DE19754815A1

DE19754815A1 - Preparation of leptin-alpha2-macroglobulin complexes, for diagnostic and therapeutic purposes

Info

Publication number: DE19754815A1
Application number: DE1997154815
Authority: DE
Inventors: Gerd Birkenmeier
Original assignee: BIOMAC GmbH
Current assignee: BIOMAC GmbH
Priority date: 1997-12-10
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 1999-06-24
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: DE19754815C2

Abstract

The preparation of leptin- alpha 2-macroglobulin complexes, comprises transforming proteinase inhibitor alpha 2-macroglobulin (M) to obtain the ability to form a stabile complex with leptin. An Independent claims is also included for a method for the quantitative determination of leptins in biological fluids.

Description

Leptin, ein 16 kDa Polypetid, ist das Produkt des ob-Gens (Zhang Y. et al.: Nature 371 (1994) 425). Es wird von Adipozyten gebildet und in das Blut abgegeben (Hardie, L. J. et al.: Hormon. Metab. Res. 28 (1996) 685). In ob/ob-Mäusen verursacht die Verabreichung von Leptin eine Gewichtsreduktion und eine Reduzierung der Nahrungsaufnahme (Weigle, D. S. et al.: J. Clin. Invest 96 (1995) 2065).Leptin, a 16 kDa polypeptide, is the product of the ob gene (Zhang Y. et al .: Nature 371 (1994) 425). It is formed by adipocytes and released into the blood (Hardie, L. J. et al .: hormone. Metab. Res. 28 (1996) 685). In ob / ob mice the administration caused of leptin a weight reduction and a reduction in food intake (Weigle, D. S. et al .: J. Clin. Invest 96 (1995) 2065).

Diese Ergebnisse führten zu der Annahme, daß Leptin wesentlich an der Regulation des Körpergewichts beteiligt ist (Halaas, J. L. et al.: Science 269 (1995) 543). Ein Mangel an Leptin oder eine Resistenz gegenüber Leptin führten im Tierexperiment zu einer schweren Fettsucht (Stephens, T. W. et al.: Nature 377 (1995) 530). Der Anstieg der Plasmakonzentration von Leptin mit dem Schweregrad einer Fettsucht bei Tieren und im Menschen, ließen vermuten, daß dieses Protein über einen negativen Feed-back-Mechanismus bestimmte Zentren im Gehirn kontrolliert, die den Energiestoffwechsel und die Nahrungsaufnahme beeinflussen (Campfield, L. A. et al.: Science 269 (1995) 546). Es gilt als bewiesen, daß die zentrale Wirkung des Leptins über eine Hemmung der Neutopeptid Y-Genexpression und -Sekretion vermittelt wird (Stephens, T. W. et al.: Nature 377 (1995) 530; Schwartz, M. W. et al.: Diabetes 45 (1996) 531). Neuropeptid Y ist ein starker Stimulator der Nahrungsaufnahme (Frankish, H. M. et al.: Peptides 16 (1995) 757). Jedoch haben Experimente in Neuropeptid Y-negativen Mäusen gezeigt, daß sie ebenfalls auf Leptinadministration reagieren, was die Rolle der vermittelnden Wirkung des Peptides einschränkt (Erickson J. C. et al.: Nature 381 (1996) 41).These results led to the assumption that leptin was significantly involved in the regulation of Body weight is involved (Halaas, J.L. et al .: Science 269 (1995) 543). A lack of Leptin or resistance to leptin led to a severe one in animal experiments Obesity (Stephens, T.W. et al .: Nature 377 (1995) 530). The rise in Plasma concentration of leptin with the severity of obesity in animals and in Humans suggested that this protein has a negative feedback mechanism certain centers in the brain that control the energy metabolism and the Affect food intake (Campfield, L.A. et al .: Science 269 (1995) 546). It applies as proven that the central action of leptin is by inhibiting the neutopeptide Y gene expression and secretion is mediated (Stephens, T. W. et al .: Nature 377 (1995) 530; Schwartz, M.W. et al .: Diabetes 45 (1996) 531). Neuropeptide Y is a strong one Food stimulator (Frankish, H.M. et al .: Peptides 16 (1995) 757). However Experiments in neuropeptide Y-negative mice have shown that they can also Leptin administration responds to the role of the mediating effect of the peptide restricted (Erickson J.C. et al .: Nature 381 (1996) 41).

