 (Hershey et al., 1985). It was about growing in the dark Nucleate phytochrome A is abundantly present in seedlings. on Due to a plethora of physiological examinations, the existence became wide Phytochrome, however, suspected its isolation because of its small amount was very difficult. Only through molecular techniques succeeded the clear  Detection of further phytochromes. The molecular identification of distinct phyto Chromogenic genes (PhyA, PhyB, PhyC) were obtained by sequencing in 1989 Arabidopsis thaliana cDNAs (Sharrock and Quail, 1989) Publication of the genes PhyD and PhyE 1993 (Clack et al., 1993). PhyA, PhyB, PhyC and PhyE are identified in approximately 50% of their amino acid positions table, PhyD is closer to PhyB than the others with 70% amino acid identity Phytochromes related. The occurrence of distinct phytochrome genes was there after being detected also in other plants. So there is in the potato a phytochrome gene that is 76% identical to Arabidopsis PhyA, and thus classified as type A (Heyer, 1992). Also to PhyB from Ara biopsis homologous gene could be isolated from the potato (Heyer, 1992). Nevertheless, one can tell from the occurrence of the five different phytochromes in Arabidopsis does not affect the composition of the phytochrome family in others Close plants. In the tomato closely related to the potato became one Phytochrome genes found, whose sequence does not enter the classes A to E. grouped (Pratt et al., 1997). Therefore it is called PhyF.

1989 wurde erstmals eine cDNA für das ein Phytochrom (Phytochrom A aus Ha­ fer) in Tabak eingeführt. Dies führte zu einer erhöhten Synthese dieses Phyto­ chroms in den transgenen Pflanzen. Dabei zeigte sich, daß Pflanzen sehr sensi­ bel auf die Erhöhung von Phytochrom reagieren. Bei starker Expression des Phytochromgens (fünffach erhöht, gemessen in etiolierten Keimlingen) zeigten sich folgende phänotypischen Veränderungen
In 1989, a phytochrome (phytochrome A from Ha fer) cDNA was first introduced into tobacco. This led to an increased synthesis of this Phyto chroms in the transgenic plants. It was found that plants react very sensitively to the increase of phytochrome. With strong expression of the phytochrome gene (five times increased, measured in etiolated seedlings), the following phenotypic changes were observed

  • - Reduzierte Apikaldominanz- Reduced apical dominance
  • - Zwergwuchs (semi-dwarfism)- Dwarfism (semi-dwarfism)
  • - Erhöhter Chlorophyllgehalt pro Blattfläche- Increased chlorophyll content per leaf area
  • - Kleinere, jedoch dickere Blätter- Smaller, but thicker leaves
  • - Deformierte Chloroplasten- Deformed chloroplasts
  • - Verschlechterte Diffusion von CO2 durch die Mesophyllzellen- Deteriorated diffusion of CO 2 through the mesophyll cells
  • - Erniedrigte Photosyntheserate- Decreased photosynthesis rate
  • - Erhöhte enzymatische Aktivität von Enzymen, die an der Photosynthese betei­ ligt sind (bezogen auf Blattfläche) - Increased enzymatic activity of enzymes involved in photosynthesis are (related to leaf area)  
  • - Weniger Wurzelmasse- less root mass
  • - Verzögerte Seneszenz.- Delayed senescence.

Von den allgemein erstrebenswerten Zielen bei einer Züchtung von Pflanzen zeigten diese Pflanzen Zwergwuchs, erhöhten Chlorophyllgehalt pro Blattfläche, dickere Blätter, erhöhte Aktivität von Enzymen, die an der Photosynthese beteiligt sind (bezogen auf Blattmasse). Allerdings waren sie in einigen Punkten den her­ kömmlichen Pflanzen unterlegen: sie hatten deformierte Chloroplasten, was zu einer verschlechterten Diffusion von CO2 durch die Mesophylzellen und zu einer erniedrigten Photosyntheserate führte. Die deformierten Chloroplasten und die verminderte Photosyntheseleistung waren so gravierende Mängel, daß die weite­ ren Effekte nicht mehr zum Tragen kommen. Die Pflanzen waren insgesamt in ihrer Leistungsfähigkeit nicht besser als die Ausgangspflanzen. Weiterhin war die Wurzelmasse weniger stark ausgeprägt als bei den herkömmlichen Pflanzen. In bezug auf die stärkere Ausbildung unterirdischer Organe (hier Wurzeln) und die Photosyntheseleistung waren sie den herkömmlichen Pflanzen unterlegen. Bei geringerer Expression (2-3fach erhöht, gemessen in etiolierten Keimlingen) je­ doch zeigten sie eine Eigenschaft, die besonders bei dichter Bepflanzung zu ei­ ner Verbesserung des sogenannten Harvest Index führt (Harvest Index: Verhält­ nis der Menge der des gewünschten Produkts (z. B. Samen, Frucht, Blatt, Knolle) zur gesamten Biomasse). Bei vielen Kulturpflanzen bewirkt die gegenseitige Be­ schattung der Pflanzen bei dichter Bepflanzung, daß die Pflanzen in die Länge wachsen, um gegenüber den um Licht konkurrierenden Nachbarpflanzen einen Vorteil zu haben. Im Feld wachsen somit alle Pflanzen in die Länge, was auf Ko­ sten des Wachstums anderer Organe geht. Die erhöhten Mengen Phytochrom A jedoch bewirken dagegen eine Verkürzung der Internodien. Dadurch ist das Blattwachstum im Verhältnis zum Stengelwachstum stärker ausgeprägt und es kommt zu einer Ertragssteigerung (Blatt/ha) um 15-20%. Diese Daten wurden mit Tabakpflanzen erzielt, bei denen die Blätter den wertvollen Rohstoff darstellen. Eine erhöhte Photosyntheserate, verzögerte Seneszenz und Vergrößerung des Wurzelballens wurde wurde bei diesen niedrig exprimierenden Pflanzen nicht dokumentiert. Among the generally desirable targets for plant breeding, these plants showed dwarfism, increased chlorophyll content per leaf area, thicker leaves, increased activity of enzymes involved in photosynthesis (based on leaf mass). However, they were inferior in some respects to the conventional plants: they had deformed chloroplasts, resulting in a decreased diffusion of CO 2 through the mesophyll cells and a decreased rate of photosynthesis. The deformed chloroplasts and the reduced photosynthesis performance were so serious defects that the wider ren effects no longer come to fruition. The plants were overall no better in their performance than the starting plants. Furthermore, the root mass was less pronounced than in the conventional plants. With regard to the increased formation of subterranean organs (here roots) and the photosynthetic performance, they were inferior to conventional plants. At lower expression (2-3 times higher, measured in etiolated seedlings), however, they showed a property which, especially in dense planting, leads to an improvement in the so-called harvest index (Harvest Index: Behaves the amount of the desired product (eg. Seed, fruit, leaf, tuber) to total biomass). In many crops, the mutual shading of the plants when densely planted causes the plants to grow in length to have an advantage over the competing neighboring plants for light. In the field, all plants grow in length, which is at the cost of the growth of other organs. The increased amounts of phytochrome A, however, cause a shortening of the internodes. As a result, leaf growth is more pronounced in relation to stalk growth and there is an increase in yield (leaf / ha) of 15-20%. These data were obtained with tobacco plants in which the leaves are the valuable raw material. An increased rate of photosynthesis, delayed senescence and enlargement of the root ball has not been documented in these low-expression plants.

1991 wurden erstmals Phytochrom B-Proteine in erhöhter Menge (18-30fach, gemessen in grünem Gewebe) in transgenen Pflanzen überexprimiert (Wagner et al., 1991). Es handelte sich um Phytochrom B aus Arabidopsis, das in Arabidop­ sis überexprimiert wurde. Es wurde ein verkürztes Wachstum des Hypocotyls be­ schrieben, später wurde der Einfluß auf Phototropismus und Blühinduktion be­ schrieben. Eine Wirkung auf die Ziele erhöhte Photosyntheserate, verzögerte Seneszenz, Vergrößerung des Wurzelballens, erhöhter Ertrag wurde nicht beob­ achtet. Phytochrom B aus Arabidopsis wurde ebenfalls in Tabak überexprimiert. Es wurde Zwergwachstum und ein Einfluß auf die Induktion des Blühens beob­ achtet. Ein Einfluß auf Photosynthese, Wurzelmasse, Ertrag oder Seneszenz wurde nicht dokumentiert (Halliday et al.).In 1991, phytochrome B proteins were first introduced in increased amounts (18-30 times, measured in green tissue) in transgenic plants overexpressed (Wagner et al., 1991). It was phytochrome B from Arabidopsis, found in Arabidop sis was overexpressed. It was a shortened growth of hypocotyl be later, the influence on phototropism and flowering induction was described wrote. An effect on the targets increased rate of photosynthesis, delayed Senescence, enlargement of the root ball, increased yield was not observed respects. Arabidopsis phytochrome B was also overexpressed in tobacco. It was observed dwarfism and an influence on the induction of flowering respects. An influence on photosynthesis, root mass, yield or senescence was not documented (Halliday et al.).

Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen bzw. Pflanzenteile, Samen und/oder Pflanzenzellen bereitzustellen, a) deren Photo­ syntheseleistungen erhöht ist und/oder b) deren Alterung verzögert ist, wodurch die Sonnenenergie länger nutzbar wird, was sich in einer Ertragssteigerung wi­ derspiegelt und/oder c) bei denen der Wurzelballen vergrößert ist, was zu einer besseren Nährstoffaufnahme führt und/oder d) deren Ertrag gesteigert ist.Accordingly, it is an object of the present invention, plants or To provide plant parts, seeds and / or plant cells, a) their photograph Synthesis is increased and / or b) their aging is delayed, which the solar energy is longer usable, which is in an increase in yield wi derspiegel and / or c) in which the root ball is enlarged, resulting in a leads to better nutrient uptake and / or d) whose yield is increased.

Insbesondere ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen, Pflanzen­ teile, Samen und/oder Pflanzenzellen anzugeben, bei denen diese vier Ziele kombiniert gelöst werden können.In particular, it is the object of the present invention, plants, plants parts, seeds and / or plant cells for which these four objectives combined can be solved.

Diese Aufgaben werden durch die in den unabhängigen Ansprüchen genannten Gegenstände gelöst. In den Unteransprüchen sind bevorzugte Ausführungsfor­ men der Erfindung angegeben.These objects are achieved by those recited in the independent claims Solved objects. In the subclaims are preferred Ausführungsfor men of the invention.

Gemäß Anspruch 1 wird eine Pflanze bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie Phytochrom überexprimiert.According to claim 1, there is provided a plant characterized is that it overexpresses phytochrome.

Im folgenden werden einige der in der Anmeldung verwendeten Begriffe näher erläutert, um klarzustellen, wie sie hier verstanden werden sollen. The following are some of the terms used in the application closer to clarify how they should be understood here.  

Unter "Phytochrome" sind all diejenigen Chromoproteine zu verstehen, die aus einem ca. 124 kDa großen Proteinanteil und einem langgestreckten Tetrapyrrol­ system als Chromophor bestehen und die in der Pflanze als Photorezeptoren dienen."Phytochromes" are understood to mean all those chromoproteins that are made an approximately 124 kDa protein content and an elongated tetrapyrrole system as a chromophore and those in the plant as photoreceptors serve.