Die Expression des ob-Gens in Ratten und Mäusen wird durch Nahrungsaufnahme und Insulin stimuliert (Saladin, R. et al.: Horm. Metab. Res. 28 (1996) 638). Einen ähnlichen Effekt zeigen einige Zytokine und Endotoxine (Grunfeld, C. et al.: J. Clin. Invest 97 (1996) 2152). Beim Menschen scheint die Expression des Leptin-Gens keiner akuten Kontrolle zu unterliegen. Erhöhte Leptinspiegel hat man lediglich bei Fettsucht gefunden, wobei eine Korrelation der Leptinkonzentration mit dem BMI-Wert besteht (Considine, R. V. et al.: New England J. Med. 334 (1996) 292). Unter der Annahme einer zentralen Wirkung des Leptins erklären sich erhöhte Leptinspiegel bei menschlicher Fettsucht durch eine mögliche Leptinresistenz (Igel, M. et al.: Horm. Metab. Res. 28 (1996) 669). Diese könnte die Folge einer Downregulation des Leptinrezeptors (Tartaglia, L. A. et al.: Cell 83 (1995) 1263) oder in einer Unterbrechung der Rezeptor-Signaltransduktion liegen. Der Leptinrezeptor wurde kürzlich kloniert und weist eine Homologie zur Zytokin-Rezeptor-Familie auf (Tartaglia, L. A. et al.: Cell 83 (1995) 1263). Andere Ursachen einer Leptinresistenz könnten in einer veränderten biologischen Verfügbarkeit oder Bioaktivität des Leptins liegen. Es gilt gegenwärtig als gesichert, daß das aktives Leptin im Plasma in freier Form vorliegt (Considine, R. V. et al.: N. Engl. J. Med. 334 (1996) 292). Die Bindung an andere Plasmaprotein wird vermutet. Neuere Untersuchungen zeigen, daß im menschlichen und tierischen Blut Proteine existieren, die mit Leptin Komplexe eingehen (Diamond, F. B. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 233 (1997) 818; Houseknecht, K. L. et al.: Diabetes 45 (1996) 1638; Shina, M. K. et al.: J. Clin. Invest. 98 (1996) 1277). Ein mögliches Bindungsprotein könnte die lösliche Form des Leptinrezeptors sein, jedoch steht die genaue Identifizierung noch aus (Diamond, F. B. et al.: Biochem. Biophys. Res. Comm. 45 233 (1997) 818). Einige hochmolekulare Plasmaprotein zeigten Leptinbindungseigenschaften, jedoch konnte keine Zuordnung zu bekannten Proteinen des Blutes erzielt werden (Diamond, F. B. et al.: Biochem. Biophys. Res. Comm. 233 (1997) 818). Die Identität und Struktur von Leptin-Bindungsproteinen in menschlichen und tierischem Blut ist bisher noch nicht bekannt.The expression of the ob gene in rats and mice is determined by food intake and insulin stimulated (Saladin, R. et al .: Horm. Metab. Res. 28 (1996) 638). A similar effect show some cytokines and endotoxins (Grunfeld, C. et al .: J. Clin. Invest 97 (1996) 2152). Expression of the leptin gene does not appear to be an acute control in humans subject to. Increased leptin levels have only been found in obesity, one of which There is a correlation between the leptin concentration and the BMI value (Considine, R.V. et al .: New England J. Med. 334 (1996) 292). Assuming a central effect of the Leptins can be explained by a possible increase in leptin levels in human obesity Leptin resistance (Igel, M. et al .: Horm. Metab. Res. 28 (1996) 669). This could result a down regulation of the leptin receptor (Tartaglia, L.A. et al .: Cell 83 (1995) 1263) or there is an interruption in receptor signal transduction. The leptin receptor was recently cloned and has homology to the cytokine receptor family (Tartaglia, L.A. et al .: Cell 83 (1995) 1263). Other causes of leptin resistance could be found in one altered bioavailability or bioactivity of the leptin. It applies currently assured that the active leptin is free in plasma (Considine, R.V. et al .: N. Engl. J. Med. 334 (1996) 292). The bond with others Plasma protein is suspected. Recent studies show that in human and animal blood proteins exist that form complexes with leptin (Diamond, F.B. et al .: Biochem. Biophys. Res. Commun. 233 (1997) 818; Houseknecht, K.L. et al .: Diabetes 45 (1996) 1638; Shina, M.K. et al .: J. Clin. Invest. 98 (1996) 1277). A possible one Binding protein could be the soluble form of the leptin receptor, but the exact one is clear Identification still from (Diamond, F.B. et al .: Biochem. Biophys. Res. Comm. 45 233 (1997) 818). Some high molecular weight plasma protein showed leptin binding properties, however, no association with known blood proteins could be achieved (Diamond, F. B. et al .: Biochem. Biophys. Res. Comm. 233 (1997) 818). The identity and structure of leptin binding proteins in human and animal blood is not yet known.