Unter "Überexpression" wird jede Erhöhung des Phytochromniveaus in der Pflan­ ze verstanden, sei es, daß sie auf Einführung eines starken Promotors gegebe­ nenfalls zusammen mit dem Phytochromgen zurückgeht oder auf eine Genampli­ fikation oder andere in der Biotechnologie bekannte Möglichkeiten, die Protein­ syntheseleistung einer Zelle zu steigern. Überexpression liegt dann vor, wenn die veränderte (überexprimierende) Pflanze mindestens die doppelte Menge an Phytochrom, insbesondere PhyB, erzeugt wie die Ausgangspflanzen. Hierunter fällt auch die doppelte Menge in nur einem Pflanzenteil, z. B. dem Blatt. Vorzugs­ weise erzeugt die veränderte Pflanze das 5fache, unter Umständen das 10fache, an dem jeweiligen Phytochrom im Vergleich zur Ausgangspflanze bzw. einem Teil der Ausgangspflanze.By "overexpression" is meant any increase in the phytochrome level in the plant It is true that they agreed to the introduction of a strong promoter If necessary, goes back together with the phytochrome gene or on a Genampli fication or other known in biotechnology, the protein increase synthesis capacity of a cell. Overexpression occurs when the modified (overexpressing) plant at least twice the amount Phytochrome, especially PhyB, produces as the parent plants. this includes falls also twice the amount in only one plant part, z. B. the sheet. virtue wise, the modified plant produces 5 times, possibly the 10 times, at the respective phytochrome in comparison to the starting plant or a part of the starting plant.

Unter "Phytochrom-Gen" wird jedes Gen verstanden, das für ein Phytochrom, wie oben definiert, kodiert.By "phytochrome gene" is meant any gene that is responsible for a phytochrome, such as defined above, encoded.

Unter "hydrophob" wird eine Aminosäuresequenz verstanden, die mehr hydro­ phobe als polare Aminosäuren aufweist, z. B. 10 Alanine pro 20 Aminosäuren.By "hydrophobic" is meant an amino acid sequence that is more hydro phobe as polar amino acids, e.g. B. 10 alanines per 20 amino acids.

Unter "glycinreich" wird eine Aminosäuresequenz verstanden, die mehr als ein Glycin pro vier Aminosäuren aufweist und vorzugsweise mindestens 20 AS lang ist, beispielsweise 12 Gly innerhalb von 30 AS.By "glycine rich" is meant an amino acid sequence that is more than one Glycine per four amino acids and preferably at least 20 AS long is, for example, 12 Gly within 30 AS.

Die Erfindung beschreibt, daß die genannten Ziele erreicht werden können, wenn in einer Pflanze Phytochrom, insbesondere Phytochrom B, überexprimiert wird. Überraschenderweise wurden die besten Ergebnisse erzielt, wenn das Phyto­ chrom in eine Pflanze eingebracht wurde, die zu einer anderen Art gehört als die Pflanze, aus der das Gen stammte. In den Beispielen wird dies insbesondere gezeigt, wenn das Phytochrom B-Protein aus Arabidopsis thaliana in erhöhten Mengen in Kulturpflanzen synthetisiert wird. Explizit gezeigt wurde dies am Bei­ spiel der Kartoffel. Die Pflanzen zeichnen sich durch eine um 30% erhöhte Pho­ tosyntheserate aus, die zudem wesentlich insensitiver gegen Lichtstreß ist, als die Photosyntheserate herkömmlicher Pflanzen mit normalen Phytochromspie­ geln. Die Seneszenz ist verzögert. Das unterirdische Sproß-Wurzelsystem ist mindestens verdreifacht. Weiterhin zeigen die Pflanzen bei einer Verdoppelung der Anzahl an Knollen eine Ertragssteigerung von 15-20%.The invention describes that the stated objects can be achieved if phytochrome, in particular phytochrome B, is overexpressed in a plant. Surprisingly, the best results were achieved when the phyto Chromium was introduced into a plant that belongs to a different species than the  Plant from which the gene originated. In the examples this becomes particular shown when the phytochrome B protein from Arabidopsis thaliana increased in Quantities in crops is synthesized. This was explicitly shown on the Bei Game of the potato. The plants are characterized by a 30% increased Pho rate of synthesis, which is also much more insensitive to light stress than the rate of photosynthesis of conventional plants with normal phytochrome spike rules. The senescence is delayed. The subterranean sprout root system is at least tripled. Furthermore, the plants show a doubling The number of tubers increased by 15-20%.

Dagegen zeigte die erhöhte Expression des Phytochroms B aus Solanum tubero­ sum weniger deutlich die gesteigerte Entwicklung des Wurzelballens, die erhöhte Photosyntheserate und die verzögerte Seneszenz. Ein offensichtlicher Unter­ schied zwischen den Phytochromen B aus A. thaliana und S. tuberosum (Amino­ säureidentität: 76%) besteht in dem unterschiedlichen N-Terminus. Wie unten gezeigt, ist der Bereich zwischen den Aminosäuren VSGV und QAQSS sehr un­ terschiedlich. Das Phytochrom B aus A. thaliana kodiert hier für einen glycinrei­ chen Bereich der im Phytochrom B aus Solanum tuberosum fehlt.In contrast, increased expression of phytochrome B from Solanum tubero less pronounced was the increased development of rootball, which increased Photosynthesis rate and delayed senescence. An obvious sub dissociated between the phytochromes B from A. thaliana and S. tuberosum (Amino acid identity: 76%) exists in the different N-terminus. As below The range between the amino acids VSGV and QAQSS is very un differently. Phytochrome B from A. thaliana encodes a glycine-free one here area missing in phytochrome B from Solanum tuberosum.

Ein Sequenzvergleich der N-Termini der B-Phytochrome von A. thaliana und S. tuberosum ist oben gezeigt.A sequence comparison of the N-termini of the B-phytochromes of A. thaliana and S. tuberosum is shown above.

Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung können mit Typen des Phytochroms B und anderen Phytochromen insbesondere dann erreicht werden, wenn die Phyto­ chrome einen hydrophoben N-Terminus aufweisen. Insbesondere ist ein glycin­ reicher N-Terminus vorteilhaft. Als besonders vorteilhaft hat sich der oben be­ schriebene N-Terminus erwiesen. Mit umfaßt sind jedoch Sequenzen, die sich von dem N-Termius von A. thaliana ableiten und die gleichen Effekte beim Ein­ bringen in Pflanzen zeigen, wie der N-Terminus von PhyB aus A. thaliana. The objects of the present invention can be achieved with types of phytochrome B and other phytochromes especially when the phyto chrome have a hydrophobic N-terminus. In particular, a glycine rich N-terminus advantageous. Particularly advantageous is the above be written N-terminus proved. Included are, however, sequences that are derive from the N termini of A. thaliana and the same effects at Ein bring in plants show how the N-terminus of PhyB from A. thaliana.  

Besonders vorteilhaft sind monokotyledone, dikotyledone Nutzpflanzen oder Zierpflanzen als Ausgangspflanzen für die vorliegende Erfindung. Dies gilt insbe­ sondere für Mais, Weizen, Hirse, Hafer, Reis, Gerste, Sorghum, Amaranth, Zwiebel, Spargel, Zuckerrohr, Alfalfa, Sojabohne, Petunien, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnen­ blume, Karotte, Sellerie, Kohl, Gurke, Pfeffer, Canola, Tomate, Kartoffel, Linse, Flachs, Brokkoli, Tabak, Bohne, Salat, Raps, Blumenkohl, Spinat, Rosenkohl, Arti­ schocken, Erbse, Okra, Kürbis, Grünkohl, collard green, Tee und Kaffee, Geranien, Nelken, Orchideen, Rosen, impatiens, Petunien, Begonien, Fuchsien, Dotterblumen, Chrysanthemen, Gladiolen, Astromeria, Salbei, Veronica, Gänseblümchen und Iris.Particularly advantageous are monocotyledone, dicotyledonous crops or Ornamental plants as starting plants for the present invention. This applies in particular especially for corn, wheat, millet, oats, rice, barley, sorghum, amaranth, onion, Asparagus, sugar cane, alfalfa, soybean, petunia, cotton, sugar beet, suns flower, carrot, celery, cabbage, cucumber, pepper, canola, tomato, potato, lentil, Flax, broccoli, tobacco, bean, lettuce, rapeseed, cauliflower, spinach, Brussels sprouts, arti shock, pea, okra, pumpkin, kale, collard green, tea and coffee, geranium, Carnations, orchids, roses, impatiens, petunias, begonias, fuchsias, yolk flowers, Chrysanthemums, gladioli, astromeria, sage, veronica, daisies and iris.

Eine besonders vorteilhafte Wirkung ergibt sich bei der Verwendung von einem Phytochrom-B-Gen, mit dem oben angegebenen N-Termius für die Erzeugung einer transgenen Kartoffel.A particularly advantageous effect results in the use of a Phytochrome B gene, with the above-mentioned N-term for production a transgenic potato.

Das oben für die Pflanzen, die Phytochrom überexprimieren, Ausgeführte gilt ebenso für die Pflanzenteile, Samen und/oder Pflanzenzellen, die Phytochrom überexprimieren. Insbesondere können z. B. bereits durch eine gewebespezifi­ sche Überexpression von Phytochrom im Blatt die gewünschten Ergebnisse er­ zielt werden. Es ist möglich, daß man in bestimmten Teilen der Pflanze das Phytochrom nicht überexprimiert haben möchte. So ist z. B. die vermehrte Knol­ lenanzahl eher unerwünscht; vorteilhaft wäre gleiche Anzahl an Knollen bei er­ höhtem Ertrag. Dies kann man z. B. dadurch erreichen, daß man das Phytochrom nicht in der ganzen Pflanze, sondern nur in den Blättern exprimiert. Mit einem konstitutiven Promotor findet man bisher auch eine Überexpression in der Sproß­ spitze, und dieser Teil der Pflanze kontrolliert die Knollenanzahl.The above applies to the plants that overexpress phytochrome also for the plant parts, seeds and / or plant cells, the phytochrome overexpress. In particular, z. B. already by a tissue specifi overexpression of phytochrome in the leaf he desired results be targeted. It is possible that in certain parts of the plant Phytochrome does not want to overexpress. So z. B. the increased Knol lenient rather undesirable; advantageous would be equal number of tubers at he higher yield. This can be z. B. thereby achieve that the phytochrome not expressed in the whole plant but only in the leaves. With a constitutive promoter is also found to overexpression in the shoot pointed, and this part of the plant controls the number of tubers.

Eine Phytochromgenaktivierung kann ebenfalls zu dem gewünschten Ergebnis führen. Dabei werden pflanzeneigene Phytochromgene durch das Einbringen eines starken Promotors und/oder Enhancers aktiviert.Phytochrome activation may also produce the desired result to lead. Plant-own phytochrome genes are thereby introduced by the introduction a strong promoter and / or enhancer activated.

Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung eines und/oder mehrerer Phyto­ chrom-Gene für die Herstellung der oben beschriebenen Pflanzen und/oder Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen, ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, ein Konstrukt, das ein wie oben beschriebenes Phytochrom-Gen ent­ hält, sowie eine Pflanze enthaltend ein Konstrukt, umfassend ein Phytochrom- Gen und einen glycinreichen N-Terminus.The invention also relates to the use of one and / or more phyto chromium genes for the production of the plants described above and / or Plant parts, seeds and / or cells, a process for producing transgenic  Plants, a construct ent a phytochrome gene as described above ent and a plant containing a construct comprising a phytochrome Gene and a glycine-rich N-terminus.

Im folgenden soll die Erfindung anhand der Beispiele und Zeichnungen im Detail erläutert werden, wobei aber beachtet werden sollte, daß es sich lediglich um spezielle Ausführungsformen handelt, die nur beispielhaft sind und den Umfang der Erfindung nicht begrenzen sollen.In the following the invention with reference to the examples and drawings in detail but it should be noted that these are only special embodiments, which are only exemplary and the scope not to limit the invention.

In den Abbildungen wird folgendes dargestellt:The figures show the following:

Abb. 1A und 1B Figs. 1A and 1B

Sproßhabitus einer untransformierten Kontrollpflanze von Kartoffel (A) im Vergleich zu einer repräsentativen transgenen Kartoffelpflanze der Linie DARA12 (B). Die Pflanzen stammen aus Sterilkultur und waren 8 Wo­ chen im Gewächshaus kultiviert worden.Sproßhabitus an untransformierten control plant of Potato (A) compared to a representative transgenic potato plant the line DARA12 (B). The plants are from sterile culture and were 8 weeks old been cultivated in the greenhouse.

Abb. 2 Fig. 2

Western-Analysen mit Antikörpern gegen Phytochrom B aus Arabi­ dopsis thaliana mit Proteinpräparationen aus Blättern untransformierter Kontroll- Kartoffelpflanzen (wt) im Vergleich zu denen der transgenen Linien DARA5 und DARA12.Western analysis with antibodies to phytochrome B from Arabi dopsis thaliana with protein preparations from leaves of untransformed control Potato plants (wt) compared to those of the transgenic lines DARA5 and DARA12.

Abb. 3A und 3B Figs. 3A and 3B

  • (A) Photosyntheserate (µmol CO2/m2s, bei 1,2-1,8 mmol Photonen/m2s) von Blättern untransformierter Kontrollpflanzen von Kartoffel (WT) im Vergleich zu der von Blättern transgener Pflanzen der Linie DARA12.(A) Photosynthesis rate (μmol CO 2 / m 2 s, at 1.2-1.8 mmol photons / m 2 s) of leaves of untransformed control plants of potato (WT) compared to leaves of transgenic plants of the line DARA12.
  • (B) Abnahme der Photosyntheserate der Blätter aus A nach 5,5-stündiger Expo­ sition unter 1,2-1,8 mmol Ph./m2s und 32-38°C. Die Daten stammen von je n = 6 Messungen 12 Wochen alter Gewächshauspflanzen.(B) Decrease in photosynthesis rate of leaves from A after 5.5 hours exposure to 1.2-1.8 mmol Ph./m 2 s and 32-38 ° C. The data are from n = 6 measurements of 12-week-old greenhouse plants.
Abb. 4 Fig. 4

Unterirdisches Sproß-/Wurzelsystem von repräsentativen Kartof­ felpflanzen der untransformierten Kontrollinie (WT) und denen der transgenen Linien DARA5 und DARA12. Die Pflanzen wurden aus Sterilkultur ausgesetzt und von Oktober 1996 bis April 1997 im Gewächshaus kultiviert. Zum Zeitpunkt der Ernte waren sie 6 Monate alt. Underground shoot / root system of representative Kartof of the untransformed control line (WT) and those of the transgenic Lines DARA5 and DARA12. The plants were exposed to sterile culture and cultivated in the greenhouse from October 1996 to April 1997. At the time of Harvest they were 6 months old.  

Abb. 5A und 5B Figs. 5A and 5B

Unterirdisches Sproß-/Wurzelsystem und Knollenausbeute von repräsentativen Kartoffelpflanzen der untransformierten Kontrollinie (WT) im Vergleich zu denen transgener Pflanzen der Linien DPOT1, DPOT9 (A) und DS13 und DS23 (B). Die Pflanzen wurden aus Sterilkultur ausgesetzt und von Oktober 1996 bis April 1997 im Gewächshaus kultiviert. Zum Zeitpunkt der Ernte waren sie 6 Monate alt.Underground shoot / root system and tuber yield of representative potato plants of the untransformed control line (WT) in the Comparison to transgenic plants of the lines DPOT1, DPOT9 (A) and DS13 and DS23 (B). The plants were exposed to sterile culture and from October 1996 to April 1997 cultivated in the greenhouse. At the time of harvest they were 6 months old.

Abb. 6 Fig. 6

Western-Analysen mit Erstantikörpern gegen Phytochrom-B aus Arabidopsis thaliana mit Phytochrom-Präparationen aus Blättern untransformier­ ter Kontroll-Kartoffelpflanzen (Wt) im Vergleich zu denen der transgenen Linien DPOT1, DPOT9, DS13 und DS23.Western analysis with first antibodies against phytochrome B off Arabidopsis thaliana with phytochrome preparations from leaves untransformed control potato plants (Wt) compared to those of the transgenic lines DPOT1, DPOT9, DS13 and DS23.

METHODENMETHODS 1. Transformation von Kartoffeln (Rocha-Sosa et al. 1985)1. Transformation of potatoes (Rocha-Sosa et al., 1985)

30 µl einer in Selektionsmedium (YEB + Kanamycin (50 mg/l) und Rifampicin (50 mg/l)) angezogenen Übernachtkultur des T-DNA-Plasmid tragenden A. tume­ faciens Stammes GV2260 wurden mit 10 ml flüssigem MS-Medium gemischt (MS-Medium: Murashige and Skoog, 1962). Blättchen aus der sterilen Gewebekultur wurden an der Mittelrippe eingeschnitten und in das inokulierte MS-Medium überführt und zwei Tage dunkel bei 22°C inkubiert. Anschließend wurden die Blattscheiben zur Callusinduktion auf MS-Medium mit Glukose (16 g/l), Naphthyl­ essigsäure (5 mg/l), 16-Benzylaminopurin (0.1 mg/l), Cephotaxim (250 mg/l), Bi­ tec-Agar (6.3 g/l) und 1 mg/l Hygromycin oder 50 mg/l Kanamycin zur Selektrion sieben Tage unter Gewebekulturbedingungen inkubiert. Nachfolgend wurden die Blattscheiben zur Regeneration der Sprosse auf MS-Medium mit Glukose (16 g/l), Zeatinribose (1.4 mg/l), Naphthylessigsäure (20 µg/l), Gibberellinsäure (GA3; 20 µg/l), Cephotaxim (250 mg/l), Bitec-Agar (6.3 g/l) und 3 mg/l Hygromycin oder 50 mg/l Kanamycin unter Gewebekulturbedingungen inkubiert. Die Blattscheiben wurden nach sieben Tagen auf neues Regenerationsmedium überführt. Die ent­ stehenden Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, selektiven An­ tibiotika (50 mg/l Kanamycin oder 3 mg/l Hygromycin B) und 250 mg/l Cephota­ xim in Gewebekultur kultiviert.
YEB-Medium:
2 g/l Hefeextrakt
5 g/l Beefextrakt
5 g/l Pepton
5 g/l Saccarose
2 mM MgSO4
pH 7.0.30 μl of an overnight culture of T. DNA plasmid-carrying A. tume faciens strain GV2260 grown in selection medium (YEB + kanamycin (50 mg / l) and rifampicin (50 mg / l)) was mixed with 10 ml of liquid MS medium (MS -Media: Murashige and Skoog, 1962). Tissues from the sterile tissue culture were cut at the midrib and transferred to the inoculated MS medium and incubated dark at 22 ° C for two days. Subsequently, the leaf discs for callus induction on MS medium with glucose (16 g / l), naphthyl acetic acid (5 mg / l), 16-benzylaminopurine (0.1 mg / l), cephotaxime (250 mg / l), bi tec agar (6.3 g / l) and 1 mg / l hygromycin or 50 mg / l kanamycin for selection, incubated for seven days under tissue culture conditions. Subsequently, the leaf discs were used to regenerate the shoots on MS medium with glucose (16 g / l), zeatinribose (1.4 mg / l), naphthylacetic acid (20 μg / l), gibberellic acid (GA 3 , 20 μg / l), cephotaxim ( 250 mg / L), Bitec agar (6.3 g / L) and 3 mg / L hygromycin or 50 mg / L kanamycin are incubated under tissue culture conditions. The leaf discs were transferred to new regeneration medium after seven days. The resulting shoots were cultured on MS medium with 2% sucrose, selective antibiotics (50 mg / l kanamycin or 3 mg / l hygromycin B) and 250 mg / l cephota xim in tissue culture.
YEB medium:
2 g / l yeast extract
5 g / l of beef extract
5 g / l peptone
5 g / l sucrose
2 mM MgSO 4
pH 7.0.

2. Kultur der Pflanzen2. Culture of plants

Die Pflanzen wurden im Versuchsgewächshaus des Botanischen Gartens der Universität Göttingen kultiviert. Ihre Anzucht erfolgte aus Knollen oder Sterilkultur (Medium nach Murashige & Skoog, 1962). Während der Kultur lag die Tempera­ tur im Gewächshaus im Winterhalbjahr (Oktober - April) bei 15-25°C, im Som­ merhalbjahr (Mai - September) bei 20-35°C. Zwischen Tag und Nacht schwank­ te sie um 5-15°C. Die relative Luftfeuchte betrug ganzjährig ca. 55%. Die Lichtintensität lag, je nach Alter und damit Höhe der Pflanzenkörper, tagsüber zwischen 200 und 450 µmol Photonen (m2s)-1, an klaren Tagen bei max. 500 µmol Ph.(m2s)-1. Die Tageslängen entsprachen der natürlichen jahreszeitlichen Periodik. Während der 4 bis 6 Monate dauernden Kultur wurden die Pflanzen in Intervallen von 2-6 Wochen in größere Töpfe umgesetzt (bis max. 20 cm Topf­ durchmesser nach 4 Monaten). Um Pflanzen vergleichbarer Stärke zu erhalten, wurden 3 Wochen nach Auflaufen der Knollen bzw. dem Aussetzen aus Sterilkul­ tur alle bis auf die beiden stärksten oberirdischen Sprosse zurückgeschnitten. Durch ihr Hochbinden und einen Topfabstand, der mindestens dem jeweiligen Topfdurchmesser entsprach, war eine weitgehend gleichmäßige Lichtexposition gewährleistet.The plants were cultivated in the experimental greenhouse of the Botanical Garden of the University of Göttingen. They were cultivated from tubers or sterile culture (medium after Murashige & Skoog, 1962). During the culture, the temperature in the greenhouse was 15-25 ° C in the winter months (October - April) and 20-35 ° C in the summer (May - September). Between day and night it wavered at 5-15 ° C. The relative humidity was about 55% throughout the year. Depending on the age and height of the plant body, the light intensity was between 200 and 450 μmol photons (m 2 s) -1 during the day, at max. 500 μmol Ph. (M 2 s) -1 . The daylengths corresponded to the natural seasonal periodicity. During the 4-6 month culture, the plants were transplanted into larger pots at intervals of 2-6 weeks (up to a maximum of 20 cm pot diameter after 4 months). In order to obtain plants of comparable strength, all but the two strongest above-ground shoots were cut back 3 weeks after emergence of the tubers or exposure to sterilization. By her high binding and a pot distance, which corresponded to at least the respective pot diameter, a largely uniform light exposure was guaranteed.