Die Wechselwirkung mit Bindungsproteinen könnte einen wesentlichen Einfluß auf die biologische Aktivität des Leptins ausüben, so durch Veränderung der Clearance, durch Inaktivierung oder Unterbrechung des Transports von Leptin in das Gehirn (Banks, W. A. et al.: Peptides 17 (1996) 305). Die Bestimmung des proteingebundenen Leptins liefert somit wichtige Informationen über das Verteilungsverhalten von Leptin im Blut und somit möglicherweise auch über seine biologische Aktivität. Die Rolle, die Bindungsproteine für Leptin in der Äthiologie der Fettsucht spielen, ist bisher ebenfalls nicht bekannt.Interaction with binding proteins could have a significant impact on the exert biological activity of the leptin by changing the clearance by Inactivating or stopping the transport of leptin to the brain (Banks, W. A. et al .: Peptides 17 (1996) 305). The determination of the protein-bound leptin thus provides important information about the distribution behavior of leptin in the blood and thus possibly also about its biological activity. The role that binding proteins play in Playing leptin in the aetiology of obesity is also not yet known.

Es wurde festgestellt, daß das α2-Makroglobulin, ein Proteinaseinhibitor des menschlichen und tierischen Blutes, mit Leptin einen Komplex bildet. Der Inhibitor liegt im Blut in zwei unterschiedlichen Formen vor, dem nativen und dem transformierten Protein (Sottrup-Jensen, L. J.: Biol. Chem. 264 (1989) 11539). Das transformierte α2-Makroglobulin, das durch Kontakt mit Proteinasen gebildet wird, macht ca 0.5% des gesamten α2-Makroglobulins aus 30 und wird schnell aus dem Blut durch Bindung an einen zellulären Oberflächenrezeptor entfernt (Strickland D. K. et al.: J Biol Chem 265 (1990) 17401). Beide Formen des Inhibitors können immunologisch erfaßt und quantifiziert werden (Birkenmeier G. and Strigbrand T.: J. Immunol. Meth. 162 (1990) 59). Dazu werden konformationsspezifische monoklonale Antikörper eingesetzt. Es wurde entdeckt, daß Leptin nur an transformiertes α2-Makroglobulin bindet.The α2 macroglobulin, a human proteinase inhibitor, has been found to be and animal blood, forms a complex with leptin. The inhibitor is in two in the blood different forms, the native and the transformed protein (Sottrup-Jensen, L. J .: Biol. Chem. 264 (1989) 11539). The transformed α2 macroglobulin, which by Contact with proteinases is about 0.5% of the total α2 macroglobulin 30 and quickly becomes blood by binding to a cellular surface receptor removed (Strickland D.K. et al .: J Biol Chem 265 (1990) 17401). Both forms of Inhibitors can be detected and quantified immunologically (Birkenmeier G. and Strigbrand T .: J. Immunol. Meth. 162 (1990) 59). For this purpose, conformation-specific monoclonal antibodies used. It was discovered that leptin only transformed α2 macroglobulin binds.