3. Präparation von Phytochromen aus Pflanzen (van Tuinen et al., 1995)3. Preparation of phytochromes from plants (van Tuinen et al., 1995)

0.3 g frisches Blattmaterial wurde mit 0.03 g Polyvinylpyrrolidon unter flüssigem Stickstoff in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß im Homogenisator pulverisiert und in 300 µl Phytochrom-Extraktionspuffer aufgenommen. Nach 15 min Zentrifugati­ on bei 15 000 xg und 4°C wurden 300 µl des Überstandes abgenommen, mit 30 µl Polyethylenimine (10% w/v in H2O) versetzt und 15 min bei 4°C im Eppen­ dorf-Schüttler bei maximaler Drehzahl inkubiert, um Nukleinsäuren und Chloro­ phyll auszufällen. Nach 10 min Zentrifugation bei 12 000 xg und 4°C wurde der Überstand mit 0.725 Vol. einer in Wasser gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt und 15 min bei 4°C bei voller Leistung im Eppendorf-Schüttler inkubiert. Nach 15 min Zentrifugation bei 12 000 xg und 4°C wurde das Sediment in 30 µl "Laemmli"-Puffer aufgenommen und 2 min bei 100°C inkubiert. Zur Western- Blot-Analyse wurden 20 µl der Probe auf ein 7%-iges PAA-Gel geladen (Laemmli, 1970).0.3 g of fresh leaf material was pulverized with 0.03 g of polyvinylpyrrolidone under liquid nitrogen in an Eppendorf reaction vessel in a homogenizer and taken up in 300 μl of phytochrome extraction buffer. After 15 min Zentrifugati on at 15,000 xg and 4 ° C, 300 ul of the supernatant were removed, mixed with 30 .mu.l polyethyleneimine (10% w / v in H 2 O) and 15 min at 4 ° C in Eppen village shaker at maximum RPM incubated to precipitate nucleic acids and chlorophyll. After centrifugation at 12,000 × g and 4 ° C. for 10 minutes, the supernatant was treated with 0.725% by volume of a water-saturated ammonium sulfate solution and incubated for 15 minutes at 4 ° C. at full power in the Eppendorf shaker. After 15 minutes of centrifugation at 12,000 xg and 4 ° C, the sediment was taken up in 30 μl of "Laemmli" buffer and incubated at 100 ° C for 2 min. For Western blot analysis, 20 μl of the sample was loaded on a 7% PAA gel (Laemmli, 1970).

Phytochrom-ExtraktionspufferPhytochrome extraction buffer

Ethylenglycolethylene glycol 50%50% EDTAEDTA 10 mM10mM Tris-HCl, pH 8.3Tris-HCl, pH 8.3 100 mM100 mM frisch zusetzen:@freshly add: @ Na-BisulfitNa-bisulfite 20 mM20 mM (NH4)2SO4 (NH 4 ) 2 SO 4 140 mM140 mM β-Mercaptoethanolβ-mercaptoethanol 56 mM56 mM PefablockPefablock 4 mM4mM Jodacetamid (IAA)Iodoacetamide (IAA) 4 mM4mM Pepstatin APepstatin A 1 µg/ml1 μg / ml Aprotininaprotinin 2 µg/ml2 μg / ml Leupeptinleupeptin 2 µg/ml2 μg / ml

4. Immunulogischer Nachweis von Phytochrom B über Western-Analyse4. Immunulogical detection of phytochrome B via Western analysis

Für den immunologischen Nachweis wurden die im PAA-Gel aufgetrennten Pro­ teine auf Nitrocellulose oder PVDF-Membranen übertragen. Dazu wurde das PAA-Trenngel 15 min in Elektroblot-Transferpuffer äquilibriert. Auf die Anoden­ platte der BioRad-Elektroblot-Apparatur wurden drei Lagen in Transferpuffer ge­ tränktes Whatman-Papier, die Membran, das Gel und drei weitere Lagen in Transferpuffer getränktes Whatman-Papier luftblasenfrei aufgelegt. Die Katho­ denplatte wurde unter leichtem Druck aufgelegt und der Elektroblot bei 15 V für 45-120 min durchgeführt. Nitrocellulose-Membranen wurden 10 min in Transfer­ puffer äquilibriert, PVDF-Membranen wurden zuerst in Methanol getränkt und anschließend 10 min in Transferpuffer äquilibriert. Der Transfer wurde mit Pon­ ceau-Rot - einem Farbstoff, der mit Wasser entfernt werden kann - überprüft.
For immunological detection, the proteins separated in the PAA gel were transferred to nitrocellulose or PVDF membranes. For this purpose, the PAA separating gel was equilibrated in electroblot transfer buffer for 15 min. On the anode plate of the BioRad electroblotting apparatus, three layers of Whatman paper soaked in transfer buffer, the membrane, the gel and three further layers were soaked in transfer buffer soaked Whatman paper air bubbles. The Katho denplatte was placed under light pressure and the Elektroblot carried out at 15 V for 45-120 min. Nitrocellulose membranes were equilibrated in transfer buffer for 10 minutes, PVDF membranes were first soaked in methanol and then equilibrated in transfer buffer for 10 minutes. The transfer was checked with Pon ceau-Red - a dye that can be removed with water.

Elektroblot-Transferpuffer:Electroblotting transfer buffer: PAGE-Laufpuffer mit PAGE run buffer with halbierter SDS-KonzentrationHalved SDS concentration mit 20% Methanolwith 20% methanol Ponceau-Färbelösung:@Ponceau staining solution: @ Ponceau-RotPonceau red 10 Tropfen10 drops Essigsäureacetic acid 10 Tropfen10 drops H2OH 2 O 100 ml100 ml

Immunologische DetektionImmunological detection

Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln durchgeführt. Zum Absättigen unspezifischer Bindungsstellen wurden die Filter wie folgt blockiert:
All steps were carried out at room temperature with gentle shaking. To saturate nonspecific binding sites, the filters were blocked as follows:

TBSITBSI 3 min3 min TBSIITBSII 10 min10 min TBSIIITBSIII 5 min5 min

Anschließend wurde der erste Antikörper in TBSIII mit 1% Magermilchpulver (w/v) 1 : 400 (polyklonaler Antikörper auf Kaninchen) oder 1 : 5000 (monoklonale Maus-Antikörper) verdünnt und 2 h inkubiert. Nach 3 × 10 min Waschen mit TBSIII wurde der Filter 90 min mit dem zweiten, biotinylierten Antikörper (1/1000 Amersham-Anti-Mouse bzw. -Anti-Rabbit) in TBSIII + 1% (w/v) Magermilch inku­ biert. Nach 3 × 10 min Waschen mit TBSIII wurde der Filter in TBSIII (ohne Tween) äquilibiriert. Der Filter wurde dann 30 min mit Streptavidin-gekoppelter Meer­ rettich-Peroxidase (1/500, Amersham) in TBSIII (ohne Tween) inkubiert. Nach 4 × 5 min Waschen in TBS können die von dem ersten Antikörper erkannten Pro­ teine auf dem Filter angefärbt oder auf Röntgenfilm über Chemolumineszenz entwickelt werden.Subsequently, the first antibody in TBSIII was made with 1% skimmed milk powder (w / v) 1: 400 (polyclonal antibody to rabbit) or 1: 5000 (monoclonal Mouse antibody) and incubated for 2 h. After 3 × 10 min washing with TBSIII, the filter was incubated for 90 min with the second, biotinylated antibody (1/1000 Amersham anti-mouse or anti-rabbit) in TBSIII + 1% (w / v) skim milk biert. After washing with TBSIII for 3 × 10 minutes, the filter was placed in TBSIII (without Tween). equilibrated. The filter was then left for 30 min with streptavidin-coupled sea radish peroxidase (1/500, Amersham) in TBSIII (without Tween). To  4 × 5 min washing in TBS can detect the Pro. Recognized by the first antibody stained on the filter or on X-ray film via chemiluminescence be developed.

TBSI-Puffer:@TBSI buffer: @ Tris-HCl, pH 8.3Tris-HCl, pH 8.3 20 mM20 mM NaClNaCl 500 mM500 mM Tween20Tween 20 0.05% (w/v)0.05% (w / v) TBSII-Puffer:@TBSII buffer: @ Tris-HCl, pH 8.3Tris-HCl, pH 8.3 20 mM20 mM NaClNaCl 150 mM150 mM Tween 20Tween 20 0.05% (w/v)0.05% (w / v) TBSIII-Puffer:@TBSIII buffer: @ Tris-HCl, pH 8.3Tris-HCl, pH 8.3 20 mM20 mM NaClNaCl 150 mM150 mM Tween 20Tween 20 0.05% (w/v)0.05% (w / v)

Anfärbenstaining

Der Filter wurde in folgender Farbreaktionslösung entwickelt:
The filter was developed in the following color reaction solution:

Diaminobenzidindiaminobenzidine 10 mg10 mg TBSTBS 20 ml20 ml CoCl2 CoCl 2 0.01% (w/v)0.01% (w / v) 20 min lösen@Solve 20 minutes @ frisch zugeben:@freshly admit: @ H2O2 (30%)H 2 O 2 (30%) 30 µl30 μl

Die Farbreaktion wurde mit Wasser gestoppt.The color reaction was stopped with water.

Chemolumineszenzchemiluminescence

Zum Chemolumineszenz-Nachweis wurde der Filter (PVDF-Membran) 1 min in Reaktionslösung (Amersham Peroxidase-Chemolumineszenzlösungen 1 und 2 im Verhältnis 1 : 1) inkubiert und 2 bis 10 min in einer Expositionskassette auf Rönt­ genfilm exponiert. Anschließend wurde der Röntgenfilm entwickeltFor chemiluminescence detection, the filter (PVDF membrane) was placed in 1 min Reaction solution (Amersham peroxidase chemiluminescent solutions 1 and 2 im Ratio 1: 1) and incubated for 2 to 10 min in an exposure cassette on X-ray genfilm exposed. Subsequently, the X-ray film was developed

5. CO2-Assimilation über Infrarotspektroskopie5. CO 2 assimilation via infrared spectroscopy

Die Aktivität der photosynthetischen Dunkelreaktion wurde mittels Infrarotspek­ troskopie über die Rate der CO2-Fixierung ermittelt. Hierzu diente ein tragbares Gaswechselporometer der Firma ADC (Hoddesdon, Großbritannien), bestehend aus der zentralen LCA-3-Analyseeinheit und einer PLC-3-Blattkammer (Durch­ messer 6,2 cm2) mit Thermofühler und Lichtsensor zur zeitgleichen Detektion von Küvetteninnentemperatur und Photonenfluxdichte. Ein integrierter PC diente der Datenspeicherung und Datenverarbeitung. Dieses System ermöglichte die Ermitt­ lung der unter verschiedenen Kulturbedingungen (siehe 1.1. und 1.2.) erzielten Assimilationsraten (in µmol (m2s)-1).The activity of the photosynthetic dark reaction was determined by means of infrared spectroscopy on the rate of CO 2 fixation. Served for this purpose was a portable gas exchange pore meter from ADC (Hoddesdon, Great Britain), consisting of the central LCA-3 analysis unit and a PLC-3 blade chamber (diameter 6.2 cm 2 ) with thermocouple and light sensor for simultaneous detection of cuvette internal temperature and photon flux density , An integrated PC was used for data storage and data processing. This system allowed the determination of the assimilation rates (in μmol (m 2 s) -1 ) obtained under different culture conditions (see 1.1 and 1.2.).

5.1 CO2-Assimilation ausgewählter Blattareale ungestreßter Kontrollpflanzen5.1 CO 2 assimilation of selected leaf areas of undestroyed control plants

Um Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten zu gewährleisten, wurden nur Blätter annähernd gleichen Alters und ähnlicher Lichtexposition verwendet. So wurden alle Untersuchungen mit Endfiedern der 3. bis 5. ausgewachsenen Blätter (aus­ gehend vom Scheitel) durchgeführt. Die Blattfieder wurden, ohne sie von der Pflanze zu trennen und unter Beibehaltung ihrer Orientierung zum Licht, in die PLC-3-Kammer gespannt und unmittelbar vor jeder Messung zwecks Äquilibrie­ rung von Gas und Temperatur im Meßsystem für 10 min adaptiert. Im Verlauf der folgenden 10 min wurden alle 2 min die aktuelle Rate der CO2-Fixierung, die Temperatur und Lichtintensität aufgenommen.To ensure comparability of the data obtained, only leaves of approximately the same age and similar light exposure were used. Thus, all investigations were carried out with endfills of the 3rd to 5th full grown leaves (from the apex). The leaflets were, without separating them from the plant and while maintaining their orientation to the light, tensioned in the PLC-3 chamber and adapted immediately before each measurement for equilibration of gas and temperature in the measuring system for 10 min. Over the next 10 minutes, the current rate of CO 2 fixation, temperature and light intensity were recorded every 2 min.

5.2. Lichtstreßanalyse5.2. Light stress analysis

Zur Analyse ihrer Empfindlichkeit gegenüber Lichtstreß wurden die Pflanzen nach Ermittlung der Kontroll-Assimilationsraten (2.1) für 5,5 Stunden Photonen­ fluxdichten zwischen 1,2 und 1,8 mmol (m2s)-1 ausgesetzt (Halogenlampe der Fa. Osram, Power Star HQI-T/N, 2000 W). Während dieser Zeit stieg die Temperatur in der Küvette bis auf 32-38°C. Im Verlauf der nachfolgenden 10 min wurden erneut alle 2 min die aktuelle Rate der CO2-Fixierung, die Temperatur und Licht­ intensität registriert.To analyze their sensitivity to light stress, the plants after determining the control assimilation rates (2.1) for 5.5 hours photon flux densities between 1.2 and 1.8 mmol (m 2 s) -1 exposed (halogen lamp from Osram, Power Star HQI-T / N, 2000 W). During this time, the temperature in the cuvette rose to 32-38 ° C. During the following 10 minutes, the current rate of CO 2 fixation, temperature and light intensity were again recorded every 2 min.

5.3. CO2-Assimilation ganzer Pflanzen5.3. CO 2 assimilation of whole plants

Zur Abschätzung der Gesamt-Assimilationsleistung einzelner Pflanzen und damit ihres Potentials zur Stärkesynthese und letztlich Knollenproduktion wurde wie folgt vorgegangen. Über die Gesamtmasse der Blätter repräsentativer Einzel­ pflanzen (je n = 3) einer Linie und über ihre mittlere Masse pro Blattfläche (Messungen mit je n = 18 Blattscheiben) wurde für jede Linie die durchschnittliche Gesamtblattoberfläche pro Pflanze ermittelt. Mit Hilfe der gemäß 3.1. bestimmten CO2-Assimilationsrate pro Fläche konnte damit auf die ungefähre Assimilationsra­ te (µmol s-1) einer ganzen Pflanze geschlossen werden. Diese Bestimmungen wurden mit 3 Monate alten, nicht seneszenten Pflanzen durchgeführt.To estimate the overall assimilation performance of individual plants and thus their potential for starch synthesis and ultimately tuber production, the procedure was as follows. The total mass of the leaves of representative single plants (each n = 3) of one line and their mean mass per leaf area (measurements with n = 18 leaf disks) were determined for each line, the average total leaf surface per plant. With the help of 3.1. determined CO 2 assimilation rate per area could thus be closed to the approximate assimilation rate (μmol s -1 ) of an entire plant. These determinations were made with 3-month-old non-senescent plants.

6. Pigmentanalysen6. Pigment analyzes 6.1. Photometrische Bestimmung der Chlorophyllgehalte6.1. Photometric determination of chlorophyll contents

Blattscheiben (1,33 cm2) wurden in flüssigem Stickstoff pulverisiert und die Chlo­ rophylle mit 80%igem Ethanol quantitativ extrahiert. Die Extrakte wurden bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert und die Extinktionen der Überstände mit Hilfe eines Uvikon 932-Spektralphotometers (Fa. Kontron, Neuzahrn) bei 645, 652 und 663 nm photometrisch ermittelt. Die Chlorophyllgehalte ergaben sich nach folgenden Formeln.
Leaf discs (1.33 cm 2 ) were pulverized in liquid nitrogen and the chlorophyll was extracted quantitatively with 80% ethanol. The extracts were centrifuged at maximum speed and the extinctions of the supernatants were determined photometrically using a Uvikon 932 spectrophotometer (Kontron, Neuzahrn) at 645, 652 and 663 nm. The chlorophyll contents were obtained according to the following formulas.

Gesamtchlorophyll (µg) = E652 × Verdünnungsfaktor × (34,5)-1
Chlorophyll a (mg/ml) = [E663 × 45,6 - E645 × 9,25 × (3858 × ml Aliquot)-1] × 1,16 × ml Vol
Chlorophyll b (mg/ml) = [E645 × 82,04 - E663 × 16,75 × (3858 × ml Aliquot)-1] × 1,07 × ml Vol.Total Chlorophyll (μg) = E 652 × Dilution Factor × (34.5) -1
Chlorophyll a (mg / ml) = [E 663 x 45.6 - E 645 x 9.25 x (3858 x ml aliquot) -1 ] x 1.16 x ml vol
Chlorophyll b (mg / ml) = [E 645 x 82.04 - E 663 x 16.75 x (3858 x ml aliquot) -1 ] x 1.07 x ml vol.

6.2. HPLC-Analyse zur Quantifizierung der photosynthetischen Pigmente6.2. HPLC analysis for the quantification of photosynthetic pigments

Bis zur Aufarbeitung wurden die Blattscheiben (1,33 cm2) im Dunkeln in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die Extraktion der Pigmente erfolgte gemäß Thiele et al. (1996). Zur Trennung und Detektion der Carotinoide und Chlorophylle wurde ein HPLC-Gerät der Firma Hitachi (Lichrograph; Merck, Darmstadt) benutzt, beste­ hend aus der Gradientenpumpe L-7100, dem Injektionsventil 7125 (Cotati, CA, USA), dem UV-Detektor L-7400, dem Lösungsmittelentgaser Gastorr 104 (Scham­ beck, Bad Honnef), dem Integrator L-7500 und einer Reversed Phase LiChroCART-Säule mit LiChroCART-Vorsäule (250-4 bzw. 4-4; beide Merck). Die Säulen­ füllung bildete LiChrospher 100RP-18 (5 µm; Merck). Als Lösungsmittel dienten (A) Acetonitril: Methanol: Tris/HCl (0,1 M, pH 8), 7 : 10 : 3, (B) Methanol: Hexan, 4 : 1. Zunächst wurde für 9 min mit Lösungsmittel A eluiert, danach über einen in 3,5 min aufgebauten linearen Gradienten (0-100%) mit B. Auf 5,5 min isokratische Elution mit B folgte ein linearer Gradient bis zurück auf 100% A, woraufhin die Säule bis zum nachfolgenden Trenngang für weitere 4 min in A reäquilibriert wur­ de. Die Flußrate betrug 2 ml (min)-1. Diese Methode ermöglichte die saubere Tren­ nung von Neoxanthin, Violaxanthin, Antheraxanthin, Lutein, Zeaxanthin, α- und β-Carotin, sowie der Chlorophylle a und b. Die Quantifizierung dieser Pigmente erfolgte nach Färber et al. (1997).Until workup, the leaf discs (1.33 cm 2 ) were stored in the dark in liquid nitrogen. The extraction of the pigments was carried out according to Thiele et al. (1996). For the separation and detection of the carotenoids and chlorophylls, an HPLC instrument from Hitachi (Lichrograph, Merck, Darmstadt) was used, consisting of the gradient pump L-7100, the injection valve 7125 (Cotati, CA, USA), the UV detector L -7400, Gastorr 104 solvent degasifier (Schambeck, Bad Honnef), the L-7500 integrator and a reversed-phase LiChroCART column with LiChroCART precolumn (250-4 and 4-4, both Merck). The column filling formed LiChrospher 100RP-18 (5 μm, Merck). The solvents used were (A) acetonitrile: methanol: Tris / HCl (0.1 M, pH 8), 7: 10: 3, (B) methanol: hexane, 4: 1. First, the mixture was eluted with solvent A for 9 min, Thereafter, a linear gradient (0-100%) with B. built up in 3.5 min. followed by 5.5 minutes of isocratic elution with B was followed by a linear gradient down to 100% A, whereupon the column was allowed to react for a further 4 was reequilibrated in A for a few minutes. The flow rate was 2 ml (min) -1 . This method allowed the clean separation of neoxanthin, violaxanthin, antheraxanthin, lutein, zeaxanthin, α- and β-carotene, as well as the chlorophylls a and b. The quantification of these pigments was carried out according to Färber et al. (1997).

6.3. Photometrische Bestimmung der UV-absorbierenden Substanzen (z. B. An­ thocyane)6.3. Photometric determination of UV-absorbing substances (eg An thocyane)

Als grobes Maß für die Anthocyangehalte diente die relative Extinktion (% des Wildtyps) ethanolischer Gewebeextrakte bei 284 nm (siehe Garden, 1997), ge­ messen mit Hilfe eines Uvikon 932-Spektralphotometers (Fa. Kontron, Neu­ zahrn). Bei dieser Wellenlänge wiesen sowohl die Extrakte aus Blättern als auch die aus Stengelepidermen deutliche Absorptionsmaxima auf. Die Extraktion er­ folgte wie unter 4.1. beschrieben.As a rough measure of the anthocyanin content, the relative extinction (% of the Wild type) ethanolic tissue extracts at 284 nm (see Garden, 1997), ge Measure using a Uvikon 932 spectrophotometer (Kontron, Neu zahrn). At this wavelength, both the extracts of leaves as well the strong absorption maxima from stem epiderms. The extraction he followed as in 4.1. described.

7. Nachweis von Trockensubstanz und Stärke7. Detection of dry matter and starch

Die relativen Trockengewichte und Stärkegehalte der Knollen wurden wie folgt indirekt über die spezifischen Gewichte der Knollen in Luft (WL) und in Wasser (WW) ermittelt (Von Schéele et al., 1937).
Dichte δ = WL (WL - WW)-1
% Trockensubstanz = (δ - 1,0988) × (211,04 + 24,182)
% Stärke = (δ - 1,0988) × (199,07 + 17,546). The relative dry weights and tubers' starch contents were determined indirectly by the specific weights of the tubers in air (W L ) and water (W W ) as follows (Schéele et al., 1937).
Density δ = W L (W L - W W ) -1
% Dry matter = (δ - 1.0988) × (211.04 + 24.182)
% Strength = (δ - 1.0988) × (199.07 + 17.546).

8. Herstellung und Färbung von Blattmikrotomschnitten für die Lichtmikroskopie8. Preparation and staining of leaf microtome sections for light microscopy

Wie für die Untersuchungen zur CO2-Assimilation (siehe 3.1) wurden, der direk­ ten anatomischen Vergleichbarkeit wegen, nur Blätter ähnlichen Alters und ähnli­ cher Lichtexposition verwendet. Die Blätter stammten von 10 Wochen alten Pflanzen und zeigten äußerlich keine Anzeichen von Seneszenz. Pro Linie wur­ den der Spreite von je 4 Blattfiedern verschiedener Pflanzen zentrale Segmente (1 cm Abstand vom Hauptleitstrang) entnommen. Die Herstellung und Färbung der Schnitte folgte der Paraffinmethode (verändert nach Gerlach 1969, persönli­ che Mitteilung, G. Weis, Universität Göttingen), mit Histosec (Merck) als Einbett­ medium und unter Verwendung eines Schlittenmikrotoms (Fa. Leitz, Wetzlar). Safraninrot (Chroma) färbte primär Chloroplasten und Zellkerne, Astrablau (Merck) vornehmlich unverholzte Zellwände und Schleime.As for the assays for CO 2 assimilation (see 3.1), for the sake of direct anatomical comparability, only leaves of similar age and similar light exposure were used. The leaves were from 10 week old plants and showed no external signs of senescence. For each line, the blade of 4 leaflets of different plants were removed from central segments (1 cm apart from the main guide strand). The production and staining of the sections followed the paraffin method (modified according to Gerlach 1969, personal communication, G. Weis, University of Göttingen), with Histosec (Merck) as embedding medium and using a slide microtome (Leitz, Wetzlar). Safranine red (chroma) stained primarily chloroplasts and cell nuclei, Astrablue (Merck) primarily non-woody cell walls and mucus.