Gegenwärtig gibt es verschiedene Nachweisverfahren für die quantitative Erfassung von Leptin im Blut (Human-Leptin-RIA-Kit der Firma BioTrend; Leptin-MTPL-EIA, DRG Diagnostika, Deutschland). Nachteile dieser Methoden ist die Tatsache, daß eine Differenzierung der verschiedenen Leptinformen im Blut, wie freies Leptin und gebundenes Leptin, nicht möglich ist.There are currently various methods of detection for the quantitative detection of leptin in blood (Human-Leptin-RIA-Kit from BioTrend; Leptin-MTPL-EIA, DRG Diagnostika, Germany). Disadvantages of these methods is the fact that a Differentiation of the various forms of leptin in the blood, such as free leptin and bound Leptin, is not possible.

Das Ziel der Erfindung ist die Beseitigung der Nachteile herkömmlicher Methoden zur Bestimmung von Leptin in menschlichen Körperflüssigkeiten.The aim of the invention is to eliminate the disadvantages of conventional methods for Determination of leptin in human body fluids.

Die Aufgabe der Erfindung ist die Etablierung eines Verfahrens zur quantitativen Erfassung des an α2-Makroglobulin gebundenen Leptins im Blut.The object of the invention is to establish a method for quantitative detection of leptin bound to α2-macroglobulin in the blood.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst, indem Komplexe aus α2-Makroglobulin und Leptin hergestellt werden. Dies setzt die Überführung von nativem α2-Makroglobulin in transformiertes α2-Makroglobulin voraus. Als Mittel zur Transformation dienen bereits bekannte Substanzen wie Methylamin und Proteinasen. Erfindungsgemäß werden Komplexe aus Leptin und α2-Makroglobulin hergestellt, indem Leptin mit transformiertem α2-Makroglobulin zur Reaktion gebracht wird. Diese Komplexe können für in vitro Untersuchungen und für in vivo Applikationen von Bedeutung sein und eingesetzt werden.According to the invention, this object is achieved by complexes of α2-macroglobulin and Leptin can be made. This implies the conversion of native α2 macroglobulin transformed α2 macroglobulin ahead. Already serve as a means of transformation known substances such as methylamine and proteinases. According to the invention, complexes made from leptin and α2-macroglobulin by transforming leptin with α2 macroglobulin is brought to reaction. These complexes can be used for in vitro Investigations and be of importance for in vivo applications and are used.

Der Nachweis von Leptin-α2-Makroglobulin Komplexen im Blut ist für die Differenzierung von freiem und gebundenem Leptin von klinischer Bedeutung. Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung von Leptin-α2-Makroglobulin-Komplexen durch Bindung des Komplexes an einen Antikörper, der nur mit transformiertem α2-Makroglobulin reagiert. Damit wird aus der gesamten Fraktion des α2-Makroglobulins im Blut nur der Anteil markiert, der zur Leptinbindung befähigt ist. Der Nachweis des gebundenen Leptins erfolgt nunmehr erfindungsgemäß durch einen zweiten Antikörper, der mit gebundenem Leptin reagiert und dessen Reaktion entweder direkt oder durch einen bereits bekannten Verstärkermechanismus meßbar gemacht wird. The detection of leptin-α2-macroglobulin complexes in the blood is for differentiation of free and bound leptin of clinical importance. According to the invention Determination of leptin-α2-macroglobulin complexes by binding the complex to an antibody that only reacts with transformed α2 macroglobulin. This turns the entire fraction of the α2-macroglobulin in the blood only the portion marked for Is capable of binding leptin. The bound leptin is now detected according to the invention by a second antibody which reacts with bound leptin and its reaction either directly or through an already known amplifier mechanism is made measurable.