BEISPIELEEXAMPLES 1. Herstellung transgener Pflanzen1. Production of transgenic plants

Die Kodierregion des Phytochrom B aus Arabidopsis thaliana (A. t. phyB) wurde durch die Polymerase Kettenreaktion amplifiziert, wobei der cDNA Klon in IEMBL3 (Somers et al., 1991) als Matrize diente. Die Primer enthielten KpnI Schnittstel­ len. Somit kann A.t. phyB als KpnI Fragment in geeignete Expressionsvektoren kloniert werden. In dem hier verwendeten Beispiel wurde es unter die Kontrolle des CaMV 35S Promotors (Benfey et al., 1990) gebracht, der zur Expression des Gens in allen Teilen der Pflanze führt. Zur Beendigung der Transkription diente die Polyadenylierungsregion des Nopalin Synthase Gens aus Agrobacterium tu­ mefaciens. Gene, bei denen der Promotor, die Kodierregion und das Polyadeny­ lierungssignal von verschiedenen Genen stammen, werden als chimäre Gene bezeichnet. Im folgenden wird daher das Konstrukt als chimäres A.t. phyB Gen bezeichnet. Die Techniken zur Herstellung solch rekombinanter DNA sind in Sambrook et al. (1989) beschrieben. Das chimäre A.t. phyB Gen wurde über Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfer in Kartoffelpflanzen trans­ formiert (Rocha-Sosa et al., 1985). Transgene Pflanzen, die Phytochrom B aus Arabidopsis thaliana exprimieren, sind an dem Zwergwuchs, der reduzierten Api­ kaldominanz, und den dunkelgrüneren Blättern leicht zu erkennen (Abb. 1, Zeichnung). Zwei unabhängige Transformanden, im folgenden mit DARA5 und DARA12 abgekürzt, wurden wie folgt charakterisiert.The coding region of Arabidopsis thaliana phytochrome B (A.t. phyB) was amplified by the polymerase chain reaction using the cDNA clone in IEMBL3 (Somers et al., 1991) as a template. The primers contained KpnI cleavage sites. Thus, At phyB can be cloned as a KpnI fragment into suitable expression vectors. In the example used here, it has been put under the control of the CaMV 35S promoter (Benfey et al., 1990) which results in the expression of the gene in all parts of the plant. To terminate transcription, the polyadenylation region of the nopaline synthase gene was from Agrobacterium tu mefaciens. Genes in which the promoter, the coding region and the polyadenylation signal originate from different genes are called chimeric genes. In the following, therefore, the construct is referred to as a chimeric At phyB gene. The techniques for producing such recombinant DNA are described in Sambrook et al. (1989). The chimeric At phyB gene was transformed into potato plants via Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer (Rocha-Sosa et al., 1985). Transgenic plants expressing Arabidopsis thaliana phytochrome B are easily recognized by the dwarfism, the reduced api kaldominance, and the dark green leaves ( Figure 1, drawing). Two independent transformants, hereinafter abbreviated to DARA5 and DARA12, were characterized as follows.

Tabelle 1Table 1

Sproßanatomie der transgenen Kartoffellinien DARA5 und DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Sproßhöhe gibt den Abstand zwischen Boden und Apikalmeristem an, die Stengeldurchmesser wurden nach Ernte der oberirdischen Sprosse an der Stengelbasis (1 cm über der Erde) ermit­ telt. Die Daten stammen von 3,5 Monaten alten aus Knollen gezogenen Ge­ wächshauspflanzen (Juli - Oktober). n = Zahl der Einzelmessungen.Sprout anatomy of the transgenic potato lines DARA5 and DARA12 in comparison to the untransformed control line (wild-type). The rung height gives the distance between soil and Apikalmeristem, the stem diameter were after Harvest of the above-ground shoots at the stem base (1 cm above the ground) telt. Data are from 3.5 months old tubers grown Ge greenhouse plants (July - October). n = number of individual measurements.

TABELLE 1 TABLE 1

2. Bestimmung des Gehaltes an Phytochrom B2. Determination of phytochrome B content

Regulatorische Proteine werden in Pflanzen im Gegensatz zu Strukturproteinen nur in geringer Menge exprimiert. Der Nachweis von Phytochromen wird oft im­ munologisch unter Verwendung von Antikörpern geführt. Monoklonale Antikörper gegen Phytochrom B aus A. thaliana stehen zur Verfügung (Somers et al., 1991). Diese Antikörper erkennen auch das Phytochrom B aus S. tuberosum. Die ge­ naue Durchführung dieses Nachweises ist im Methodenteil beschrieben. Abb. 2 zeigt das Ergebnis der Western Blot Analyse. Im Vergleich zur untrans­ formierten Kontrolle (Wt) zeigen die Linien DARA5 und DARA12 ein deutlich stärkeres Signal. Die vergleichende Quantifizierung unter Verwendung von Ver­ dünnungsreihen ergab, daß DARA5 ca. fünffach mehr Phytochrom B syntheti­ siert, DARA12 etwa 12fach mehr, im Vergleich zur untransformierten Kontrolle (wt).Regulatory proteins are expressed only in small amounts in plants as opposed to structural proteins. The detection of phytochromes is often performed immunologically using antibodies. Monoclonal antibodies against A. thaliana phytochrome B are available (Somers et al., 1991). These antibodies also recognize phytochrome B from S. tuberosum. The exact execution of this proof is described in the Methods section. Fig. 2 shows the result of the Western blot analysis. Compared to the untransformed control (Wt) the lines DARA5 and DARA12 show a much stronger signal. Comparative quantitation using dilution series revealed that DARA5 synthetizes about fivefold more phytochrome B, DARA12 about 12-fold more, compared to the untransformed control (wt).

3. Erhöhung der Photosyntheserate3. Increase in the rate of photosynthesis

Anzuchtsbedingungen sowie die Technik der Messung der Phyotosyntheserate sind im Methodenteil beschrieben. Abb. 3A und 3B zeigen das Ergebnis der Messungen exemplarisch bei der Pflanze DARA12. Die Photosyntheseleistung von Gewächshauspflanzen (Transgene und Kontrollpflanzen), die 10 Wochen im Gewächshaus angezogen waren, wurde über die Messung der CO2-Assi­ milationsrate bestimmt. Zunächst wurden die Pflanzen für ein paar Stunden bei einer Lichtstärke von 0.3 mmol Photonen/m2s belassen. Danach wurde Pho­ tosyntheseleistung unter 1.5 bis 1.8 mmol Photonen/m2s durch Messung der CO2-Aufnahme analysiert. Bei dieser Messung zeigte die untransformierte Kon­ trollpflanze eine durchschnittliche CO2-Assimilationsrate von 17,5 mmol/m2s, während die transgene Pflanze (DARA12) mit 22,5 mmol/m2s um 28,5% erhöht war. Rechnet man diese Werte auf die CO2-Assmililationskapazität ganzer Pflan­ zen um, ergibt sich pro Pflanze eine um ca. 20% erhöhte Leistungsfähigkeit.Cultivation conditions and the technique of measuring the rate of phyto-synthesis are described in the Methods section. FIGS. 3A and 3B show the result of the measurements by way of example in the case of the plant DARA12. The photosynthetic performance of greenhouse plants (transgenes and control plants) grown in the greenhouse for 10 weeks was determined by measuring the CO 2 assiliation rate. First, the plants were left for a few hours at a light intensity of 0.3 mmol photons / m 2 s. Thereafter, Pho tosyntheseleistung was analyzed under 1.5 to 1.8 mmol photons / m 2 s by measuring the CO 2 uptake. In this measurement, the untransformed control plant showed an average CO 2 assimilation rate of 17.5 mmol / m 2 s, while the transgenic plant (DARA 12) was increased by 28.5% to 22.5 mmol / m 2 s. If these values are converted to the CO 2 assimilation capacity of whole plants, this results in an approx. 20% increase in productivity per plant.

Das in Abb. 3B gezeigte Diagramm zeigt, daß die Leistungsfähigkeit der Photosynthese bei andauernd starker Lichtintensität, wie es im Sommer bei wol­ kenlosem Himmel vorkommt, bei den transgenen Pflanzen gegenüber den her­ kömmlichen Pflanzen um mehr als 30% erhöht ist. Die eben beschriebenen Pflanzen wurden für weitere 5 Stunden bei 1.2-1.8 mmol Photonen/m2s gehal­ ten, dann wurde die Photosyntheserate wieder gemessen. Diese war in den un­ transformierten Kontrollpflanzen von 17.5 µmol CO2/m2s auf 3 µmol CO2/m2s re­ duziert, während bei den transgenen Pflanzen die Rate von 22.5 µmol CO2/m2s auf 15 µmol CO2/m2s abfiel. Integriert man die Flächen unter beiden Kurven, so ergibt sich eine Verdoppelung der Photosyntheserate der DARA12 Pflanzen im Vergleich zu den nicht transformierten Kontrollpflanzen.The diagram shown in Fig. 3B shows that the efficiency of photosynthesis with constantly strong light intensity, as occurs in the summer when kenslosem sky, in the transgenic plants compared to the conventional her plants by more than 30% is increased. The plants described above were maintained for a further 5 hours at 1.2-1.8 mmol photons / m 2 s, then the photosynthesis rate was measured again. This was reduced in the un transformed control plants from 17.5 .mu.mol CO 2 / m 2 s to 3 .mu.mol CO 2 / m 2 s, while in the transgenic plants, the rate of 22.5 .mu.mol CO 2 / m 2 s to 15 .mu.mol CO 2 / m 2 s fell off. Integrating the areas under both curves results in a doubling of the photosynthetic rate of the DARA12 plants compared to the untransformed control plants.

Die erhöhte Photosyntheseleistung ist mit folgenden phänotypischen Verände­ rungen korreliert, durch die sich die transgenen DARA-Pflanzen auszeichnen. The increased photosynthesis performance is with the following phenotypic changes correlates with the transgenic DARA plants.  

Anatomische VeränderungenAnatomical changes

Die anatomischen Veränderungen der Blätter sind in Tabelle 2 zusammenge­ faßt. Die Blätter der transgenen Pflanzen sind kleiner und um ca. 15% dicker. Die erhöhte Blattdicke beruht auf einer Verlängerung der Zellen des Palisa­ denparenchyms um 50%. Weiterhin zeichnen sie sich durch ein um 60% er­ höhtes spezifisches Blattgewicht (g/cm2) aus. Bei annähernd gleicher Ge­ samtblattfläche aller Linien ist damit auch das Gesamtblattgewicht pro Pflanze um 50% erhöht. Bei Pflanzen, bei denen die Blätter geerntet werden (Luzerne, Salat, Kohl, Tabak) ermöglicht die Überexpression von PhyB eine Ertragsstei­ gerung von 50%.The anatomical changes of the leaves are summarized in Table 2 together. The leaves of the transgenic plants are smaller and about 15% thicker. The increased leaf thickness is due to an extension of the cells of the Palisa denparenchyms by 50%. Furthermore, they are distinguished by a 60% higher specific sheet weight (g / cm 2 ). With approximately the same total leaf area of all lines, the total leaf weight per plant is thus increased by 50%. In plants harvesting the leaves (alfalfa, lettuce, cabbage, tobacco), PhyB overexpression allows a 50% increase in yield.