Embodiment 1. Preparation of leptin-α2-macroglobulin complexes

Eine ausreichende Menge von nativem α2-Makroglobulin (z. B. 5 mg) wird mit ausreichenden Konzentrationen an Methylamine (z. B. 0,2 M) bei adequater Temperatur (z. B. Raumtemperatur) in adequater Zeit (z. B. 2 Stunden) unter Schütteln inkubiert. Anschließend wird der Ansatz zur Entfernung des überschüssigen Methylamins gegen einen entsprechenden Puffer (z. B. 100 mM Na-Phosphatpuffer, pH 8,0) dialysiert. An Stelle des Methylamins kann zur Transformation auch eine Proteinase verwendet werden. Dazu wird natives α2-Makroglobulin mit 2-4 molarem Überschuß an Proteinase (z. B. α-Chymotrypsin) bei Raumtemperatur und adequater Zeit (z. B. 2 Minuten) in Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,5) inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe eines adequaten Inhibitor (z. B. Phenylmethylsulfonylfluorid) gestoppt und die Komplexe werden durch Gel permeationschromatographie getrennt. Das durch Methylamine oder durch eine Proteinase transformierte α2-Makroglobulin wird anschließend mit adequaten Konzentrationen an Leptin (z. B. in 2-4 molarem Überschuß) in Phosphatpuffer bei adequater Temperatur (z. B. 37°C) für adequate Zeit (z. B. 2 Stunden) inkubiert. Der Leptin-α2-Makroglobulin-Komplex wird anschließend von freiem Leptin durch Gelpermationschromatographie getrennt. Der Leptin-α2-Makroglobulin-Komplex ist unter nichtdenaturierenden Bedingungen stabil.A sufficient amount of native α2 macroglobulin (e.g. 5 mg) will be sufficient Concentrations of methylamines (e.g. 0.2 M) at an adequate temperature (e.g. Room temperature) in an adequate time (e.g. 2 hours) with shaking. Subsequently is the approach to remove the excess methylamine against a corresponding Buffer (e.g. 100 mM Na phosphate buffer, pH 8.0) dialyzed. Instead of the methylamine can a proteinase can also be used for transformation. This becomes native α2-macroglobulin with 2-4 molar excess of proteinase (e.g. α-chymotrypsin) Room temperature and adequate time (e.g. 2 minutes) in phosphate buffer (100 mM, pH 7.5) incubated. The reaction is stopped by adding an adequate inhibitor (e.g. Phenylmethylsulfonyl fluoride) and the complexes are gelatinized permeation chromatography separated. That by methylamine or by a proteinase transformed α2 macroglobulin is then applied with adequate concentrations Leptin (e.g. in 2-4 molar excess) in phosphate buffer at an adequate temperature (e.g. 37 ° C) for adequate time (e.g. 2 hours). The leptin-α2 macroglobulin complex is then separated from free leptin by gel permeation chromatography. Of the Leptin-α2 macroglobulin complex is stable under non-denaturing conditions.

2. Quantification of leptin-α2-macroglobulin complexes

Ein Antikörper, der nur die transformierte Form des α2-Makroglobulins erkennt, wird unter adequaten Bedingungen (z. B. bei 4°C über Nacht) an die Wand einer Titerplatte (2 µg/ml) adsorbiert. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (z. B. PBS-T = 50 mM Na-Phosphat, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) wird die Probe (z. B. 200 µl Plasma oder Standard) in die Kavitäten pipettiert und der Ansatz wird für adequate Zeit (z. B. 1 Stunde bei 37°C) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Kavitäten mit Waschpuffer wird ein zweiter Antikörper zugegeben, der das an transformiertem α2-Makroglobulin-gebundene Leptin erkennt. Die Inkubation erfolgt bei 37°C in PBST für 1 Stunde. Nach dem Waschen der Proben wird anschließend ein Enzym-markierter Antikörper, der gegen den zweiten Antikörper gerichtet ist, in die Kavitäten pipettiert und für 1 Sunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wird Substratlösung (z. B. DAB/H₂O₂ bei Verwendung von Peroxidase) in die Kavitäten pipettiert und die Farbreaktion wird nach 20 min mittels Schwefelsäure nach bekannter Vorschrift abgestoppt. Die Extinktion der Proben wird anschließend bei 495 nm gegen eine geometrische Verdünnung eines Standards (Leptin-2-Makroglobulin) gemessen. Aus der Eichgerade läßt sich die Konzentration des Leptin-α2-Makroglobulin-Komplexes der Probe ermitteln.An antibody that only recognizes the transformed form of the α2 macroglobulin is adsorbed onto the wall of a titer plate (2 µg / ml) under adequate conditions (e.g. at 4 ° C overnight). After washing three times with wash buffer (e.g. PBS-T = 50 mM Na phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), the sample (e.g. 200 µl plasma or standard) is pipetted into the wells and the mixture is incubated for adequate time (e.g. 1 hour at 37 ° C). After washing the wells three times with wash buffer, a second antibody is added, which recognizes the leptin bound to transformed α2-macroglobulin. Incubation takes place at 37 ° C in PBST for 1 hour. After washing the samples, an enzyme-labeled antibody, which is directed against the second antibody, is then pipetted into the wells and incubated for 1 hour at 37 ° C. After washing, the substrate solution (eg DAB / H ₂ O ₂ when using peroxidase) is pipetted into the cavities and the color reaction is stopped after 20 minutes using sulfuric acid according to a known procedure. The absorbance of the samples is then measured at 495 nm against a geometric dilution of a standard (leptin-2-macroglobulin). The concentration of the leptin-α2-macroglobulin complex of the sample can be determined from the calibration line.