Tabelle 2Table 2

Anatomische Charakterisierung der Blätter der transgenen Kartoffellinien DARA5 und DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Länge der Palisadenparenchymzellen und die Gesamtblattdicke wurden lichtmikrosko­ pisch mit Skalenokular bestimmt. Je Parameter stammen die n Proben von drei verschiedenen, 6-12 Wochen alten Gewächshauspflanzen (April-Juli 1997) (mit Ausnahme der letzten Spalte: 2 verschiedene Pflanzen). k.M. = keine Messun­ gen.Anatomical characterization of the leaves of the transgenic potato lines DARA5 and DARA12 compared to the untransformed control line (wild-type). The length the palisade parenchyma cells and the total leaf thickness became light microscopic determined with scale eyepiece. Per parameter, the n samples come from three various, 6-12 weeks old greenhouse plants (April-July 1997) (with Exception of last column: 2 different plants). K. M. = no measurement gene.

TABELLE 2 TABLE 2

Veränderungen der PigmentmengeChanges in the amount of pigment

Tabelle 3 gibt die absoluten und relativen Mengen der photosynthetischen Pigmente in den Blättern der transgenen Kartoffellinie DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie an. Alle gemessenen Pigmente sind um den gleichen Betrag (ca. 26%) erhöht. Es läßt sich folgern, daß sich die photosyn­ thetischen Zentren der transgenen Linien qualitativ nicht von denen der Kon­ trollen unterscheiden.Table 3 gives the absolute and relative amounts of photosynthetic Pigments in the leaves of the transgenic potato line DARA12 in comparison to the untransformed control line. All measured pigments are around the same amount (about 26%). It can be concluded that the photosyn thetic centers of transgenic lines are qualitatively different from those of the Kon differentiate.

Tabelle 3Table 3

Absolute und relative Mengen photosynthetischer Pigmente in Blättern der trans­ genen Kartoffellinie DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Daten stammen aus HPLC-Analysen von Blattsegmenten 9 Wo­ chen alter Gewächshauspflanzen. Pro Linie wurden 6 Segmente verschiedener Pflanzen entnommen und in 2 Trenngängen á 3 Segmenten analysiert. Unter Ca­ rotinoide (*) fällt die Summe der Mengen an Neoxanthin, Violaxanthin, An­ theraxanthin, Lutein, Zeaxanthin, α- und β-Carotin.Absolute and relative amounts of photosynthetic pigments in leaves of trans potato line DARA12 compared to the untransformed control line (Wild type). The data are from HPLC analyzes of leaf segments 9 wk old greenhouse plants. Per segment, 6 segments were different Taken from plants and analyzed in 2 separations á 3 segments. Under Ca rotinoide (*) is the sum of the amounts of neoxanthine, violaxanthin, An theraxanthin, lutein, zeaxanthin, α- and β-carotene.

4. Verzögerung der Seneszenz4. Delay of senescence

Seneszenz ist phänotypisch an der Vergilbung der Blätter zu erkennen. Diese Symptome treten bei untransformierten Kontrollpflanzen zu einem Zeitpunkt auf, an dem die Pflanzen der Linien DARA12 noch dunkelgrün sind. Somit haben die transgenen Pflanzen die Möglichkeit, über einen längeren Zeitraum die Energie des Sonnenlichts für die Assimilation von Kohlendioxid zu verwenden.Senescence is phenotypically recognizable by the yellowing of the leaves. These Symptoms occur in untransformed control plants at a time when on which the plants of the lines DARA12 are still dark green. Thus, the Transgenic plants have the ability to sustain energy over a longer period of time of sunlight for the assimilation of carbon dioxide.

5. Vergrößerung des Wurzelballens5. Enlargement of the root ball

Ein ausgedehntes unterirdisches Sproß-Wurzelsystem ermöglicht eine gute Ver­ sorgung der Pflanze mit Wasser und Nährstoffen. Abb. 4 zeigt die Ver­ größerung des Wurzelballens der transgenen DARA-Pflanzen im Vergleich zu un­ transformierten Kontrollpflanzen.An extensive subterranean shoot-root system allows for a good supply of the plant with water and nutrients. FIG. 4 shows the enlargement of the root ball of the transgenic DARA plants in comparison to un transformed control plants.

6. Erhöhung des Ertrages6. Increase of the yield

Bei Kartoffelpflanzen ist der Knollenertrag bei der Beurteilung der Leistungsfä­ higkeit einer Linie entscheidend. Abb. 4 und Tabelle 4 zeigen, daß DARA Pflanzen bis zu dreimal mehr Knollen bilden. Im Mittel liegt die Ertragssteigerung zwischen 10-40%, wenn die Pflanzen mindestens 5 Monate kultiviert werden. Der Stärkegehalt der Knollen ist mit 15% des Frischgewichts unverändert.In potato plants, tuber yield is crucial in assessing the performance of a line. Fig. 4 and Table 4 show that DARA plants produce up to three times more tubers. On average, the yield increase is between 10-40% if the plants are cultivated for at least 5 months. The starch content of the tubers is unchanged at 15% of the fresh weight.

Tabelle 4Table 4

Knollenertrag und Anzahl der Einzelknollen pro Pflanze der transgenen Kartoffel­ linien DARA5 und DARA12 im Vergleich zur untransformierten Kontrollinie (Wildtyp). Die Pflanzen wurden auf Sterilkultur ausgesetzt und für 6 Monate (November 1996 - April 1997) im Gewächshaus kultiviert. Je Linie wurden die Knollen von 5 Einzelpflanzen ausgewertet. Im Fall der Knollenzahl sind nur Knollen über 1 g berücksichtigt.Tuber yield and number of single tubers per plant of the transgenic potato lines DARA5 and DARA12 compared to the untransformed control line (Wild type). The plants were exposed to sterile culture and for 6 months (November 1996 - April 1997) in the greenhouse. Per line were the Tubers from 5 individual plants evaluated. In the case of the tuber count are only Tubers over 1 g are considered.

TABELLE 4 TABLE 4

7. Weitere Eigenschaften der DARA-Linien7. Further features of the DARA lines

Die Pflanzen zeichnen sich weiterhin durch einen bis zu 50% erhöhten An­ thocyangehalt aus, der ihnen verbesserten Schutz vor UV-Strahlung gibt.The plants are further characterized by an up to 50% increased An thocyanine content, which gives them improved protection against UV radiation.

Beschreibung der transgenen Kartoffelpflanzen, die das TypB Phytochrom von Solanum tuberosum in erhöhten Mengen exprimieren.Description of transgenic potato plants containing the type B phytochrome of Express Solanum tuberosum in increased amounts.

1. Herstellung transgener Pflanzen1. Production of transgenic plants

Die Kodierregion des Phytochrom B aus Solanum tuberosum (S.t. phyB) wurde durch die Polymerase Kettenreaktion amplifiziert, wobei ein cDNA Klon in IZAP2 (Heyer und Gatz, 1992b) als Matrize diente. Die Primer enthielten EcoRV Schnitt­ stellen. Somit kann S.t. phyB als EcoRV Fragment in geeignete Expressionsvek­ toren kloniert werden. Solanum tuberosum kodiert für zwei phyB Allele (phyB(c) und phyB(g)), die sich in 4 Aminosäuren unterscheiden. Die Sequenzinformatio­ nen sind in der Datenbank unter der Hinterlegungsnummer Y14572 S51538 (EMBL, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge, CD10 1SD, U.K) abgelegt. In dem hier verwendeten Beispiel wurden die beiden phyB Allele unter die Kontrolle des CaMV 35S Promotors (Benfey et al., 1990) gebracht, der zur Expression der Ge­ ne in allen Teilen der Pflanze führt. Zur Beendigung der Transkription diente die Polyadenylierungsregion des Octopin Synthase Gens aus Agrobacterium tume­ faciens. Gene, bei denen der Promotor, die Kodierregion und das Polyadenylie­ rungssignal von verschiedenen Genen stammen, werden als chimäre Gene be­ zeichnet. Im folgenden wird daher die Konstrukte als chimäres S.t. phyB Gene bezeichnet. Die Techniken zur Herstellung solch rekombinanter DNA-Moleküle sind in Sambrook et al. (1989) beschrieben. Die beiden chimären S.t. phyB Gen wurde über Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfer in Kartoffel­ pflanzen transformiert (Rocha-Sosa et al., 1985). Transgene Pflanzen, die erhöh­ te Mengen Phytochrom B aus Solanum tuberosum exprimieren, sind phänoty­ pisch an der Vergrößerung des Wurzelballens und der Vergrößerten Knollenan­ zahl zu erkennen. (Abb. 5, Tabelle 5). Pflanzen, die das phyB(c) Allel in überexprimieren, werden als DS Pflanzen bezeichnet, Pflanzen, die das phyB(g) Allel überexprimieren, werden als DPOT Pflanzen bezeichnet. Von jeder Linie wurden jeweils zwei Pflanzen genauer charakterisiert (DS13 und DS23; DPOT1 und DPOT9).The coding region of phytochrome B from Solanum tuberosum (St phyB) was amplified by the polymerase chain reaction using a cDNA clone in IZAP2 (Heyer and Gatz, 1992b) as a template. The primers contained EcoRV cut. Thus, St phyB can be cloned as EcoRV fragment into suitable expression vectors. Solanum tuberosum encodes two phyB alleles (phyB (c) and phyB (g)), which differ in 4 amino acids. The sequence information is stored in the database under the accession number Y14572 S51538 (EMBL, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge, CD10 1SD, UK). In the example used here, the two phyB alleles were placed under the control of the CaMV 35S promoter (Benfey et al., 1990), which leads to expression of the genes in all parts of the plant. To terminate transcription, the polyadenylation region of the octopine synthase gene was from Agrobacterium tume faciens. Genes in which the promoter, the coding region and the polyadenylation signal originate from different genes are referred to as chimeric genes. In the following, therefore, the constructs referred to as chimeric St phyB genes. The techniques for making such recombinant DNA molecules are described in Sambrook et al. (1989). The two chimeric St phyB gene was transformed into potato plants via Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer (Rocha-Sosa et al., 1985). Transgenic plants expressing elevated levels of phytochrome B from Solanum tuberosum are phenotypically recognized by the enlargement of the root ball and the increased number of tubers. ( Figure 5, Table 5). Plants overexpressing the phyB (c) allele are referred to as DS plants, plants overexpressing the phyB (g) allele are referred to as DPOT plants. Two lines of each line were more accurately characterized (DS13 and DS23; DPOT1 and DPOT9).

2. Bestimmung des Gehaltes an Phytochrom B2. Determination of phytochrome B content

Regulatorische Proteine werden in Pflanzen im Gegensatz zu Strukturproteinen nur in geringer Menge exprimiert. Der Nachweis von Phytochromen wird oft im­ munologisch unter Verwendung von Antikörpern geführt. Monoklonale Antikörper gegen Phytochrom B aus A. thaliana stehen zur Verfügung (Somers et al., 1991). Diese Antikörper erkennen auch das Phytochrom B aus S. tuberosum. Weiterhin steht ein polyklonales Serum zur Verfügung, das durch Immunisierung von Ka­ ninchen mit PhyB aus S. tuberosum gewonnen wurde. Die genaue Durchführung dieses Nachweises ist im Methodenteil beschrieben. Abb. 6 zeigt das Er­ gebnis der Western Blot Analyse. Die vergleichende Quantifizierung unter Ver­ wendung von Verdünnungsreihen ergab, daß die Linien DS15 im Vergleich zur untransformierten Kontrolle (Wt) eine 12fach erhöhte Phytochrommenge zeigt. Die drei anderen Linien waren in ihrem Phytochrom B Gehalt im Vergleich zur untransformierten Kontrollpflanze um den Faktor 5 erhöht.Regulatory proteins are expressed only in small amounts in plants as opposed to structural proteins. The detection of phytochromes is often performed immunologically using antibodies. Monoclonal antibodies against A. thaliana phytochrome B are available (Somers et al., 1991). These antibodies also recognize phytochrome B from S. tuberosum. Furthermore, a polyclonal serum is available, which was obtained by immunization of rabbits with PhyB from S. tuberosum. The exact implementation of this proof is described in the Methods section. Fig. 6 shows the result of the Western blot analysis. Comparative quantitation using dilution series revealed that the DS15 lines exhibited a 12-fold increase in phytochrome levels as compared to the untransformed control (Wt). The three other lines were increased by a factor of 5 in their phytochrome B content compared to the untransformed control plant.

3. Phänotypische Charakterisierung3. Phenotypic characterization

Die oberirdischen Organe (Stengel, Blatt) der Pflanzen der DS und der DPOT Linien zeigen keine Veränderungen zu untransformierten Kontrollpflanzen. Blat­ tanatomie, Photosyntheserate und Seneszenzeigenschaften sind unverändert.The aboveground organs (stem, leaf) of the plants of the DS and the DPOT Lines show no changes to untransformed control plants. Blat tanatomy, photosynthesis rate and senescence properties are unchanged.

Allerdings sind die unterirdischen Organe (Sproß, Wurzel, Knollen) stärker aus­ gebildet (Abb. 5). Tabelle 5 dokumentiert, daß die Knollenanzahl um den Faktor 2 bis 3 erhöht ist, der Ertrag ist etwa um 10-40% gesteigert, wenn die Pflanzen mindestens 5 Monate kultiviert werden.However, the subterranean organs (shoot, root, tubers) are stronger ( Figure 5). Table 5 shows that the number of tubers is increased by a factor of 2 to 3, the yield is increased by about 10-40% when the plants are cultivated for at least 5 months.

Tabelle 5Table 5

Knollenertrag und Anzahl der Einzelknollen pro Pflanze der transgenen Kartoffel­ linien DPOT1, DPOT9, DS13 und DS23 im Vergleich zur untransformierten Kon­ trollinie (Wildtyp). Die Pflanzen wurden aus Sterilkultur ausgesetzt und für 6 Mo­ nate (November 1996 - April 1997) im Gewächshaus kultiviert. Je Linie wurden die Knollen von 5 Einzelpflanzen (nur DPOT9: 4 Einzelpflanzen) ausgewertet. Im Fall der Knollenzahl sind nur Knollen über 1 g berücksichtigt.Tuber yield and number of single tubers per plant of the transgenic potato lines DPOT1, DPOT9, DS13 and DS23 compared to untransformed Kon trollinia (wild type). The plants were exposed from sterile culture and allowed to stand for 6 mo nate (November 1996 - April 1997) in the greenhouse. Ever line were the tubers of 5 individual plants (only DPOT9: 4 individual plants) evaluated. in the Fall of the tuber count are considered only tubers over 1 g.

TABELLE 5 TABLE 5

Diese Versuche zeigen, daß das Gen aus Solanum tuberosum nach Einbringen in Kartoffel ebenfalls deren Eigenschaften verbessern kann, obwohl es eine ge­ ringere Anzahl an Merkmalen verbessert als das Gen aus Arabidopsis thaliana.These experiments show that the gene from Solanum tuberosum after insertion in potato also can improve their properties, although there is a ge reduced number of features than the Arabidopsis thaliana gene.

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SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (30)

1. Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß sie Phytochrom überexprimiert.1. plant, characterized in that it overexpresses phytochrome. 2. Pflanze gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Phytochrom-B überexprimiert.2. Plant according to claim 1, characterized in that it phytochrome B overexpressed. 3. Pflanze gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Über­ expression durch Einführung eines Phytochromgens in die Pflanze und/oder Phyto­ chromgenaktivierung ausgelöst wird.3. Plant according to claim 1 or 2, characterized in that the over expression by introducing a phytochrome gene into the plant and / or phyto Chromogen activation is triggered. 4. Pflanze gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Überexpression durch Einführung des Phytochrom-B-Gens in die Pflanze und/oder dessen Aktivierung ausgelöst wird.4. Plant according to one of claims 1 to 3, characterized in that the Overexpression by introduction of the phytochrome B gene into the plant and / or whose activation is triggered. 5. Pflanze gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Phytochrom-B- Gen aus der Familie der Solanaceen stammt.5. Plant according to claim 4, characterized in that the phytochrome B Gen is from the family Solanaceae. 6. Pflanze gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Phytochrom-B- Gen aus Arabidopsis thaliana stammt.6. Plant according to claim 5, characterized in that the phytochrome B Gene from Arabidopsis thaliana is derived. 7. Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es eine monokotyledone Pflanze ist.7. Plant according to one or more of the preceding claims, characterized ge indicates that it is a monocotyledonous plant. 8. Pflanze gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Weizen, Hirse, Hafer, Reis, Gerste, Sorghum, Amaranth, Zwiebel, Spargel und Zuckerrohr.8. Plant according to claim 7, characterized in that it is selected from the group consisting of corn, wheat, millet, oats, rice, barley, sorghum, Amaranth, onion, asparagus and sugar cane. 9. Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine dikotyledone Pflanze ist.9. Plant according to one or more of the preceding claims 1-5, characterized characterized in that it is a dicotyledonous plant. 10. Pflanze gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alfalfa, Sojabohne, Petunien, Baumwolle, Zuckerrü­ be, Sonnenblume, Karotte, Sellerie, Kohl, Gurke, Pfeffer, Canola, Tomate, Kartoffel, Linse, Flachs, Brokkoli, Tabak, Bohne, Salat, Raps, Blumenkohl, Spinat, Rosenkohl, Artischocken, Erbse, Okra, Kürbis, Grünkohl, collard green, Tee und Kaffee.10. Plant according to claim 9, characterized in that it is selected from the group consisting of alfalfa, soybean, petunia, cotton, sugar beet  be, sunflower, carrot, celery, cabbage, cucumber, pepper, canola, tomato, potato, Lentil, flax, broccoli, tobacco, bean, lettuce, rapeseed, cauliflower, spinach, Brussels sprouts, Artichokes, pea, okra, pumpkin, kale, collard green, tea and coffee. 11. Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie eine Zierpflanze ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Geranien, Nelken, Orchideen, Rosen, impatiens, Petunien, Begonien, Fuchsien, Dotterblumen, Chrysanthemen, Gladiolen, Astromeria, Salbei, Veronica, Gänseblüm­ chen und Iris.11. Plant according to one or more of claims 1 to 5, characterized records that it is an ornamental plant selected from the group consisting of Geraniums, carnations, orchids, roses, impatiens, petunias, begonias, fuchsias, Yolk flowers, chrysanthemums, gladioli, astromeria, sage, veronica, daisies Chen and Iris. 12. Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze die Kartoffel ist.12. Plant according to claim 10, characterized in that the plant the Potato is. 13. Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Terminus der durch das Phytochrom-Gen kodierten Aminosäuresequenz hydrophob ist.13. Plant according to one or more of the preceding claims, characterized characterized in that the N-terminus encoded by the phytochrome gene Amino acid sequence is hydrophobic. 14. Pflanze gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Terminus der durch das Phytochrom-Gen kodierten Aminosäuresequenz glycin- und/oder alanin­ reich ist.14. Plant according to claim 13, characterized in that the N-terminus of by the phytochrome gene encoded amino acid sequence glycine and / or alanine is rich. 15. Pflanze gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der N-Terminus der durch das Phytochrom-Gen kodierten Aminosäuresequenz die folgende Sequenz umfaßt:
15. Plant according to claim 13, characterized in that the N-terminus of the amino acid sequence encoded by the phytochrome gene comprises the following sequence:
16. Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen einer Pflanze nach einem der Ansprü­ che 1 bis 15.16. Plant parts, seeds and / or cells of a plant according to Ansprü che 1 to 15. 17. Verwendung eines oder mehrerer Phytochrom-Gene für die Herstellung der Pflanzen gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflan­ zenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16. 17. Use of one or more phytochrome genes for the production of Plants according to one or more of claims 1 to 15 and / or Pflan parts, seeds and / or cells according to claim 16.   18. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit erhöhter Syntheserate.18. Use of a plant according to one or more of claims 1 to 15 and / or the plant parts, seeds and / or cells according to claim 16 for the Er production of plants with an increased rate of synthesis. 19. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen Sonnenbestrahlung.19. Use of a plant according to one or more of claims 1 to 15 and / or the plant parts, seeds and / or cells according to claim 16 for the Er production of plants with increased resistance to sunlight. 20. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit verzögerter Seneszenz.20. Use of a plant according to one or more of claims 1 to 15 and / or the plant parts, seeds and / or cells according to claim 16 for the Er production of plants with delayed senescence. 21. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 und/oder der Pflanzenteile, Samen und/oder Zellen gemäß Anspruch 16 für die Er­ zeugung von Pflanzen mit einem stärker ausgeprägten Wurzelballen.21. Use of a plant according to one or more of claims 1 to 15 and / or the plant parts, seeds and / or cells according to claim 16 for the Er production of plants with a more pronounced root ball. 22. Verwendung einer Pflanze für die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Knol­ lenertrag.22. Use of a plant for the production of plants with increased knol lener contract. 23. Verwendung einer Pflanze für die Erzeugung von Pflanzen mit verbessertem Harvest Index.23. Use of a plant for the production of plants with improved Harvest Index. 24. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der vorstehenden An­ sprüche 1 bis 15 oder eine Pflanzenteils, Samens und/oder einer Zelle gemäß An­ spruch 16 für die Bekämpfung der weißen Fliege.24. Use of a plant according to one or more of the preceding An claims 1 to 15 or a plant part, seeds and / or a cell according to An claim 16 for the fight against the white fly. 25. Verwendung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15 oder eines Pflanzenteils, Samens und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 16 für die Erzeugung gegen Sonnenbestrahlung resistenter Pflanzen. 25. Use of a plant according to one or more of claims 1 to 15 or a plant part, seed and / or a cell according to claim 16 for the Generation against solar irradiation of resistant plants.   26. Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze gemäß einem oder mehreren der An­ sprüche 1 bis 15 oder von Pflanzenteilen, Samen und/oder Zellen gemäß An­ spruch 16, umfassend den Schritt:
  • - Einbringen eines Phytochrom-Gens, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 ange­ geben, in die Pflanze und/oder Aktivierung eines Phytochromgens in der Pflan­ ze.
26. A method for producing a plant according to one or more of claims 1 to 15 or of plant parts, seeds and / or cells according to claim 16, comprising the step:
  • Introducing a phytochrome gene as specified in any of claims 1 to 15 into the plant and / or activation of a phytochrome gene in the plant.
27. Konstrukt, enthaltend ein Phytochrom-Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, deren N-Terminus hydrophob ist.27. Construct containing a phytochrome gene coding for an amino acid sequence encoded whose N-terminus is hydrophobic. 28. Konstrukt, enthaltend ein Phytochrom-Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, deren N-Terminus glycinreich ist.28. Construct containing a phytochrome gene coding for an amino acid sequence whose N-terminus is glycine-rich. 29. Konstrukt nach Anspruch 28, enthaltend ein Phytochrom-Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, deren N-Terminus die folgende Sequenz umfaßt:
29. Construct according to claim 28, containing a phytochrome gene coding for an amino acid sequence whose N-terminus comprises the following sequence:
30. Pflanze, enthaltend ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 27 bis 29.30. A plant containing a construct according to any one of claims 27 to 29.
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