Claims

1. A process for the formation of leptin-α2-macroglobulin complexes, characterized in that the proteinase inhibitor, α2-macroglobulin, is transformed and only thereby acquires the ability to form a stable complex with leptin.

2. The method according to claim 1, characterized in that as a transforming agent Substance from the compound class of primary amines alone or in combination with others is used.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that aliphatic amines be used.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that methylamine added becomes.

5. The method according to claim 1, characterized in that as a transforming agent Proteinase is used alone or in combination with other proteinases.

6. The method according to claim 1 and 5, characterized in that trypsin as the proteinase and / or chymotrypsin is used alone or in combination with other proteinases.

7. Means for the formation of leptin-α2-macroglobulin complexes, characterized in that it is added to the proteinase inhibitor and performs a transformation.

8. Composition according to claim 7, characterized in that an amine alone or in combination is used with others.

9. Composition according to claim 7 and 8, characterized in that it is methylamine.

10. Composition according to claim 7, characterized in that it is proteinases.

11. Agent according to claim 7 and 10, characterized in that the agent is trypsin.

12. Composition according to claim 7 and 10, characterized in that the agent is chymotrypsin.

13. The method according to claim 1, characterized in that transformed α2-macroglobulin is reacted with leptin.

14. The method according to claim 1 and 13, characterized in that α2-macroglobulin and / or leptin of human or other origin.

15. The method according to claim 1 and 13, characterized in that α2-macroglobulin and / or leptin can be of animal origin.

16. The method according to claim 1 and 13, characterized in that α2-macroglobulin and Leptin can be produced recombinantly.

17. The method according to claim 1, characterized in that leptin-α2 macro globulin complexes can be used in vitro and in vivo can.

18. Method for the quantitative determination of leptin-α2-macroglobulin complexes in biological fluids.

19. The method according to claim 18, characterized in that an antibody which is specific recognizes the transformed form of the α2 macroglobulin is used.

20. The method according to claim 18 and 19, characterized in that this antibody can be of monoclonal or polyclonal origin.

21. The method according to claim 18 to 20, characterized in that the transformed α2-macroglobulin bound leptin by a second antibody against leptin is directed, is detected.

22. The method according to claim 18 to 21, characterized in that the second antibody can be of monoclonal or polyclonal origin.

23. The method according to claim 18 to 22, characterized in that the binding of the second Antibody to the leptin-α2-macroglobulin complex can be measured by an indicator reaction is made.

24. The method according to claim 18 to 23, characterized in that a reference Leptin-α2-macroglobulin complex, which is prepared according to claims 1 to 16, is used.

25. The method according to claim 18 to 24, characterized in that the determination of Leptin-α2 macroglobulin complexes in human, animal and other biological Liquids.

26. The method according to claim 18 to 25, characterized in that from the determination the leptin-α2-macroglobulin complexes in biological fluids further diagnostic and therapeutic measures can be derived.